CN102787089B

CN102787089B - 一株拜氏不动杆菌及其应用

Info

Publication number: CN102787089B
Application number: CN2012102791677A
Authority: CN
Inventors: 郭长虹; 刘佳莉; 方芳; 蔡洪生; 谢宝明
Original assignee: Harbin Normal University
Current assignee: Harbin Normal University
Priority date: 2012-08-07
Filing date: 2012-08-07
Publication date: 2013-10-09
Anticipated expiration: 2032-08-07
Also published as: CN102787089A

Abstract

本发明公开了一株拜氏不动杆菌及其应用。本发明提供的拜氏不动杆菌（Acinetobacterbeijerinckii）LJL-12，它的保藏编号为CGMCCNo.6291。拜氏不动杆菌LJL-12具有如下应用价值：可以在ACC作为唯一氮源的环境中生长，同时将ACC分解；可以合成IAA，且IAA合成量随着L-Trp浓度的增加而增加；可以合成嗜铁素；在石油污染的盐碱土中对燕麦的生长有促进作用。拜氏不动杆菌LJL-12有望在石油污染的盐碱土壤的植物修复中发挥重要作用。

Description

一株拜氏不动杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株拜氏不动杆菌及其应用。

背景技术

石油已经成为了人类生活必不可少的能源，为人类文明和社会进步做出了巨大的贡献。然而，由于各种原因使石油进入了环境，造成了环境的污染，给人类的生存带来了危害。土壤盐碱化目前也是世界性的土壤退化问题之一，土壤盐碱度是影响植物生长和产量的一个重要的环境因子，盐碱胁迫几乎会影响植物所有的重要生命过程，给农业生产造成了极大的损失。

污染土壤的植物修复因其费用低、效果好且不会造成二次污染而成为世界各国关注的焦点。而植物修复在实施过程中也存在问题，如石油及盐碱土壤的生物有效性低，使植物生长缓慢或不生长，生物量小等，这些都影响植物修复的效果。而石油及盐碱共同胁迫使修复更加困难。如何促进植物在石油盐碱共同胁迫情况下提高植物生长及对污染物的代谢是植物修复中的关键。

环境胁迫可以导致植物体内胁迫乙烯的大量积累，而过量的乙烯会导致植物根部的生长受阻。1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）是植物体内乙烯的合成前体，很多研究发现，多种植物根际促生细菌（PGPR）可分泌ACC脱氨酶（ACCD），将ACC分解为α-丁酮酸和氨，可减少胁迫乙烯的产生，促进植物的生长。因此，亟待开发能够在石油污染的盐碱土中有效促进植物生长的植物根际促生细菌。

发明内容

本发明的目的是提供一株拜氏不动杆菌及其应用。

本发明提供的拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii）LJL-12，已于2012年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.6291。拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii）LJL-12CGMCCNo.6291简称拜氏不动杆菌LJL-12。

本发明还保护拜氏不动杆菌LJL-12在促进植物生长中的应用。所述植物具体可为燕麦。所述促进植物生长具体可为促进植物在石油污染和/或盐碱性土壤中的生长。

本发明还保护一种植物生长促进剂，其活性成分为拜氏不动杆菌LJL-12。所述植物具体可为燕麦。所述活性成分具体可为将拜氏不动杆菌LJL-12悬浮于水中得到的菌悬液。所述菌悬液中，拜氏不动杆菌LJL-12的浓度具体可为10⁹CFU/mL。

本发明还保护所述植物生长促进剂在促进植物生长中的应用。所述植物具体可为燕麦。

以上任一所述燕麦具体可为品种Baiyan No.7。

拜氏不动杆菌LJL-12可用于生产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶和/或吲哚乙酸和/或嗜铁素。

应用拜氏不动杆菌LJL-12生产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶可包括如下步骤：

（1）将拜氏不动杆菌LJL-12悬浮于ADF培养液，振荡培养后收集菌体；

（2）将步骤（1）得到的菌体悬浮于0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)，加入甲苯并破碎细胞，得到1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶。

所述0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH=8.0)和所述甲苯的加入量配比具体可为:600μL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)：30μL甲苯。

步骤（1）中，所述破碎细胞的方法具体可为采用涡旋震荡仪振荡30s。

应用所述拜氏不动杆菌LJL-12生产吲哚乙酸具体可包括如下步骤：将拜氏不动杆菌LJL-12接种于含有色氨酸的DF培养液，培养后得到吲哚乙酸。所述色氨酸在所述DF培养液中的浓度具体可为50-500μg·mL^-1。所述培养的条件可为：室温培养2天。所述培养的条件具体可为：28℃、180r·min^-1振荡培养2天（48小时）。

