CN103981128A - 一株粪产碱杆菌菌株Bxo-4及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开一株粪产碱杆菌菌株Bxo-4及其应用。所述粪产碱杆菌（Alcaligenesfaecalis）菌株Bxo-4，于2013年3月12日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO：M2013090。本发明将粪产碱杆菌Bxo-4菌株接种至pH7.0的LB液体培养基中，于28℃下200r/min振荡培养48h，即可获得生物制剂。该生物制剂对水稻白叶枯病菌和/或水稻细菌性条斑病菌和/或花生青枯病菌具有强烈的抑制作用，且来源环保无毒性，对生态环境影响小；另外，其培养条件要求低，对多种病原真菌具有抑菌作用，具有很好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一株粪产碱杆菌菌株Bxo-4及其应用。
背景技术
水稻（Oryza sativa）在我国具有悠久的栽培历史。水稻原产亚洲热带，在中国广为栽种后，逐渐传播到世界各地。世界上近一半人口，都以大米为食。是世界是最重要的粮食作物。随着水稻的发展，各种病虫害也不断出现，成为影响水稻生产的限制因子之一。水稻白叶枯病（Xanthomonas oryzae pv. oryzae），是水稻生产中重要的病害，危害严重时可导致植株枯死，给水稻生产造成严重威胁。水稻细菌性条斑病（简称细条病），也是水稻生产中的一个重要病害，属全国农业植物检疫性对象。水稻细条病对籼稻的危害性最大，近十多年来，已上升为华南、中南稻区上的主要细菌病害，其危害程度已超过水稻白叶枯病，减产达5%~25%。
花生青枯病是花生生产中的一个重要病害，严重危害花生的产量。
产碱杆菌属（Alcaligenes）是由于1919年建立的新属，包括3个种(Alcaligenes facecalis、A. Defragrans、A. latus)，其模式种为粪产碱杆菌(Alcaligenes facecalis Castellani & Chalmers)。研究表明，粪产碱杆菌对提高水稻幼苗对高、低温不良环境的抗逆性，提高内根际的ＩＡＡ的含量，促进植株及根系的生长发育。
对于水稻或花生等农作物病害的防治方面，现有技术中主要采用选取抗病品种来降低发病率，但是这种防治方式太过于保守和被动。生物防治是近年来发展比较快速的植物病害防治方法，但是，具有抑制病害的生防菌资源还比较稀少，因此，研究出具有良好抑菌效果的生防菌是防治植物病害的迫切需要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有防治植物病害如水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病、花生青枯病技术的不足，提供一株具强烈抑菌作用的粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4。
本发明的另一个目的在于提供由上述粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4的发酵液制备而得的生物制剂，该生物制剂具有广谱的抑菌作用。
本发明的另一个目的在于提供上述生物制剂的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供上述粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4及其发酵液在植物病害防治中的应用。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
一株粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4，所述菌株于2013年3月 12 日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2013090。所述中国典型培养物保藏中心的地址为湖北省武汉市武汉大学。所述菌株命名为粪产碱杆菌Bxo-4 Alcaligenes faecalisBxo-4。
粪产碱杆菌Bxo-4是发明人于2012年10月15日从仲恺农业工程学院采集的水稻田土壤中经常规稀释分离法分离得到的。该菌株在LB培养基上培养48 h后观察，其单菌落为圆形，白色，表面光滑，略隆起，边缘整齐无皱褶。该菌在pH7.0 的LB培养液中， 28 ℃、200 r/min振荡培养12h后，发酵液呈浑浊状。该菌株经16S rDNA序列分析，其序列与GenBank中的4株粪产碱杆菌Alcaligenes facecalis （登录号分别为KC172062.1、JX871333.1、JX871327.1、JX871323.1）同源性达100%。粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
一种生物制剂，是由粪产碱杆菌Bxo-4经液体发酵制备而得，其制备方法为：将粪产碱杆菌Bxo-4接种至pH7.0的LB液体培养基，于28℃下200 r/min振荡培养48 h，即可获得。
优选地，生物制剂中粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4的最终浓度为1×1010CFU/mL。
实验证明：上述生物制剂对水稻白叶枯病菌有强烈的抑菌作用，平均抑菌带半径为15.6mm；该菌株的发酵液对水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola）和花生青枯病菌（Ralstonia solanacearum）也有明显的抑制效果。
