CN112226392A - 防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株及其应用 - Google Patents

防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株及其应用，该菌株为枯草芽孢杆菌ZBN‑201，保藏编号为CGMCC NO.20559，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。本发明通过大姜种植地的原位筛选分离得到一株枯草芽孢杆菌菌株，该菌株能够有效降低大姜根结线虫病害对大姜的损伤，提高作物产量和品质，增加种植户的经济收入；可以减少大姜种植过程中农药的使用，保护生态环境，可广泛应用于大姜栽培中。

Description

防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株防治大姜根结线虫病害的菌株，及其在农业生产中促进大姜生长的应用。
背景技术
大姜根结线虫病害是一种常见的土传病害，依靠寄生大姜植株根部吸收植株营养生存，线虫在土壤中长期生存，连作会使线虫病害更加严重，当植株发病时类似水肥不足，叶片发黄且卷曲，植株矮小，而在植株的根部有大小不同的根结，影响大姜植株对养分和水分的吸收，降低大姜的品质产量，在成熟的大姜茎块表面会有线虫侵染的痕迹，造成伤痕表皮，使得大姜的成品价值大大降低，给姜农造成严重的经济损失。
防治根结线虫的方式有多种，在当前的农业生产中主要以化学防治为主，施用农药会导致绝大部分农药作用于非靶点位置，导致土壤污染加重，农药进入土壤后会导致土壤温度、湿度、有机质含量、酸碱度变化，而且农药进入土壤中后，存在毒性且不易被降解，在土壤中存在时间长，对土壤危害大。
因此，提供一种新型防治方式以解决防治大姜根结线虫病害手段局限及防治困难问题是很有必要的。
发明内容
本发明目的在于提供一株具有防治大姜根结线虫病害效果的菌株，且对大姜植株具有良好的促生效果，减少农药的使用，保护生态环境。
本发明提供了一种防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株，该菌株为枯草芽孢杆菌ZBN-201，保藏编号为CGMCC NO.20559。
本发明提供的防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株(枯草芽孢杆菌ZBN-201)的16s rRNA基因序列测定结果如序列表中SEQ ID NO.1所示。
本发明保护上述菌株(枯草芽孢杆菌ZBN-201)在防治大姜根结线虫病害中的应用，本发明还保护上述菌株(枯草芽孢杆菌ZBN-201)在促进大姜生长中的应用。
本发明还保护一种生物菌肥，该生物菌肥的活性成分包括防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株(枯草芽孢杆菌ZBN-201)。
优选地，上述生物菌肥是将防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株和载体混合发酵而成；其中，按重量份计，菌株1-3重量份，载体70-90重量份。进一步优选地，生物菌肥中，按重量份计，菌株2重量份，载体79重量份。
进一步优选地，上述生物菌肥采用的载体的原料组分包括木薯发酵物和锯末中的一种或两种；其中，锯末的粒径小于5mm。木薯发酵物为采用常规方法制得，锯末为木制品加工过程中产生的边角料，打磨成细粉，粒径小于5mm，将上述组分混合在一起，添加枯草芽孢杆菌ZBN-201菌株进行充分发酵，制成生物菌肥。
本发明还保护上述生物菌肥在防治大姜根结线虫病害中的应用；本发明还保护上述生物菌肥在促进大姜生长中的应用。
本发明通过大姜种植地的原位筛选进行生防菌(枯草芽孢杆菌ZBN-201)的分离，对生防菌进行相应的杀虫实验，筛选出具有高防效的菌株并进行菌种鉴定及生理生化指标测定，对生防菌进行盆栽防效验证，得到防治效果，与有机载体进行混合形成生物菌肥，进行大田试验，综合验证防治效果及促生效果，能够有效的降低大姜根结线虫病害对大姜的损伤，提高作物产量，提高作物的品质，增加种植户的经济收入。
保藏信息：枯草芽孢杆菌ZBN-201，拉丁名：Bacillus subtilis；保藏编号：CGMCCNO.20559，于2020年8月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
实施例1：防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株枯草芽孢杆菌ZBN-201(生防菌)分离纯化、筛选
1、菌株分离
土壤样品取自潍坊大姜种植地大姜的根际土壤，称取10g加入装有90mL的无菌水的三角瓶中过70℃水浴，水浴后进行震荡，将震荡后的土壤样品置于37℃恒温摇床中，180rpm振荡30min进行活化，稀释到10-3、10-4、10-5、10-6浓度在LB优化培养基(蛋白胨10g，NaCl 10g，酵母膏5g，1000mL水，10mL无菌土壤浸出液，琼脂条20g，pH7.0)上进行梯度稀释涂布，置于37℃培养箱中培养36h，挑取不同菌落在LB优化固体培养基上进行三区划线，得到分离纯化的菌株。将菌株保存于LB优化试管斜面中保藏于4℃冰箱，并做甘油管保藏于-80℃超低温冰箱中。
2、菌株筛选
大姜根结线虫分离：在山东省潍坊昌邑市一处发病严重的大姜种植地中取发病严重的大姜根部，使用无菌水冲洗干净，使用1.5％的次氯酸钠溶液进行浸泡3min，使用镊子将发病严重大姜根部上的卵囊挑下，放入装有无菌水的孔板中，孵育24h，得到虫液。
杀虫实验验证：使用24孔板，每孔中总体积500μL，分别加入100μL发酵液上清、200μL无菌水、100μL线虫悬液(约100条)、50μL氯霉素(50IU/mL)及50μL四环素(50IU/mL)，充分吸打混匀，放于25℃培养箱12h，吸出孔中所有液体，涂布于载玻片用40倍光学显微镜下进行观察计数，筛选到杀虫效果最好的菌株。该菌株的12h杀虫校正死亡率为90.15％。
实施例2：防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株枯草芽孢杆菌ZBN-201(生防菌)分子鉴定
通过16S rDNA序列分析和生理生化实验鉴定菌株，具体步骤如下：
采用DNA提取试剂盒(天根细菌基因组DNA提取试剂盒)提取和纯化菌株的DNA，4℃保存。选用细菌的16s通用引物由华大基因公司合成，引物如下：
上游引物为5‘-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3’(SEQ ID NO.2)；
下游引物为5‘-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’(SEQ ID NO.3)。
扩增反应体系：引物各2μL，2xPCR mix 25μL，模板DNA 1μL，ddH2O 20μL。
PCR反应程序设定为：95℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环29个周期；72℃延伸10min；4℃保持10min。将PCR产物进行测序(生工生物工程公司)。
将测序结果与NCBI BLAST数据库进行比对，发现其属于枯草芽孢杆菌。
该菌株的16s rRNA基因序列测定结果如序列表中SEQ ID NO.1所示：CCCGGTGCGGCGGCCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAAGGTGAACCAAAGT。
基于测序结果和生理生化试验结果，确定该菌株属于枯草芽孢杆菌。将该菌命名为ZBN-201，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏日期为2020年8月27日，保藏编号为CGMCC NO.20559。
将生防菌接种在LB优化固体培养基上，37℃培养，3天后观察单菌落特征，菌落特征如下：淡黄色、不透明、近圆形、表面不光滑有褶皱、边缘不规则。
革兰氏染色实验：取一滴无菌水滴于在洁净载玻片上，用接种环挑取待测菌落充分混匀后，滴加结晶紫进行染色1min，流水冲至水流无色，滴加碘液进行染色1min，流水冲洗至水流无色，滴加95％乙醇进行脱色，至洗脱液无色，滴加番红染液2-3min，流水冲至水流无色，于40倍显微镜下进行观察，呈现深紫色为革兰氏阳性菌。
