CN105154353A - 一种枯草芽孢杆菌及其在温室大棚土壤修复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种枯草芽孢杆菌及其在温室大棚土壤修复的应用。通过对温室大棚土壤样品进行菌种的分离、筛选、选育、驯化，经16S？rDNA序列测定及系统发育分析，确定了枯草芽孢杆菌（<i>Bacillus？Subtilis</i>）XHS0035Kc？CGMCC？NO.9434？70份-80份、荧光假单胞菌20份-40份、胶冻样芽胞杆菌25份-45份和锁掷孢酵母菌15份-35份进行混合，菌种混合液充分吸附于载体中，并与辅料相混合，载体选用温室大棚土壤；辅料采用尿素和过磷酸钙，通过利用发酵技术制备温室大棚土壤修复组剂，该土壤修复组剂在温室大棚土壤修复中具有突出的技术效果。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在温室大棚土壤修复中的应用

技术领域

本发明涉及农业微生物应用技术领域，具体地说，本发明涉及一种自行选育筛选的枯草芽孢杆菌及在温室大棚土壤修复中应用的技术领域。

背景技术

在集约农业生产中，土壤作为一个时空连续体，在精准管理时必须考虑土壤性质的空间变异性。目前由于农民缺乏必要的施肥指导，许多农民大多根据自己的经验进行施肥管理，并且认为“高投入，高产出”，这导致大量盲目过量的施肥现象经常发生。然而，过量的施肥虽然在短期内能提高作物的产量，但是，从长期来看，过量的施肥会导致土壤的生产力下降，作物减产，同时还会导致地下水污染的危险。

温室大棚连续种植几年蔬菜后，就会出现很多的问题，如土壤板结、盐渍化、酸化，蔬菜长势弱、产量低、土传病害和根结线虫发生严重等。温室大棚蔬菜生产具有高投入高产出的特点，菜农为了获得高产，受“施肥越多产量越高”观念的影响，往往是盲目、超量和不平衡施肥。而且，多数蔬菜需氮、磷、钾的比例为l：0.4：1.2，而实际施肥的比例多为1：0.96：0.36，严重失调。不合理施肥造成大量化肥存积在土壤中，不仅浪费，而且还引起土壤板结、酸化、盐化等一系列问题，影响根系和蔬菜正常生长，引起蔬菜死棵。土壤表面长青苔、发红就是由于土壤中含盐过多引起的。

利用生物修复作用对温室大棚土壤进行改良，必须遵循的原则，要使用适合的生物、在适合的场所、适合的环境条件和适合的技术费用。适合的生物是温室大棚土壤改良的先决条件，它是指具有正常生理和代谢能力，并能以较大的速率降解和转化污染物，并在修复过程中不产生毒性产物的生物体系；适合的场所是指有污染物和合适的生物相接触的地点，污染场地不含对降解菌种有抑制作用的物质且目标化合物能够被降解；适合的环境条件是指环境因子包括温度、湿度、氧气、pH值、无机养分等；适合的技术费用是指生物修复技术费用必须尽可能低、至少低于同样可以消除该污染物的其他技术。目前，由于设施栽培复种指数高，产量高，并且能够实现一年四季均衡生产，因此，设施栽培已经成为我国农业生产的主导产业之一。尽管有许多关于在大田中研究有机物料对土壤性质及作物产量影响的报道，但是有关从温室大棚土壤中分离筛选能够改良温室大棚土壤的菌种，以及利用自行选育筛选驯化获得的枯草芽孢杆菌与其他多菌种根据菌种的相融性、适用性和安全性基本要求和菌种特性制备土壤修复剂用于改良温室大棚土壤的研究还未见报道。

发明内容

针对现有技术中未见有关从温室大棚土壤中筛选枯草芽孢杆菌作为优良菌种并与多菌种相配伍相融合制备温室大棚土壤修复组剂的技术现状，本发明旨在提供一种枯草芽孢杆菌及其用于温室大棚土壤修复中的应用。本发明通过在温室大棚土壤中分离出一批微生物菌株，从中分离筛选出一株编号为XHS0035Kc的菌株，并通过利用编号为XHS0035Kc的枯草芽孢杆菌，与荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌相配伍相融合制备土壤修复组剂，有效地改良和活化土壤，降解土壤中的有害物质，解决土壤的盐渍化问题，解决实际设施大棚中土壤养分失衡、盐渍化、沙化或者板结严重的现状，综合将对于蔬菜生产的不利影响降低到最低限度,有利于提高蔬菜的产量和品质，获得良好的技术效果，在温室大棚土壤修复中具有广泛而现实的价值。

