CN105368739B - 广谱抗果树病原真菌的解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的拮抗菌株通过生理生化反应、16S rDNA和gyrA基因测序和序列比对最终鉴定为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens；命名为Bacillus amyloliquefaciens YTB1407。本发明菌株对多种果树病原真菌有拮抗活性，包括苹果轮纹病菌、苹果斑点落叶病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌和葡萄霜霉病菌等；本发明菌株广谱抗菌、抗菌物质活性稳定且效果持久，具有从中开发出新型、高效、天然的生物防治药剂的巨大潜力。

Description

广谱抗果树病原真菌的解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌菌株Bacillus amyloliquefaciens YTB1407，还涉及该菌株对多种果树病原真菌室内拮抗活性及稳定性分析。

背景技术

果树病害是果树生长发育和结果过程中重要的影响因素，严重的制约了水果的产量和品质，每年给全球造成了巨大的经济损失。目前仍主要采用化学杀菌剂来防治果树病害，化学杀菌剂的优点是作用快、效果好、使用方便，能在短期内消灭或控制所发生的病害，有效减少损失，但大量化学杀菌剂的使用又使人类面临新的问题：大量的农药残留危害人畜健康，污染环境。因此，新型、高效、无毒的生物农药的开发和利用成为目前研究的热点。

拮抗菌作为一种生物菌剂，对环境安全，对人畜无威胁，可以有效的避免化学杀菌剂所带来的一系列问题。同时，目前许多研究表明许多细菌会对植物产生有益作用，如固氮、促植物生长、抗逆境等，使得拮抗菌成为病害防治的一条重要而有效的途径，更将是21世纪绿色食品生产中病害防治的主攻方向，具有广阔的应用前景。

芽孢杆菌是一种安全性高、生长繁殖速度快、抗逆性强的微生物菌株，目前广泛应用于生物农药、肥料及医学等方面。目前我国已经成功研发和并投入生产了多种芽孢杆菌商品制剂，主要防治粮食、蔬菜的纹枯病、白粉病、稻瘟病等真菌病害，而针对果树真菌病害的生物制剂很少。目前，研究者通过大量试验筛选到能够拮抗多种果树病原真菌的芽孢杆菌菌株，并初步取得显著成效。

发明内容

本发明的目的是提供了一种具有广谱抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌及其应用，其菌体和发酵液具有较强的广谱抗多种果树病原真菌的作用。

本发明涉及解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens YTB1407应用于多种果树病原真菌的防治。即一种具有拮抗苹果轮纹病、苹果斑点落叶病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病及葡萄霜霉病的解淀粉芽孢杆菌。

一种具有广谱抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌，是从中国山东省烟台市福山区西洋参种植地采集的西洋参根中分离得到，保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；请求保藏人：山东省烟台市农业科学研究院；保藏日期为2015年10月12日；保藏编号：CCTCC NO:M 2015598，该菌命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens YTB1407。

本发明的解淀粉芽孢杆菌培养条件简单，在大多数培养基上生长良好，在牛肉膏蛋白胨琼脂平板生长时菌落为乳白色，中间有突起，表面不光滑，不透明，边缘为不规则形状，在多种培养基上均不产生色素。通过显微镜观察，该菌为革兰氏阳性菌，有的可见芽孢，芽孢中生，约1.0×3.0μm，菌体杆状，有鞭毛。该菌在葡萄糖发酵反应倒置试管有气泡出现，淀粉水解反应有透明水解圈生成，过氧化氢酶试验中呈阳性反应，销酸盐还原试验产生深红色物质，硫化氧反应呈阴性，V-P试验生成红色化合物，梓檬酸盐利用试验平板变蓝色呈阳性反应；耐盐性试验，在加入5％的氯化钠的平板上可以正常生长。

通过16S rDNA同源性分析，该菌株的基因组DNA为模板扩增其16S rDNA序列，PCR产物为单一条带，回收后纯化，进行DNA测序。该菌株的16S rDNA序列长度为1440bp，将该菌株的16S rDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号GenBank NO.KT799876。同时将该菌株的16S rDNA序列与GenBank数据库收录的代表菌株的16S rDNA基因核苷酸序列进行同源性比对，结果与解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌株的同源性均高达99％。进一步通过对该菌的gyrA基因片段的扩增、测序和序列同源性比对，结果与解淀粉芽孢杆菌同源性均高达99％，最终将该菌鉴定为解淀粉芽孢杆菌，并命名为Bacillus amyloliquefaciensYTB1407。