进行生理生化测定，通过苯丙胺酸脱氢酶实验，ZBN-201呈现阴性反应；通过解淀粉实验，表明ZBN-201具有分解淀粉的能力；进行V-P试验，呈阳性；通过柠檬酸盐实验，表明ZBN-201能够利用柠檬酸盐。
实施例3：防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株(枯草芽孢杆菌ZBN-201)生防效果验证
实验设置两个处理组，分别为CK组和ZBN-201处理组，ZBN-201处理组使土壤中的有效活菌数达到107CFU/g，CK组加入等量的清水，处理完成48h后定植，放于光照培养室内进行培养，条件为16h光照，8h黑暗，温度25℃，定植50d后取样对卵囊数、根结数、虫口密度测，根据数据显示该生防菌的防效为81.96％。实验结果如下表1所示。
表1生防菌对大姜根结线虫的影响
Figure BDA0002769301160000061
Figure BDA0002769301160000071
实施例4：防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株(枯草芽孢杆菌ZBN-201)促生效果测定
在盆栽实验结束后取植株进行植株株高、茎粗、上部鲜重、上部干重、下部鲜重、上部干重等数据测定，将植株装入样品纸袋，放入烘箱内烘干至恒重进行上下干重的测量，结果显示该菌株对实验植株具有明显的促生效果，地上鲜重部分增长了43.46％，地下鲜重部分增长了41.41％，地上干重增加了53.79％，地下干重增长了68％，茎粗部分增长了29.12％，株高部分增加了29.41％。具体实验结果如下表2所示。
表2盆栽植株生物量的影响
处理 CK ZBN-201
地上鲜重(g) 28.3±5.46Aa 40.6±3.22Cc
地下鲜重(g) 3.84±0.55Aa 5.43±0.94Aa
地上干重(g) 1.32±0.040Aa 2.03±0.044Cc
地下干重(g) 0.25±0.064Aa 0.42±0.090Cd
茎粗(mm) 4.98±0.45Aa 6.43±0.26Bb
株高(cm) 48.36±1.65Aa 62.58±2.03Bc
实施例5：含枯草芽孢杆菌ZBN-201的生物菌肥的制备及效果实验
1、生物菌肥制备
含有ZBN-201的微生物菌肥，包括以下重量份的组分：ZBN-2012份，载体79份；载体选用木薯发酵物和锯末的混合物，木薯发酵物为采用常规方法制得，锯末为木制品加工过程中产生的边角料，打磨成细粉，粒径小于5mm，将上述组分混合在一起，添加微生物进行充分发酵，制成生物菌肥。
2、含有枯草芽孢杆菌ZBN-201的生物菌肥的大田实验
实验地点：山东潍坊昌邑围子镇。
供试作物：潍坊大姜，供试品种为面姜。
施用方法：小区实验面积1亩(666.7平方米)，试验共分为3个处理组。CK组：不使用任何防治根结线虫病的物质。T1处理组：阳性对照组，农户正常使用农药噻唑啉，根据种植要求，定植前沟底施用2kg/亩噻唑啉，小培沟冲施2kg/亩噻唑啉，大培沟冲施2kg/亩噻唑啉。T2处理组：ZBN-201生物菌肥处理。定植前施用，用量为100kg/亩，小培沟冲施一次50kg/亩，大培沟冲施50kg/亩。于种姜前将供试肥料或菌肥均匀撒入姜沟，小培沟补施，大培沟补施，定植180d取大姜进行相应指标测定，经数据分析得到该生物菌肥的防效为73.51％。具体实验结果如下表3和表4所示。
表3大姜根结线虫影响
处理 根结数(个) 卵囊数(个) 虫口密度 防效
CK 52.85±3.13Cc 22.28±2.42Aa 23.22±3.35Aa -
阳性 18.57±2.37Bb 8.57±1.27Bb 7.74±3.25Bb 64.86％
ZBN-201 14±2Aa 7.42±1.13Bb 5.01±1.34Bb 73.51％
表4大姜生物量的影响
Figure BDA0002769301160000081
从上述表中数据可知，ZBN-201生物菌肥处理组的株高、茎粗及产量均高于CK组，ZBN-201生物菌肥处理组的大姜植株的生物量也高于噻唑啉农药处理组的生物量，且随防效增加生物量也随之增加，茎粗方面增加了13.98％，株高方面增加了11.26％，产量方面增加了18.92％。
本发明通过大姜种植地的原位筛选进行生防菌的分离，对生防菌进行相应的杀虫实验，筛选出具有高防效的进行菌种鉴定及生理生化指标测定，对生防菌进行盆栽防效验证，得到防治效果，与有机载体进行混合形成生物菌肥，进行大田试验，综合验证防治效果及促生效果，能够有效的降低大姜根结线虫病害对大姜的损伤，提高作物产量，提高作物的品质，增加种植户的经济收入。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。
序列表
<110> 青岛滋百农农业科技有限公司
<120> 防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株及其应用
<130> 2
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1457
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 1
cccggtgcgg cggcctatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120
ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcaaaca taaaaggtgg 180
cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240
caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420
agaacaagta ccgttcgaat agggcggtac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600
gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720
aactgacgct gaggagcgaa aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc 780
acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa 840
cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg 900
ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc 960
aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac 1020
aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg 1140
acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac 1200
acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac 1260
aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta 1320
gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta acctttagga gccagccgcc 1440
gaaaggtgaa ccaaagt 1457
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> “人工序列”()
<400> 2
agagtttgat cctggtcaga acgaacgct 29
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> “人工序列”()
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac ttcacccc 28

