CN108239610A - 一株耐低温解磷菌及其进行农田解磷的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株耐低温的将不溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的耐低温解磷菌菌株。包括以下步骤：耐低温解磷细菌的富集分离‑筛选纯化‑解磷能力检测‑菌株鉴定。该方法可在低温条件下(15℃)将不溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐，从而减少磷肥使用，降低土壤板结情况。

Description

一株耐低温解磷菌及其进行农田解磷的方法

技术领域

本发明属于应用微生物学科领域，涉及一株耐低温解磷菌，该菌株可在低温条件下将不溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的耐低温解磷菌。

背景技术

磷作为农作物生长的最主要营养元素之一，在植物的光合作用和生长的生物生化过程发挥这不可替代作用。但是在我国的土壤中能被直接利用的磷元素很少，我国有74％的耕地土壤缺磷，有95％及其以上的磷以难以利用的无效形式存。目前对于农业来说，施用磷肥是保证增产的有效措施，但是由于受制于土壤的酸碱性和磷在土壤的富集存在形态，70％～90％的易于形成不被利用的固态磷。同时过量的使用磷肥还有或多或少的弊端，会给生态环境特别是生物微循环造成一定的破坏作用。

其中主要存在的问题有：

1.大量的施用磷肥，这类磷以磷酸盐的形式存在，易于与土壤中的Fe³⁺、Ca²⁺、Al³⁺形成不溶性磷酸盐，不仅不利于对微量元素和有效磷的吸收，而且长时间施用易造成土壤的板结。2.大量磷不能被植物利用，随着雨水的冲刷，这些磷进入到水体中，易于造成水的富营养化，造成严重的水体污染。3.由于有效磷的当季利用率为8％，长时间磷的利用率也不会超过25％，易形成不溶性的磷酸盐，潜在的造成资源的浪费。

因此寻找一种清洁高效的提高磷肥资源利用率，特别是利用潜在的不溶性磷酸盐的方法，提高粮食产量势在必行。相比较于外部强加改变土壤的方法，从土壤自身寻求改变目前利用磷肥不利局面的方法，更有利于土壤肥效的改变，农作物的增产。微生物的方法就是一种不错的选择，解磷微生物在自然中就存在于农作物的根际土壤中，但是受制于生存环境和自然条件，特别是低温的影响，解磷微生物往往生长条件较差，并不能完全发挥将土壤中不溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的功效。因此，筛选出一株耐低温的具有解磷能力的细菌，将是解决上述问题的关键因素。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一株耐低温解磷菌，该菌能够在低温条件下将不溶性或者微溶性磷酸盐转变为可溶性磷酸盐。

本发明的第二个目的是提供一种可以富集、分离、培养该细菌的培养基。

本发明的第三个目的是提供一种利用该菌原位修复治理农田重金属污染的方法。

为了实现上述目的，本发明提供一株耐低温解磷菌，分类命名为：Paenibacilluscineris GRINML1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCC No.13063。

本发明的耐低温解磷菌GRINML1的菌落特征为：在固体培养基上31℃生长较快，能够耐受15℃低温，3天后菌落直径约为3mm，解磷圈直径为7mm，菌落呈规则圆形，颜色为蓝色，质地致密，透明圈为圆形，紧贴着菌落生长。

用于富集、分离培养上述述耐低温解磷菌的培养基，该培养基的配方为：10重量份葡萄糖，5重量份磷酸钙，0.3重量份七水硫酸镁，0.5重量份硫酸铵，0.3重量份氯化钠，0.3重量份氯化钾，0.002重量份硫酸锰，0.03重量份七水硫酸亚铁，1重量份酵母提取物，1000重量份蒸馏水，pH7.0～7.5，使用前将其115℃灭菌30min。

