CN104498399A - 沼泽红假单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

沼泽红假单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沼泽红假单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法和应用，其中沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌LY-1（ Rhodopseudomonas palustris LY-1），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 2014524。本发明的沼泽红假单胞菌生防菌剂由沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到，具有生产成本低、无毒、环保、对烟草具有显著的促生效果，可应用于烟草促生和烟草花叶病毒病的防控。

Description

沼泽红假单胞菌菌株、生防菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及一种沼泽红假单胞菌菌株、沼泽红假单胞菌生防菌剂及其制备方法，还涉及沼泽红假单胞菌生防菌剂在农业病虫害防治中的应用。
背景技术
植物病毒病是“植物癌症”，对农业生产造成严重损失。植物病毒普遍具有系统侵染性和专性寄生性，因此造成抗病毒药剂的研发难度大、效果稳定性低等。在烟草的种植过程中，烟草花叶病毒（TMV）危害尤其严重。烟草花叶病毒病是世界性的重要烟草病害之一，分布范围广、发病危害严重，造成烟叶品质下降、产量降低等。
对于烟草花叶病毒病的防治，目前还以化学防治为主。但化学农药的投入，影响了农田生态系统的结构，破坏了农田生态系统平衡，从而影响农田生产的可持续性，降低了农产品的质量，且化学农药的不合理投入，对非靶标毒害及农产品残留超标，越来越受到人们关注。
微生物制剂是部分解决该问题的有效方法。然而，本领域的技术难题是，筛选环境友好型、高活性的微生物资源，微生物菌剂的高效发酵工艺，微生物菌剂的田间应用技术等。光合细菌（Photosynthetic Bacteria，PBS）是能在厌氧条件下进行不放氧气的光合作用的一类细菌的总称，是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物。其种类繁多、分布广泛，普遍存在于海洋、江河、湖泊、水田、活性污泥和土壤中，已知的光合细菌共有绿硫细菌科（Chlorobiaceae）、红硫细菌科（Chromatiaceae）、红螺菌科（Rhodospirillaceae）3个科。光合细菌复杂的代谢功能和独特的生理生态特性使其在农畜业、饲料、环保、食品加工、生物能源和医药保健等领域得到广泛应用。在农业生产方面，运用光合细菌进行种子种苗的处理、作物品质改良、土壤修复与增肥、病虫害防治、废水处理以及保障农产品安全是目前的研究热点。光合细菌本身无毒，具有固氮、固碳、促进硫循环作用，且富含B族维生素、泛酸、叶酸、类胡萝卜素、辅酶Q、脯氨酸、尿嘧啶、胞嘧啶等生理活性物质对提高土壤肥力、刺激植物细胞活性、促进根系发育、提高作物光合效率和生殖生长能力具有很强的促进功能。虽然，光合细菌在农业领域的应用研究得到深入展开，并为农产品的优质、安全、卫生提供了有力保证，但其农业病虫害的防治应用，特别是对植物病毒病防控的应用还未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种生产成本低，促进烟草生长且高效、无毒、环保的沼泽红假单胞菌菌株。另外提供一种利用沼泽红假单胞菌菌株制成的生防菌剂及生防菌剂的制备方法，具有生产工艺简单，成本低等优势。本发明还提供了前述生防菌剂在提高烟草产量和对烟草花叶病毒病防控方面的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种沼泽红假单胞菌菌株，沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌LY-1（Rhodopseudomonas palustris LY-1），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014524。
沼泽红假单胞菌菌株LY-1，具有以下主要特征：革兰氏阴性，经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为沼泽红假单胞菌，主要生物学特征有：双层固体平板培养基上培养4d～8d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm～0.60mm；液体培养基中培养7d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30℃～32℃，pH=7。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种沼泽红假单胞菌生防菌剂，沼泽红假单胞菌生防菌剂由前述的沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述沼泽红假单胞菌生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）活化：将权利要求1沼泽红假单胞菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；
（2）种子培养：将步骤（1）培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液；
（3）生产培养：将步骤（2）种子培养后得到的菌液按光合细菌菌株总体积5%的接种量接种到生产瓶中，以光合细菌生产培养基进行生产培养至对数生长期得到菌剂；
（4）离心：将步骤（3）生产培养得到的菌剂进行离心，取离心后的沉淀用灭菌后的NaCl溶液重悬获得菌悬液，即制得生防菌剂。
前述的制备方法，进一步的，步骤（2）中种子培养的温度为30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
前述的制备方法，进一步的，步骤（3）中生产培养的温度为30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
前述的制备方法，进一步的，步骤（4）中离心转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min。
前述的制备方法，进一步的，步骤（4）中NaCl溶液的质量百分含量为0.85%。
前述的制备方法，进一步的，步骤（4）中生防菌剂的浓度为5×106 cfu/mL。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述的生防菌剂或前述制备方法制得的生防菌剂在烟草促生中的应用。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种前述的生防菌剂或前述制备方法制得的生防菌剂在防控烟草花叶病毒病中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）本发明的沼泽红假单胞菌LY-1的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到用于烟草促生与烟草花叶病毒病防控的生防菌剂。
