CN110669691B

CN110669691B - 一种防治植物线虫病害的巨大芽孢杆菌及其应用

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Publication number: CN110669691B
Application number: CN201910986516.0A
Authority: CN
Inventors: 咸洪泉; 张启航; 杨亚楠; 赵洪海; 李雅华; 梁晨
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2039-10-17
Also published as: CN110669691A

Abstract

本发明公开了一种巨大芽孢杆菌及其在防治植物线虫病害方面的应用，其保藏编号是：CGMCC NO.18007，还公开了该菌株的培养方法、形成的菌剂、菌剂的制备方法及应用。所述巨大芽孢杆菌菌落为奶白色、圆形或者近似圆形、边缘透明锯齿状、质地均匀、乳质状、湿润扁平。巨大芽孢杆菌BCCX15为杆状，呈链状排布；产芽孢、芽孢中生，短柱状，革兰氏染色反应阳性；所述巨大芽孢杆菌能利用蔗糖，不能利用乳糖。本发明提供的巨大芽孢杆菌为广谱线虫拮抗菌株，制备的菌剂高效防治植物线虫病，还具有一定的促进作物生长和增产作用，在植物线虫病害防治方面具有重要意义。

Description

一种防治植物线虫病害的巨大芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种巨大芽孢杆菌及其在防治植物线虫病害方面的应用。

背景技术

植物寄生线虫或简称植物病原线虫，分布广、寄主多，侵染植物根系组织常常形成根结或胞囊，导致植物发生线虫病害，其危害超过细菌和病毒,仅次于真菌病害。全球每年由植物寄生线虫所造成的作物损失多达780亿美元,线虫病害防治已成为农林生产上的重要问题。植物线虫病害主要包括根结线虫病和胞囊线虫病，其中根结线虫寄主相当广泛，据不完全统计，根结线虫寄主已超过3000种植物，例如茄科、葫芦科、十字花科等植物；由于根结线虫寄主范围广泛，生活史短，繁殖率高，所以其经济危害性很大，被认为是世界上最重要的植物病原物之一。根结线虫对世界上重要的经济作物年造成的损失就高达数百亿美元。在我国的大部分地区，根结线虫病都有发生，一般导致作物减产25％左右，严重时可达70％以上。胞囊线虫病害中的小麦胞囊线虫在湖北、安徽、山西、山东、河北、河南等省的麦田均有发生，并且有继续蔓延扩大的趋势，受害的地区一般小麦减产20～30％，严重的达到70％，已严重威胁我国小麦的安全生产。

目前防治植物线虫病害的方法基本分为农业防治、物理防治、化学防治和生物防治四大类。轮作和选育种植抗线虫品种是两种有效的农业防治线虫病害方法，由于线虫寄主范围广、耕地资源和耕作条件等方面制约，轮作受到较大限制；目前生产上尚缺乏农艺性状良好的抗线虫病品种。热力处理是有效的杀线虫方法，但成本高、无差别杀死土壤中有益微生物，破坏土壤的微生态环境难以大面积推广应用。化学杀线剂高效、使用方便，是线虫防治的主要方法，随着长期使用化学杀线剂，化学杀线剂暴露出的毒性强、残留高、严重污染环境等问题日趋突出，已不适用于绿色、有效的防治线虫病害要求，一些生产上曾广泛使用的杀线剂，如涕灭威、甲基异硫磷、灭线磷、克百威等相继被禁用或限制使用，因此迫切的需要寻找一种新的绿色防治线虫病害途径来代替传统的防治方法。

生物防治具有绿色、安全、环境友好等特点，是控制根结线虫和小麦孢囊线虫的重要手段，也是今后的发展方向，开发生防制剂以作为化学农药的补充或替代品，利用拮抗微生物来防治线虫病害的研究倍受关注,具有十分巨大的社会、经济效益与环境效益。线虫病害生物防治研究已经取得了一定进展，其中研究较多的有真菌和细菌两大类。大部分生防真菌在室内及盆栽试验中有较好的防治效果，但在大田防治试验中往往会受定殖能力、温度、湿度等多种因素的限制而无法发挥出理想的效果。细菌一般具有易培养、繁殖快、定殖能力强等特点，是重要的线虫生防菌资源，但是不同细菌菌株生防效果差异极大，具有菌株特异性，筛选高效、广谱线虫拮抗细菌菌株，开发其培养和应用技术是线虫病害生物防治研究应用需要解决的重要问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种巨大芽孢杆菌及其在防治植物线虫病害方面的应用，本发明的有益效果是提供的巨大芽胞杆菌为广谱线虫拮抗菌株，制备的菌剂高效防治植物线虫病，还具有一定的促进作物生长和增产作用。