Claims (10)

1.一种防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株，其特征在于：
所述菌株为枯草芽孢杆菌ZBN-201，保藏编号为CGMCC NO.20559。
2.根据权利要求1所述的防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株，其特征在于：
所述菌株的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的菌株在防治大姜根结线虫病害中的应用。
4.权利要求1所述的菌株在促进大姜生长中的应用。
5.一种生物菌肥，其特征在于：
所述生物菌肥的活性成分包括权利要求1所述的防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株。
6.根据权利要求5所述的生物菌肥，其特征在于：
所述生物菌肥是将所述防治大姜根结线虫病害并促进大姜生长的菌株和载体混合发酵而成；其中，按重量份计，所述菌株1-3重量份，所述载体70-90重量份。
7.根据权利要求6所述的生物菌肥，其特征在于：
所述生物菌肥中，按重量份计，所述菌株2重量份，所述载体79重量份。
8.根据权利要求6所述的生物菌肥，其特征在于：
所述载体的原料组分包括木薯发酵物和锯末中的一种或两种；其中，所述锯末的粒径小于5mm。
9.权利要求5-8任一项所述的生物菌肥在防治大姜根结线虫病害中的应用。
10.权利要求5-8任一项所述的生物菌肥在促进大姜生长中的应用。
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胡玉金等: "作物根结线虫病害综合防治技术概述", 《山东农业科学》 *

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