CN105462882B - 一种用于防治作物黄萎病的铜绿假单胞菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治作物黄萎病的铜绿假单胞菌及其应用，该菌株被命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KK9a，保藏号为：CGMCC 11637。本发明提供了一种含有所述铜绿假单胞菌的菌剂。本发明菌株对大丽轮枝菌孢子萌发及菌丝生长都有抑制效果，具有高效拮抗作用。本发明菌株能用于大丽轮枝菌引起的作物黄萎病的防治，对棉花黄萎病有显著防治效果，盆栽试验防效达到86％以上，作为生物农药应用具有很大的潜力。

Description

一种用于防治作物黄萎病的铜绿假单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物种质资源的开发与利用领域，具体涉及一种用于防治大丽轮枝菌引起的作物黄萎病的铜绿假单胞菌及其应用。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)属于子囊菌门真菌，主要以微菌核在土壤、病残组织、带菌的种子和未经腐熟的土杂肥上越冬，可为害38科660种植物，其中大田作物包括棉花、向日葵、茄子、辣椒、番茄、烟草、马铃薯等，引起的病害称为黄萎病。越冬后的微菌核萌发，产生大量的分生孢子，分生孢子萌发侵入根毛、根表皮细胞或根部伤口，经过皮层进入导管，破坏植物的维管束系统，并在侵染过程中产生毒素，导致作物萎蔫死亡给农业生产带来严重损失。病原菌产生的黑色微菌核具有抗逆性，且具有积累效应，可在土壤中可存活多年，而引起的作物黄萎病是生产中最难防治的病害之一。

长期以来，农业生产中防治黄萎病主要以培育抗病品种和使用化学杀菌剂为主，但针对大丽轮枝菌的作物抗病性几乎没有获得完全抗病的品种。主要原因是大丽轮枝菌易变异，新培育的抗病品种很快丧失了抗病性。生产上主要依赖化学杀菌剂，而大量使用化学药剂对人类健康潜在的危害、对食品和环境的污染、对非靶标生物的影响以及导致病原菌抗药性的加速发展等问题已经引起社会的日益关注，减量使用化学农药是发展的必然趋势。

随着随经济的发展和人类生活质量的提高，对农产品安全和农业的可持续发展越来越关注，这也促使了生物防治的发展。几年来国内外大量研究表明，利用拮抗微生物研发生防制剂，具有广阔的前景。一方面，微生物种群丰富，而且可通过生物工程技术大幅度提高目标活性物质的产量，易于实现工业化生产；另一方面，微生物制剂本身来源于自然界，易于降解，对环境友好、安全，已有大量的生防产品应用于植物病害防治。

近年来，铜绿假单胞菌在医学上研究越来越多，但在病害生物防治方面研究较少，目前发现铜绿假单胞菌对水稻纹枯病、烟草青枯病以及茄丝核菌引起的黄瓜和番茄的苗期粹倒病具有良好防效。铜绿假单胞菌属于假单胞菌类，其拮抗机制主要是分泌胞外活性物质，主要是抗生素、产生几丁质酶、溶菌酶以及竞争和定殖等。然而，不同的种类，甚至同种的不同来源株系间的拮抗效果差异很大。

由于菌株的多样性，不同铜绿假单胞菌株仍具有不同的抗菌谱、抗菌活性和抗菌特点，筛选不同作用对象的高效菌株仍是现在乃至今后相对长的一段时间内各国科研工作关注的方向。

发明内容

本发明提供了一种防治作物黄萎病的铜绿假单胞菌，该菌株对大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病的防效达86％以上。

一种铜绿假单胞菌，分类命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KK9a，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期为2015年11月11日，保藏号为：CGMCC No.11637。

该菌株主要形态及生物学特征为：革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，无鞭毛，大小约为(0.7～0.9μm)×(1.8～3μm)，菌落边缘不整齐，菌落周围形成透明晕圈。该菌株16SrDNA序列分析显示其与GenBank号为LN890658.1的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)一致性为99％。

本发明提供了一种含有所述铜绿假单胞菌的菌剂，该菌剂的浓度优选为1×10⁷～1×10⁸CFU/mL，最优选为1×10⁷CFU/mL。

本发明提供了所述菌剂的制备方法，包括：

将所述铜绿假单胞菌接种于培养液中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，获得种子液；

所述培养液可选用LB液体培养基，其配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH为7.0～7.2。

将种子液接种于发酵培养基中扩大培养，调节发酵液中铜绿假单胞菌的浓度至1×10⁷CFU/mL，即获得所述菌剂。

其中，所述种子液的接种量优选为1％；所述发酵培养基为：胰蛋白 胨10g/L，蔗糖3g/L，氯化钠2.5g/L，调节pH为7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。