本发明采用主要的技术方案：

通过微生物菌种的分离筛选，在温室大棚土壤中分离出一批微生物菌株，经过进一步分离、筛选、选育、驯化，获得一株编号为XHS0035Kc的枯草芽孢杆菌株。通过对所获菌株进行形态特征、生理生化特性及16srDNA区段序列测定及系统发育分析，初步确定了其分类地位。同时，将编号为XHS0035Kc的枯草芽孢杆菌与荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌相配伍相融合制备温室大棚土壤修复组剂，按照重量份比核计，以编号为XHS0035Kc的枯草芽孢杆菌70份-80份、荧光假单胞菌20份-40份、胶冻样芽胞杆菌25份-45份和锁掷孢酵母菌15份-35份进行混合，菌种混合液充分吸附于载体中，并与辅料相混合，通过利用发酵技术制备温室大棚土壤修复组剂。利用温室土壤修复组剂可以改良温室大棚土壤的品质，有效地防治蔬菜生育期的各类病害，将温室大棚土壤对蔬菜生产的不利影响降低到最低限度，有效地改良和活化土壤、降解土壤中的有害物质、解决土壤的盐渍化问题，将土壤对果蔬生产中的不利影响降低到最低限度，有利于提高蔬菜的产量和品质，获得良好的技术效果，在温室大棚土壤修复中具有现实的意义和作用。

本发明具体提供一种枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)，通过在温室大棚土壤中分离、筛选、驯化和培养，获得一批细菌类微生物菌株，从中筛选出一株编号为XHS0035Kc的菌株，经微生物学分类与鉴定，属于枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)。

具体的，本发明提供菌株编号为XHS0035Kc的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2014年7月10日，保藏号是CGMCCNo.9434。经微生物学鉴定为BacillusSubtilis。该菌株最适生长条件为：温度28℃,pH7.2，时间48h；该菌株菌落中等且平滑，呈透明、白色、表面湿润、边缘整齐，生长较快；杆状,革兰氏阳性，严格好氧，化能异养，接触酶阳性，M.R和V-P试验阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐利用阳性；经微生物学鉴定为BacillusSubtilis菌。依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey,sManualofSystematicBacterio-logy》)和《常用细菌系统鉴定手册》对XHS0035Kc菌株进行形态学测定，生理生化检测确定XHS0035Kc菌株为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)中的成员。通过BLAST同源比对，菌株XHS0035Kc的16SrRNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后,构建系统进化树，菌株XHS0035Kc与30334-31756BacillusSubtilisKCTC1028是其近似种，因而根据16SrDNA序列分析结果，结合形态及生理生化特性，将菌株XHS0035Kc鉴定为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)。

该菌株XHS0035Kc在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基生长良好，经鉴定板试验证明XHS0035Kc培养时的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、甘油、甘露醇、麦芽糖；使用的无机组分包括包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。

进一步，本发明提供一种枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434在温室大棚土壤修复中的应用。通过利用XHS0035Kc菌株制备土壤修复剂应用于改良温室大棚的土壤，有效地改良和活化土壤、降解土壤中的有害物质、解决土壤的盐渍化问题，获得显著良好的技术效果。

同时，本发明具体提供一种温室大棚土壤修复组剂的制备方法，具体制备方法步骤如下：

(1)接种：制备枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434、荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌四种菌种的固体培养基，灭菌后严格进行无菌操作，从斜面转接至平板，温度28℃下培养3天。

(2)一级培养：从步骤(1)中的固体培养基上挑取单菌落转接至装有液体培养基的50mL锥形瓶中，无菌操作，28℃、120r/min培养24h-48h。

(3)二级发酵：将上述步骤一级培养菌种接种于盛有液体培养基的500mL锥形瓶中，无菌操作，28℃、120r/min培养24h-48h。

(4)菌种发酵液的配伍：按照重量份比核计，选用步骤(3)制备的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434二级发酵液70份-80份、荧光假单胞菌二级发酵液20份-40份、胶冻样芽胞杆菌二级发酵液25份-45份和锁掷孢酵母菌二级发酵液15份-35份进行混合，制备复合菌种的混合液。

