CN118028177B - 一株花椒芽孢杆菌p1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株花椒芽孢杆菌P1及其应用，属于农业微生物技术领域。所述花椒芽孢杆菌P1的保藏编号为CGMCC No.29754，于2024年1月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明获得的菌株，可以使盐碱土壤中速效磷含量明显增加；本发明还提供了一种适于所述花椒芽孢杆菌P1发酵的液体培养基，利用该培养基可以快速大量的获得花椒芽孢杆菌P1，该菌株为盐碱农田土壤修复提供了优良的菌株资源，该菌株及其菌液具有较高的农业应用前景和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株花椒芽孢杆菌P1及其应用，属于农业微生物技术领域。
背景技术
土壤盐渍化导致耕地面积减少，对农业生产带来比较严重的损失，盐碱地治理对维持耕地稳定均具有重要战略意义。土壤盐渍化导致土壤结构被破坏、土壤有机质含量极低，进而导致土壤板结严重、作物出苗困难等现实问题。近年来，利用功能微生物改善土壤理化性质和改良土壤生态环境，对盐碱地农业产能提升具有较好的效果。因此选育高效实用的耐盐促生功能微生物资源具有重要意义。
微生物菌肥是通过具有活性的微生物自身生命活动或与植物相互作用为农作物提供生长发育所需要的营养元素。溶磷和解磷细菌可将难溶性的磷转化成可被植物直接吸收利用的磷元素，促进植物生长。常规农业微生物菌剂在高盐胁迫下难以生长代谢或生长极为缓慢，施入盐碱土壤中，不能发挥促生效果。因此，挖掘盐碱地本土耐盐促生功能微生物，并利用它们的促生功能，可有效改善植物菌群环境，增加土壤中速效营养元素，加速盐碱地的改良和修复，从而提高盐碱地土壤利用率。
高盐碱胁迫下，导致普通农作物生长困难，但确蕴含着大量耐盐碱微生物类群，丰富多样的耐盐促生菌群通过与植物的互作，为植物提供营养物质，并可有效缓解环境中盐离子对植物的毒害作用。目前可应用于实际生产的菌种资源依然比较贫乏，具有解磷和溶磷功能的高耐盐可培养微生物，特别是不仅可以在高盐度环境中生存，而且可以有效提高盐碱土壤利用率的花椒芽孢杆菌及其增加盐碱土壤速效磷中的应用还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株花椒芽孢杆菌(Bacillus zanthoxyli)P1。
本发明的另一目的为提供了上述花椒芽孢杆菌P1在增加盐碱土壤速效磷中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一株花椒芽孢杆菌P1，所述花椒芽孢杆菌P1的保藏编号为CGMCCNo. 29754，于2024年1月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明还提供了一种上述花椒芽孢杆菌P1在盐胁迫条件下增加盐碱土壤中速效磷的应用。
进一步的，应用过程中，所述盐胁迫是指土壤中盐浓度质量比不低于3‰的盐碱土壤。
本发明提供的花椒芽孢杆菌P1在盐胁迫条件下增加盐碱土壤中速效磷的应用过程中，具体包括以下步骤：
（1）将活化后的花椒芽孢杆菌P1种子液接种至发酵液体培养基中进行培养，获得含花椒芽孢杆菌菌悬液；
（2）将发酵制得的花椒芽孢杆菌菌悬液进行稀释，向盐碱土壤中施入稀释后的花椒芽孢杆菌菌悬液即可。
进一步的，步骤（1）中，所述接种为将活化后的花椒芽孢杆菌种子液按照体积比1~2%的接种量进行。
进一步的，步骤（1）中，所述花椒芽孢杆菌菌悬液的OD600值为0.4~0.8
进一步的，步骤（1）中，所述发酵液体培养基为每1000 mL自来水中含有葡萄糖10g，酵母粉1 g，氯化钠10 g，氯化钾0.5 g，磷酸钙3 g，卵磷脂3 g，硫酸亚铁0.05 g，硫酸镁0.1 g，pH调节至7.5~8.0。
进一步的，步骤（1）中，所述培养的条件为在28~32℃、180 rpm条件下培养24 -36h。