本发明从小麦胞囊线虫病田土壤中筛选获得的一株细菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium)BCCX15，保藏编号是：CGMCC NO.18007，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为青岛农业大学；保藏日期：2019年6月20日。

本发明通过研究发现，优选的菌体培养条件为，采用加富牛肉膏蛋白胨液体培养基，BCCX15的最优发酵条件为pH7.5、接种量3％、10％的装瓶量、24h的培养时间。

机械搅拌发酵罐发酵条件为：

(1)发酵罐发酵培养基为加富牛肉膏蛋白胨液体培养基，装料系数为50-80％；

(2)按1％～9％的接种量接入培养16～18h的巨大芽孢杆菌种子液，200～300r/min，23.5℃～41.5℃条件下发酵，加入消泡剂控制消泡；

(3)发酵过程中通气量(V/V·min)1:1～2，控制pH为5.5～9.5，发酵30～40h，得到发酵液。

菌剂制备：用无菌水将上述发酵液调整到1×10⁹CFU/mL，即得巨大芽孢杆菌的液体菌剂；将所述液体菌剂按1:1(V:W)加入灭菌的麸皮吸附，35℃～40℃通风干燥后即得巨大芽孢杆菌固体菌剂。

本发明的巨大芽孢杆菌菌剂可有效防治小麦胞囊线虫病、花生根结线虫病、网纹瓜根结线虫病、番茄根结线虫病、黄瓜根结线虫病等植物线虫病害；移栽前穴施巨大芽孢杆菌的液体菌剂，施用剂量为60-70mL/穴；混土施用巨大芽孢杆菌的固体菌剂，施用剂量为5kg/667m²～7kg/667m²。

附图说明

图1为巨大芽孢杆菌BCCX15菌落形态；

图2显微镜下为巨大芽孢杆菌BCCX15菌体及芽孢形态。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的图1和图2，对本发明实施例中的技术方案进行描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

实施例1：巨大芽孢杆菌的分离筛选

1.培养基的制备

普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的配方为：牛肉膏5g；蛋白胨10g；氯化钠5g；琼脂粉20g；蒸馏水，1L。pH调制7.2，121℃高温灭菌20min。

加富牛肉膏蛋白胨培养基的配方为：牛肉膏10g；蛋白胨20g；氯化钠5g；蒸馏水，1L；121℃高温灭菌20min。

2.巨大芽孢杆菌的分离筛选

称取500g小麦胞囊线虫病田土壤土样放于盆中，用自来水冲洗，搅拌，将上层水倒入套筛(上层40目筛，下层60目筛)，操作重复五次。将60目筛截留的土样冲洗至装有少量水的烧杯中。混匀后倒入放有滤纸的多孔塑料皿中，在体视镜下挑取褐色柠檬形的孢囊，置于小培养皿中。将收集的孢囊用1％的次氯酸钠灭菌3min后，然后用无菌水洗三遍。在体视镜下利用灭菌挑针扎破孢囊，转移至牛肉膏蛋白胨培养基中，28℃下培养2～3d后，待细菌长出，分区划线，进行细菌的纯化，保存于斜面。

分别挑取活化的供试细菌单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，28℃、140rpm、摇床振荡培养3d，发酵液8000rpm离心10min，分别收集菌体和上清液(发酵产物)备用。

发酵产物对二龄幼虫(J2)的致死作用：24孔细胞培养板每个孔加入30条新孵化的二龄幼虫，并分别加入2mL不同细菌菌株不同浓度的发酵上清液，以无菌水为对照，每处理3次重复。于15℃培养箱中培养，观察记录J2死亡情况。观察时取处理的二龄幼虫，滴加4mol/L NaOH，如幼虫身体僵直、不再扭动则判定为幼虫已经死亡。死亡率的计算公式如下：

