CN103243044A

CN103243044A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN103243044A
Application number: CN2013101210483A
Authority: CN
Inventors: 郭阳; 龚谷迪; 严斌; 李涛; 孙志伟; 宋涛
Original assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Current assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2033-04-09
Also published as: CN103243044B

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)YJ01，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCCN0.7328。该解淀粉芽孢杆菌主要用于酿酒葡萄的真菌病害的防治。本发明解淀粉芽孢杆菌YJ01能够代谢出抑菌物质伊枯草菌素A（iturinA）和表面活性素（surfactin），对酿酒葡萄的多种致病真菌具有明显抑制作用。该菌种繁殖速度快，能够人工培养，易于操作，便于生产应用，抗逆能力强等优点，尤其是对真菌引起的酿酒葡萄灰霉病，白腐病，炭疽病等病害的防治具有重要意义，培养条件简单、容易保存，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌YJ01及其在防治酿酒葡萄灰霉病、酿酒葡萄炭疽菌、酿酒葡萄白腐病，酿酒葡萄白粉病的应用，属于生物技术领域。

背景技术

近年来，食品安全问题频发，农药残留和食品添加剂的添加是主要的原因。植物病害会造成植物的损失，而使用传统手段防治会造成农药残留，环境污染，抗药性等后果。而一些危险高毒农药的禁用，促使着生物防治的发展。生物防治主要是利用有益菌与病原菌的营养竞争，或产生拮抗物质，或诱导抗病性或提高抗逆性来达到防治效果。与化学防治相比具有安全无毒的优点，现已成为各国的研究热点。生物农药指含非人工合成、具有杀虫杀菌或抗病能力的的生物活性物质或生物制剂，包括生物杀虫剂，杀菌剂，农用抗生素，生态农药等。生物农药具有选择性强、对人畜安全、对环境影响小、改良潜力大等优点，能部分或完全替代化学农药。生物农药的研究和发展是我国大力支持的科研领域，也是提高食品安全的重要措施之一。

酿酒葡萄上霉菌病害很多，如灰霉病，炭疽病，酸腐病，白腐病等等，造成的损失在30%以上。在酿酒葡萄上可使用的农药很多，有波尔多液，百菌清，多菌宁，农利宁，碳特宁等多达几十种。目前国内外生物农药的研究虽然很多，但是真正应用的很少，因为成本问题或者效果问题。从保护生态环境和食品安全的角度出发，酿酒葡萄种植需要有低毒、污染少，对人体安全的微生物制剂来控制酿酒葡萄真菌病害，以达到安全食用的目的。也符合生物农业发展和政府、社会与生物农药产业的发展。

本发明从酿酒葡萄园中分离得到解淀粉芽孢杆菌抑菌YJ01，其产生的主要成分iturin主要作用于病原菌细胞膜的磷脂双分子层，改变细胞膜通透性和功能性，从而抑制病原微生物的生长。由于其特殊的化学组成和两亲型分子结构，抑菌脂肽对其抑制菌是非特定作用，不会引起抗性，非常适合开发成抑菌剂。而且动物和人体临床试验表明，iturin 低毒、低致敏性。另一种主要成分surfactin具有良好的表面活性，和iturin一起作用能够提高抑菌效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对酿酒酿酒葡萄真菌具有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌，以及该解芽孢杆菌在防治酿酒酿酒葡萄真菌病害中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供的菌株为解淀粉芽孢杆菌YJ01，拉丁名为Bacillus amyloliquefaciens，是从河北省昌黎市华夏长城酿酒葡萄酒庄园的酿酒葡萄上分离得到的，目前已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址是：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，其保藏编号为：CGMCC No.7328，保藏日期为2013年3月19日。菌株的生理生化性质如下：革兰氏阳性菌，细胞形态杆状，形成芽孢，接触酶和氧化酶反应均为阳性。利用碳水化合物产酸试验：淀粉水解、水解酪素及水解明胶均为阳性,柠檬酸利用试验呈阳性，甲基红试验呈阴性。菌种具有较弱的抑制细菌和酵母能力，较强抑制霉菌的能力。该菌株经过中国科学院微生物研究所鉴定为解淀粉芽孢杆菌，其拉丁名为Bacillus amyloliquefaciens。该菌株的16SrNA基因序列测定结果如下：

TGCGGCGTGCCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACcTTGACGGTACCTAACcAGAAAGCcACGGCTAACTACGTGcCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGtTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAaTCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGgCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGTACAGATGAC

