CN103497925B - 一株降解磺酰脲类除草剂的基因工程菌KT-puts2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株降解磺酰脲类除草剂的基因工程菌KT‐puts2及其应用，属于生物高技术领域。它是将菌株S113（Hansschlegelia？zhihuaiae）的磺酰脲除草剂去酯化酶基因sulE与适合在植物根际土壤中发挥功能的启动子p2进行无缝连接，然后通过无标记同源重组的方法整合到恶臭假单胞菌（Pseudomonas？putida）的模式菌株KT2440的染色体中而获得。利用KT‐puts2生产的菌剂产品能够降解土壤中的磺酰脲类除草剂，可以应用于磺酰脲类除草剂污染土壤的生物修复。
Description
技术领域
本发明属于为生物领域，涉及一株降解磺酰脲类除草剂的基因工程菌KT-puts2及其应用。
背景技术
磺酰脲类除草剂自问世以来由于其高效、广谱和高选择性的特性，迅速发展成为除草剂市场的主流。但是磺酰脲类除草剂在土壤中降解缓慢，在碱性土壤中残效期长达数月甚至几年，这些累积残留不仅会对后茬敏感作物产生药害，造成经济损失，而且还会对生态环境造成严重破坏。以微生物降解为基础的生物修复技术被认为是最具潜力的去除环境中有机污染物的方法。由于普通的磺酰脲除草剂降解菌施到污染土壤中以后受到土壤复杂环境以及土著微生物竞争的影响，往往会影响其存活状态和修复效果。如果能将从磺酰脲除草剂降解菌中克隆的磺酰脲除草剂去酯化酶基因导入到能够在适合在土壤中生存的菌株中，构建既具有降解功能又适合在土壤中的生存的基因工程菌，并生产菌剂，然后运用到磺酰脲除草剂污染土壤的生物修复中，将具有什么重要的意义。到目前为止还没有这方面的技术，迫切需要开发。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株降解磺酰脲类除草剂的基因工程菌KT-puts2。
本发明的另一目的是提供基因工程菌KT-puts2的应用。
本发明的目的可以通过如下技术方案实现：
一株降解磺酰脲类除草剂的基因工程菌KT-puts2，该菌株是将SEQIDNO.1所示的带有启动子p2的sulE序列通过无标记同源重组的方法整合到恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）的模式菌株KT2440的染色体中而获得。
其中SEQIDNO.1所示的带有启动子p2的sulE序列是将菌株S113（Methylophilussp.）中磺酰脲除草剂去酯化酶基因sulE与适合在植物根际土壤中发挥功能的启动子p2进行无缝连接而获得。
所述的基因工程菌KT-puts2分类命名：恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2013.6.29，保藏编号：CCTCCNO：M2013284。
用本发明所述的基因工程菌KT-puts2生产的菌剂。
本发明所述的菌剂的制备方法，包含如下步骤：
1）将保藏号为CCTCCNO：M2013284的菌株KT-puts2接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期，LB培养基配方：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，pH值7.0-7.2；
2）将上述培养好的菌种按体积比1%的接种量接种入1吨种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖：9g/L；硫酸铵：0.8g/L；酵母膏：0.3g/L；磷酸氢二钾：1g/L；七水硫酸镁：0.5g/L；氯化钠：0.1g/L；碳酸钙：1g/L；pH：7.0-7.2，培养过程中无菌空气的通气量为20m3/hr，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35℃，全流程培养时间为48-60小时,发酵结束后菌体数量达到10亿/ml以上；
3）将种子液按生产罐培养基的10%接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为150-170m3/hr，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35℃，全流程培养时间为48-60小时,发酵结束后菌体数量达到10亿/ml以上，此时的培养液即为菌剂。
本发明所述的基因工程菌KT-puts2在磺酰脲类除草剂污染土壤的生物修复中的应用。
本发明所述的基因工程菌KT-puts2生产的菌剂在磺酰脲类除草剂污染土壤的生物修复中的应用。
有益效果：
本发明提供的菌株KT-puts2可降解土壤中磺酰脲类除草剂，成功地解决了普通磺酰脲除草剂降解菌难以抵抗土壤的复杂环境和土著微生物竞争的问题。使用该菌株生产菌剂具有质量稳定，使用方便，施用效果好的优点，可以应用于磺酰脲类除草剂污染土壤的生物修复。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康具有重要的意义。
附图说明