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens YTB1407的应用中，所述菌体及发酵液发酵培养条件为：于100ml发酵培养基(容器为250mL三角瓶)中按体积接种2％的YTB1407菌株，转速150转/min，培养温度为30℃，培养4天。发酵培养基配方为：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0-8.0。

本发明的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens YTB1407的菌体和发酵液抗菌活性采用平板对峙法、菌体生长速率法、叶盘法测定。本发明所述的解淀粉芽孢杆菌对供试的苹果轮纹病菌、苹果斑点落叶病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌、葡萄霜霉病菌均具有很好的拮抗作用。

本发明的解淀粉芽孢杆菌YTB1407发酵液中的抗菌物质的热稳定性良好，以20℃、40℃、60℃、80℃、100℃处理30min，121℃高压灭菌处理20min，其抗菌活性除121℃高温处理后有所下降外，其余温度下抗菌活性基本保留85％以上。本发明的解淀粉芽孢杆菌YTB1407抗菌物质的酸碱稳定性良好，在pH值2-10范围内非常稳定，活性保留70％以上，pH为12，抗菌活性明显降低。

本发明的解淀粉芽孢杆菌YTB1407的菌体和发酵液均具有较强的广谱的果树真菌病害抗菌活性，且抗菌效果持久、稳定，具备从中开发出新型、高效、广谱生防杀菌剂的巨大潜力。

附图说明

图1解淀粉芽孢杆菌YTB1407的菌落形态；

图2根据16S rDNA基因序列构建的拮抗细菌YTB1407菌株的系统发育树；

图3根据gyrA基因序列构建的拮抗细菌YTB1407菌株的系统发育树；

图4解淀粉芽孢杆菌YTB1407抗菌结果(平板对峙法)；

图5解淀粉芽孢杆菌YTB1407抗菌结果(菌落生长速率法)；

图6解淀粉芽孢杆菌YTB1407抗葡萄霜霉病菌结果(叶盘法)；

图7解淀粉芽孢杆菌YTB1407的热稳定性分析图；

图8解淀粉芽孢杆菌YTB1407pH稳定性分析图。

解淀粉芽孢杆菌YTB1407，已于2015年10月12日提交至中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为NO:M 2015598。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员了解本发明。

实施例1

解淀粉芽孢杆菌YTB1407的分离和鉴定

中国山东省烟台市福山区西洋参种植地西洋参根部，在实验室按下列条件培养和鉴定，及可获得本发明的广谱抗菌解淀粉芽孢杆菌YTB1407：

YTB1407的分离和纯化：将西洋参根进行表面消毒，切成小块，在NA固体培养基上培养。2天后挑取单菌落，采用分区划线法接种于NA固体培养基上，37℃培养1～2天，挑取单菌落保存。

本发明所述的解淀粉芽孢杆菌YTB1407是依据其菌落形态、个体形态学特征、生理生化特征、16S rDNA和gyrA基因序列的系统发育树等进行鉴定。

该菌个体形态与菌落特征如下：细菌YTB1407菌落为乳白色，中间有突起，表面不光滑，不透明，边缘为不规则形状，见附图1。镜检为革兰氏阳性菌，有的可见芽孢，芽孢中生，呈椭圆形状，约1.0×3.0μm，有鞭毛。其部分生理生化鉴定结果见下表：

表1生理生化鉴定结果

生理生化特征	试验结果	生理生化特征	试验结果
				好氧或厌氧性	+	葡萄糖氧化发酵	+
V-P测定	+	接触酶	+
				柠檬酸盐利用	+	甲基红	+
丙酸盐利用	-	淀粉水解	+
				硫化氢	-	耐盐性	+
硝酸盐还原	+	明胶液化	+

通过16S rDNA同源性分析：该菌株的基因组DNA为模板，利用细菌通用引物27-F/1492-R进行16S rDNA基因的PCR扩增。引物序列为：27-F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492-R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR产物为单一条带，回收后纯化，进行DNA测序。该菌株的16S rDNA序列长度为1440bp，具体序列见附件序列表的核苷酸序列。将该菌株的16SrDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号GenBank NO.KT799876。同时将该菌株的16SrDNA序列与GenBank数据库收录的代表菌株的16S rDNA基因核苷酸序列进行同源性比对，结果与解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌菌株的同源性均高达99％，附图2为根据16S rDNA基因序列构建的拮抗细菌YTB1407菌株的系统发育树。