(5)添加辅料：将步骤(4)制备的复合菌种混合液充分吸附于载体中，载体选用温室大棚土壤；辅料采用尿素和过磷酸钙，其中尿素与过磷酸钙的重量比为1:3；载体和辅料的用量按照重量比为1:3.5配比混合，加水至含水量40-70％，然后按体积比每立方米载体与辅料混合用料加入上述步骤(4)制备的复合菌种混合液100-300g，并混合均匀，制备获得温室大棚土壤修复组剂。

进一步，本发明提供应用上述温室大棚土壤修复组剂在温室大棚中的应用。通过利用自行筛选分离驯化获得枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434，通过实践与荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌三种菌种融合试验，实践证明制备的土壤修复组剂应用于改良温室大棚的土壤，对于改良和活化土壤、降解土壤中的有害物质、解决土壤的盐渍化问题，获得显著突出的技术效果。

本发明进一步提供上述温室大棚土壤修复组剂的应用方法：在空气温度20-30℃下堆制；堆制是在覆盖草帘下进行，堆制开始后每30天翻堆一次，翻堆时补水至含水量40-70％，堆制时间持续120天；堆制完成后摊晾至干燥后即可直接施用于土壤。

本发明所选用编号为XHS0035Kc的枯草芽孢杆菌是从温室大棚土壤中筛选得到，同时，尽管荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌为常见的菌种，但是，微生物菌种的特异性和复杂性，将各种不同的菌种能够复合配伍使用，通过各种菌种的相融性、配伍性与各菌种属性结合，考虑的复合菌种的安全性，特别是应用于温室大棚土壤修复中都需要大量的基础实验验证，本发明基于前期基础研究积累，通过采用大量不同的菌种复配试验，证明本发明采用复合菌种通过添加辅料制备温室大棚土壤修复剂，温室大棚土壤修复剂按照重量比配比由编号为XHS0035Kc的枯草芽孢杆菌70份-80份、荧光假单胞菌20份-40份、胶冻样芽胞杆菌25份-45份和锁掷孢酵母菌15份-35份相混合，菌种混合液充分吸附于载体大棚土壤中，并与选用合适的辅料相混合，通过工艺制备获得温室大棚土壤修复组剂，并通过大棚生产实践应用获得的温室大棚土壤修复剂，对于有效改良和活化土壤、降解土壤中的有害物质、解决土壤的盐渍化问题等方面都具有重要的意义和作用。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果:

(1)本发明筛选的编号为XHS0035Kc的枯草芽孢杆菌菌株具有较强的生长繁殖能力，生长速率快，遗传特性稳定，并对土壤修复有特定的作用。

(2)本发明制备的温室大棚土壤修复组剂有利于改良温室大棚的土壤，有效地改良和活化土壤、降解土壤中的有害物质、解决土壤的次生盐渍化等问题，将土壤对果蔬生产中的不利影响降低到最低限度，有利于提高蔬菜的产量和品质，获得良好的技术效果，因此在温室大棚土壤修复中具有广泛而适用的价值。

附图说明

图1显示为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434的接触酶实验图。

图2显示为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434的淀粉水解试验图。

图3显示为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434的16SrDNA系统发育树图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

实施例一：枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434的分离、筛选及鉴定

1、菌种的分离和筛选

(1)分离

本发明所使用的枯草芽孢杆菌从新疆南疆库尔勒典型的盐渍化严重、土壤沙化或板结突出的温室大棚土壤中取样分离，根据菌种拮抗作用机理分析，初步筛选出对温室大棚土壤的土壤盐渍化、土壤板结等土壤问题具有一定拮抗能力的菌株。利用传统的平板培养法分离出土层中的微生物，平板划线法纯化菌株，以不同的培养温度、pH值、培养基为富集条件，筛选出一批生长良好的微生物菌株，从中优选一株序列号为XHS0035Kc的菌株。