发酵产物对孢囊孵化的抑制作用：分离4℃冰箱中预处理30天后的土样中的孢囊，用1％的次氯酸钠表面消毒后用无菌水冲洗3遍。分别取不同供试细菌菌株不同浓度的发酵上清液2mL于24孔细胞培养板中，细胞培养板每个孔中随机加入5个饱满的孢囊，以无菌水作对照，每处理3次重复。于15℃培养箱中孵育，观察记录孵化出的J2线虫条数，研究不同浓度不同细菌菌株发酵产物对小麦孢囊线虫孢囊孵化的抑制作用。采用DPS v7.5(DataProcessing System)软件进行统计分析。

从分离506株细菌中筛选出1株对小麦孢囊线虫的孢囊孵化和二龄幼虫的致死作用最强的菌株，编号BCCX15，其发酵产物对二龄幼虫的致死作用结果见表1。BCCX15发酵产物稀释2倍后，对二龄幼虫的校正致死率为86.86％；稀释4倍后对二龄幼虫的致死率达到69.60％，稀释16倍后对二龄幼虫无作用，说明BCCX15的发酵产物对二龄幼虫的致死作用存在剂量效应，发酵产物浓度越高对小麦孢囊线虫二龄幼虫致死作用越强。

表1不同浓度BCCX15发酵产物处理24h对二龄幼虫的致死作用

注：表中每组数据后不同小写字母表示在P＝0.05水平下差异显著(下同)

BCCX15不同浓度的发酵产物对孢囊孵化抑制作用结果见表2，在第5d的时候，BCCX15的原液对孢囊孵化抑制率为93.41％，2倍稀释液对孢囊孵化抑制率为90.67％，4倍稀释液对孢囊孵化的抑制率达到88.09％，发酵上清液稀释8倍后对孢囊孵化抑制率为74.73％。在第10d，第15d时孢囊不再孵化，抑制率没有发生变化。说明BCCX15的发酵产物抑制孢囊孵化存在剂量效应，发酵产物浓度越高对孢囊孵化的抑制作用越强。

表2 BCCX15不同浓度的发酵产物对孢囊孵化抑制作用(孢囊孵化抑制率％)

实施例2巨大芽孢杆菌BCCX15的鉴定

1、形态学鉴定和生理生化特性检测

将分离到的菌株接种到牛肉膏蛋白胨平板上，28℃恒温培养18～48h，观察菌落特征，挑取菌体制备涂片，进行革兰氏染色，显微观察菌体形态和芽孢形成情况，进行形态学鉴定。采用常规方法进行糖(醇)类发酵试验、Voges-Proskauer试验(伏-普试验，V.P.试验)、甲基红试验(M.R试验)、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验、淀粉水解试验、明胶水解试验，接触酶试验、酪氨酸水解试验(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册，第一版.北京,科学出版社,2001)。

结果表明：菌株BCCX15菌落为奶白色、较大、圆形或者近似圆形、边缘透明锯齿状、质地均匀、乳质状、湿润扁平，见附图1。如附图2所示，BCCX15菌体为杆状，其长度为3.49μm～6.49μm、宽度为1.10μm～1.50μm，呈链状排布；产芽孢、芽孢中生，短柱状，革兰氏染色反应阳性。

BCCX15能利用蔗糖，柠檬酸盐试验、淀粉水解试验、明胶水解、酪氨酸水解、接触酶试验反应阳性，不能利用乳糖，吲哚试验、甲基红试验、伏普试验反应阴性。

2、分子生物学鉴定

挑取菌株单菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中28℃、200rpm振荡培养18h，采用DNA提取试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)提取细菌基因组。

2.1 16S rRNA基因序列的测定

利用细菌16S rRNA基因通用引物27f和1492r，进行16S rRNA基因的PCR扩增，引物序列如下表3：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO:1)

1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO:2)

PCR反应体系(50μL)：

表3 16S rRNA基因PCR扩增反应体系

细菌基因组DNA	2.0μL
		TaqDNA聚合酶(5U/μL)	0.5μL
dNTPs(2mmol/L)	4μL
		引物27F(10μM)	2μL
引物1492R(10μM)	2μL
		10×PCR buffer	5μL
ddH<sub>2</sub>O	34.5μL

PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性0.5min、51℃退火0.5min、72℃延伸1.5min，共35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。

PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，测序由北京擎科生物技术有限公司完成，序列利用RDP数据库和NCBI数据库进行BLAST分析。