图1基因工程菌KT-puts2的sulEp2片段的PCR检测
其中，A:PCR扩增产物;B:sulEp2对照;M:DL2000maker。
图2不同菌株对土壤中噻吩磺隆降解效果的比较
生物材料保藏信息
菌株KT-puts2，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2013-6-25，保藏编号：CCTCCNO：M2013284，分类命名：PseudomonasputidaKT-puts2。
菌株S113，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2005-10-12，保藏编号：CGMCCNo.1479，分类命名Methylophilussp.。
具体实施方式
实施例1
根据磺酰脲除草剂去酯化酶基因（sulE）序列以及启动子序列分别设计引物进行重叠延伸获得。以菌株S113（CGMCCNo.1479）的总DNA为模板，通过引物1：
psf25’-TGAGAATTCGTTATGGAAACCGATAAAAAAACCGGAA-3’（SEQIDNO.2，下划线标注为重叠延伸区域），和psr25’-GCCATATGTCAGCTTTCGTTCTGATCTAAGCCG-3’（SEQIDNO.3，下划线标注为NdeI酶切位点）扩增出磺酰脲除草剂去酯化酶基因（sulE）。
以恶臭假单胞菌模式菌株KT2440的基因组总DNA为模板，通过引物2：p2f5’-GCCATATGCGCTGCTGGATAAATACGCCGACAC-3’（SEQIDNO.4，下划线标注为NdeI酶切位点）和
p2r5’-TATCGGTTTCCATAACGAATTCTCAATCGGTGTGGCAA-3’（SEQIDNO.5，下划线标注为重叠延伸区域）扩增出启动子p2。以磺酰脲除草剂去酯化酶基因（sulE）和启动子p2为模板，以p2f和psr2和为引物，通过重叠延伸PCR进行无缝连接，得到含有酶切位点的带有启动子p2的sulE的DNA片段（sulEp2），其中带有启动子p2的sulE序列如SEQIDNO.1所示，其中前300bp为启动子p2的碱基序列。sulEp2片段可以通过以上方法获得，也可以通过化学方法合成。
将带有启动子p2的sulE序列通过NdeI酶切后连接到同样用NdeI酶切的载体pUTTnsKm上，构建pUTTnsKm-sulEp2，将其转化到E.coliDH5αλpir（上海北诺生物科技有限公司）中得到E.coliDH5αλpir-sulEp2。通过三亲接合的方法将带有启动子p2的sulE基因整合到菌株KT2440的染色体上，并通过将接合子在添加蔗糖10%（w/v）的LB培养基中进行筛选，使其抗性基因丢失，得到可以降解磺酰脲除草剂，但无抗生素抗性的基因工程菌KT-puts2，将该菌送交CCTCC保藏，保藏编号：CCTCCNO：M2013284。
基因工程菌KT-puts2的形态学特征：革兰氏阴性杆菌菌，好氧生长，不产芽孢。在LB培养基上呈现微黄色，半透明，湿润的圆形菌落。
以基因工程菌KT-puts2的基因组总DNA为模版，利用sulEp2的两端引物进行PCR扩增，正向引物5’-GCCATATGGTGCAGCGCGCCAGGTGCTGGAAG-3’，（SEQIDNO.6，下划线为NdeΙ酶切位点），反向引物5’-GCCATATGTCAGCTTTCGTTCTGATCTAAGCCG-3’，（SEQIDNO.7，下划线为NdeΙ酶切位点）。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果如图1，通过PCR扩增出的片段（约1.5kb）与实际sulEp2片段的大小相符。
实施例2
将本发明的菌株KT-puts2（CCTCCNO：M2013284）在平板上活化后接种于试管斜面上备用。试管种接种于20瓶含有300mlLB培养基的1000ml摇瓶中。LB培养基的配方为（g/L）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl10，pH值7.0-7.2。振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐1000升，投料量600升，种子罐所用的培养基配方为（g/L）：葡萄糖：9；硫酸铵：0.8；酵母膏：0.3；磷酸氢二钾：1；七水硫酸镁：0.5；氯化钠：0.1；碳酸钙：1；pH：7.0-7.2。投料完毕后121℃高压湿热灭菌30分钟，冷却至32℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按1%的接种量接种到种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为180-220转/分，无菌空气的通气量为20m3/hr。将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量10吨，投料量6吨。投料后的生产罐于121℃高压湿热灭菌30分钟，灭菌后冷却至32℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30-32℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为150-170m3/hr，搅拌速度为240-280转/分，整个工艺流程培养时间为80-100小时。发酵结束后菌体数量达到10亿/ml以上，此时的培养液即为菌剂。