（2）本发明的沼泽红假单胞菌LY-1制得的生防菌剂具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点。
（3）本发明提供的沼泽红假单胞菌LY-1可以同时诱导烟草植株的SA和JA两个信号通路，激活植株的病程相关蛋白基因，从而提高植株本身的抗病能力，达到烟草促生和抑制烟草花叶病毒的目的。
一株沼泽红假单胞菌，其名称为沼泽红假单胞菌LY-1（Rhodopseudomonas palustris LY-1），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 2014524。保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2014年10月29日。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中沼泽红假单胞菌LY-1菌株的电子显微镜扫描图片。
图2为本发明实施例3中生防菌剂对烟草的田间促生试验结果图。
图3为本发明实施例4中生防菌剂在室内盆栽条件下对烟草花叶病毒病的防治效果对比图。
图4为本发明实施例4中生防菌剂在室内盆栽条件下诱导烟草病程相关蛋白基因PR-1a、PR-2、PR-3、PR-5、PAL基因表达电泳效果图，其中β-actin为内参基因。
图5为本发明实施例5中生防菌剂在田间试验中对烟草花叶病毒病的防治效果柱状图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一株沼泽红假单胞菌菌株，其名称为沼泽红假单胞菌LY-1，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为 CCTCC M 2014524，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为 2014年10月29日。
参见图1：沼泽红假单胞菌菌株LY-1为革兰氏阴性菌，经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为沼泽红假单胞菌。主要生物学特征有：双层固体平板培养基上培养4d～8d，形成红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm～0.60mm；液体培养基中培养7d呈深红色；在厌氧和微氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度30℃～32℃，pH=7。
实施例2：
一种沼泽红假单胞菌生防菌剂，采用实施例1的沼泽红假单胞菌菌株LY-1为原料，通过经活化、种子培养、生产培养、离心制备得到，其具体制备方法包括以下步骤：
（1）活化：将沼泽红假单胞菌LY-1菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：0.1wt%的（NH4）2SO4、0.02wt%的MgSO4、0.5wt%的NaHCO3、0.05wt%的K2HPO4、0.02wt%的NaCl、0.15wt%的酵母膏和1.5wt%的琼脂，pH=7.0。
（2）种子培养：将步骤（1）培养出的红色单菌落接入至120mL血清瓶中，在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH=7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液。光合细菌液体培养基的配方为：0.1wt%的（NH4）2SO4、0.02wt%的MgSO4、0.5wt%的NaHCO3、0.05wt%的K2HPO4、0.02wt%的NaCl、0.15wt%的酵母膏，pH=7.0。
（3）生产培养：将步骤（2）种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基（培养基成分与上述光合细菌液体培养基一致）进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5%，在温度为30℃～32℃、光照条件为2500Lx～4000Lx、pH=7.0条件下，培养至对数生长期得到菌剂。
（4）离心：将步骤（3）生产培养得到的菌剂进行8000rpm、4℃、15min离心后，弃上清，沉淀用灭菌后的0.85%NaCl溶液重悬获得菌悬液，将菌悬液配制成浓度为5×106 cfu/mL，即制得生防菌剂。
实施例3：沼泽红假单胞菌LY-1生防菌剂在烟草促生中的应用。
分别将实施例2的生防菌剂稀释成浓度分别为5×106 cfu/mL、2.5×106 cfu/mL、1.25×106 cfu/mL。
在无烟草花叶病毒病流行的田间，将浓度分别为5×106 cfu/mL、2.5×106 cfu/mL、1.25×106 cfu/mL的生防菌剂叶面喷施于移栽15d后的烟草苗，每亩60L，每隔15d喷施一次，共施用3次。另设0.85%NaCl溶液处理和清水空白对照，均按同样的方法喷施烟草。45d后，考察烟草的田间促生试验结果。
参见图2，其中CK为清水对照，编号1、编号2、编号3分别表示5×106 cfu/mL、2.5×106 cfu/mL、1.25×106 cfu/mL的生防菌剂叶面喷施组， 柱上不同小写字母表示差异显著性（P<0.05）。从图2中可以知道施用各生防菌剂处理后的烟草叶片鲜重相对于清水对照增加23%、20%、9%；0.85%NaCl溶液处理后的烟草叶片鲜重相对于清水对照无显著性提高。
实施例4：沼泽红假单胞菌LY-1生防菌剂室内条件下诱导烟草产生对烟草花叶病毒的抗性。
温室条件下，烟苗移栽后长至12叶期，将实施例2制得的浓度为5×106 cfu/mL的沼泽红假单胞菌LY-1生防菌剂，按10mL/株、每5d一次喷施叶面，进行诱导处理，共诱导3次。空白对照为0.85%NaCl溶液。完成诱导处理3d后采用石英砂摩擦接种法以TMV浓度200 pg/mL（ELISA定量测定）、10μL/叶对烟苗第5、6、7叶进行摩擦接种。接种TMV分别在6h、12h、18h、24h后采集烟草叶片测定烟草病程相关蛋白基因PR-1a、PR-2、PR-3、PR-5、PAL基因表达。
图3为沼泽红假单胞菌LY-1生防菌剂在室内盆栽条件下对烟草花叶病毒病的防治效果对比图。从图3中可以看出，本发明提供的沼泽红假单胞菌LY-1烟草花叶病毒的防治作用明显。
图4为沼泽红假单胞菌LY-1生防菌剂在室内盆栽条件下诱导烟草病程相关蛋白基因PR-1a、PR-2、PR-3、PR-5、PAL基因表达电泳效果图，其中β-actin为内参基因测定结果显示。从图4中可知：实施例2的生防菌剂诱导处理可以提高和提前烟草叶片内病程相关蛋白基因的表达，并且能诱导烟草产生对烟草的抗病性。
实施例5：沼泽红假单胞菌LY-1生防菌剂在防控烟草花叶病毒病中的应用。
在烟草花叶病毒病流行的田间，将实施例2制得的沼泽红假单胞菌LY-1生防菌剂配制成浓度分别为5×106 cfu/mL、2.5×106 cfu/mL的生防菌剂叶面喷施于移栽15d后的烟草苗，每亩65L，每隔15d喷施一次，共施用3次。另设0.85%NaCl溶液处理和清水空白对照，均按同样的方法喷施烟草。60d后，按5点法取样计算烟草花叶病毒病病情指数，并计算相对清水空白对照的防治效果。
图5为田间试验中对烟草花叶病毒病的防治效果柱状图，编号1、编号2分别表示5×106 cfu/mL、2.5×106 cfu/mL生防菌剂叶面喷施组，柱上不同小写字母表示差异显著性（P<0.05）。从图5中可知：施用各生防菌剂处理后防治效果为46%、29%。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