用于富集培养上述耐低温解磷菌的方法，将上述耐低温解磷菌接种入上述的培养基中，在15-18℃的培养温度下，100rpm摇床培养至菌浓度为10⁸个/mL。

本发明还提供一种利用上述耐低温解磷菌进行农田解磷的方法，其特征在于，将上述耐低温解磷菌的菌种，采用如上述的方法进行富集培养后，接种菌液至农田。

优选地，接种农田的接种量为每m²面积1-100L。

优选地，接种农田的接种量为每m²面积10-30L。

本发明所用分离细菌的土壤来自于河南省某地的耕地，选取玉米、花生、豆角、红薯、杨树作物的根际土壤，经筛选分离后，得到一株耐低温的将不溶性的磷酸盐转化为可溶性磷酸盐的菌株，编号为2^#菌株。经过形态学鉴定、菌株的16S rDNA序列鉴定，将其鉴定为类芽孢杆，命名为类芽孢杆菌GRINML1菌株。经过查阅已经报道的解磷菌的解磷作用的相关文献，该菌株具有较好的解磷功效。实验结果表明：原始菌株在液体培养基：pH7.3，温度15℃，摇床转速160r/min的条件下培养7天，其可溶态的磷含量最高为126.93mg/L。本解磷菌株的解磷能力在报道的耐低温解磷菌株中属于较高水平，为寒冷地区及南方冬季植物的解磷提供了可能性。

附图说明

图1为磷的标准曲线。

图2为本发明提供的耐低温解磷菌的解磷效果。

具体实施方式

本发明的工艺包括耐低温解磷菌的富集分离、筛选纯化、解磷能力检测以及鉴定，具体说明如下：

本发明所提供的耐低温解磷菌分类命名为：Paenibacillus cineris GRINML1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCCNo.13063。

实施例1耐低温解磷菌的富集分离

(1)培养基

固体培养基：10g/L葡萄糖，5g/L磷酸钙，0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，0.3g/L氯化钠，0.3g/L氯化钾，0.002g/L硫酸锰，0.03g/L七水硫酸亚铁，1g/L酵母提取物，琼脂20g，0.4％的溴酚蓝6mL，pH7.0～7.5。

液体培养基：10g/L葡萄糖，5g/L磷酸钙，0.3g/L七水硫酸镁，0.5g/L硫酸铵，0.3g/L氯化钠，0.3g/L氯化钾，0.002g/L硫酸锰，0.03g/L七水硫酸亚铁，1g/L酵母提取物，pH7.0～7.5。

上述培养基在高压灭菌锅中115℃灭菌30min备用，其中固体培养基制成平板培养基或试管斜面培养基。

(2)菌株的富集分离

本试验所用分离细菌的土壤来自于河南省某地的耕地，该耕地连续三年施用磷肥，选取玉米、花生、豆角、红薯、杨树作物的根际土壤。在离地表10～20cm处，完整挖出植物的根，采用斗根法抖掉块状较大的土块，将完整的根须连同粘连的根须土装入无菌封口袋种，在24h内通过冷链运输方式带回实验室并储存于4℃冰箱备用。

试验前，将根须上面粘连的土用刀片一点点的刮下来，颗粒稍大的碾碎，将玉米、花生、豆角、红薯、杨树根须土壤收集并混合均匀。准确称量35g的土放入装有200mL去离子水的250mL锥形瓶，并加入少量剪碎的根须。用磁力搅拌器在300r/min转速条件下搅拌土壤40min，静置分层。取上清液观察，菌量较少。

取20mL上清液于装有200mL上述液体培养基的250mL锥形瓶中，在15℃，160r/min的摇床富集培养三天，使菌液的浓度达到10⁸个/mL，取出摇瓶，取适量上清液分别进行10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，六个梯度的稀释。混合均匀后取20μl涂布于事先倒好的固体平板上，每个浓度重复三次，于15℃恒温固定培养箱培养5天，每天观察平板菌落的变化。