本发明主要通过两种使用方式进行酿酒葡萄真菌病害的应用：一是提取解淀粉芽孢杆菌YJ01中的抑菌物质制作成菌剂配方。一是将解淀粉芽孢杆菌YJ01进行发酵培养制作成发酵液直接喷涂使用。

解淀粉芽孢杆菌YJ01抑菌物质的制取及鉴定：

（1）斜面培养：培养时间1-2 天，培养基成分（1 升）：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15～20g，自然pH，培养温度28~32 ℃。

（2）种子培养：超净工作台中从斜面挑取经活化的单菌落接入种子培养液中，28℃摇菌1~2 天，转速200 r/min，得到种子液；种子培养液成分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3gL/，氯化钠5g/L，pH 值7.0~7.2。

（3）发酵培养：按4% 接种量，将上步骤获得的种子液接入发酵培养基中，28℃振荡培养2~3 天，转速200 r/min，得到解淀粉芽孢杆菌YJ01的发酵液。发酵培养基成分为：葡萄糖 30g/L,谷氨酸钠（味精）15g/L, MgSO4 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，KH2PO4 1.0g/L，FeSO₄0.15 mg/L，MnSO₄ 5.0 mg/L，CuSO₄ 0.16 mg/L,水1000ml，初始PH 7.0。

（4）抑菌产物提取方法: 将发酵液在8000r/min条件下离心10min除去菌体，加入6 mol/L的HCL调PH值到2，4℃冰箱低温保存8h，8 000 r/min 离心10 min 收集沉淀，沉淀加入甲醇萃取，并加入1mol/L的NaOH调PH到7，多次萃取后合并萃取液，旋转蒸发除去甲醇后获得抑菌制品。

（5）将抑菌物质经凝胶层析后，将获得的纯品送至北京微量研究所，经电喷雾质谱-电解基质解离（ESI-MS-CID），解析获得的碎片离子峰，确认主要含有伊枯草菌素（iturin）和表面活性素（surfactin）两种物质。

（6）将制得的抑菌制品解淀粉芽孢杆菌YJ01做成系列稀释的不同浓度的溶液制品，其浓度范围为30-100mg/L。发现在该浓度范围内抑菌效果明显。

解淀粉芽孢杆菌YJ01发酵液的制备及应用：

（1）菌斜面培养：培养时间1-2 天，培养基成分（1 升）：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15～20g，自然pH，培养温度28~32 ℃。

（4）发酵液的使用为直接喷涂。

与现有技术相比，本发明的优点是：解淀粉芽孢杆菌YJ01是从酿酒葡萄中分离得到，因此对真菌引起的酿酒葡萄灰霉病、酿酒葡萄白粉病等病害的防治具有显著的效果。

解淀粉芽孢杆菌YJ01在防治酿酒葡萄真菌病害中的应用也属于该发明的保护范围。

所述的解淀粉芽孢杆菌在抑制酿酒葡萄灰霉病、酿酒葡萄白粉病、酿酒葡萄白腐病、酿酒葡萄炭疽病、酿酒葡萄聚围小丛壳菌、酿酒葡萄酸腐病具有很好的作用效果。

附图说明

附图1解淀粉芽孢杆菌YJ01对酿酒葡萄灰霉病病原菌灰酿酒葡萄孢霉菌实验效果图。

附图2解淀粉芽孢杆菌YJ01对酿酒葡萄聚围小丛壳菌实验效果图。

附图3解淀粉芽孢杆菌YJ01提取的抑菌物质对酿酒葡萄防腐效果图。

具体实施方式

实施例1：解淀粉芽孢杆菌发酵液对酿酒葡萄灰霉病病原菌灰酿酒葡萄孢霉菌和酿酒葡萄小丛壳菌的抑制效果。

将灭菌后PDA培养基温度保持在55℃，然后将斜面挑取一环病原菌，接入无菌水中，混匀后，取200μL液体加入PDA培养基中，混匀后到平板。待凝固后，在培养基正中间放入一无菌的牛津杯，轻轻挤压，使牛津杯与培养基表面无缝隙，然后在牛津杯中注入200μL的无菌发酵液。最后在28℃培养箱中培养2d，观察抑菌圈的有无。对实验结果如灰酿酒葡萄孢霉菌图1所示，对聚围小丛壳菌抑制结果如图2所示。表明发酵液对二种病原菌具有良好的抑制效果。