16S rDNA扩增产物为1400bp左右，测序获得菌株BCCX15的16S rRNA基因序列(1411bp)如SEQ ID NO:3所示(具体见序列表)。

基因比对结果显示，菌株BCCX15的16S rRNA基因序列与Bacillus aryabhattaistrain B8W22 16S ribosomal RNA gene(EF114313.2)序列相似性为100％；Bacillusmegaterium strain IAM 13418 16S ribosomal RNA gene(D16273.1)序列相似性为99.57％；Bacillus megaterium strain ATCC14581 16S ribosomal RNA gene(NR117473.1)序列相似性为99.79％。

2.2gyrB基因序列的测定

由于16s rDNA基因的高度保守性，对相似率高的近缘种无法做到进一步区分，而编码促旋酶亚基B基因(gyrase subunit B gene，gyrB)能区分大部分细菌的近缘种，成为鉴定近缘种的重要有效靶标。本发明采用gyrB基因序列的分析对菌株BCCX15做进一步地鉴定。

设计并合成以下gyrB基因扩增引物为：

gyrB1F：5'-CAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'(SEQ ID NO:4)

gyrB2R：5'-CCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'(SEQ ID NO:5)

其中，Y为C或者T，N为A、T、C或者G，R为A或者G。

PCR反应体系(50μL)如下表4：

表4gyrB基因PCR扩增反应体系

细菌基因组DNA	2.0μL
		TaqDNA聚合酶	0.5μL
dNTPs(2mmol/L)	4μL
		引物gyrB1F(10μM)	2μL
引物gyrB2R(10μM)	2μL
		10×PCR buffer	5μL
ddH<sub>2</sub>O	34.5μL

PCR扩增条件为：95℃4min；94℃30s，48℃0.5min，72℃2min，35个循环；72℃10min。扩增结束后，取5μL PCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测，测序由北京擎科生物技术有限公司完成，序列利用NCBI数据库进行BLAST分析。

gyrB基因扩增产物为1100bp左右，测序获得菌株BCCX15的gyrB基因序列(1059bp)，如SEQ ID NO:6所示(具体见序列表)。

将测序所获得的菌株BCCX15的gyrB基因序列与GenBank数据库中的已有序列进行BLAST比对分析，发现该序列与该序列与Bacillus megaterium strain10245gyrB gene序列(EU711066.1)相似性为99.62％,与Bacillus megaterium strain ATCC 14581DNAgyrase subunit B(gyrB)gene(JN575335.1)相似性为99.24％。

结合菌株的形态学特征、生理生化特性和基因序列比对结果，最终将菌株BCCX15鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。将筛选到的巨大芽孢杆菌BCCX15于2018年10月18日保藏于：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.18007，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，请求保藏单位为青岛农业大学。

实施例3巨大芽孢杆菌BCCX15菌体的培养条件

设初始pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，接种量分别为1％、3％、5％、7％、9％，装瓶量分别10％、20％、30％、40％、50％，每处理3次重复，在加富牛肉膏蛋白胨液体培养基中28℃、140rpm条件下振荡培养24-72h取样，测定OD600值，研究不同初始pH值、接种量、装瓶量对菌体数量的影响。结果表明，加富牛肉膏蛋白胨液体培养基的初始pH值调节为7.5、接种量为3％、装瓶量为10％时有利于菌体生长，菌体数量最大，为最优培养条件。

进一步比较最优培养条件和常规培养条件下菌体的生长情况，试验采用250mL三角瓶，28℃、140rpm振荡培养；常规培养条件为牛肉膏蛋白胨液体培养基的初始pH值为7.2、接种量为1％、装瓶量均为20％。不同处理分别在6h、12h、24h、36h、48h、60h、66h、72h取出3瓶作为待检样品，4℃保存。取样完成后将待检样品用灭菌水按10倍梯度系列稀释至10^-7、10^-8、10^-9，分别取0.1mL待检样品稀释液涂布牛肉膏蛋白胨琼脂平板，28℃恒温培养48h，进行菌落计数，3次重复。