分离步骤：依据梯度稀释法，称取10g土壤样品于90mL无菌生理盐水，30℃活化30min后进行梯度稀释，选取10^-2、10^-3、10^-4稀释液分别涂布于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基的平板，每个处理3个重复，于28℃培养。待长出菌落后挑取形状、大小、颜色等不同的菌落分别划线接种于新的分离培养基胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基，直至无杂菌落。将纯化后的菌株一部分采用冻干物安瓿管、甘油管和液氮等方式保藏，一部分保存于4℃直接用于后续研究。

(2)培养条件

将纯化的菌株接种到胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)固体培养基斜面上，于28℃培养48h，放入4℃冰箱中保存备用。

具体的：该菌株最适培养温度为28℃，生长最适pH为7.2。

所述胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基的制备为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，NaCI5g，琼脂20g，补水至1000mL，pH7.2，分装，灭菌，即可制备获得胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基。

通过对温室大棚土壤中微生物进行分离、筛选和培养，获得一批微生物菌株，从中筛选出一株序列号为XHS0035Kc的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于BacillusSubtilis。本发明提供一种枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)，菌株编号为XHS0035Kc。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期是2014年7月10日，保藏号是CGMCCNo.9434。经微生物学鉴定为BacillusSubtilis。该菌株最适培养条件：温度28℃,pH7.2，时间48h；该菌株菌落中等且平滑，呈透明、白色、表面湿润、边缘整齐，生长较快；革兰氏阳性，严格好氧，化能异养，接触酶阳性，M.R和V-P试验阳性，淀粉水解阳性，明胶水解阳性，硝酸盐还原阳性，柠檬酸盐利用阳性；杆状，革兰氏阳性，不产芽孢；经微生物学鉴定为BacillusSubtilis菌。依照第九版《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》(《Bergey,sManualofSystematicBacterio-logy》)和《常用细菌系统鉴定手册》对XHS0035Kc菌株进行形态学测定，生理生化检测确定XHS0035Kc菌株为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)中的成员。通过BLAST同源比对，菌株XHS0035Kc的16SrRNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后,构建系统进化树，菌株XHS0035Kc与30334-31756BacillusSubtilisKCTC1028是其近似种，因而根据16SrDNA序列分析结果，结合形态及生理生化特性，将菌株XHS0035Kc鉴定为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)。

该菌株XHS0035Kc在胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)培养基生长良好，经鉴定板试验证明XHS0035Kc培养时的主要氮源包括但不限于蛋白胨、酵母粉；使用的主要碳源包括但不限于蔗糖、甘油、甘露醇、麦芽糖；使用的无机组分包括包括但不限于氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钠、氢二钾、磷酸三钙、二水氯化钙、七水合硫酸镁、七水和硫酸亚铁。

实施例二：枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434的生长因子

1、革兰氏染色

革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

(1)载玻片固定。在无菌操作条件下，用接种环挑取少量菌株XHS0035Kc于干净的载玻片上涂布均匀，在火焰上加热以杀死菌种并使其粘附固定。

(2)草酸铵结晶紫染1分钟。

(3)自来水冲洗，去掉浮色。

(4)用碘-碘化钾溶液媒染1分钟，倾去多余溶液。

(5)用中性脱色剂如乙醇(95％)或丙酮酸脱色30秒，革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色，革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。酒精脱色为整个流程最关键的一步。

(6)用蕃红染液或者沙黄复染30秒，革兰氏阳性菌仍呈紫色，革兰氏阴性菌则呈现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。镜检观察芽孢，菌的形态。

实验结果：菌株XHS0035Kc革兰氏染色显微观察呈紫色，表示菌株XHS0035Kc为革兰氏阳性菌。

2、接触酶实验

将菌株XHS0035Kc接种于肉汤培养基斜面上，适温培养18-24h。取干净的载玻片，在上面滴l滴3％-5％的H₂O₂：，挑取l环培养18-24h的菌苔，在H₂O₂溶液中涂抹，若有气泡出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性。

所述的肉汁培养基制备为牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaC10.5％，琼脂2.0％，pH7.0-7.2，121℃，灭菌30min。

实验结果：菌株XHS0035Kc能够产气，过氧化氢酶呈阳性，参见附图1。

3、甲基红(MethylRed)试验

原理：有些细菌能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。

试验方法：挑取新的待试菌株XHS0035Kc的纯培养物少许，接种于通用培养基中，在28℃下培养于24h，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1-2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。

