CN111705021B - 一种花椒芽孢杆菌菌株及其菌剂和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种花椒芽孢杆菌菌株及其菌剂和应用，本发明的一种花椒芽孢杆菌菌株，该菌株为花椒芽孢杆菌1433菌株；保藏名称为花椒芽孢杆菌Bacillus zanthoxyli 1433；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2018年06月14日；保藏编号：CCTCC No.M 2018369。本发明的根结线虫诱吸剂具有成本低、无残留、对人畜安全的特点，能显著提高常规杀线虫农药的防效效果。

Description

一种花椒芽孢杆菌菌株及其菌剂和应用
技术领域
本发明涉及植物病害防治技术领域，尤其涉及一种花椒芽孢杆菌菌(Bacilluszanthoxyli)1433菌株及其菌剂和在防治植物根结线虫病中的应用。
背景技术
植物寄生性线虫是威胁农业生产的主要病原物之一，在世界范围内每年造成高达1570亿美元的经济损失(Elling，2013)。我国地处亚温两带，耕作制度纷杂，复种指数高，植物种类繁多，各种线虫发生和危害严重，尤以根结线虫(Meloidogyne spp.)对农作物危害最重，分布范围最广，我国农作物每年因根结线虫的危害而遭受的经济损失达数亿元以上(Ye et al.，2019)，根结线虫的二龄幼虫是侵染作物的唯一虫态，其分泌的蛋白类物质能诱发植物根细胞增生成巨大细胞，进而堵塞植物吸收营养和水分的导管，引起作物生长不良、萎蔫、枯死等症状(卢志军，2012)，因此对根结线虫的防治刻不容缓。对于根结线虫的防治，历来以化学药剂为主，但化学杀线虫剂对环境污染严重,使用过程中对人畜也不安全，很多高毒的化学杀线剂已被禁用。利用线虫天敌微生物研发的生物杀线剂凭借其对环境生态的相容性及人畜健康的安全性和其可持续发展的特性被认为是最具发展前景的植物根结线虫病害防治手段，引起了世界各国科研人员的广泛关注(Li et al.，2015；Silva etal.，2019)。
根结线虫在土壤中呈无规律的不均匀分布，这给防治带来了极大的困难。当土壤中线虫虫口密度很大时无论是化学杀线剂还是生物杀线剂均难以取得良好的防治效果。针对线虫在土壤中分布不均分布造成的防治困难，基于诱杀害虫的生防策略，将对线虫具有吸引作用的吸引剂与具有毒杀作用的杀线剂配合使用，可大幅度减少杀线剂的使用剂量，还可有效提高杀线剂的毒杀作用，这为线虫的综合生物防治开拓了新的研究思路。
嗅觉趋化性(Olfactive chemotaxis)是线虫通过嗅觉感知环境中的挥发物产生趋向或远离的行为，也是线虫寻找、追踪食物，分辨食物与危险，远离病原菌和危险环境的主要途径(Bargmann and Horvitz，1991)。细菌产生的挥发性有机物质是细菌次生代谢产物的重要组成部分，是细菌与周围各种生物进行交流的重要信息物质(Audrain et al.，2015；Kanchiswamy et al.，2015)。细菌挥发物作为线虫嗅觉趋化性物质，吸引线虫靠近或使线虫避让细菌，这类挥发物在细菌与植物寄生线虫间的互作关系中非常关键(Bargmann，1993)，具有潜在的价值及其作为研发植物寄生线虫生防制剂的珍贵资源。
花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株是本发明人等报道的一细菌新种(Ma etal.，2017)。本发明人等在近期的研究中首次发现此菌株在常规培养基上能产生尿素，对番茄、烤烟等作物具有显著的促进生长的作用，是研发生物肥料的重要菌株(专利：一株产尿素细菌及其应用，专利申请号：20180812205.8)，而该细菌对根结线虫的诱吸功能、是否能产生挥发性吸引线虫物质及其在线虫防治中的应用至今未见公开报道。
目前，缺乏一种从花椒叶片分离得到的能产生挥发性、吸引线虫活性成分的花椒芽孢杆菌菌株及其菌剂和应用。
发明内容
为了克服现有防治技术的不足，本发明提供了一株从花椒叶片分离得到的能产生挥发性、吸引线虫活性成分的花椒芽孢杆菌菌株及其菌剂和应用。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：本发明的该菌株为花椒芽孢杆菌1433菌株；保藏名称为花椒芽孢杆菌B.zanthoxyli；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2018年06月14日；保藏编号：CCTCC No.M 2018369。
进一步地，所述的花椒芽孢杆菌菌株为革兰氏阳性菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，32℃下培养2天，菌落直径2-5mm，淡黄色；细胞圆杆状，宽0.6-0.9μm，长1.2-1.5μm，细胞具游动性，该菌株在4-45℃的温度范围内生长，最适生长温度32℃；在pH 6.0-10.0的范围内生长，最适生长pH为7.2；耐受NaCl的最高浓度为7％(W/V)。
本发明所述的花椒芽孢杆菌制备的花椒芽孢杆菌菌剂。