因此，本发明的粪产碱杆菌Bxo-4及其发酵液可用于水稻白叶枯病和/或水稻细菌性条斑病和/或花生青枯病的防治。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明的生物制剂对水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌、花生青枯病菌具有强烈的抑制作用，而且该生物制剂来源环保无毒性，对生态环境影响小；2.本发明采用的粪产碱杆菌Bxo-4菌株，其培养条件要求低，且对多种病原细菌具有抑菌作用，具有很好的开发应用前景。
附图说明
图1为Alcaligenes facecalis Bio-4在LB培养基上的单菌落背面图。
图2为Alcaligenes facecalis Bio-4发酵液对水稻白叶枯病菌的抑制作用。
图3为Alcaligenes facecalis Bio-4的发酵滤液对水稻白叶枯病菌的抑制作用。
图4为LB培养液对水稻白叶枯病菌的抑制作用（CK）。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。本发明以下实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明内。
实施例1
LB培养基配方：胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，Nacl 10 g，琼脂粉15 g，定容至1000 mL，pH 7.2。以上材料不加琼脂粉即为LB液体培养基。
本发明人于2012年 10月15日从仲恺农业工程学院采集水稻田土壤，通过常规稀释分离法分离菌株，具体步骤为：取100g水稻田泥土，用蒸馏水充分稀释，取100μl土壤液滴于盛有10ml的LB平板上，再倒入15ml冷却至50℃左右的LB培养基，并充分摇匀土壤液，再经26℃下培养3d，选择单菌落，再进行三次划线稀释分离，获得单菌落，在4℃下保藏。
该菌株在LB培养基上培养48 h后观察，其单菌落为圆形，白色，表面光滑，不透明，略隆起，边缘整齐无皱褶。该菌经16S rDNA序列分析，其序列与GenBank中的粪产碱杆菌Alcaligenes facecalis （登录号分别为KC172062.1、JX871333.1、JX871327.1、JX871323.1）同源性达100%。粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
采用抑菌圈法测定该菌株活体菌和菌株培养滤液的活性。将细菌菌株Bio-4和水稻白叶枯病菌分别接种于LB培养液中，于28 ℃、200 r/min振荡培养48 h。取0.5 mL水稻白叶枯病菌培养液于直径为9cm的灭菌培养皿中，倒入冷却至50℃左右的LB培养基，均匀混合后，在平板中央放上一个直径为6 mm的灭菌圆纸片，圆纸片上加入细菌Bio-4菌液10 μL。同时，将细菌Bio-4培养液于12,000 rpm离心10 min，取上清液，再用0.45 μm的细菌过滤器滤除菌体，获得细菌滤液，然后用上述方法将10 μL细菌培养滤液加在圆纸片上。以加入LB液体培养基为对照，每个处理重复3次，28 ℃恒温培养箱内培养4d，测量抑菌直径。经测定SHL-1菌株活体菌液及培养滤液对Xanthomonas oryzae pv. oryzae均具有明显抑制作用，产生平均带宽为15.3mm的抑菌半径。因此，本实施例中的一株对水稻白叶枯病菌具有拮抗活性的菌株Bio-4命名为粪产碱杆菌Bxo-4 Alcaligenes facecalis Bio-4，并于2013年3月12日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO:M 2013090。
实施例2 Alcaligenes facecalis Bio-4培养液的抗菌谱
以几种作物细菌病害病原菌为对象，通过抑菌圈法测定Alcaligenes facecalis Bio-4菌株的抗菌谱。将细菌菌株（拮抗菌Alcaligenes facecalis Bio-4和病原菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae、X. oryzae pv. oryzicola、Ralstonia solanacearum）接种于LB培养液中，于28 ℃、200 r/min振荡培养48 h。将3个病原菌菌株分别涂布于LB平板上，在平板中央放上一个直径为6 mm的灭菌圆纸片，圆纸片上加入拮抗细菌Bio-4菌液10 μL。以加入LB液体培养基为对照，每个处理重复3次，28 ℃恒温培养箱内培养4d，测量抑菌半径。
表1 Alcaligenes facecalis Bio-4发酵液对3种病原菌的抑制作用
由上表可以看出，Alcaligenes facecalis Bio-4对这几种病害的病原菌都有抑菌作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 仲恺农业工程学院
<120> 一株粪产碱杆菌菌株Bxo-4及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> 16S rDNA
<400> 1
ggcatcagag ctttaacatg cagtcgaacg gcagcgcgag agagcttgct ctcttggcgg 60
cgagtggcgg acgggtgagt aatatatcgg aacgtgccca gtagcggggg ataactactc 120