所述的通用培养基配制方法：蛋白胨5g；葡萄糖5g；NaCl(或K₂HPO₄):5g；蒸馏水：1000mL；PH:7.0-7.2，分装试管，毎管装约4-5cm，115℃灭菌20min。

实验结果：呈红色表示阳性。

4、V-p实验

原理：菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V-P(+)反应。

试验方法：将菌株XHS0035Kc接种于培养基中，在28℃下培养于24h、培养液2.5ml先加入a萘酚(2-na-phthol)纯酒精溶液0.6ml,再加40％氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2-5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或28℃恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。

所述的培养基配制方法：蛋白胨5g；葡萄糖5g；NaCl(或K₂HPO₄):5g；蒸馏水：1000mL；PH:7.0-7.2，分装试管，毎管装约4-5cm，115℃灭菌20min。

实验结果：呈红色表示阳性，菌株XHS0035KcV-P实验呈现阳性。

5、淀粉水解实验

实验原理：某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

实验方法：将培养18-24hXHS0035Kc菌株的纯培养物，点接于淀粉琼脂平板或直接移种于淀粉肉汤中，于28℃培养24-48h。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明圈、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明圈或肉汤呈深蓝色。淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。

实验结果：呈深蓝色表示阳性，呈透明圈，参见附图2。

6、明胶液化实验

实验原理：有些细菌具有明胶酶，能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，因此失去凝胶性质而被液化。

试验方法：挑取18-24h待试XHS0035Kc菌的培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于28℃培养24-48h。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性，否则为阴性。

实验结果：明胶被XHS0035Kc菌液化，表示明胶液化实验为阳性；

7、硝酸盐还原实验

实验方法：被检菌XHS0035Kc菌接种于硝酸盐培养基中，于28℃培养1-2d。将对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100ml和α-奈胺0.5g+5mol/L醋酸等量混合后加入培养基内，立即观察结果。

实验结果：若出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没有被还原，试验阴性或硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。

实验结果：XHS0035Kc菌硝酸盐还原实验为阳性；

8、柠檬酸盐利用实验

有的细菌如产气杆菌，能利用柠檬酸钠为碳源，因此能在柠檬酸盐培养基上生长，并分解柠檬酸盐后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。不能利用柠檬酸盐为碳源的细菌，在该培养基上不生长，培养基不变色。

所述的柠檬酸盐培养基:柠檬酸钠2g,K₂HPO₄1g,NH₄H₂PO₄1g,NaCI5g,MgSO₄0.2g,琼脂1.5-2g,1％溴麝香草酚蓝(酒精溶液)或0.04％苯酚红10ml,水1000ml.将上述各成分加热溶解后，调pH6.8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。制成后为黄绿色，分装试管。121℃灭菌20min后制成斜面。

实验结果:XHS0035Kc菌能利用柠檬酸盐为碳源，培养基变为蓝色，表示阳性。

9、生长温度实验

测定XHS0035Kc菌的生长温度，要求培养液十分澄清，并采用液体菌种直接接种，放置于恒温水浴培养。温度在20-37℃下培养2d，观察生长情况。

实验结果：XHS0035Kc菌在28℃下培养1-2d最好。

通过上述对于枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434的菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定，即通过菌体形态观察、菌株培养特征观察、需氧性和运动性测定、生长温度测定、耐盐试验、柠檬酸盐利用试验、触酶试验、糖醇类发酵试验、硝酸盐还原试验、淀粉水解、明胶液化，均参照《常用细菌系统鉴定手册》对XHS0035Kc菌株进行形态学测定，从菌种分类角度将菌种编号为XHS0035Kc综合鉴定为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)。

实施例三：枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434的分子水平

1、PCR扩增枯草芽孢杆菌的16SrDNA序列及其测序

挑取少量XHS0035Kc菌株的单菌落，放入盛有25μL无菌水的EP管中，100℃煮沸8-10min，后迅速放入冰水混合物中5min。离心10000r/min、5min，4℃保存，用时取上清。

16SrDNA基因序列测定及其系统进化树的构建：按常规方法提取菌株的总DNA，用去离子水将稀释通用引物,并进行PCR扩增，引物设计如下:

27f:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

1492r:TACGGCTACCTTGTTACGACTT

16SrRNA基因序列测定及其系统进化树的构建：按常规方法提取细菌菌株的总DNA，用去离子水将稀释通用引物16srDNA区段的PCR扩增。引物由上海生物工程有限公司合成。电泳检测,并经过测序。