本发明中，所述扩大培养是在发酵罐中进行，扩大培养温度在35～37℃之间，培养时间在48～60h之间，通气比为0.4～2:1，转速为300～600rpm，pH值在7～7.5之间。最终菌浓度通常可达1×10¹¹～1×10¹²CFU/mL，调节菌悬液浓度至1×10⁷～1×10⁸CFU/mL施用。

本发明提供了所述铜绿假单胞菌在拮抗大丽轮枝菌中的应用。

在平板拮抗试验中，本发明菌株对大丽轮枝菌孢子萌发的抑菌圈直径为4.2cm，对菌丝生长的抑制率达86.1％，菌丝被抑制后不能形成轮枝，出现明显的膨大、消解等畸形现象。

本发明提供了所述铜绿假单胞菌在防治作物黄萎病中的应用。

所述作物可以是棉花、向日葵、茄子、番茄、烟草或马铃薯，优选为棉花。

防治棉花黄萎病可以按如下方法操作：在棉花3～4叶期，将所述菌剂浇在苗床上或对植株灌根处理，防治5天后接种大丽轮枝菌，接种20天后，防效仍达86％以上。

本发明铜绿假单胞菌对大丽轮枝菌具有高效拮抗作用，能用于大丽轮枝菌引起的作物黄萎病的防治，棉花盆栽试验防效达86％以上，说明该菌株作为生物农药应用具有很大的潜力。

附图说明

图1为本发明铜绿假单胞菌的电镜图，A标尺5μm，B标尺1μm。

图2为本发明铜绿假单胞菌对大丽轮枝菌分生孢子的抑制作用，左边为实验组，右边为对照组。

图3为本发明铜绿假单胞菌对大丽轮枝菌菌丝的抑制作用，左边为实验组，右边为对照组。

具体实施方式

实施例1菌株分离筛选

供试菌株分离自浙江省杭州市浙江大学华家池校区棉花试验田。

双层平板法筛选土壤中的生防细菌。将培养4-5天的大丽轮枝菌打菌 饼于无菌水中，配制浓度为10⁶个/mL的孢子悬浮液。取适量(1g)土样于无菌水中配制成土壤悬浮液，系列稀释至10^-2-10^-3。双层平板法：将配制的大丽轮枝菌孢子悬浮液均匀涂布PDA上，28℃下生长48h后，倒LB于PDA上层，均匀涂布土壤悬浮液。将平板置于28℃黑暗条件下培养，待菌落长出后，挑选有抑菌圈的菌落纯化培养，然后进行复筛。

筛选共得到1个有生防效果的菌株，命名为KK9a。

生防菌株对孢子萌发的抑制作用

将初筛得到的菌株接种于LB培养液中培养至培养液OD₆₀₀为0.6～0.8，获得菌液；配制大丽轮枝菌的孢子悬浮液，加入到冷却至45℃的PDA中，混合均匀后倒平板，冷却。取高压灭菌后的牛津杯，置于PDA中央，加入100μL的菌液，低温10℃下扩散2h后置于30℃培养箱中培养。观察有无抑菌圈形成，若有抑菌圈形成，测量并记录抑菌圈直径。

菌株KK9a对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制直径达4.42cm(图3)。

生防菌株对菌丝生长的抑制作用

在PDA培养基中央接种大丽轮枝菌，在其菌落周围将细菌菌液呈三角形划线，置于25℃培养箱下培养。7d测定菌丝生长抑制率(生长抑制率＝[(R1-R2)/R1]×100％，其中，R1为对照病原菌的菌落半径；R2为接细菌的病原菌菌落半径)。

菌株KK9a对大丽轮枝菌菌丝生长具有较强的抑制效果，抑制率达86.1％(图2)。

实施例2菌株的鉴定

形态学鉴定

菌株在LB培养基上菌落边缘不整齐，菌落周围形成透明晕圈。染色试验测定为革兰氏阴性菌。扫描电镜下为杆状细菌，大小为0.7-0.9μm×1.8-3μm(图1B)。

16S rDNA序列分析

将菌株接种于NA培养液(酵母粉1g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L， 蔗糖10g/L，pH＝7.0)中，在30℃、180rpm培养120小时后，进行DNA提取；采用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，获得大约877bp的电泳条带，回收后由生工生物工程有限公司(上海)完成测序。将所测定的16S rDNA序列与GenBank数据库中序列进行比较分析，确定其分类地位。

16S rDNA测序，比较和编辑后获得877bp(如SEQ ID NO.1所示)，该序列用Blast搜索和比较分析显示，KK9a菌株与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)序列(genBank号：LN890658.1)一致性为99％。

脂肪酸测定

脂肪酸测定采用全自动微生物鉴定系统(美国Agilent 6890型气相色谱系统)，按照MIDI公司说明书上的方法进行。将菌株先在NA培养基上于28℃下生长24h后，转入含3％胰蛋白酶的TSBA固体培养基上再培养24h。然后用直径4mm的无菌塑料接种环挑取一环培养菌放入有螺帽的试管中，提取脂肪酸。鉴定结果通过专化的微生物鉴定系统软件—美国MIDI公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的MIS4.5(microbial identificationsystem)和LGS 4.5(1ibrary generation software)获得。把分析结果与数据库中储存的标准菌种的脂肪酸信息进行比对。FAME鉴定结果匹配程度遵循Buyer等的原则：相似性系数<0.2，结果不可用；相似性系数≥0.2，鉴定到属；相似性系数≥0.5，鉴定到种。