进一步地，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的花椒芽孢杆菌的发酵培养物；
(b)所述的花椒芽孢杆菌细胞的超声裂解上清；
(c)所述的花椒芽孢杆菌细胞的超声裂解沉淀。
进一步地，所述的花椒芽孢杆菌菌剂为根结线虫诱吸剂。
本发明所述根结线虫诱吸剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)花椒芽孢杆菌B.zanthoxyli 1433菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到常规牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，30～37℃下培养2～3天后获得斜面种子；
(2)B.zanthoxyli 1433菌株液体种子的液体培养：将斜面种子接种到三角瓶中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32℃，200rpm条件下摇床培养2天；
(3)B.zanthoxyli 1433菌株发酵罐大量培养：将液体种子按V/V为5‰的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在10-10000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度200rpm，发酵时间4天；
(4)诱吸剂的制备：经发酵罐培养获得的B.zanthoxyli 1433菌株菌体及其代谢物经过喷雾干燥获B.zanthoxyli1433菌体原粉，将B.zanthoxyli 1433菌体原粉加入糖蜜中，需保证B.zanthoxyli 1433菌株在糖蜜中的活菌数含量在6×109个/毫升以上，搅拌均匀后用氢氧化钠稀溶液将pH调至7.0，制得根结线虫诱吸剂。
本发明所述的根结线虫诱吸剂在诱吸土壤中根结线虫二龄幼虫中的应用。
进一步地，根结线虫诱吸剂与噻唑膦化学农药混配后在防治根结线虫病中的应用。
本发明所述的B.zanthoxyli 1433菌株，利用固相微萃取联合气相色谱质谱联用技术(solid-phase microextractionand gas chromatography-mass spectroscopy，SPME-GC/MS)检测产生的挥发性酮类物质十三烷酮在诱吸根结线虫二龄幼虫中的应用。
本发明所述的花椒芽孢杆菌株在制备防治根结线虫病的药物中的应用。
有益效果：本发明的根结线虫诱吸剂具有成本低、无残留、对人畜安全的特点，能显著提高常规杀线虫农药的防效效果。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明所分离的花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株能产生挥发性酮类物质十三烷酮，该物质具有吸引根结线虫的效果。诱吸剂对一平方米内土壤中根结线虫二龄幼虫的诱吸率在70％以上。诱吸剂与噻唑膦化学农药混配使用，提高了防治根结线虫病的效果。
(2)本发明所分离获得的花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株能产生吸引根结线虫二龄幼虫的挥发性活性成分。从花椒叶片分离得到的能产生挥发性、吸引线虫活性成分的，利用固相微萃取联合气相色谱质谱联用技术检测产生的挥发性物质，通过比对质谱仪中NIST MS Search 2.0数据库来鉴定挥发性物质，结果共鉴定出了26种有效成分，其中，以十三烷酮为主要成分。
(3)通过趋化试验表明，本发明花椒芽孢杆菌1433菌株对根结线虫二龄幼虫有强吸引作用，所产生的挥发性酮类产物十三烷酮对根结线虫二龄幼虫有显著吸引效果。
附图说明
下面将结合附图进一步说明，附图中：
图1为本发明的所分离的花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株诱吸线虫趋化平板实验图。
图2为本发明分析本发明所分离的花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株的挥发性成分的质谱图。
图3为本发明的趋化实验示意图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。
实施例1
本发明的一种花椒芽孢杆菌菌株，该菌株为花椒芽孢杆菌1433菌株；保藏名称为花椒芽孢杆菌B.zanthoxyli；保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2018年06月14日；保藏编号：CCTCC No.M 2018369。
所述的花椒芽孢杆菌菌株为革兰氏阳性菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，32℃下培养2天，菌落直径4mm，淡黄色；细胞圆杆状，宽0.6μm，长1.5μm，细胞具游动性，该菌株在4℃的温度范围内生长，最适生长温度32℃；在pH 10.0的范围内生长，最适生长pH为7.2；耐受NaCl的最高浓度为7％(W/V)。