试验结果表明，发酵条件优化前细菌生长较慢；优化发酵条件后细菌生长迅速，在24h时活菌数量最大，达到2.3×10¹⁰CFU/mL，是常规培养活菌数量的12.6倍。

实施例4巨大芽孢杆菌BCCX15菌剂的制备

将加富牛肉膏蛋白胨液体培养基加入全自动机械搅拌通风发酵罐中，装料系数65％，121℃灭菌30min，以体积比为液体培养基1％～9％的接种量接种培养16～18h的种子液，pH值调整为6.5～9.5，15～30h条件下培养，搅拌速度为150～280r/min，通气量为1:1v/v min～1:2v/v min，以豆油为消泡剂自动控制消泡，罐的压力控制在0.03～0.05MPa，发酵培养24～72h。发现按3％的接种量接入培养16～18h的种子液，250r/min，28℃发酵，发酵过程中通气量(V/V·min)1:1.2，控制pH为7.5，发酵24h，发酵液中BCCX15活菌数量较高，为4.4～7.8×10¹⁰CFU/mL；发酵60h，发酵液中BCCX15芽孢率为85.1～91.2％。

用无菌水将发酵60h的BCCX15发酵液调整到1×10⁹CFU/mL，即得BCCX15液体菌剂，将BCCX15液体菌剂按1:1(V:W)加入灭菌的麸皮吸附，35℃～40℃通风干燥后即得BCCX15固体菌剂。

实施例5：巨大芽孢杆菌BCCX15防治小麦胞囊线虫

潍麦8号小麦种子用1％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水冲洗，25℃保湿催芽。将小麦胞囊线虫病田土壤去除大土块混匀装盆，每盆3kg，播种催芽的小麦种子，每盆15粒。处理为每盆浇50mL BCCX15液体菌剂；药剂对照为每盆病土均匀拌入0.06g噻唑膦，然后播种；空白对照每盆浇入50mL水；5次重复。10月中旬播种，置于室外环境中，肥水管理同常规生产，第二年六月初调查小麦的发病及生长情况，统计孢囊减退率。利用DPS v7.5(DataProcessing System)软件采用Duncan氏新复极差法进行统计分析。

试验结果见表5，BCCX15处理能显著地增加小麦的茎叶鲜重、株高、根鲜重，促进小麦的生长；有效降低土壤中胞囊的数量，孢囊减退率达到64.2％，防病效果显著优于化学杀线剂噻唑膦。

表5 BCCX15对小麦胞囊线虫和小麦生长的影响

实施例6：BCCX15防治网纹瓜根结线虫

试验在山东即墨移风店蔬菜根结线虫危害严重的温室大棚中进行，供试作物为网纹瓜，品种为阿姆斯，小区试验，试验设A(BCCX15液体菌剂)、B(10％噻唑膦颗粒剂)和CK(对照)3个处理，A处理于网纹瓜移栽前穴施1×10⁹CFU/mL BCCX15液体菌剂60mL、B处理于网纹瓜移栽前混土撒施2kg/666.7m²的10％噻唑膦颗粒剂，对照区移栽前不处理。4月5日移栽，大垄双行，垄距90cm，株距50cm，12.6m²/区；3次重复。滴灌，常规田间管理，移栽后1个月取样调查网纹瓜生长情况、根结线虫根结指数，评价防治效果，收获前根据植株地上部生长情况调查统计病死株率。根结严重度分0～10级，利用DPS v7.5(Data Processing System)软件采用Duncan氏新复极差法进行统计分析。

相对防治效果(％)＝(对照区根结指数－处理区根结指数)/对照区根结指数×100

或相对防治效果(％)＝(对照区病死株率－处理区病死株率)/对照区病死株率×100

试验结果见表6，BCCX15处理网纹瓜株高和植株鲜重显著高于对照，能促进网纹瓜生长；BCCX15处理根结指数显著低于对照，防病效果显著

表6 BCCX15菌剂对网纹瓜生长影响和根结线虫病的防治效果

实施例7：BCCX15防治花生根结线虫盆栽试验

盆栽试验在青岛农业大学温室进行，供试作物为花生，品种为花育22号，盆栽试验，盆栽用土为花生根结线虫重病田土壤，花盆直径32cm。试验设A(BCCX15液体菌剂)、B(10％噻唑膦颗粒剂)和CK(对照)3个处理，A处理于花生播种前灌1×10⁹CFU/mL BCCX15液体菌剂50mL/盆、B处理于花生播种前混土撒施0.3g/盆的10％噻唑膦颗粒剂，对照区播种前不处理，8粒花生/盆；5次重复。播种后逐月取样调查花生叶绿素含量、株高、株重、根长、根重、根结指数6个指标。利用DPS v7.5(Data Processing System)软件采用Duncan氏新复极差法进行统计分析。