本发明筛选得到的花椒芽孢杆菌P1，其生物学特征是：菌体形态呈长杆状，单个，细胞大小为（0.4μm ~ 0.8 μm）×（3.0 μm ~ 5.0 μm），不产生孢子。28℃固体培养时菌落为规则的圆形，较小，乳白色，不透明，表面光滑湿润，易挑取，边缘整齐；其生理生化特征是：革兰氏染色阴性，好氧，最适生长温度为28~32℃，最适生长pH值为7.0~8.0，最适盐浓度为1~3%，具有解磷和溶磷特性。
对本发明所述花椒芽孢杆菌P1测定16S rRNA基因序列的结果显示，其基因长度为1488 bp，相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
通过使用美国生物工程信息中心（National Center for BiotechnologyInformation , NCBI）BLASTN 程序比对和系统发育分析确定本发明所述菌株P1与模式菌株花椒芽孢杆菌（Bacillus zanthoxyli）1433高度同源，序列相似度高达99.44%。选取同源性比较高的12条序列的16S rDNA序列作为参比对象，采用邻近法（Neighbour-Joining）运用Mega 7软件构建菌株P1与参比菌株之间的系统进化树。在进化树中，菌株P1与花椒芽孢杆菌（Bacillus zanthoxyli）1433形成单独的簇内进化分支（图6）。因此可以确定P1是一株花椒芽孢杆菌（Bacillus zanthoxyli）。
本发明所述花椒芽孢杆菌P1菌种选育的基本方法是：
从黄河三角洲自然保护区盐碱地采集盐地碱蓬根部土壤，取1g置于有机磷液体培养基中，于28~32℃ 180 rpm恒温振荡培养箱中富集培养48 h，梯度稀释涂布于有机磷固体培养平板上，28~32℃条件下静置培养，挑取单菌落于相同培养平板上，经两次纯化后获得菌种，甘油冻藏保菌。
本发明所述具有耐盐促生功能的花椒芽孢杆菌P1在增加土壤中速效磷含量中的应用，其中土壤中速效磷含量增加达51%。
本发明的有益效果为：
（1）本发明公开了一株具有耐盐促生功能的花椒芽孢杆菌P1，该菌株同时具备耐盐及解磷和溶磷等特性，在含有1~3%NaCl的培养条件下，菌株可正常生长繁殖，具有应用于盐碱土壤修复和农业生产中的极大潜力。
（2）本发明通过多轮筛选，获得一株具有多重促生功能的耐盐菌株，在高盐胁迫下，所述菌株可以使土壤中速效磷含量提高51%；本发明在提供所述花椒芽孢杆菌P1的同时还提供了一种适于所述花椒芽孢杆菌P1发酵的液体培养基，利用该培养基可以快速大量的获得具有耐盐促生功能的花椒芽孢杆菌P1，该耐盐促生菌株为盐碱农田土壤修复提供了优良的菌株资源，该菌株及其菌液具有较高的农业应用前景和经济价值。
保藏信息
保藏时间：2024年1月24日；
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏编号：CGMCC NO.29754；
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
邮政编码：100101；
分类命名：Bacillus zanthoxyli。
附图说明
图1为花椒芽孢杆菌P1在显微镜下的细胞形态；
图2为花椒芽孢杆菌P1的菌落形态；
图3为花椒芽孢杆菌P1在不同盐浓度条件下的生长曲线；
图4为花椒芽孢杆菌P1的解磷（有机磷）效果图；
图5为花椒芽孢杆菌P1的溶磷（无机磷）效果图；
图6为花椒芽孢杆菌P1与参比菌株之间的系统进化树。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
实施例1 耐盐花椒芽孢杆菌的筛选
（1）从黄河三角洲自然保护区盐碱地中采集盐地碱蓬的根部土壤样品，装入干净的采样袋，做好标记置于冰盒中带回实验室，并于-20℃保存备用。在无菌超净台中分别称取1 g土样置于含有20 mL有机磷筛选液体培养基的三角瓶中，于28℃、180 rpm 振荡培养箱中富集培养48小时。在无菌条件下，分别吸取1 mL培养液于9 mL无菌水中充分混匀，然后依次梯度稀释，制成10-1、10-3、10-5不同稀释度的样品溶液，分别吸取0.2 mL 样品溶液并涂布于有机磷固体培养基平板上，于28℃恒温培养箱中倒置培养1~5天，观察平板上是否有降解透明圈产生。挑取降解圈上的单菌落转接至相同的有机磷固体培养基平板上并依次进行编号后培养，转接划线两次后，获得纯培养菌株。