本发明所述的花椒芽孢杆菌制备的花椒芽孢杆菌菌剂。
其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的花椒芽孢杆菌的发酵培养物；
(b)所述的花椒芽孢杆菌细胞的超声裂解上清；
(c)所述的花椒芽孢杆菌细胞的超声裂解沉淀。
所述的花椒芽孢杆菌菌剂为根结线虫诱吸剂。
本发明所述根结线虫诱吸剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)花椒芽孢杆菌B.zanthoxyli 1433菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到常规牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，35℃下培养2.5天后获得斜面种子；
(2)B.zanthoxyli 1433菌株液体种子的液体培养：将斜面种子接种到三角瓶中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32℃，200rpm条件下摇床培养2天；
(3)B.zanthoxyli 1433菌株发酵罐大量培养：将液体种子按V/V为5‰的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在10-10000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度200rpm，发酵时间4天；
(4)诱吸剂的制备：经发酵罐培养获得的B.zanthoxyli 1433菌株菌体及其代谢物经过喷雾干燥获B.zanthoxyli 1433菌体原粉，将B.zanthoxyli 1433菌体原粉加入糖蜜中，需保证B.zanthoxyli 1433菌株在糖蜜中的活菌数含量在6×109个/毫升以上，搅拌均匀后用氢氧化钠稀溶液将pH调至7.0，制得根结线虫诱吸剂。
本发明所述的根结线虫诱吸剂在诱吸土壤中根结线虫二龄幼虫中的应用。
本发明所述的根结线虫诱吸剂与噻唑膦化学农药混配后在防治根结线虫病中的应用。
本发明所述的B.zanthoxyli 1433菌株，利用固相微萃取联合气相色谱质谱联用技术(solid-phase microextractionand gas chromatography-mass spectroscopy，SPME-GC/MS)检测产生的挥发性酮类物质十三烷酮在诱吸根结线虫二龄幼虫中的应用。
本发明所述的花椒芽孢杆菌株在制备防治根结线虫病的药物中的应用。
实施例2
实施例2与实施例1的区别在于：本发明所述的花椒芽孢杆菌菌株为革兰氏阳性菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，32℃下培养2天，菌落直径2mm，淡黄色；细胞圆杆状，宽0.8μm，长1.3μm，细胞具游动性，该菌株在45℃的温度范围内生长，最适生长温度32℃；在pH 6.0的范围内生长，最适生长pH为7.2；耐受NaCl的最高浓度为7％(W/V)。
本发明所述根结线虫诱吸剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)(1)花椒芽孢杆菌B.zanthoxyli 1433菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到常规牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，30℃下培养2天后获得斜面种子；
(2)B.zanthoxyli 1433菌株液体种子的液体培养：将斜面种子接种到三角瓶中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32℃，200rpm条件下摇床培养2天；
(3)B.zanthoxyli 1433菌株发酵罐大量培养：将液体种子按V/V为5‰的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在10-10000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度200rpm，发酵时间4天；
(4)诱吸剂的制备：经发酵罐培养获得的B.zanthoxyli 1433菌株菌体及其代谢物经过喷雾干燥获B.zanthoxyli 1433菌体原粉，将B.zanthoxyli 1433菌体原粉加入糖蜜中，需保证B.zanthoxyli 1433菌株在糖蜜中的活菌数含量在6×109个/毫升以上，搅拌均匀后用氢氧化钠稀溶液将pH调至7.0，制得根结线虫诱吸剂。
实施例3
实施例3与实施例1的区别在于：本发明所述的花椒芽孢杆菌菌株为革兰氏阳性菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，32℃下培养2天，菌落直径5mm，淡黄色；细胞圆杆状，宽0.9μm，长1.2μm，细胞具游动性，该菌株在40℃的温度范围内生长，最适生长温度32℃；在pH 10.0的范围内生长，最适生长pH为7.2；耐受NaCl的最高浓度为7％(W/V)。