相对防治效果(％)＝(对照区根结指数－处理区根结指数)/对照区根结指数×100。

表7 BCCX15对花生叶片叶绿素含量的影响

表8 BCCX15对花生根结线虫病的防治效果

由表7可以看出，经BCCX15处理的花生植株叶绿素含量明显高于对照，植株整体比对照矮壮一些，有利于花生抗倒伏；由表8可以看出，CX-15对花生根结线虫具有良好的防效，与药剂处理相比差异不显著。

实施例8：BCCX15防治花生根结线虫田间试验

田间试验设A(BCCY15固体菌剂5kg/667m²)、B(10％噻唑膦颗粒剂2kg/667m²)和CK(空白对照)3个处理，采用田间小区试验，3次重复；试验地点为山东海阳花生根结线虫重病田，花生品种为花育36，春播大垄双行覆膜，51m²/区；处理区A、B于花生播种前沟施，对照区于花生播种前沟施灭菌的麸皮5kg/667m²，5月上旬播种，常规田间管理，收获前调查线虫危害情况。采用对角线五点取样，每点调查6穴，分级标准采用国家标准GB/T 17980.38-2000。

试验结果表明，BCCY15菌剂可有效降低花生根结线虫病的发病率和病情指数，防效显著，与对照药剂噻唑膦比差异不显著，同时具有良好的增产作用(表9)。

表9 BCCY22菌剂对花生根结线虫病的防治效果和增产作用

综上所述，BCCX15菌剂对小麦胞囊线虫病、网纹瓜根结线虫病、花生根结线虫的防治效果显著，并且BCCX15菌剂的防治持效期比化学药剂更长和持久，不污染环境，此外，还具有一定的促进作物生长和增产作用，具有广阔的开发和应用前景。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 一种防治植物线虫病害的巨大芽孢杆菌及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 2

tacggytacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1411

<212> DNA

<213> 巨大芽胞杆菌 BCCX15的16S rDNA 基因(16S rDNA of Bacillus megaterium)

<400> 3

agtcgagcga actgattaga agcttgcttc tatgacgtta gcggcggacg ggtgagtaac 60

acgtgggcaa cctgcctgta agactgggat aacttcggga aaccgaagct aataccggat 120

aggatcttct ccttcatggg agatgattga aagatggttt cggctatcac ttacagatgg 180

gcccgcggtg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcatagcc 240

gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg 300

cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga 360

tgaaggcttt cgggtcgtaa aactctgttg ttagggaaga acaagtacga gagtaactgc 420

tcgtaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480

aatacgtagg tggcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggcggttt 540

cttaagtctg atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg gtcattggaa actggggaac 600

ttgagtgcag aagagaaaag cggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg 660

aggaacacca gtggcgaagg cggctttttg gtctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg 720

tggggagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt 780

gttagagggt ttccgccctt tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag 840

tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat 900

gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaactc 960

tagagataga gcgttcccct tcgggggaca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc 1080

cagcatttag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat 1140

gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac 1200

aaagggctgc aagaccgcga ggtcaagcca atcccataaa accattctca gttcggattg 1260

taggctgcaa ctcgcctaca tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1320

ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac 1380

ccgaagtcgg tggagtaacc gtaaggagct a 1411

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 4

caygcnggng gnaarttyga 20

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Synthetic sequence)

<400> 5

ccrtcnacrt cngcrtcngt cat 23

<210> 6

<211> 1059

<212> DNA

<213> 巨大芽胞杆菌 BCCX15 的gyrB基因( gyrB gene of BacillusmegateriumBCCX15)