应用所述拜氏不动杆菌LJL-12生产嗜铁素具体可包括如下步骤：将拜氏不动杆菌LJL-12接种于MKB培养基，培养过后得到嗜铁素。所述培养的条件可为：室温培养2天。所述培养的条件具体可为：28℃、180r·min^-1振荡培养2天（48小时）。

本发明还保护拜氏不动杆菌LJL-12的发酵液。所述发酵液是将拜氏不动杆菌LJL-12接种于发酵培养基并进行发酵后得到的。所述发酵培养基具体可为含有色氨酸的DF培养液或MKB培养基。所述色氨酸在所述DF培养液中的浓度具体可为50-500μg·mL^-1。所述发酵的条件可为：室温培养2天。所述发酵的条件具体可为：28℃、180r·min^-1振荡培养2天。所述发酵液中含有吲哚乙酸或嗜铁素。

本发明还保护拜氏不动杆菌LJL-12的细胞破碎物。所述细胞破碎物中含有1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶。

拜氏不动杆菌LJL-12具有如下应用价值：可以在ACC作为唯一氮源的环境中生长，同时将ACC分解；可以合成IAA，且IAA合成量随着L-Trp浓度的增加而增加；可以合成嗜铁素；在石油污染的盐碱土中对燕麦的生长有促进作用。拜氏不动杆菌LJL-12有望在石油污染的盐碱土壤的植物修复中发挥重要作用。

附图说明

图1为拜氏不动杆菌LJL-12在ADF培养基上的生长状况。

图2为拜氏不动杆菌LJL-12在不同浓度L-Trp中IAA合成量的变化。

图3为拜氏不动杆菌LJL-12在铬天青S固体培养基平板上形成橘黄色晕圈。

图4为拜氏不动杆菌LJL-12对燕麦促生30天时盆栽效果。

图5为拜氏不动杆菌LJL-12对燕麦促生50天时盆栽效果。

图6为拜氏不动杆菌LJL-12对燕麦促生80天时盆栽效果。

图7为拜氏不动杆菌LJL-12在石油污染盐碱土壤中对燕麦植株生长的影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

1-氨基环丙烷-1-羧酸，英文名称为1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，简称为ACC：购于上海笛柏化学品技术有限公司，货号为P201735。哌嗪-1,4-二乙磺酸，英文名称为piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid），简称为PIPES：购于Sigma公司，货号为MFCD06658739。

TSB培养液（pH7.5）：取胰蛋白胨17.0g、大豆胨3.0g、NaCl 5.0g、葡萄糖2.5g、K₂HPO₄ 2.5g，加入蒸馏水并用蒸馏水定容至1000mL。

DF培养液（pH7.5）：取KH₂PO₄4.0g、Na₂HPO₄6.0g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、FeSO₄·7H₂O0.1mg，葡萄糖2.0g、葡萄糖酸2.0g、柠檬酸2.0g、(NH₄)₂SO₄2.0g、0.1mL微量元素溶液，加入蒸馏水并用蒸馏水定容至1000mL。

ADF培养液（pH7.5）：用3.0mmol ACC替代DF培养液中的2.0g (NH₄)₂SO₄，其它完全同DF培养液；ADF培养液中ACC为唯一氮源。

微量元素溶液：取H₃BO₃10mg、MnSO₄11.2mg、ZnSO₄124.6mg、CuSO₄78.2mg和MoO₃10mg，加入蒸馏水并用蒸馏水定容至100mL。

MKB培养基（pH7.2）：取酸水解酪蛋白5g、甘油15mL、K₂HPO₄2.5g、MgSO₄·7H₂O 2.5g，加入蒸馏水并用蒸馏水定容至1000mL。

实施例1、拜氏不动杆菌LJL-12的分离和鉴定

一、菌株LJL-12的获得

1、取样

土壤取自黑龙江省大庆市采油厂附近盐碱土中生长的稗草的根际土，将根际土装入灭过菌的采集瓶中带回实验室，放入4℃冰箱保存备用。

2、筛选和纯化

（1）取1g根际土样于50mL PAF培养基中，28℃振荡培养。PAF培养基含有蛋白胨、酪蛋白水解物、MgSO₄、K₂HPO₄和甘油。

（2）取1mL（1）震荡后的PAF培养液，于50mL PAF培养基中，28℃振荡培养。

（3）取1mL（2）得到的PAF培养液，于50mL DF盐培养液中，28℃振荡培养。DF盐培养液含有KH₂PO₄、Na₂HPO₄、MgSO₄、FeSO₄、葡萄糖、葡萄糖酸、柠檬酸、(NH₄)₂SO₄、H₃BO₃、MnSO₄、ZnSO₄、CuSO₄和MoO₃。