本发明所述根结线虫诱吸剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)(1)花椒芽孢杆菌B.zanthoxyli 1433菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到常规牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，37℃下培养3天后获得斜面种子；
(2)B.zanthoxyli 1433菌株液体种子的液体培养：将斜面种子接种到三角瓶中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32℃，200rpm条件下摇床培养2天；
(3)B.zanthoxyli 1433菌株发酵罐大量培养：将液体种子按V/V为5‰的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在10-10000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度200rpm，发酵时间4天；
(4)诱吸剂的制备：经发酵罐培养获得的B.zanthoxyli 1433菌株菌体及其代谢物经过喷雾干燥获B.zanthoxyli 1433菌体原粉，将B.zanthoxyli 1433菌体原粉加入糖蜜中，需保证B.zanthoxyli 1433菌株在糖蜜中的活菌数含量在6×109个/毫升以上，搅拌均匀后用氢氧化钠稀溶液将pH调至7.0，制得根结线虫诱吸剂。
实施例4
本发明中花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株的分离与鉴定
(1)分离和鉴定方法
利用分离内生细菌的常规方法从从采自甘肃省陇南市的花椒叶片中分离到B.zanthoxyli 1433菌株；利用细菌16S rRNA基因扩增通用引物(5’-GGT TAC CTTGTTACGACT T-3’，5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTCAG-3’)经PCR扩展B.zanthoxyli 1433菌株的DNA，获得其16S rRNA基因序列并提交到GeneBank公共数据库获得相应序列号为KX865140，此序列是鉴定该菌株的主要特征依据，利用多相分类方法将分离自花椒叶片的1433菌株鉴定为新种。
(2)鉴定结果
本发明人采用内生细菌常规分离方法，从采自甘肃省陇南市的花椒叶片中获得了一株内生细菌1433菌株，鉴定为花椒芽孢杆菌(Bacilluszanthoxyli)(Ma et al.,2017)。花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株已于2018年6月14日保存于中国典型培养物保藏中心；保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏号：CCTCC No:M 2018369。
该菌株为革兰氏阳性菌，在传统的牛肉膏蛋白胨培养基上，32℃下培养2天，菌落直径2-5mm，淡黄色；细胞圆杆状，宽0.6-0.9μm，长1.2-1.5μm，细胞具游动性。该菌株在4-45℃的温度范围内生长，最适生长温度32℃；在pH 6.0-10.0的范围内生长，最适生长pH为7.2；耐受NaCl的最高浓度为7％(W/V)。利用引物5’-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’，5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’经PCR扩增该菌株的16S rRNA基因，获得的序列提交到GeneBank公共数据库，其序列号为KX865140，此序列是鉴定该菌株的分子特征依据。1433菌株的主要脂肪酸为异式十五碳饱和脂肪酸，占31.6％，是鉴别该菌的化学特征依据。
本发明中花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株诱吸剂的制备
本发明的生物诱吸剂经如下步骤得到：
(1)B.zanthoxyli 1433菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到常规牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，32℃下培养2天后获得斜面种子；
(2)B.zanthoxyli 1433菌株液体种子的液体培养：将斜面种子接种到三角瓶中的常规牛肉膏蛋白胨液体培养基中，32℃，200rpm条件下摇床培养2天；
(3)B.zanthoxyli 1433菌株发酵罐大量培养：将液体种子按V/V为5‰的比例接入发酵罐中的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在10-10000升发酵罐中的培养条件控制在：温度32℃，搅拌速度200rpm，发酵时间4天；
