CN109593658A - 一种具有抗生作用的内生真菌zxl-szy-r-9及其应用 - Google Patents

一种具有抗生作用的内生真菌zxl-szy-r-9及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种具有抗生作用的内生真菌ZXL‑SZY‑R‑9及其应用。所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL‑SZY‑R‑9，命名为蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL‑SZY‑R‑9，于2018年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15676，该菌株对小麦常见土传真菌病害：小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦茎基腐病菌具有明显的抗生作用，具有防治小麦常见土传真菌病害的潜在能力。

Description

一种具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9及其应用
技术领域
本发明属于微生物制剂技术领域，具体涉及一种具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9及其应用。
背景技术
自20世纪40年代以来，化学农药投入并大量使用，尽管大大提高了农产品产量，但是带来的环境污染问题日益突出。化学农药污染持续时间长，污染面积大，不仅对土壤、水体、大气直接污染，而且由于人们的乱用和滥用，大量的残留在环境中，持续的毒害农产品，进而对人们的健康造成威胁。尤其是进入21世纪，随着人们环保意识的提高及对健康安全的关注，如何减轻并解决化学农药污染问题势在必行。与化学农药相比，微生物农药对非靶标生物和哺乳动物安全、无残毒、不破坏生态环境、资源丰富、经济效益高，而且开发周期短、开发费用低，愈来愈引起人们的重视。
小麦是世界的第二大粮食作物，在保障粮食安全方面起着举足轻重的作用。近年来，由于气候变暖、小麦品种、耕作制度及肥水条件的改变，使得小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦茎基腐病菌等小麦土传真菌病害的病菌在田间不断累积，危害日趋严重，直接造成产量的下降，轻则10～20％，重则50％以上，甚至颗粒无收。目前对于小麦土传病害的防治，仍以化学防治为主，不仅污染环境，而且防效并不显著。内生真菌是一类定殖于宿主植物体内，而不引起植物发生明显病害的真菌，经过长期的协同进化，内生真菌不仅能促进植物的生长、提高植物的抗逆性，还可以产生很多具有保健、抗癌、抗肿瘤、抗病毒、抗疟、杀虫、杀菌等特性的生物活性物质，在生物制药、农业生产、工业发酵等各个方面都表现出潜在的应用前景。因此，利用植物内生真菌的抗菌活性，开发生物杀菌剂是目前研究微生物农药的一个热点。
发明内容
为了克服现有技术中化学防治小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦茎基腐病菌等小麦土传真菌病害的不足和缺点，本发明首要目的在于提供一种具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9。
本发明的另一目的在于提供上述具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9，命名为蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9，于2018年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.15676；
用于培养所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9的培养基优选为PDA培养基或CMA培养基；
所述的PDA培养基包含如下组分：马铃薯粉6g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，培养基pH为6.5；
所述的CMA培养基包含如下组分：玉米浸粉7g/L，琼脂粉15g/L，培养基pH为6.0；
所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9的培养条件为温度20～35℃，pH5.5～7.5；
所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9的培养条件优选为温度26℃，pH6.5；
所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9来源于药用植物山茱萸，经分离、纯化、鉴定和筛选获得；
所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9，具有如下形态特征：
a、菌落的形态特征为(CMA培养基)：菌丝体白色至淡黄色，菌落中心有突起，平坦或有少量放射状皱纹，质地絮状兼绒状，边缘全缘；菌落背面淡黄色；
b、孢子的形态特征为：闭囊壳大量产生，分生孢子梗多样；分生孢子呈球形、近球形或椭圆形透明状，有的成串连呈链状，分生孢子是以单生或链生方式着生的，大小(7.6～10)×(5.5～7.5)μm；
所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9的5.8S rDNA碱基序列如下所示，与亚西岛蓝状菌(Talaromyces assiutensis)(基因登录号KM458833.1)的同源性达99％：
GCTTTCGGGTGCGGGCGCTCTGGGCCAACCTCCCACCCGTGTCTCTTGCGTACTTTGTTGCTTTGGCGGGCCCACTGGGTCACTCCGGTCGCCGGGGG GCGCTATGCTCCCGGGCCCGTGCCCGCCAGAGCACCCCTGTGAACCCTGATGAAGAGAGGCTGTCTGAGTCCCACGATAATCGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCGCGGCTTGTGTGTTGGGCGTGGTCCCCCTGTCTTTGGCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCCGCCTAGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACGCGCTCGGGAGGGACTGGTGGGCGTTGGTCACCCCTTATTCTTTCTACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9在微生物制剂领域中的应用；