实例二：解淀粉芽孢杆菌发酵液喷洒实验

实验品种：7-8年生霞多丽277 、赤霞珠685。

实验数量：每个实验共做菌液，空白，波尔多液三组，每个实验品种酿酒葡萄用地约100m²，约110株酿酒葡萄。

实验用药：波尔多液由华夏长城葡萄酒公司配置，菌液由YJ01发酵而来，发酵2-4d，温度35℃。培养基成分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3gL/，氯化钠5g/L，pH 值7.0~7.2。

试验方式：波尔多液由基地员工正常打药，空白组不做处理。菌液组人工喷洒，每组实验共8L。实验每周打药一次。喷洒前先摘除病果，然后进行打药实验，在下次实验前统计病果数量，并且摘除。

表一喷洒试验结果

药效时间	菌液	波尔多液	空白
				6d	11	6	18
5d	8	13	30
				7d	21	20	34
4d	5	3	17
				7d	29	19	34

实例三：解淀粉芽孢杆菌YJ01提取的抑菌物质对酿酒葡萄防腐效果

从市场中购买实验用酿酒葡萄，将酿酒葡萄粒全部剪下，挑选表皮没有破坏挤压的酿酒葡萄作用实验使用。最后每组挑选出各25粒健康的葡萄，约300g。解淀粉芽孢杆菌YJ01提取的抑菌物质配制成不同的浓度。将酿酒葡萄在无菌水，50mg/L和100mg/L的抑菌液中浸泡2min，然后取出，自然晾干后装进塑封袋中，然后在每个戴子上扎3个小孔。一星期后，再次处理后放置直至第五周。统计每组中腐烂的果粒。最后结果为图3所示。

表二：防腐实验烂果数量

时间	空白	50mg/L	100mg/L
				1	0	0	0
7	0	0	0
				9	3	1	0
11	8	2	1
				13	11	4	2
15	12	4	2
				26	18	6	4
35	22	7	5

实验结果显示，50mg/L的药品处理酿酒葡萄在35天好果率达72%，100mg/L效果稍好，约为80%，空白组仅为12%。

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌YJ01，其保藏编号为：CGMCC No.7328，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌YJ01作为防治酿酒葡萄病害的应用，其特征是：提取YJ01发酵液中的抑菌物质制作成菌剂配方，提取和使用方式如下：

（1）斜面培养：培养时间1-2 天，培养基成分：蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，琼脂15～20g/L，自然pH，培养温度28~32 ℃；

（2）种子培养：超净工作台中从斜面挑取经活化的单菌落接入种子培养液中，28℃摇菌1~2 天，转速200 r/min，得到种子液；

（3）发酵培养：按4% 接种量，将上步骤获得的种子液接入发酵培养基中，28℃振荡培养2~3 天，转速200 r/min，得到解淀粉芽孢杆菌YJ01的发酵液;

（4）抑菌产物提取方法: 将发酵液在8000r/min条件下离心10min除去菌体，加入6 mol/L的HCL调PH值到2，4℃冰箱低温保存8h，8 000 r/min 离心10 min 收集沉淀，沉淀加入甲醇萃取，并加入1mol/L的NaOH调PH到7，多次萃取后合并萃取液，旋转蒸发除去甲醇后获得抑菌制品；

（5）将制得的抑菌制品做成系列稀释的不同浓度的溶液制品，其浓度范围为30-100mg/L。

3.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌YJ01作为防治酿酒葡萄病害的应用，其特征是将解淀粉芽孢杆菌YJ01进行发酵培养制作成发酵液直接喷涂使用。

4.如权利要求2所述的种子培养液成分为：蛋白胨10g/L，牛肉膏3gL/，氯化钠5g/L，pH 值7.0~7.2。

5.如权利要求2所述的发酵培养基成分为：葡萄糖 30g/L,谷氨酸钠15g/L, MgSO4 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，KH2PO4 1.0g/L，FeSO₄0.15 mg/L，MnSO₄ 5.0 mg/L，CuSO₄ 0.16 mg/L,水1000ml，初始PH 7.0。

6.如权利要求2所述的抑菌制品的使用浓度优选为50mg/L。

7.如权利要求1 所述的解淀粉芽孢杆菌YJ01在防治酿酒葡萄真菌病害中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于所属真菌病害为酿酒葡萄灰霉病、酿酒葡萄白粉病、酿酒葡萄白腐病、酿酒葡萄炭疽病、酿酒葡萄聚围小丛壳菌、酿酒葡萄酸腐病。