(4)诱吸剂的制备：经发酵罐培养获得的B.zanthoxyli 1433菌株菌体及其代谢物经过喷雾干燥获B.zanthoxyli 1433菌体原粉，将B.zanthoxyli 1433菌体原粉加入糖蜜中，需保证B.zanthoxyli 1433菌株在糖蜜中的活菌数含量在6×109个/毫升以上，搅拌均匀后用氢氧化钠稀溶液将pH调至7.0，制得该根结线虫诱吸剂。
试验例1
花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株的挥发性产物的SPME-GC/MS分析
(1)分析方法
取样及固相萃取：花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株接种于100mLNB培养液，32℃震荡(200rpm)培养2d获得发酵液，移取8mL发酵液加入15mL固相微萃取瓶中，放入磁石进行搅拌，将平衡后的DVB/CAR萃取头插入萃取瓶，压下活塞使纤维头伸出，暴露于样品上层空气中，磁力搅拌器上40℃条件下固相微萃取1h。
进样及GC/MS分析：将萃取头从顶空瓶中取出，插入进样孔中，然后将萃取头调出，停留40s后拔出萃取头，使用DB-wax石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；载气为He，流速1.0mL/min；进样口温度250℃；炉温：起始40℃，保持2.5min，以5℃/min的升温速度升至200℃，再以10℃/min的升温速度升至240℃，保持5min；分流进样，分流比10:1；质谱扫描范围是33～350amu；EI离子源；光电倍增管(PMT)电压230V，电子能量70EV；温度170℃；扫描时间0.3s，扫描间隔0.2s。通过比较质谱仪中NIST MS Search 2.0数据库来鉴定挥发性物质。
试验例2
SPME-GC/MS分析结果
通过GC-MS分析了花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株的挥发性物质成分，从质谱图(图2)中可知共鉴定出了26种主要的挥发性有机成分(见表1)，其中，以十三烷酮(2-tridecanone)为主要成分，GC/MS分析花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株发酵液如表1所示，
表1
Figure GDA0003886441710000121
Figure GDA0003886441710000131
试验例3
花椒芽孢杆菌(B.zanthoxyli)1433菌株的诱吸根结线虫活性分析
(1)南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)二龄幼虫的制备：从云南省峨山县化念镇的大棚番茄中采集感染线虫的根瘤，从根瘤中挑取卵囊于培养皿中，加入1％的次氯酸钠溶液降解卵囊壁使卵粒游离出来，然后将培养皿至于28℃的温箱中孵化2-3天。利用贝曼漏斗法(将样品用3层擦镜纸包裹，置于漏斗中，漏斗下端接一长度约50厘米的塑料管，塑料管末端用夹子夹住，在漏斗中加满水，放置24小时候从塑料管放出200ml左右的水，即得线虫悬液。)分离获得大量的二龄龄幼虫，通过离心沉淀和解剖镜下的线虫计数，将线虫悬液浓度调整到约1000条/毫升，4℃保存备用。
(2)趋化平板实验：按照趋化实验示意图(图3)，在1％水琼脂平板两端180度角处分别做样品(+)和对照(-)的标记；将平板用记号笔划线分为三个区域，分别为：样品区、对照区和中间区域。移取10μL线虫液(约100条)滴加在培养皿中间区，与两标记的地方等距；待线虫分散开来后，移取10μL样品菌液或是适宜浓度的十三烷酮化合物溶液滴加在样品区，移取10μL对照液(空白液体培养基)滴加在对照区，密封培养皿，每一种菌液做三次平行，置于22℃恒温箱、黑暗放置2h后观察统计。
细菌或化合物吸引线虫的活性用诱吸指数(CI)值表示：CI＝(样品线虫条数-对照区线虫条数)/加入线虫总条数；CI值越高，表示对线虫的诱吸能力越强；CI≥0.5以上的视为强诱吸线虫活性，0.3≤CI＜0.5、0.1≤CI＜0.3、CI＜0.1分别为中等活性，弱活性以及无活性。
(3)趋化实验结果
从趋化实验结果可知，花椒芽孢杆菌1433菌株培养液在48h时的吸引南方根结线虫二龄幼虫的能力最强，趋化值达到0.58，但在72h时则没有显示出吸引活性。通过不同浓度的挥发性十三烷酮对南方根结线虫二龄幼虫趋化实验表明，十三烷酮对南方根结线虫二龄幼虫具有显著的吸引效果，其趋化值均高于对照组中异戊醇的趋化值，且在2.5mg/L浓度时的诱吸性最强(CI，0.37)。根结线虫对花椒芽孢杆菌1433菌株培养液的趋化值如表2所示，根结线虫对不同浓度挥发性十三烷酮的趋化值如表3所示，
表2
Figure GDA0003886441710000151
表3
Figure GDA0003886441710000152
试验例4
根结线虫诱吸剂对土壤中根结线虫的诱吸效果试验
(1)分析方法