实施例3
用实施例2所得的产品进行促进土壤中磺酰脲类除草剂解的试验。
将五种磺酰脲类除草剂即甲磺隆、噻吩磺隆、苄嘧磺隆、胺苯磺隆、氯嘧磺隆药液以20mg·kg-1土壤的浓度施用于供试土壤搅拌均匀，将工程菌剂按KT-puts2（CCTCCNO：M2013284）106CFU·g-1的接种量接种供试土壤，同时设置不加菌的作为对照。薄膜封口，留有少许气孔，以维持水分和通气量。50d后分别测定土壤中农药的含量。结果见表1。
表1：KT-puts2菌剂在土壤中对不同磺酰脲类除草的降解效果
实施例4
为了比较工程菌株KT-puts2和普通磺酰脲除草剂降解菌S113（CGMCCNo.1479）对土壤中磺酰脲除草剂的降解效果，我们进行了以下研究。将普通磺酰脲除草剂降解菌S113（CGMCCNo.1479）以及以基因工程菌KT-puts2（CCTCCNO：M2013284）活化，制成菌体浓度约109个/ml的降解菌剂。配制噻吩磺隆浓度为30mg/kg的含药未灭菌土壤，然后分别接种S113，工程菌KT-puts2两种降解菌剂，混匀，使土壤中含菌量为106个/g干土，并以含药土壤不加降解菌剂作为对照。置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，定时取样测定噻吩磺隆在土壤中的残留。结果如图2所示
从图2中可以看出，普通磺酰脲除草剂降解菌S113以及以基因工程菌KT-puts2对噻吩磺隆都有降解作用，但是KT-puts2的降解效果要明显高于S113。在第30天时，接种S113菌株的土壤中的噻吩磺隆浓度从30mg/kg下降为25mg/kg，降解率只有16.7%，而接种KT-puts2菌株的土壤的噻吩磺隆浓度从30mg/kg下降为10mg/kg，降解率为66.7%，降解效果明显高于接种S113。能在短时间内迅速降解噻吩磺隆。即使到第50天时，在接种S113的土壤中，噻吩磺隆降解率为40.5%，而接种KT-puts2的土壤中的噻吩磺隆降解率为76.8%；降解效果明显高于前者。因为土壤是一个复杂的环境，降解菌剂接种到土壤中后，不但要受到土壤中非生物因素的影响，还要面临和和土著微生物竞争的问题，从而影响降解菌剂的效果。由于基因工程菌KT-puts2是以适合土壤生存的KT2440作为载体菌，因此表现出明显的的优势。
Claims (6)
1.一株降解磺酰脲类除草剂的基因工程菌KT‐puts2，其特征在于该菌株是将SEQIDNO.1所示的带有启动子p2的sulE序列通过无标记同源重组的方法整合到恶臭假单胞菌（Pseudomonasputida）的模式菌株KT2440的染色体中而获得。
2.根据权利要求1所述的降解磺酰脲类除草剂的基因工程菌KT‐puts2，其特征在于所述的基因工程菌KT‐puts2分类命名：恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2013‐6‐25，保藏编号：CCTCCNO：M2013284。
3.用权利要求1所述的基因工程菌KT‐puts2生产的菌剂。
4.权利要求3所述的菌剂的制备方法，其特征在于包含如下步骤：
1）将保藏号为CCTCCNO：M2013284的菌株KT‐puts2接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期，LB培养基配方：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，pH值7.0‐7.2；
2）将上述培养好的菌种按体积比1%的接种量接种入1吨种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖：9g/L；硫酸铵：0.8g/L；酵母膏：0.3g/L；磷酸氢二钾：1g/L；七水硫酸镁：0.5g/L；氯化钠：0.1g/L；碳酸钙：1g/L；pH：7.0‐7.2，培养过程中无菌空气的通气量为20m3/hr，搅拌速度为180‐240转/分，培养温度为30‐35℃，全流程培养时间为48‐60小时,发酵结束后菌体数量达到10亿/ml以上；
3）将种子液按生产罐培养基的10%接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，在生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为150‐170m3/hr，搅拌速度为180‐240转/分，培养温度为30‐35℃，全流程培养时间为48‐60小时,发酵结束后菌体数量达到10亿/ml以上，此时的培养液即为菌剂。
5.权利要求1所述的基因工程菌KT‐puts2在磺酰脲类除草剂污染土壤的生物修复中的应用。
6.权利要求3所述的菌剂在磺酰脲类除草剂污染土壤的生物修复中的应用。
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