（2）用接种环挑取单菌落，转接到装有5 mL耐盐筛选液体培养基的试管中，在28℃、180 rpm 条件下振荡培养24 h，分别进行菌株保藏和生理生化分析。菌株保藏方法采用甘油管冷冻保藏法，向冻藏管中分别加入200 μL甘油（甘油终浓度为20%）和800 μL的菌液，混合均匀后放置-80℃超低温冰箱中保存。
在筛选菌株中，有一株菌体形态呈长杆状，细胞大小为（0.4μm ~ 0.8 μm）×（3.0μm ~ 5.0μm），不产生孢子。28℃固体培养时菌落为规则的圆形，浅黄色，不透明，表面光滑湿润，易挑取，边缘整齐；其生理生化特征是：革兰氏染色阴性，好氧，最适生长温度为28~32℃，最适生长pH值为7.0~8.0，最适盐浓度为1~3%，具有解磷和溶磷特性。该菌株编号为P1，初步确定为本发明选定菌株P1。
上述有机磷筛选液体培养基组成是：每1000 mL蒸馏水中含有葡萄糖10 g，硫酸铵0.5 g，硫酸锰0.03 g，硫酸亚铁0.03 g，氯化钠30 g，硫酸镁0.3 g，氯化钾0.3 g，磷酸钙5g，调节pH至7.5~8.0；有机磷固体培养基组成是：每1000 mL蒸馏水中含有葡萄糖10 g，硫酸铵0.5 g，硫酸锰0.03 g，硫酸亚铁0.03 g，氯化钠30 g，硫酸镁0.3 g，氯化钾0.3 g，磷酸钙5 g，琼脂粉15 g，调节pH至7.5~8.0。
上述耐盐筛选液体培养基组成是：每1000 mL蒸馏水中含有葡萄糖10 g，硫酸铵0.5 g，硫酸锰0.03 g，硫酸亚铁0.03 g，氯化钠30 g，硫酸镁0.3 g，氯化钾0.3 g，磷酸钙5g，调节pH至7.5~8.0。
实施例2 菌株P1形态观察及生理生化特征鉴定
采用尼康倒置显微镜的油镜对菌株P1的形态进行观察。
菌株P1生理生化特征鉴定试验培养温度均设为28℃。同时分析菌株P1在LB固体培养基上生长时的最适温度、最适生长pH值及最适盐浓度。
菌株P1的生物学特征是：呈长杆状，单个，细胞大小为（0.4 μm ~ 0.8 μm）×（3.0μm ~ 5.0μm）（图1）。28℃固体培养时菌落为规则的圆形，突起，浅黄色，不透明，表面光滑湿润，易挑取，边缘整齐（图2）。
菌株P1的生理生化特征是：革兰氏染色阴性，好氧，最适生长温度为28~32℃，最适生长pH值为7.0~8.0，最适盐浓度为1~3%（图3）。
对筛选得到的菌株P1测定16S rRNA基因序列的结果显示，其基因长度为1488 bp，相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
通过使用美国生物工程信息中心（National Center for BiotechnologyInformation , NCBI）BLASTN 程序比对和系统发育分析确定筛选的菌株是一株花椒芽孢杆菌（Bacillus zanthoxyli），即花椒芽孢杆菌P1。
选取同源性比较高的12条序列的16S rDNA序列作为参比对象，采用邻近法（Neighbour-Joining）运用Mega 7软件构建菌株P1与参比菌株之间的系统进化树。在进化树中，菌株P1与花椒芽孢杆菌的模式菌株Bacillus zanthoxylistrain1433形成单独的簇内进化分支（图6）。
上述用于菌体形态观察的液体培养基组成是：每1000 mL蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5 g，氯化钠30 g，调节pH至7.5-8.0。
上述用于菌体形态观察的固体培养基组成是：每1000 mL蒸馏水中含有蛋白胨10g，酵母粉5 g，氯化钠30 g，琼脂粉15 g，调节pH至7.5-8.0。
实施例3菌株P1解磷、溶磷等促生效果分析