取田间土壤，晒干后粉碎并过100目筛子，将过筛的细土经过高温湿热灭菌(121℃，灭菌2小时)以杀死土壤中原有的线虫。在室内灭菌土壤按长方形(长×宽＝1.4米×0.1米)铺在塑料布上，土壤厚度为15厘米。取1ml、3ml、5ml、7ml本发明制备的根结线虫诱吸剂(B.zanthoxyli 1433菌株的菌体含量为6.2×109个/毫升)分别滴加到棉球中，在上述条形土壤带的一端放入棉球并用土覆盖。在对照处理中用等量的无菌水替代线虫诱吸剂，其余操作相同。在距离棉球端1米位置的土壤中分别加入根结线虫悬液10毫升(约含线虫10000条)。加入线虫后的72小时取棉球及其附近20厘米范围内的土样约1000克，用贝曼漏斗法分离土壤中的线虫，在解剖镜下计数线虫数量，按下述公式计算线虫诱吸率：
线虫诱吸率(％)＝(处理的线虫数-对照的线虫数)/10000×100％
(2)试验结果
如表4所示，在土壤带一段分别加入本发明制备的根结线虫诱吸剂1ml、3ml、5ml、7ml，在距离棉球1米处加入线虫72小时时在棉球及其附近20厘米范围内土壤中分离到的线虫数量从4066条增加到5196条，诱吸率从39.53％提高到50.90％。线虫诱吸剂在加入分别剂量为5ml和7ml时对线虫的诱吸率分别为49.03％50.90％，二者无显著差异。因此，在田间应用时，本发明的线虫诱吸剂使用剂量以5毫升/株为宜。在此剂量下根部1米范围内约50％的土壤线虫可被诱吸到根部，便于杀灭。根结线虫诱吸剂对根结线虫二龄幼虫的诱吸效果如表4所示：
表4
Figure GDA0003886441710000171
试验例5
本发明的根结线虫诱吸剂提高噻唑膦对根结线虫病防效的试验
(1)供试药剂
a.根结线虫诱吸剂：本发明制备的根结线虫诱吸剂，B.zanthoxyli1433菌株的菌体含量为6.2×109个/毫升；推荐用量:8000毫升/亩。b.30％噻唑膦微囊悬浮剂：山东省联合农药工业有限公司生产；厂家推荐用量：1000毫升/亩。
(2)试验处理设置
处理1：30％噻唑膦微囊悬浮剂1000毫升，线虫诱吸剂8000毫升，将二者与10公斤细土充分混匀。处理2：10％噻唑膦颗粒剂2000克，线虫诱吸剂8000毫升，将二者与10公斤细土充分混匀。处理3：30％噻唑膦微囊悬浮剂1000毫升与10公斤细土充分混匀。处理4：10％噻唑膦颗粒剂2000克与10公斤细土充分混匀。处理5(空白对照)：15公斤细土。
(3)试验方法
试验地点为云南省峨山县化念镇大棚番茄地，前茬作物为番茄，根结线虫病严重。番茄移栽时，分别将处理1-5的药剂穴施到番茄根部，当番茄苗按2500株/亩的种植密度移栽时，处理1-5的施用剂量分别为：7.8克/株，8.2克/株，4.6克/株，5.2克/株，7克/株。每处理100株番茄，三个重复，重复间随机排列。番茄毛移栽时间为2019年5月03日，防效调查时间为2019年11月03日。调查防效时，从每处理的三个重复中各随机拔取50株番茄，获得的150株番茄作为该处理的调查样本。根瘤分级按0-5级进行(Oka et al.，Pest ManagSci.2012，68:268-275)，0级：无根瘤，1级：1-20％的根有根瘤，2级：21-40％的根有根瘤，3级：41–60％的根有根瘤，4级：61–80％的根有根瘤，5级：81-100％的根有根瘤。病情指数及防效的计算公式如下(Wang et al.，2012，Phytopathology 102:267-271)：
病情指数(％)＝(n1×1+n2×2+n3×3+n4×4+n5×5)/(S×5)×100n1-n5表示该根瘤级别的植株数量，S表示调查的植株总数。
防效(％)＝100(1-x/y)；x、y分别代表处理和对照的病情指数。
(4)试验结果：如表5所示，30％噻唑膦微囊悬浮剂(处理3)和10％噻唑膦颗粒剂(处理4)单独施用时对根结线虫病的防效分别为61.5％和58.2％；当这两种农药分别与本发明的根结线虫诱吸剂混合施用时，对根结线虫病的防效分别提高至83.6％(处理1)和78.9％(处理2)，防效分别提高了13.6％和12.2％。表明本发明的线虫诱吸剂能显著提高噻唑膦化学杀线虫农药对根结线虫的防治效果。根结线虫诱吸剂提高噻唑膦对根结线虫的防效结果如表5所示：
表5
Figure GDA0003886441710000181
Figure GDA0003886441710000191
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (2)

1.一种根结线虫诱吸剂的应用，该根结线虫诱吸剂由花椒芽孢杆菌制备，该菌株为花椒芽孢杆菌1433菌株；保藏名称为花椒芽孢杆菌(Bacillus zanthoxyli)1433；保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学；保藏日期：2018年06月14日；保藏编号：CCTCC No.M 2018369，其特征在于：所述根结线虫诱吸剂在诱吸土壤中根结线虫二龄幼虫中的应用。
2.根据权利要求1所述的根结线虫诱吸剂的应用，其特征在于，所述根结线虫诱吸剂与噻唑膦化学农药混配后用于防治根结线虫病。
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