所述的微生物制剂优选为杀菌剂；
所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9在防治植物真菌病害中的应用；
所述的植物真菌病害优选为植物土传真菌病害；
所述的植物土传真菌病害优选为小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌和小麦茎基腐病菌中的至少一种；
所述的防治的对象优选为小麦；
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明提供了一种具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9，命名为蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9，该菌株在PDA平板上与小麦病原真菌进行对峙试验时，3～5天后，可观察到明显的抑制作用；其对小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦茎基腐病菌的抑制率分别为38％、49％和40％；同时可观察到明显的抑菌带，其对小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦茎基腐病菌的抑制带宽度分别可达0.7cm、0.6cm、0.9cm。与其他菌株相比，本发明提供的菌株具有较强的抗生作用。
附图说明
图1是蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9的菌落形态图；其中，A：菌落正面；B：菌落反面。
图2是蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9的显微形态图，其中，A、B和C分别为产孢结构不同。
图3是基于ITS序列构建的蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9的系统发育树图谱图。
图4是蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9在PDA平板上与小麦纹枯病菌的对峙试验结果图；其中，A：菌株ZXL-SZY-R-9对小麦纹枯病菌的拮抗作用；B：对照。
图5是蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9在PDA平板上与小麦全蚀病菌的对峙试验结果图；其中，A：菌株ZXL-SZY-R-9对小麦全蚀病菌的拮抗作用；B：对照。
图6是蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9在PDA平板上与小麦茎基腐病菌的对峙试验结果图；其中，A：菌株ZXL-SZY-R-9对小麦茎基腐病菌的拮抗作用；B：对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
小麦纹枯病菌(Rhizotonia cerealis)已在参考文献(张海燕,张颖,王磊,刘凤英,王刚.防治小麦纹枯病有益内生细菌的筛选[J].河南农业科学,2011,40(06):87-89.)中公开；
小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)GYY4-2已在参考文献(全鑫,薛保国,杨丽荣,武超.河南省小麦全蚀病菌的分离及变种类型鉴定[J].植物病理学报,2014,44(02):139-146.)中公开；
小麦茎基腐病菌(Fusarium graminearum)已在参考文献(李志力.茎基腐病菌侵染小麦对光合作用及根的影响[D].2016.)中公开；以上菌株均由河南科技大学林学院植物病理研究室徐健强老师提供；
实施例1蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9的分离及纯化
本发明所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9分离自河南省洛阳市隋唐遗址植物园山茱萸生长片区的健康山茱萸根部组织。其分离及纯化的具体方法如下：
采集新鲜的山茱萸根若干，迅速带回实验室于24小时内分离完。自来水冲洗干净样品，吸水纸吸干表面水分后，把各个组织切成1cm左右的小段，然后依次放入体积分数为75％的酒精浸泡1min，体积分数为3.33％的次氯酸钠浸泡3min，体积分数为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗5次，无菌吸水纸吸干表面水分后，用无菌刀片将材料切成0.3×0.3cm的组织块，将组织块放在PDA平板中(直径90mm)，每个平板中放5块，重复8次，取最后一次冲洗用的无菌水200μL涂布于平板作为对照。倒置于26℃恒温培养箱中黑暗条件下培养7d，待组织块上长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法转移到新的培养基上继续培养，观察菌落的生长情况，及时挑取菌落边缘菌丝转接于另一新的PDA平板上，重复纯化3次。得到纯化菌株后编号，并接种于PDA斜面，于相同条件下培养5d后，置于4℃冰箱内保存。上述PDA培养基的配置方法为：马铃薯粉6g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，水1L，调节pH至6.5。
将纯化得到的菌株进行鉴定，鉴定结果如下：
(1)菌体的形态特征：
a、菌落的形态特征为(CMA培养基)：菌丝体白色至淡黄色，菌落中心有突起，平坦或有少量放射状皱纹，质地絮状兼绒状，边缘全缘；菌落背面淡黄色，如图1所示；
b、孢子的形态特征为：闭囊壳大量产生，分生孢子梗多样；分生孢子呈球形、近球形或椭圆形透明状，有的成串连呈链状，分生孢子是以单生或链生方式着生的，大小(3.2～3.9)×(1.8～2.0)μm，如图2所示；
此外，用于培养该菌株的培养基为PDA培养基或CMA培养基(玉米浸粉7g/L，琼脂粉15g/L，培养基pH为6.0)，培养条件为温度20～35℃，pH5.5～7.5，最佳培养条件为温度26℃，pH6.5；
(2)通过CTAB法提取真菌基因组DNA，采用通用引物ITS1(5′-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，正向)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向)对供试菌株5.8SrDNA的ITS区域进行PCR扩增，得到567bp的碱基序列，如下所示：