<400> 6

tttctacctc tttggaagtg tacgtacatc gtgatggtaa agttcattat caaaaatatg 60

aacgaggtgt accggctgct gacttaaaag tagttggaga aacagataaa acaggtactg 120

ttattcaatt ccatccagac ggcgaaattt ttacagaaac gcttgaatac gattttgata 180

cgttagctaa tcgtctgcgt gagttagctt tcttaaatcg cggtattaaa attacgattg 240

aagacaaacg tgaagaagat aaaagacgtg agtatcacta tgaaggcgga attaagtctt 300

acgttgaaca cttaaaccgt gcaaaagaag taattcacga agagccgatc tatattgaag 360

gtaatcgaga caacatttct gtagaaattg ctattcaata taacgatagc tatacaagta 420

atttatattc ttttgcaaac aacattcaca catatgaagg tggaacgcac gaagcaggat 480

ttaaaacagc gttaacgcgt gtaattaacg actatgcacg taaaaacagc gtatttaaag 540

acagtgatgc caatctaacg ggtgaagatg ttcgtgaagg aattacagct atcatctcta 600

ttaagcaccc agatccgcag tttgaaggac aaacaaaaac aaagctggga aatagtgaag 660

caagaacaat tactgactct gtgtttgcag aacacttaga aacgtacttg ctagagaacc 720

ctattgtggc gaaaaaggta attgaaaaag gtttaatggc tgcaagagca agaatggcag 780

ctaaaaaagc tcgtgagctt acaagacgta aaagcgcgct tgaaatctca aacttaccgg 840

gtaaattagc agattgttca tcaaaagatc cttctattag cgaactctat gtagtagagg 900

gtgactctgc cggaggatca gctaagcagg gaagaagccg tcatttccaa gctattttgc 960

ctttacgggg taaaattatc aacgtagaga aagcccgttt agataaaatt ttatctaata 1020

acgaaattcg tacaatcatt accgctctag gaacgggta 1059

Claims

1.防治植物线虫病害的巨大芽孢杆菌，其特征在于：巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatherium)BCCX15，其保藏编号是：CGMCC NO.18007；其为菌体杆状，其长度为3.49um～6.49um、宽度为1.10um～1.50um，呈链状排布；产芽孢、芽孢中生，短柱状，革兰氏染色反应阳性；所述巨大芽孢杆菌能利用蔗糖，不能利用乳糖，柠檬酸盐试验、淀粉水解试验、明胶水解、酪氨酸水解、接触酶试验反应都为阳性；吲哚试验、甲基红试验和伏普试验反应都为阴性。

2.一种如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，所述培养方法为：利用牛肉膏蛋白胨液体培养基对巨大芽孢杆菌进行接种并培养，其中，培养条件为：培养基的初始pH值为5.5～9.5，巨大芽孢杆菌的接种量1％～9％，培养温度为23.5℃～41.5℃，培养基的装瓶量为10％～50％。

3.根据权利要求2所述的巨大芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，采用加富牛肉膏蛋白胨液体培养基，BCCX15的最优发酵条件为pH7.5、接种量3％、10％的装瓶量、24h的培养时间，活菌数达到2.3×10¹⁰CFU/mL。

4.一种如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌的菌剂，其特征在于，所述菌剂采用巨大芽孢杆菌BCCX15发酵培养制备得到，菌剂为液体或者固体。

5.一种如权利要求4所述的巨大芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)发酵罐发酵培养基用加富牛肉膏蛋白胨液体培养基，装料系数为50-80％；

(3)发酵过程中通气量(V/V·min)1:1～2，控制pH为5.5～9.5，发酵24～72h，得到发酵液；发酵60h活菌数为4.4×10¹⁰CFU/mL～7.8×10¹⁰CFU/mL，芽孢率为85.1％～91.2％；

(4)用无菌水将上述发酵液调整到1×10⁹CFU/mL，即得巨大芽孢杆菌的液体菌剂；将所述液体菌剂按1:1(V:W)加入灭菌的麸皮吸附，35℃～40℃通风干燥后即得巨大芽孢杆菌固体菌剂。

6.如权利要求4所述的巨大芽孢杆菌菌剂在防治植物线虫病害中的应用。

7.根据权利要求6所述的巨大芽孢杆菌菌剂在防治植物线虫病害中的应用，其特征在于，所述植物线虫病害是小麦胞囊线虫病、花生根结线虫病、网纹瓜根结线虫病、番茄根结线虫病、黄瓜根结线虫病。

8.根据权利要求7所述的巨大芽孢杆菌菌剂在防治植物线虫病害中的应用，其特征在于，用于防治网纹瓜根结线虫病、番茄根结线虫病、黄瓜根结线虫病时，于移栽前穴施巨大芽孢杆菌的液体菌剂，施用剂量为60-70mL/穴。

9.根据权利要求7所述的巨大芽孢杆菌菌剂在防治植物线虫病害中的应用，其特征在于，用于防治小麦胞囊线虫病、花生根结线虫病时，混土施用巨大芽孢杆菌的固体菌剂，施用剂量为5kg/667m²～7kg/667m²。