将分离获得的菌株P1单菌落转接到装有5 mL液体培养基的试管中，在28℃、180rpm 条件下振荡培养24 h，取10 uL种子液点接于有机磷固体培养基上，于28℃恒温培养箱中培养，观察菌落周围是否有降解透明圈。结果显示，菌株P1在有机磷固体培养基培养2天后，菌落周围出现明显的降解透明圈，继续培养，降解圈显著增大，表明菌株P1能够快速溶解有机磷，具有较强的解磷特性（图4）。
将分离获得的菌株P1单菌落转接到装有5 mL液体培养基的试管中，在28℃、180rpm 条件下振荡培养24 h，取10 uL种子液点接于无机磷固体培养基上，于28℃恒温培养箱中培养。培养3天后，菌落周围产生较清晰的透明降解圈，表明菌株P1可溶解无机磷，具有溶磷特性（图5）。
上述有机磷固体培养基的组成是：每1000 mL蒸馏水中含有葡萄糖10 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠30 g，硫酸镁0.3 g，硫酸锰0.03 g，氯化钾0.3 g，硫酸亚铁0.03 g，卵磷脂2.0 g，琼脂粉15 g，pH 7.5。
上述无机磷固体培养基的组分及浓度是：每1000 mL蒸馏水中含有葡萄糖10 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠30 g，硫酸镁0.3 g，硫酸锰0.03 g，氯化钾0.3 g，硫酸亚铁0.03 g，磷酸钙5.0 g，琼脂粉15 g，pH 7.5。
实施例4 菌株P1的16S rRNA基因鉴定方法
根据BioTeKe细菌基因组提取试剂盒的操作说明，提取分离纯化的菌株P1的总基因组DNA。提取的总基因组DNA采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳电压175V，电泳时间20分钟。选用上游引物27F，如SEQ ID NO.2所示（5’ - 3’：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和下游引物1492R，如SEQ ID NO.3所示（5’ - 3’：GGTTACCTTGTTACGACTT）扩增分离菌株的16SrRNA基因，PCR反应体系和条件如表1和表2所示。
表1 纯化的菌株P1的16S rRNA基因PCR反应体系
表2 PCR反应程序设置
PCR产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳电压175V，电泳时间20分钟。使用凝胶成像仪观察，16S rRNA基因的PCR在1.5 kbp Marker条带位置附近，切下所需条带后，根据琼脂糖凝胶回收试剂盒的操作说明，对PCR产物进行纯化回收。纯化回收后的PCR产物送往测序公司进行测序。
对菌株P1测定16S rRNA基因序列的结果显示，其基因长度为1488 bp，相应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
将测序所得的16S rRNA基因序列递交到NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中进行BLASTN比对，结果显示该菌株的16S rRNA与花椒芽孢杆菌（Bacillus zanthoxyli）1433相似性为99.98%。选取同源性比较高的12条序列的16S rDNA序列作为参比对象，采用邻近法（Neighbour-Joining）运用Mega 7软件构建菌株P1与参比菌株之间的系统进化树。在进化树中，菌株P1与花椒芽孢杆菌模式菌株Bacillus zanthoxylistrain 1433，因此，将其命名为花椒芽孢杆菌P1。
实施例5 菌株P1在增加盐碱土壤中速效磷的应用方法
（1）菌种选择：花椒芽孢杆菌菌株P1。
（2）菌种活化：将菌种接种于菌种活化固体培养基上，28~30℃条件下静置培养12~24 h，备用。
（3）种子培养：挑取步骤（2）中的菌落接种于含有5 mL液体种子培养基中，于28~30℃ 180 rpm条件下培养12~24 h。