Claims (10)

1.一种沼泽红假单胞菌菌株，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌菌株为沼泽红假单胞菌LY-1（Rhodopseudomonas palustris LY-1），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2014524。
2.一种沼泽红假单胞菌生防菌剂，其特征在于，所述沼泽红假单胞菌生防菌剂由权利要求1所述的沼泽红假单胞菌菌株经活化、种子培养、生产培养、离心后制备得到。
3.一种权利要求2所述沼泽红假单胞菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）活化：将权利要求1所述沼泽红假单胞菌菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；
（2）种子培养：将步骤（1）培养出的红色单菌落接入至血清瓶中，以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液；
（3）生产培养：将步骤（2）种子培养后得到的菌液按光合细菌菌株总体积5%的接种量接种到生产瓶中，以光合细菌生产培养基进行生产培养至对数生长期得到菌剂；
（4）离心：将步骤（3）生产培养得到的菌剂进行离心，取离心后的沉淀用灭菌后的NaCl溶液重悬获得菌悬液，即制得生防菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述种子培养的温度为30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中所述生产培养的温度为30℃～32℃，光照条件为2500Lx～4000Lx，pH为7.0。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中所述离心转速为8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为15min。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中所述NaCl溶液的质量百分含量为0.85%。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中所述生防菌剂的浓度为5×106 cfu/mL。
9.一种权利要求2所述的生防菌剂或权利要求3至8中任一项所述制备方法制得的生防菌剂在烟草促生中的应用。
10.一种权利要求2所述的生防菌剂或权利要求3至8中任一项所述制备方法制得的生防菌剂在防控烟草花叶病毒病中的应用。
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