2、16SrDNA序列比对及系统发育分析

将测序得到的16SrDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中获取相近的16SrDNA序列，将XHS0035Kc的16SrDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST分析后,构建系统进化树。参见附图3所示，菌株XHS0035Kc与30334-31756BacillusSubtilisKCTC1028之间进化距离最短，是30334-31756BacillusSubtilisKCTC的近似种。结合XHS0035Kc的形态结构特征及生理生化特性，确定其为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)属。将所测得的16SrDNA序列输入Genbank，以Blast程序进行同源性比较，发现它与30334-31756BacillusSubtilisKCTC1028的16SrDNA序列的相似性最大相似性为84％，从而进一步确定为BacillusSubtilis。结合XHS0035Kc的形态结构特征及生理生化特性，确定其为菌种编号为XHS0035Kc综合鉴定为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)。

实施例四：温室大棚土壤修复组剂的制备

(1)接种：制备枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434、荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌四种菌种的固体培养基，灭菌后严格进行无菌操作，从斜面转接至平板，温度28℃下培养3天。

(2)一级培养：从步骤(1)中的固体培养基上挑取单菌落转接至装有液体培养基的50mL锥形瓶中，无菌操作，28℃、120r/min培养24h-48h。

(3)二级发酵：将上述步骤一级培养菌种接种于盛有液体培养基的500mL锥形瓶中，无菌操作，28℃、120r/min培养24h-48h。

(4)菌种发酵液的配伍：按照重量份比核计，选用步骤(3)制备的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434二级发酵液70份-80份、荧光假单胞菌二级发酵液20份-40份、胶冻样芽胞杆菌二级发酵液25份-45份和锁掷孢酵母菌二级发酵液15份-35份进行混合，制备复合菌种的混合液。

(5)添加辅料：将步骤(4)制备的复合菌种混合液充分吸附于载体中，载体选用温室大棚土壤；辅料采用尿素和过磷酸钙，其中尿素与过磷酸钙的重量比为1:3；载体和辅料的用量按照重量比为1:3.5配比混合，加水至含水量40-70％，然后按体积比每立方米载体与辅料混合用料加入上述步骤(4)制备的复合菌种混合液100-300g，并混合均匀，制备获得温室大棚土壤修复剂。

同时，进一步，本发明提供温室大棚土壤修复剂的应用方法：在空气温度20-30℃下堆制；堆制是在覆盖草帘下进行，堆制开始后每30天翻堆一次，翻堆时补水至含水量40-70％，堆制时间持续120天；堆制完成后摊晾至干燥后即可直接施用于土壤。

本发明中，所选用的荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌都为常见的菌种，本领域普通技术人员可以通过公众渠道获得。同时，所用的菌种荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌发酵液按照现有技术中常见的方法及相应培养基制备获得。

本发明所选用编号为XHS0035Kc的枯草芽孢杆菌是从温室大棚土壤中筛选得到，同时，尽管荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌为常见的菌种，但是，微生物菌种的特异性和复杂性，将各种不同的菌种能够复合配伍使用，通过各种菌种的相融性、配伍性与各菌种属性结合，考虑的复合菌种的安全性，特别是应用于温室大棚土壤修复中都需要大量的基础实验验证，本发明基于前期基础研究积累，通过采用大量不同的菌种复配试验，证明本发明采用复合菌种通过添加辅料制备温室大棚土壤修复组剂，温室大棚土壤修复组剂按照重量比配比由XHS0035Kc菌70份-80份、荧光假单胞菌20份-40份、胶冻样芽胞杆菌25份-45份和锁掷孢酵母菌15份-35份混合，菌种混合液充分吸附于载体大棚土壤中，并与选用合适的辅料相混合，通过工艺制备获得温室大棚土壤修复组剂，并通过大棚生产实践应用获得的温室大棚土壤修复组剂，对于有效改良和活化土壤、降解土壤中的有害物质、解决土壤的次生盐渍化问题等方面都具有重要的意义和作用。

实施例五：温室大棚土壤修复组剂的制备

(1)接种：制备枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434、荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌四种菌种的固体培养基，灭菌后严格进行无菌操作，从斜面转接至平板，温度28℃下培养3天。