GCTTTCGGGTGCGGGCGCTCTGGGCCAACCTCCCACCCGTGTCTCTTGCGTACTTTGTTGCTTTGGCGGGCCCACTGGGTCACTCCGGTCGCCGGGGGGCGCTATGCTCCCGGGCCCGTGCCCGCCAGAGCACCCCTGTGAACCCTGATGAAGAGAGGCTGTCTGAGTCCCACGATAATCGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAA GCGCGGCTTGTGTGTTGGGCGTGGTCCCCCTGTCTTTGGCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCCGCCTAGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACGCGCTCGGGAGGGACTGGTGGGCGTTGGTCACCCCTTATTCTTTCTACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA；
将所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9的5.8S rDNA碱基序列提交至Genbank，经过BLAST比对后，结果显示该内生真菌与亚西岛蓝状菌(Talaromycesassiutensis)(基因登录号KM458833.1)的同源性达99％；图3为基于ITS序列构建的蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9的系统发育树图谱图。
综合上述鉴定结果，本发明所获得的真菌应归属于子囊菌门，散囊菌纲，曲霉目，发菌科，蓝状菌属，命名为蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9，于2018年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.15676。
实施例2蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9的拮抗作用研究
本发明所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9对小麦土传真菌病害的作用活性通过平板对峙试验测定，具体方法为：
待内生真菌ZXL-SZY-R-9和病原真菌、小麦纹枯病菌(Rhizotonia cerealis)、小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)及小麦茎基腐病菌(Fusarium graminearum)生长至平板1/2大小时，在菌落边缘生长旺盛区域打取直径5mm的菌饼；将病原真菌和内生真菌菌饼分别放置在直径9cm的PDA平板中央相对两侧，两菌饼相距4cm，每个处理重复3次；将病原真菌单独放置在空白PDA平板的中心作为对照；所有平板均放置于26℃恒温黑暗的培养箱中培养；每天定时记录菌落的生长半径及是否产生抑菌带；待对峙平板上病原真菌停止生长或对照平板上病原真菌接近长满平板上停止记录菌落半径，根据下述公式计算菌落生长抑制率：
菌落生长抑制率＝(对照病原真菌菌落半径－对峙培养病原真菌菌落半径)/对照病原真菌菌落半径×100％。
关于拮抗作用，主要分为：基质竞争作用、寄生作用和抗生作用。通过观察，菌株蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9对小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦茎基腐病菌产生了基质竞争作用和抗生作用。
就基质竞争作用而言，菌株蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9对小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦茎基腐病菌的抑制率分别为38％、49％和40％。
就抗生作用而言，菌株蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9对小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦茎基腐病菌的抑菌带宽度分别可达0.7cm、0.6cm、0.9cm。而且，随着时间的推移，菌株ZXL-SZY-R-9的半径在缓慢增加，而其它病原真菌的半径在缓慢缩小。
综上所述，菌株蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9能够持续产生对小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦茎基腐病菌具有抑制作用的活性物质，如图4～6所示。
实施例3外界因素对蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9活性的影响
本实施例以对小麦全蚀病菌的抑制作用来说明外界因素对蓝状菌(Talaromycessp.)ZXL-SZY-R-9活性的影响，具体方法如下：
(1)菌株ZXL-SZY-R-9发酵滤液的准备：在装有100mL马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基的250mL锥形瓶中，放入5个直径6mm的ZXL-SZY-R-9菌饼(制备方法见实施例2)，于26℃、120r/min培养7d，12000r/min离心5min，取上清液经0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液置4℃冰箱冷藏备用。
(2)温度的影响：取步骤(1)制得的过滤发酵液6份，每份5mL，装入离心管中，分别于40、60、80、100℃水浴1h，以及121℃高压湿热灭菌30min，以室温(25℃)未处理的过滤发酵液为对照，按照如下方法检测菌株ZXL-SZY-R-9的活性：处理平板中加入1.5mL过滤发酵液和13.5mL的PDA，混匀；对照平板中加入15mL的PDA；重复三次。处理和对照平板中央均接种小麦全蚀病菌，7d后十字交叉法测量菌落半径，菌落生长抑制率的计算同实施例2；
(3)pH值的影响：取步骤(1)制得的过滤发酵液60mL，分装于12支试管，其中1～11管用1mol/L HCL和1mol/L NaOH溶液调节pH值于1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、12。第12管发酵液经室温(25℃)放置过夜后，再将pH值调至原初发酵液的pH值，并用pH值为7.0的无菌水调节每份至等体积，混匀待用。按照步骤(2)所示方法检测菌株ZXL-SZY-R-9的活性。