gaaagagtgg ctaataccgc atacgcccta cgggggaaag ggggggatcg caagacctct 180
cactattgga gcggccgata tcggattagc tagttggtgg ggtaaaggct caccaaggca 240
acgatccgta gctggtttga gaggacgacc agccacactg ggactgagac acggcccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt ggggaatttt ggacaatggg ggaaaccctg atccagccat 360
cccgcgtgta tgatgaaggc cttcgggttg taaagtactt ttggcagaga agaaaaggta 420
tcccctaata cgggatactg ctgacggtat ctgcagaata agcaccggct aactacgtgc 480
cagcagccgc ggtaatacgt agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgt 540
gtgtaggcgg ttcggaaaga aagatgtgaa atcccagggc tcaaccttgg aactgcattt 600
ttaactgccg agctagagta tgtcagaggg gggtagaatt ccacgtgtag cagtgaaatg 660
cgtagatatg tggaggaata ccgatggcga aggcagcccc ctgggataat actgacgctc 720
agacacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccctaaacg 780
atgtcaacta gctgttgggg ccgttaggcc ttagtagcgc agctaacgcg tgaagttgac 840
cgcctgggga gtacggtcgc aagattaaaa ctcaaaggaa ttgacgggga cccgcacaag 900
cggtggatga tgtggattaa ttcgatgcaa cgcgaaaaac cttacctacc cttgacatgt 960
ctggaaagcc gaagagattt ggccgtgctc gcaagagaac cggaacacag gtgctgcatg 1020
gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080
tcattagttg ctacgcaaga gcactctaat gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140
ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta tgggtagggc ttcacacgtc atacaatggt 1200
cgggacagag ggtcgccaac ccgcgagggg gagccaatct cagaaacccg atcgtagtcc 1260
ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa 1320
tgtcgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg 1380
tttcaccaga agtaggtagc ctaaccgtaa ggagggcgct accacggtga tctc 1434
Claims (6)
1.一株粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4，所述菌株于2013年3月 12 日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2013090。
2.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株的菌落形态为：圆形，白色，表面光滑，略隆起，边缘整齐无皱褶。
3.权利要求1所述粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4及其代谢产物在防治水稻白叶枯病和/或水稻细菌性条斑病和/或花生青枯病中的应用。
4.一种抑制水稻白叶枯病菌和/或水稻细菌性条斑病菌和/或花生青枯病菌的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂是由权利要求1所述粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4经液体发酵培养制备而得。
5.根据权利要求4所述生物制剂，其特征在于，生物制剂中粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4的最终浓度为1×1010CFU/mL。
6.权利要求4所述抑制水稻白叶枯病菌和/或水稻细菌性条斑病菌和/或花生青枯病菌的生物制剂的制备方法，其特征在于，将粪产碱杆菌 （Alcaligenes faecalis）菌株Bxo-4接种至pH7.0的NB液体培养基，于28℃下200 r/min振荡培养48 h，即可获得。
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