(2)一级培养：从步骤(1)中的固体培养基上挑取单菌落转接至装有液体培养基的50mL锥形瓶中，无菌操作，28℃、120r/min培养24h-48h。

(3)二级发酵：将上述步骤一级培养菌种接种于盛有液体培养基的500mL锥形瓶中，无菌操作，28℃、120r/min培养24h-48h。

(4)菌种发酵液的配伍：按照重量份比核计，选用步骤(3)制备的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434二级发酵液70份、荧光假单胞菌二级发酵液40份、胶冻样芽胞杆菌二级发酵液45份和锁掷孢酵母菌二级发酵液35份进行混合，制备复合菌种的混合液。

(5)添加辅料：将步骤(4)制备的复合菌种混合液充分吸附于载体中，载体选用温室大棚土壤；辅料采用尿素和过磷酸钙，其中尿素与过磷酸钙的重量比为1:3；载体和辅料的用量按照重量比为1:3.5配比混合，加水至含水量40-70％，然后按体积比每立方米载体与辅料混合用料加入上述步骤(4)制备的复合菌种混合液100-300g，并混合均匀，制备获得温室大棚土壤修复剂。

同时，进一步，本发明提供温室大棚土壤修复组剂的应用方法：在空气温度28℃下堆制；堆制是在覆盖草帘下进行，堆制开始后每30天翻堆一次，翻堆时补水至含水量60％，堆制时间持续120天；堆制完成后摊晾至干燥后即可直接施用于土壤。

实施例六：土壤修复组剂对温室大棚土壤的修复作用

1、试验设计与处理

本试验在库尔勒市的塑料温室大棚中进行(30m×70m)。表层土壤(0～15cm)的性质如表1。在本研究以前，温室土壤已连续种植过2季黄瓜。

试验共有3个处理和1个对照，即：对照组、市售土壤修复剂组、枯草芽孢杆菌单菌种制备的土壤修复剂组和本发明制备的土壤修复组剂组。4次重复，共16个小区，每个小区45m²，试验采取完全随机区组排列。为了减少边际效应，小区之间留1.2m的缓冲区。

所述的枯草芽孢杆菌菌种土壤修复剂制备为：制备枯草芽孢杆菌菌种的固体培养基，灭菌后严格进行无菌操作，从斜面转接至平板，温度28℃下培养3天；经过一级培养和二级培养制备枯草芽孢杆菌XHS0035Kc液体菌液；将制备的菌种枯草芽孢杆菌XHS0035Kc菌液充分吸附于载体中，载体为温室大棚土壤，辅料为尿素和过磷酸钙，其中尿素与过磷酸钙的重量比为1:3；载体和辅料的重量比为1:3.5；加水至含水量40-70％，然后按体积比每立方米加入土壤修复剂250g，并混合均匀，即为制备为枯草芽孢杆菌菌种土壤修复剂。

表1：温室土壤的理化性质

沙粒(％)	粉粒(％)	粘粒(％)	Ph	电导率	总碳(％)	总氮(％)	碳氮比
								22.5	36.3	41.2	7.88	0.87	1.57	0.41	3.87

2、试验过程

将于培养15d且生长均一的黄瓜幼苗按45000株每亩移栽入每个小区。在黄瓜生长期间采用沟灌保持田间持水70％-80％。在黄瓜结果初期，对黄瓜进行取样测定总生物量、蔓长、茎粗、叶面积指数和叶片数。黄瓜的产量采用累计法测定。

3、试验结果

(1)温室大棚土壤修复剂对温室黄瓜生长、产量和品质的影响

由表2可知，和对照相比，市售普通土壤修复剂、本发明制备的单菌种枯草芽孢杆菌土壤修复剂和本发明制备的温室大棚土壤修复组剂均可以显著提高黄瓜的产量。但是，市售普通土壤修复剂提高产量10.1％，采用单菌种枯草芽孢杆菌土壤修复剂提高产量为12.9％，同时本发明制备的温室大棚土壤修复组剂提高产量为15.9％，可见本发明制备的温室大棚土壤修复组剂明显优于市售普通土壤修复剂。温室大棚土壤修复剂处理均能显著降低黄瓜中硝酸盐。