（4）取1mL（3）得到的DF盐培养液，于50mL不含(NH₄)₂SO₄但含有3mM 1-氨基环丙烷-1-羧酸的上述DF盐培养液中，28℃振荡培养。

（5）取1mL（4）得到的培养液，涂布于含3mM ACC的DF盐琼脂培养基上，28℃培养。

（6）取（5）培养基上生长的菌落，纯化并得到纯培养的菌株。

将得到的一株菌命名为LJL-12。

二、菌株LJL-12的鉴定

1、形态鉴定

菌株菌株LJL-12在ADF培养基上形成圆形、不透明、灰白色、突起光滑、边缘整齐、有粘性的菌落（图1）。

2、分子鉴定

提取菌株LJL-12的基因组DNA，进行16S rDNA的PCR扩增和测序。

PCR扩增采用的引物如下：

F8：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

F1541：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。

PCR扩增条件：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃90s，30个循环；72℃10min。

对PCR扩增产物进行测序，测序结果如序列表的序列1所示。

三、菌株LJL-12的保藏

通过步骤二的鉴定，菌株LJL-12属于拜氏不动杆菌（Acinetobacterbeijerinckii）。

拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii）LJL-12，已于2012年6月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCCNo.6291。拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii）LJL-12CGMCC No.6291简称拜氏不动杆菌LJL-12。

实施例2、拜氏不动杆菌LJL-12生产ACC脱氨酶的能力

实验机理：1-氨基环丙烷-1-羧酸在ACC脱氨酶的作用下，降解生成α-丁酮酸（α-KA）和氨气。

实验步骤如下：

1、将拜氏不动杆菌LJL-12在TSB培养液中过夜培养，4℃离心收集菌体并用DF培养液洗涤三次。

2、将步骤1得到的菌体重新悬浮于ADF培养液，室温(21士1℃)振荡培养2d，4℃离心收集菌体，用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.6)洗涤三次。

3、将步骤2得到的菌体重新悬浮于600μL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，加入30μL甲苯并迅速振荡30s（采用涡旋震荡仪）以破碎细胞，整个破碎后体系即为细胞提取物。

4、分组处理

实验组：取200μL细胞提取物，加入20μL 0.5mol/L ACC水溶液并混匀，30℃培养15min（即反应时间为15min，也就是0.25小时）；然后加入1mL 0.56mol/L HCl水溶液，16000g离心5min，取上清液；取1mL上清液，加入800μL 0.56mol/L HCl水溶液和300μL 2，4-二硝基苯肼溶液（溶剂为2M HCl水溶液），30℃培养30min，加入2mL 2mol/L NaOH水溶液，540nm测吸光度，得到OD_540nm数值。

空白对照组：用20μL水代替20μL 0.5mol/L ACC水溶液，其它同实验组。

采用α-丙酮酸标准品代替以上细胞提取物进行步骤4的实验组相同的实验并制作标准曲线，标准曲线方程（方程甲）如下：y=3.6928x-0.035（R²=0.9879），其中x代表OD_540nm数值，y代表α-丁酮酸含量（μmol）。

采用考马斯亮蓝法（Bradford法）检测细胞提取物的总蛋白含量。以采用牛血清白蛋白为标准品，制作标准曲线，标准曲线方程（方程乙）如下：y=205.73x-1.3251（R²=0.9846），其中x代表OD_595nm数值，y代表蛋白含量（mg）。

ACC脱氨酶活性的计算方法如下：将（实验组的OD_540nm数值-空白对照组的OD_540nm数值）的结果代入方程甲，得到数值A；将细胞提取物的总蛋白含量作为数值B；用数值A除以数值B，再除以反应时间（0.25小时），得到的结果即为ACC脱氨酶活性，单位为μmolα-KA·(mg蛋白质·h)^-1。