脂肪酸测定结果表明，KK9a菌株与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)相似指数达0.712(表1)，鉴定为铜绿假单胞菌。

表1脂肪酸(FAME)鉴定结果。

根据形态学特征、16S rDNA序列分析结果和脂肪酸(FAME)测定结果，KK9a菌株被鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

该菌株已于2015年11月11日保藏于位于北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.11637。

实施例3菌株KK9a的发酵培养和拮抗组份的检测

培养液可选用LB液体培养基，其配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH为7.0～7.2。

50L全自动发酵罐培养：将铜绿假单胞菌接种于LB培养液中培养至培养液OD₆₀₀为0.6～0.8，获得种子液；将种子液接种至50L发酵罐中，扩大培养温度宜在35～37℃之间，培养时间在48～60h之间，通气比为0.4～2:1，转速为300～600rpm，pH宜在7～7.5之间。发酵培养基为：胰蛋白胨10g/L，蔗糖3g/L，氯化钠2.5g/L，调节pH为7.0～7.2，121℃灭菌30分钟。最终菌浓度通常可达1×10¹⁰～1×10¹¹CFU/mL。

实施例4菌株KK9a对棉花黄萎病的温室盆栽试验

盆栽试验共设置3个试验组，2个对照组。每个试验组45个植株作一个处理，每个处理3个重复。对照组包括对照组1(只接种大丽轮枝菌)和对照组2(接无菌水)，各设45个处理(菌株)。棉花育苗是在温室中进行的，待棉花植株生长到3～4叶期后，将菌株KK9a发酵液稀释到最适浓度1×10⁷CFU/mL，浇灌于试验组幼苗根部(60mL/盆)，对照组1、2分别浇灌相同体积的灭菌水。发酵液接种5天后，采用蘸根法接种大丽轮枝菌，即制备丽轮枝菌孢子悬浮液(1×10⁶孢子/mL)，然后将发酵液处理的植株和对照组1的植株切根处理后在孢子悬浮液中进行蘸根处理(1小时)，处理后植株在相同条件下生长。接菌5天、10天、20天后，观察症状，并统计病害的严重度和防效。

病害严重度统计方法参见Hanson(Journal ofCotton Science，2000,4(4)：224-231)分级标准进行评估，即：

100＝落叶；

80＝叶中脉两边都出现萎黄、坏死、叶缘上卷等黄萎病症状；

50＝叶片萎蔫，叶中脉一侧出现萎黄症状；

25＝叶片萎蔫，无其它症状；

0＝无症状。

病情指数(％)＝Σ(级值×株数)/(4×总株数)×100

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

接种试验结果显示，接种大丽轮枝菌5天后，接种大丽轮枝菌对照组1个别植株上叶片出现可见轻度萎蔫，而浇灌发酵液的处理组植株无任何症状(见表2)。

10天后，接种大丽轮枝菌的对照组植株叶中脉基部出现坏死症状，中脉两侧叶脉变褐，浇灌发酵液的处理组植株有个别出现叶脉轻度黄化现象。三个处理组植株病情指数分别为2.22、1.67和2.22，而对照组病情指数达到了18.33，生防菌防效分别下降为87.89％、90.89％和87.89％(见表2)；

20天后，对照组植株叶片上症状非常显著，呈现叶片坏死、变黄等症状，部分植株真叶开始脱落，而浇灌发酵液的处理组植株有个别出现叶脉轻度黄化现象，处理组植株病情指数分别为2.78、3.89和3.33，而对照组病情指数达到了29.44，生防菌防效分别为86.78％、86.78％和86.78％(见表2)。

表2温室盆栽KK9a对棉花黄萎病的防治作用结果。

*处理组1、2、3：接种发酵液和孢子悬浮液；对照组1：仅接种孢子悬浮液；对照组2：仅接灭菌水。

Claims (8)

1.一种铜绿假单胞菌，其特征在于，命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KK9a，保藏号为：CGMCC 11637。

2.一种包含如权利要求1所述铜绿假单胞菌的菌剂。

3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述铜绿假单胞菌的浓度为1×10⁷～1×10⁸CFU/mL。

4.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌在拮抗大丽轮枝菌中的应用。

5.如权利要求1所述的铜绿假单胞菌在防治作物黄萎病中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述作物为棉花、向日葵、茄子、番茄、烟草或马铃薯。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述作物为棉花。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，包括：在棉花3～4叶期，将含有所述铜绿假单胞菌的菌剂浇在苗床上或对植株灌根处理。