温度对菌株ZXL-SZY-R-9发酵滤液活性的测定表明：抑菌活性随温度的升高呈下降趋势。当用100℃处理发酵滤液后，其对小麦全蚀病菌的抑制率下降了82％；当用121℃高压湿热灭菌发酵滤液30min后，抑菌活性基本丧失。
pH值对菌株ZXL-SZY-R-9发酵滤液活性的测定表明：发酵滤液的原初pH值为6.5；在酸性范围内，当pH值大于4时，活性下降缓慢；反之则迅速下降，至pH值为2时，活性完全丧失；在碱性范围内，当pH值大于8时，活性迅速下降，至pH值为10时则完全丧失。
综上所述，菌株ZXL-SZY-R-9的发酵滤液对高温处理具有不稳定性，易失活；在碱性和强酸条件下也很不稳定，但在偏酸性和偏碱性条件下的稳定性好，尤以在偏酸性条件下稳定性最好。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 一种具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9及其应用
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 567
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9的5.8S rDNA碱基序列
<400> 1
gctttcgggt gcgggcgctc tgggccaacc tcccacccgt gtctcttgcg tactttgttg 60
ctttggcggg cccactgggt cactccggtc gccggggggc gctatgctcc cgggcccgtg 120
cccgccagag cacccctgtg aaccctgatg aagagaggct gtctgagtcc cacgataatc 180
gttaaaactt tcaacaatgg atctcttggt tccggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg 240
cgataagtaa tgtgaattgc agaattccgt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg 300
ccccctggca ttccgggggg catgcctgtc cgagcgtcat ttctgccctc aagcgcggct 360
tgtgtgttgg gcgtggtccc cctgtctttg gcggggacct gcccgaaagg cagcggcgac 420
gtcccgccta gtcctcgagc gtatggggct ctgtcacgcg ctcgggaggg actggtgggc 480
gttggtcacc ccttattctt tctacggttg acctcggatc aggtaggagt tacccgctga 540
acttaagcat atcaataagc ggaggaa 567
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物ITS1
<400> 2
ccgtaggtga acctgcgg 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物ITS4
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (10)

1.一种具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9，其特征在于命名为蓝状菌(Talaromyces sp.)ZXL-SZY-R-9，于2018年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.15676。
2.根据权利要求1所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9，其特征在于：
用于培养权利要求1所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9的培养基为PDA培养基或CMA培养基。
3.根据权利要求3所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9，其特征在于：
所述的PDA培养基包含如下组分：马铃薯粉6g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，培养基pH为6.5。
4.根据权利要求3所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9，其特征在于：
所述的CMA培养基包含如下组分：玉米浸粉7g/L，琼脂粉15g/L，培养基pH为6.0。
5.根据权利要求1所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9，其特征在于：
所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9的培养条件为温度20～35℃，pH5.5～7.5。
6.权利要求1所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9在微生物制剂领域中的应用。
7.根据权利要求6所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9在微生物制剂领域中的应用，其特征在于：
所述的微生物制剂为杀菌剂。
8.权利要求1所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9在防治植物真菌病害中的应用。
9.根据权利要求8所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9在防治植物真菌病害中的应用，其特征在于：
所述的植物真菌病害为植物土传真菌病害。
10.根据权利要求9所述的具有抗生作用的内生真菌ZXL-SZY-R-9在防治植物真菌病害中的应用，其特征在于：
所述的植物土传真菌病害为小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌和小麦茎基腐病菌中的至少一种。
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