拜氏不动杆菌LJL-12得到的细胞提取物具有ACC脱氨酶活性，数值为14.94μmolα-KA·(mg蛋白质·h)^-1。

实施例3、拜氏不动杆菌LJL-12生产生长激素（吲哚乙酸，IAA）的能力

1、将拜氏不动杆菌LJL-12在DF培养液中28℃、180r·min^-1振荡培养2d，再微量转入添加不同浓度色氨酸(L-Trp)的DF培养液(L-Trp 的浓度为0、50、100、200或500μg·mL^-1)中继续28℃、180r·min^-1振荡培养2d，取样测菌液OD₆₀₀（OD_600nm数值），其余培养液室温下8000g离心取上清液。

2、取500μL步骤1的上清液，添加2mL Salkowski试剂(每升含150mL H₂SO₄、250mLddH₂O和7.5mL 0.5mol/L FeC1₃水溶液，其余为水)，室温黑暗培养20min在535nm处测吸光度(OD_535nm数值)。

将DF培养液代替步骤1的上清液进行步骤2的实验，作为测吸光度的调零处理。

将不同浓度的IAA水溶液代替步骤1的上清液进行步骤2的实验，制作标准曲线，标准曲线方程如下：y=0.1701x-0.0237（R²=0.9855），其中x代表OD_535nm数值，y代表IAA浓度（μg·mL^-1）。

对照标准曲线，计算步骤1得到的上清液中的IAA浓度。将IAA浓度除以OD_600nm数值，结果见表1和图2。

表1步骤1得到的上清液中的IAA浓度，单位为μg·(mL·OD₆₀₀)^-1

结果表明，拜氏不动杆菌LJL-12能产生吲哚乙酸，且随着L-Trp浓度的增加，吲哚乙酸合成量也随之增加。

实施例4、拜氏不动杆菌LJL-12生产嗜铁素的能力

某些菌株通过产生嗜铁素(Siderophores)与环境中的铁离子高度结合，使植物病原菌缺乏铁营养而不能生长繁殖，从而占据一定的生态位。

一、铬天青S固体培养基平板的制备

1、蓝色染液的制备

（1）将0.06g铬天青S(chrome azurol S)溶于50ml去离子水。

（2）取0.0027g FeCl·6H₂O溶于10ml 10mM HCl水溶液（溶剂为去离子水）。

（3）取0.073g CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)溶于40ml去离子水。

（4）将全部步骤（1）的溶液与9ml步骤（2）的溶液混合，再混合全部步骤（3）的溶液，此时为蓝色，121℃灭菌20min。

2、铬天青S固体培养基平板的制备

（1）MM9培养液：将15g KH₂PO₄、25g NaCl和50g NH₄Cl溶于500ml去离子水。

（2）将20g葡萄糖溶于100mL去离子水，110℃灭菌。

（3）将3g酪蛋白水解物溶于27ml去离子水，滤膜过滤并收集滤液。

（4）铬天青S固体培养基平板的制备

将100ml MM9培养液与750ml去离子水混匀，然后加入32.24g PIPES并使其溶解，加入15g琼脂，121℃灭菌20min后冷却到50℃，然后加入30ml步骤（3）得到的滤液和10ml 步骤（2）得到的溶液，然后缓慢加入100ml步骤1制备的蓝色染液(沿玻璃瓶壁加入，充分混匀)，倒板。