（4）发酵培养：以1%接种量将种子液接种至含有100 mL发酵培养基的三角瓶（500mL）中，于28~30℃、180 rpm条件下培养24~36 h，获得含花椒芽孢杆菌的菌悬液（OD 600值为0.6），备用。
（5）增加盐碱土壤中速效磷的检测：向花盆（30 cm × 24 cm × 9 cm）中装入盐浓度为3‰盐碱土壤并浇灌7‰ NaCl溶液，将发酵制得的花椒芽孢杆菌菌悬液进行梯度稀释，分别制成10-1、10-2、10-3菌悬液；向土壤中分别施入20 mL的三种不同浓度的菌液，同时以灭活菌液为对照；十天后检测土壤速效磷的含量。每个处理三个重复。
结果显示，通过测定土壤理化指标发现（表3），添加P1菌液的盐碱土壤中速效磷含量与对照组相比均有显著增加，速效磷含量增加最高达51%。
表3实验土壤中速效磷检测结果
上述菌种活化固体培养基组成为：每1000 mL蒸馏水中含有蛋白胨10 g，酵母粉5g，氯化钠20 g，琼脂粉15 g，调节pH至7.5~8.0。
上述液体种子培养基组成为：每1000 mL蒸馏水中含有蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠20 g，调节pH至7.5-8.0。
上述花椒芽孢杆菌P1的发酵培养基组成为：每1000 mL自来水中含有葡萄糖10 g，酵母粉1 g，氯化钠10 g，氯化钾0.5 g，磷酸钙3 g，卵磷脂3g，硫酸亚铁0.05g，硫酸镁0.1g，pH调节至7.5~8.0。
Claims (8)
1.一株花椒芽孢杆菌（Bacillus zanthoxyli）P1，其特征在于，所述花椒芽孢杆菌P1的保藏编号为CGMCC No. 29754，于2024年1月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种如权利要求1所述的一株花椒芽孢杆菌P1在盐胁迫条件下增加盐碱土壤中速效磷的应用。
3.根据权利要求2所述的一株花椒芽孢杆菌P1在盐胁迫条件下增加盐碱土壤中速效磷的应用，其特征在于，所述盐胁迫是指土壤中盐浓度质量比不低于3‰的盐碱土壤。
4.根据权利要求2或3所述的一株花椒芽孢杆菌P1在盐胁迫条件下增加盐碱土壤中速效磷的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将活化后的花椒芽孢杆菌P1种子液接种至发酵液体培养基中进行培养，获得含花椒芽孢杆菌菌悬液；
（2）将发酵制得的花椒芽孢杆菌菌悬液进行稀释，向盐碱土壤中施入稀释后的花椒芽孢杆菌菌悬液即可。
5.根据权利要求4所述的一株花椒芽孢杆菌P1在盐胁迫条件下增加盐碱土壤中速效磷的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述接种为将活化后的花椒芽孢杆菌种子液按照体积比1~2%的接种量进行。
6.根据权利要求5所述的一株花椒芽孢杆菌P1在盐胁迫条件下增加盐碱土壤中速效磷的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述花椒芽孢杆菌菌悬液的OD600值为0.4~0.8。
7.根据权利要求4所述的一株花椒芽孢杆菌P1在盐胁迫条件下增加盐碱土壤中速效磷的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述发酵液体培养基为每1000 mL自来水中含有葡萄糖10g，酵母粉1 g，氯化钠10 g，氯化钾0.5 g，磷酸钙3 g，卵磷脂3 g，硫酸亚铁0.05 g，硫酸镁0.1 g，pH调节至7.5~8.0。
8.根据权利要求7所述的一株花椒芽孢杆菌P1在盐胁迫条件下增加盐碱土壤中速效磷的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述培养的条件为在28~32℃、180 rpm条件下培养24~36h。
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