实施例2耐低温解磷菌的筛选纯化和鉴定

观察蓝色的固体平板上菌落的变化，筛选出有白色溶磷圈的蓝色菌落，用牙签挑取单个菌落在固体平板上进行点接，观察菌落直径(d)和溶磷圈直径(D)之比。挑选出比值最大的菌落，直径比为5:3。观察该菌落形态，并用光学显微镜观察菌株的形态，将所得的菌株的形态学特征《真菌鉴定手册对比(魏景超著)》，得到所要菌株的初步鉴定结果。然后再用PCR扩增菌株的16S rDNA序列并进行测序分析分析，序列如Seq ID No.1所示，将测序获得的16S序列到NCBI公共数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝Blast Search&LINK_LOC＝blasthome)进行比对，比对结果为Paenibacillus cineris，属于类芽胞杆菌，命名为GRINML1。将鉴定后菌株挑取单个克隆并转接于斜面培养，直至长出菌苔后放于冰箱于4℃保存，以供后面的实验取用。

实施例3分离微生物解磷能力的检测

(1)液体培养基摇瓶培养

将鉴定后菌株活化后，按5％的接种量接种于装有100mL液体培养基的250mL锥形瓶中，菌株设置两个重复摇瓶，于15℃，160r/min的摇床上培养7天，同时设置无菌对照组，从第三天起，每天同一时间取样测量可溶磷的含量。

(2)可溶性活性磷的测定(钼锑比色法)

主要试剂的配制：

钼酸铵溶液：将14g钼酸铵溶解于100mL去离子水中，冷却。若溶液变浑浊，重新配制。

H₂SO₄溶液：将150mL浓H₂SO₄(ρ＝1.84g/L)在搅拌下缓缓倒入300mL水中冷却。

酒石酸锑钾溶液：将3g的酒石酸锑钾溶解于100mL水中，完全溶解后保存于聚乙烯瓶中。若溶液变浑浊，重新配制。

钼酸铵—酒石酸锑钾混合溶液：将上述钼酸铵溶液缓缓倒入200mL H₂SO₄溶液中，向其中加入5mL的酒石酸锑钾溶液，混合均匀后倒入棕色试剂瓶中作为钼锑贮存液避光保存。若溶液变浑浊，重新配制。

抗环血酸溶液：10g抗坏血酸于100mL水中，充分混合后于棕色试剂瓶中保存作为钼锑抗显色剂。此溶液随配随用，若溶液变浑浊，重新配制。

磷酸盐标准贮备溶液：将烘干后的0.659g磷酸二氢钾溶解于5mL的H₂SO₄溶液中，溶解后用500mL的容量瓶定容。此溶液的浓度为0.300g/L，置于阴凉处保存。

磷酸盐标准使用溶液：用移液枪准确移取1.00mL的磷酸盐标准贮备液至100mL的容量瓶中加水定容。此溶液1.00mL含有3.00μg的的磷，于阴凉处保存。

(3)磷标准曲线的绘制：

依次吸取磷酸盐标准使用溶液0mL、0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、2.5mL、5mL、10mL、15mL、20mL于25mL的容量瓶中，分别向其加入0.5mL的钼锑混合液和0.5mL的康坏血酸溶液充分混匀后定容。此时各浓度依次为0mg/L、0.03mg/L、0.06mg/L、0.12mg/L、0.24mg/L、0.3mg/L、0.6mg/L、1.2mg/L、1.8mg/L、2.4mg/L。

待显色反应15min后，挑取浓度最大的注入比色皿中进行全波段扫面，在833nm处得到最大吸收峰。以833nm为光源，各浓度梯度为测量值，以浓度为0作参比，测量其吸光度值。以磷浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制磷标准曲线。得到磷标准曲线函数为Abs＝K1*f(C)+KO，其中KO＝-0.02423，K1＝0.67603，拟合度R^2＝0.9991。符合标准曲线的要求，磷标准曲线如图1所示。

(4)样品的测定

因为土壤中的不溶性磷酸盐大部分以磷酸钙的形式存在，在检测细菌的解磷效果时，选用纯的磷酸钙为测量物，对比随着细菌作用的进行，可溶磷含量的变化即解磷效果的反应。

微生物培养三天后，从菌液样品中取5mL溶液于离心管中，在25℃，11000r/min离心5min。分别取100μL的上清液按照磷标准曲线的测量步骤测定吸光度，最后通过函数计算可溶性磷浓度的大小。