通过gyrA基因同源性分析：根据枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的gyrA基因序列差异性设计一对特异性引物，gyrA-F:5'-ATGACAAGTGACAAACCTTA-3'，gyrA-R:5'-AGATGTTTGTTCGATCTCAGC-3'，以该菌株的基因组DNA为模板扩增其gyrA基因片段，PCR产物为单一条带，回收后纯化，进行DNA测序。得到的测序序列长度为564bp，将该序列与GenBank数据库收录的代表菌株的gyrA基因核苷酸序列进行同源性比对，结果与解淀粉芽孢杆菌同源性均高达99％。附图3为根据gyrA基因序列构建的拮抗细菌YTB1407菌株的系统发育树。通过gyrA基因构建的发育树分析，该菌株与解淀粉芽孢杆菌同源性达到99％，可确定YTB1407菌株为解淀粉芽孢杆菌。

实施例2

本发明所述的培养和发酵条件

(1)斜面培养条件：牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂粉15g，水1000mL，pH 7.0-8.0。121℃，0.1MPa蒸汽灭菌20分钟；培养温度37℃，培养时间2～4天。

(2)发酵培养条件：牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0-8.0。121℃，0.1MPa蒸汽灭菌20分钟；将培养物以2％接种量，接种于发酵培养基中，发酵培养基装液量为100mL(容器为250mL三角瓶)，转速150转/min，培养温度30℃，培养时间4天得到发酵液。

本发明的解淀粉芽孢杆菌YTB1407产生的发酵液经5000转/min离心10min，取沉淀即为具有抗菌活性的菌体；取上清液，经过细菌过滤器过滤后，即为具有抗菌活性的无菌发酵液。

实施例3

本发明的解淀粉芽孢杆菌YTB1407产生的广谱抗菌性菌体和发酵液的抗菌活性分析

将指示菌(苹果轮纹病菌、苹果斑点落叶病菌、葡萄白腐病菌和葡萄炭疽病菌)取直径为6mm的菌饼放置在土豆固体培养基平板中间，采用十字交叉法在四周接种拮抗菌YTB1407，见附图4。下表为解淀粉芽孢杆菌YTB1407对不同果树植物病原真菌的抑菌带的大小：

表2解淀粉芽孢杆菌YTB1407对不同果树植物病原真菌的抑菌带的大小

果树病原真菌	抑菌带
		苹果轮纹病菌	8.11
苹果斑点落叶病菌	9.45
		葡萄白腐病菌	8.75
葡萄炭疽病菌	7.72

取本发明的解淀粉芽孢杆菌YTB1407的无菌发酵液，按照1:50比例加入到已灭菌的土豆固体培养基中，混匀后配制平板，冷却后向平板中央加入直径为6mm的指示菌(苹果轮纹病菌、苹果斑点落叶病菌、葡萄炭疽病菌)菌饼，采用菌落生长速率法，确定拮抗菌YTB1407对不同病原真菌的抑菌效果，结果见附图5。下表为解淀粉芽孢杆菌YTB1407发酵液对不同果树植物病原真菌的抑制效果：

表3解淀粉芽孢杆菌YTB1407发酵液对不同果树植物病原真菌的抑菌效果

果树病原真菌	处理菌落直径	对照菌落直径	抑菌率
				苹果轮纹病菌	28.67	80.00	64.17
苹果斑点落叶病菌	24.00	75.67	68.28
				葡萄炭疽病菌	32.33	64.67	50.00

取本发明的解淀粉芽孢杆菌YTB1407的无菌发酵液稀释50倍后，浸泡健康葡萄叶片2h后晾干，打成直径10mm的叶碟，背面朝上保湿培养，滴上20μL新鲜的葡萄霜霉病菌孢子悬浮液(镜检浓度达1×10⁶个/mL)，25℃培养，7天后通过发病情况计算抑菌率，确定YTB1407对葡萄霜霉病菌的抑菌效果，见附图6。处理后霜霉病发生病指为17.62，对照病指为42.01，抑菌率为58.05％。

从附图4、5、6可以看出，本发明的解淀粉芽孢杆菌YTB1407对以上病菌均有抵抗或抑制作用。

实施例4

本发明的解淀粉芽孢杆菌YTB1407产生的广谱抗菌物质的稳定性分析

热稳定性分析：将解淀粉芽孢杆菌YTB1407抑菌物质的无菌发酵液分别置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃温度下处理30min，121℃高温高压处理20min，分别将各处理以拮抗菌发酵液与PDA培养基体积比为1:50的比例制成平板，将直径为6mm的病原菌菌块接于平板中央，以未处理的发酵液抑菌率作为对照。以葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌和苹果轮纹病菌作为指示菌，采用菌落生长速率法，于28℃培养3～7d后，测量菌落直径。并计算处理后的拮抗菌发酵液对病原菌的抑制率，作为抑菌性能的衡量指标。附图7为试验结果：20℃～100℃下对葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌和苹果轮纹病菌的抑制作用无明显变化，表明随温度的升高，拮抗菌拮抗物活性几乎没有变化；在121℃处理20min对葡萄炭疽病菌抑制活性明显下降，对苹果轮纹病菌和葡萄白腐病菌抑制活性略有下降。该试验表明该抗菌活性物质的热稳定性较好。