表2：温室大棚土壤修复剂对温室黄瓜生长、产量和品质的影响

(2)温室大棚土壤修复剂对黄瓜营养成分的影响结果

由表3可以看出，温室大棚土壤修复剂对黄瓜果实中氮和锰含量均没有显著性影响。和对照相比，能够降低黄瓜果实中的铜含量。可见，本发明制备的土壤修复组剂能够改善温室大棚的土壤质量，修复温室大棚的土壤。

表3：温室大棚土壤修复剂对黄瓜营养成分的影响

通过上述系列实施例试验验证获得本发明筛选选育驯化获得的枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)XHS0035KcCGMCCNO.9434的菌株具有较强的生长繁殖能力，生长速率快，遗传特性稳定，并对土壤修复有特定的作用，是一种单菌剂土壤修复剂；通过实践与其他荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌四种菌种融合试验，实践证明制备的土壤修复组剂应用于改良温室大棚的土壤，对于改良和活化土壤、降解土壤中的有害物质、解决土壤的盐渍化问题，将土壤对果蔬生产中的不利影响降低到最低限度,有利于提高蔬菜的产量和品质，获得显著突出的技术效果，因此在温室大棚土壤修复中具有广泛而适用的价值。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

SEQUENCELISTING

<110>新疆惠森生物技术有限公司

<120>一种枯草芽孢杆菌及其在温室大棚土壤修复中的应用

<130>枯草芽孢杆菌

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1420

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌

<220>

<221>16SrDNA

<222>(1)..(1420)

<400>1

tgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagta60

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Claims (6)

1.一种适用于温室大棚土壤修复的枯草芽孢杆菌（BacillusSubtilis）XHS0035Kc，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌（BacillusSubtilis）XHS0035Kc保藏编号为CGMCCNO.9434。

2.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌（BacillusSubtilis）XHS0035Kc的基因序列如SEQUENCELISTING。

3.如权利要求1所述枯草芽孢杆菌（BacillusSubtilis）XHS0035Kc在温室大棚土壤修复中的应用。

4.一种温室大棚土壤修复组剂，其特征在于，所述的温室大棚土壤修复组剂通过如下制备方法获得：

（1）接种：制备枯草芽孢杆菌（BacillusSubtilis）XHS0035KcCGMCCNO.9434、荧光假单胞菌、胶冻样芽胞杆菌和锁掷孢酵母菌四种菌种的固体培养基，灭菌后严格进行无菌操作，从斜面转接至平板，温度28℃下培养3天；

（2）一级培养：从步骤（1）中的固体培养基上挑取单菌落转接至装有液体培养基的50mL锥形瓶中，无菌操作，28℃、120r/min培养24h-48h；

（3）二级发酵：将上述步骤一级培养菌种接种于盛有液体培养基的500mL锥形瓶中，无菌操作，28℃、120r/min培养24h-48h；

（4）菌种发酵液的配伍：按照重量份比核计，选用步骤（3）制备的枯草芽孢杆菌（BacillusSubtilis）XHS0035KcCGMCCNO.9434二级发酵液70份-80份、荧光假单胞菌二级发酵液20份-40份、胶冻样芽胞杆菌二级发酵液25份-45份和锁掷孢酵母菌二级发酵液15份-35份进行混合，制备复合菌种的混合液；

（5）添加辅料：将步骤（4）制备的复合菌种混合液充分吸附于载体中，载体选用温室大棚土壤；辅料采用尿素和过磷酸钙，其中尿素与过磷酸钙的重量比为1:2.5；载体和辅料的用量按照重量比为1:3配比混合，加水至含水量40-70%，然后按体积比每立方米载体与辅料混合用料加入上述步骤（4）制备的复合菌种混合液100-300g，并混合均匀，制备获得温室大棚土壤修复组剂。

5.如权利要求4所述温室大棚土壤修复组剂的使用方法，其特征在于，所述的使用方法步骤如下：

将权利要求4制备的温室大棚土壤修复组剂在空气温度20-30℃下堆制；堆制是在覆盖草帘下进行，堆制开始后每30天翻堆一次，翻堆时补水至含水量40-70%，堆制时间持续120天；堆制完成后摊晾至干燥后即可直接施用于土壤。

6.如权利要求4所述温室大棚土壤修复组剂在温室大棚土壤修复中的应用。