经过连续七天测量，无菌对照组可溶性磷酸盐浓度分别为11.18mg/L，13.4mg/L，13.4mg/L，11.92mg/L，16.36mg/L，12.66mg/L，15.25mg/L，13.77mg/L，Paenibacilluscineris组可溶性磷酸盐浓度分别为11.18mg/L，118.42mg/L，119.53mg/L，123.23mg/L，126.19mg/L，129.88mg/L，132.85mg/L，126.93mg/L。

具体使用时可将将该菌用液体培养基扩大培养接种入农田，接种量每m²面积土壤接种1-100L菌液，优先为10-30L，更优选为25L。

从上述实施例可以看出，本发明提供的耐低温解磷菌GRINML1可以将被固定的磷转化为可溶性磷，为植物生长提供缓释而有效的磷，减少普通磷肥的用量，减少土壤板结的情况，同时其能够适应寒冷地区和南方冬季农作物的种植。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京有色金属研究总院

<120> 一株耐低温解磷菌及其进行农田解磷的方法

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1395

<212> DNA

<213> Paenibacillus cineris

<400> 1

cagtcgagcg gacttgatgg agagcttgct ctcctgatgg ttagcggcgg acgggtgagt 60

aacacgtagg caacctgcct gcaagaccgg gataacccac ggaaacgtga gctaataccg 120

gatatctcat ttcctctcct gaggggatga tgaaagacgg agcaatctgt cacttgcgga 180

tgggcctgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta 240

gccgacctga gagggtgaac ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt agggaatctt ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcaac gccgcgtgag 360

tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgccaggga agaacgtccg atagagtaac 420

tgctatcgga gtgacggtac ctgagaagaa agccccggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt agggggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 540

tcatttaagt ctggtgttta aggccaaggc tcaaccttgg ttcgcactgg aaactgggtg 600

acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatgt 660

ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tgggctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag 720

cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatgctag 780

gtgttagggg tttcgatacc cttggtgccg aagttaacac attaagcatt ccgcctgggg 840

agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcagtggagt 900

atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc cctctgaccg 960

gtctagagat agccctttcc ttcgggacag aggagacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020

ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga ttttagttgc 1080

cagcacttcg ggtgggcact ctagaatgac tgccggtgac aaaccggagg aaggcgggga 1140

tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtactaca atggccagta 1200

caacgggaag cgaagccgcg aggtggagcc aatcctatca aagctggtct cagttcggat 1260

tgcaggctgc aactcgcctg catgaagtcg gaattgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320

gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttacaac 1380

acccgaagtc ggtga 1395

Claims (6)

1.一株耐低温解磷菌，其特征在于，分类命名为：Paenibacillus cineris GRINML1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2016年9月29日，保藏编号：CGMCCNo.13063。

2.用于富集、分离培养如权利要求1所述耐低温解磷菌的培养基，其特征在于，该培养基的配方为：10重量份葡萄糖，5重量份磷酸钙，0.3重量份七水硫酸镁，0.5重量份硫酸铵，0.3重量份氯化钠，0.3重量份氯化钾，0.002重量份硫酸锰，0.03重量份七水硫酸亚铁，1重量份酵母提取物，1000重量份蒸馏水，pH7.0～7.5，使用前将其115℃灭菌30min。

3.用于富集培养权利要求1所述耐低温解磷菌的方法，其特征在于，将如权利要求1所述耐低温解磷菌接种入如权利要求2所述的培养基中，在15-18℃的培养温度下，100rpm摇床培养至菌浓度为10⁸个/mL。

4.一种利用权利要求1所述耐低温解磷菌进行农田解磷的方法，其特征在于，将权利要求1所述耐低温解磷菌的菌种，采用如权利要求3所述的方法进行富集培养后，接种菌液至农田。

5.如权要求4所述的方法，其特征在于，接种农田的接种量为每m²面积1-100L。

6.如权要求4或5所述的方法，其特征在于，接种农田的接种量为每m²面积10-30L。