pH稳定性分析：测定解淀粉芽孢杆菌YTB1407的抑菌物质粗提液的初始pH值，并将其作为对照组。用1mol/L的HCl与NaOH将YTB1407的抑菌物质粗提液调至pH值为2、4、6、8、10和12，2h后将pH值调回初始值。以葡萄炭疽病菌、葡萄白腐病菌、苹果轮纹病菌为指示菌，将抑菌物质粗提液以1:50比例加入到土豆培养基中配制成平板，采用菌落生长速率法，测定抗菌物质的抑菌活性。附图8显示试验结果：pH在2～10范围内，其活性变化不大，pH值为12时，对其活性有一定的影响；发酵滤液在pH为8时对两种病原菌的抑制活性最高。实验表明该抗菌活性物质对不同酸碱条件均具有很好的稳定性，在强碱条件下活性降低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>山东省烟台市农业科学研究院

<120>广谱抗果树病原真菌的解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

<400> 1

Tacatgcagt cgagcggaca gatgggagct tgctccctga tgttagcggc ggacgggtga 60

gtaacacgtg ggtaacctgc ctgtaagact gggataactc cgggaaaccg gggctaatac 120

cggatggttg tctgaaccgc atggttcaga cataaaaggt ggcttcggct accacttaca 180

gatggacccg cggcgcatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgacgatgcg 240

tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg 300

ggaggcagca gtagggaatc ttccgcaatg gacgaaagtc tgacggagca acgccgcgtg 360

agtgatgaag gttttcggat cgtaaagctc tgttgttagg gaagaacaag tgccgttcaa 420

atagggcggc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc 480

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cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg 600

gggaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag 660

atgtggagga acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg 720

aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg 780

ctaagtgtta gggggtttcc gccccttagt gctgcagcta acgcattaag cactccgcct 840

ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg 900

gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga catcctctga 960

caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc atggttgtcg 1020

tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgatcttag 1080

ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg aggaaggtgg 1140

ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggaca 1200

gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt ctcagttcgg 1260

atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg 1320

ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg agagtttgta 1380

acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg ccgaaggtgg gacagatgat 1440

Claims (5)

1.一种具有广谱抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌YTB1407，该菌种于2015年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为：CCTCC，保藏编号为：CCTCC NO:M 2015598，命名为Bacillus amyloliquefaciens YTB1407。

2.如权利要求1所述的一种具有广谱抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens YTB1407，该菌株在大多数培养基上能够生长良好，于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上生长时菌落为乳白色，中间有突起，表面不光滑，不透明，边缘为不规则形状，在多种培养基上均不产生色素；通过显微镜观察，该菌为革兰氏阳性菌，可见芽孢，芽孢中生，约1.0×3.0 μm，菌体杆状，有鞭毛；该菌在葡萄糖发酵反应倒置试管有气泡出现，淀粉水解反应有透明水解圈生成，过氧化氛酶试验中呈阳性反应，销酸盐还原试验产生深红色物质，硫化氧反应呈阴性，V-P试验生成红色化合物，梓檬酸盐利用试验平板变蓝色呈阳性反应；耐盐性试验，在加入5%的氯化钠的平板上正常生长。

3.如权利要求1所述的一种具有广谱抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens YTB1407，其16S rDNA如序列1所示。

4.如权利要求1所述的一种具有广谱抗菌活性的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens YTB1407的应用，其特征在于：所述菌株Bacillus amyloliquefaciensYTB1407的菌体及发酵液对抗苹果轮纹病菌、苹果斑点落叶病菌、葡萄白腐病菌、葡萄炭疽病菌和葡萄霜霉病菌植物病原菌引起的果树病害。

5.根据权利要求4所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens YTB1407的应用，其特征在于，所述菌株Bacillus amyloliquefaciens YTB1407的应用中，所述菌体的发酵条件为：于100 ml 发酵培养基中按体积接种2%的YTB1407菌株，转速150转/min，培养温度为30℃，培养4天；所述发酵培养基配方为：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1000mL，pH 7.0-8.0。