二、拜氏不动杆菌LJL-12生产嗜铁素的能力

将拜氏不动杆菌LJL-12接种至于铬天青S固体培养基平板上，28℃培养48h,观察菌落周围的颜色变化，如有橘黄色圈产生说明拜氏不动杆菌LJL-12产生了嗜铁素。

28℃培养48h后的照片见图3。拜氏不动杆菌LJL-12菌落周围有橘黄色晕圈产生，即拜氏不动杆菌LJL-12可产生嗜铁素。

三、CAS检测液的制备

1、将0.182g CTAB溶于50ml去离子水。

2、将0.0054g FeCl·6H₂O溶于20ml 10mM HCl水溶液。

3、将0.0605g铬天青S溶于50ml去离子水。

4、将1.5ml步骤2得到的溶液与7.5ml步骤3得到的溶液混合，再与6ml步骤1得到的溶液混合，得到混合液。

5、将4.307g PIPES用20-30ml去离子水溶解，加入6.25ml浓HCl，调pH为5.6。

6、将全部步骤4得到的溶液和全部步骤5得到的溶液混合，并用去离子水定容至溶100ml。

四、拜氏不动杆菌LJL-12生产嗜铁素的能力

1、将拜氏不动杆菌LJL-12接种于MKB培养基，28℃、180r·min^-1振荡培养48h，离心（10000rpm/min，10min）取上清液。

2、将步骤1得到的上清液与CAS检测液等体积混匀，28℃静置1h，然后在630nm处测吸光值（OD_630nm数值），结果为A。

3、将MKB培养基与CAS检测液等体积混匀，28℃静置1h，然后在630nm处测吸光值（OD_630nm数值），结果为Ar。

A/Ar值越小，说明合成嗜铁素能力越强。拜氏不动杆菌LJL-12的A/Ar值为1.83，说明其具有一定的合成嗜铁素的能力。

实施例5、拜氏不动杆菌LJL-12对燕麦的促生效果

土壤（盐碱土壤）取于黑龙江省大庆市，采集样品时在每个区域内设置5个样方，样方面积为1×1m²，收集表层土壤（0~20cm），土壤混合后，装入事先准备好的干净保鲜袋中，迅速将土样带回实验室，经碾碎，混匀，风干后过筛保存。土壤的理化性质见表2。

表2土壤理化性质

pH	有机质（g/kg）	氮（mg/kg）	磷（mg/kg）	钾（mg/kg）	盐（g/kg）
						7.9	18.22	176.4	21.1	176	0.37

一、拜氏不动杆菌LJL-12菌液的制备

将拜氏不动杆菌LJL-12接种于TSB培养液，28℃下振荡培养，4℃离心收集菌体，用无菌水洗涤2次后重悬浮于无菌水中，使活菌数在无菌水中的终浓度达10⁹CFU/mL，即为拜氏不动杆菌LJL-12菌液。

二、浸种实验

燕麦种子(Avena sativa cv.)Baiyan No.7购于黑龙江省农业科学院。

将燕麦种子用0.5%(体积比)次氯酸钠水溶液表面消毒10min，用无菌水洗涤，然后分组处理（每组50粒种子）：实验组：用步骤一制备的菌液浸泡2h；对照组：用无菌水浸泡1h。

然后将处理后的燕麦种子均匀种在盆中（填充物为添加石油的土壤，每千克干重的土壤添加3.75g石油），每盆10株，每组种植5盆，于培养室内25℃培养，隔天浇水。分别于发芽30天、50天和80天后拍照并测量株高，并于发芽80天后测量植株的地上部分鲜重、植株的地上部分干重、植株的根干重和植株的根鲜重（地上部分鲜重、地上部分干重、根干重和根鲜重均以10个植株的重量计）。

发芽30天后的照片见图4，发芽50天后的照片见图5，发芽80天后的照片见图6。

进行三次重组实验，结果取平均值。

各个时间的株高统计见表3。

表3拜氏不动杆菌LJL-12对燕麦平均株高（cm）的影响

	30天	50天	80天
				对照组	12.24±2.20b	16.98±4.44b	40.38±7.86b
实验组	14.57±1.74a	19.42±2.44a	46.64±4.68a

注：表中字母表示在0.05水平上的显著差异。

结果表明，拜氏不动杆菌LJL-12对燕麦的株高具有显著的促进作用。在30天时，与对照相比，株高增加19.04%，50天时株高增加14.37%，80天时株高增加15.50%。

植株地上部分鲜重、植株地上部分干重、植株根干重和植株根鲜重的测量结果见图7。拜氏不动杆菌LJL-12对燕麦的地上部分鲜重及干重、根鲜重及干重均具有显著的促进作用。经拜氏不动杆菌LJL-12处理的燕麦，与对照相比，植株地上部分鲜重增加6.59%，根鲜重增加5.65%。

Claims

1.拜氏不动杆菌（Acinetobacter beijerinckii）LJL-12，它的保藏编号为CGMCCNo.6291。

2.权利要求1所述拜氏不动杆菌LJL-12在促进植物生长中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述植物为燕麦。

4.一种植物生长促进剂，其活性成分为权利要求1所述拜氏不动杆菌LJL-12。

5.如权利要求4所述的植物生长促进剂，其特征在于：所述植物为燕麦。

6.权利要求4所述植物生长促进剂在促进植物生长中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述植物为燕麦。

8.权利要求1所述拜氏不动杆菌LJL-12在生产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶和/或吲哚乙酸和/或嗜铁素中的应用。

9.权利要求1所述拜氏不动杆菌LJL-12的发酵液。

10.权利要求1所述拜氏不动杆菌LJL-12的细胞破碎物。