CN109486882A - 一种解淀粉芽孢杆菌抗g-细菌抗菌肽及其发酵生产方法 - Google Patents

一种解淀粉芽孢杆菌抗g-细菌抗菌肽及其发酵生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌抗G‑细菌抗菌肽及其发酵生产方法，按质量份数计算，其组成和含量如下：酵母膏0.1‑0.3％；L‑谷氨酸0.3‑0.5％；葡萄糖1.4‑2.4％；七水硫酸镁0.005‑0.1％；氯化钾0.05‑0.1％；磷酸二氢钾0.1‑0.2％；五水硫酸铜0.00016‑0.0003％；七水硫酸亚铁0.00015‑0.0002％；硫酸锰0.005‑0.007％；水96.3925％‑97％。本发明提供的抗菌肽发酵方法所制备的抗菌肽液态抑大肠杆菌菌圈直径可以达到12.4mm效价可以达到24590u/ml，同时丰富了细菌抗菌肽种类，通过本发明提供的发酵生产方法得到的抗菌肽产品具有较好的抑菌活性。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽及其发酵生产方法
技术领域
本发明涉及微生物制剂领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽及其发酵生产方法。
背景技术
随着社会的发展和人们的生活水平提高，更多的人越来越关心食物的安全和健康问题，无污染、无残留和无公害的绿色安全食品已逐步成为人们一种新的消费追求。饲料添加剂是生产饲料的源头之一，其质量直接影响饲料的质量，而饲料的质量又直接影响到畜禽的质量，所以要生产出绿色安全的畜禽产品，就必须严把饲料添加剂的质量和安全关。目前，所有的常规抗生素都出现了相应的抗药性致病株系，致病菌的抗药性问题已经日益严重地威胁着人们的健康。随着抗生素的大量广泛用于饲料中和人们对食品和环境质量的要求越来越高，人们对抗生素的副作用认识日益加深，抗生素在饲料业中的应用，已面临着全面淘汰或禁用的局面。
抗菌肽具有多种功效，可替代对人类健康有危害的抗生素和抗菌类药物在饲料中添加，是理想的无毒、无残留、高效广谱、抗菌，促生长的绿色饲料添加剂，被认为是抗生素的理想替代品。近年研究表明，解淀粉芽孢杆菌可改善动物肠道菌群的平衡，抑制病原菌的生长，增强动物机体免疫力，提高动物消化功能，促进动物生长发育和提高动物生产性能等益生作用，解淀粉芽孢杆菌产抗菌蛋白脂肽类和各种消化酶，具有一般乳酸菌维持肠道微生态平衡，刺激免疫，提高动物消化功能等益生作用，还具有抗菌肽抑制病原菌生长的能力。尤其在抑制G-细菌如大肠杆菌，沙门氏菌等上表现优越。使其必将成为饲料添加剂行业中不可替代重要成员。
故如何将饲料中对人类健康有危害的抗生素和抗菌类药物替换成具有高抑菌性能的抗菌肽成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明为制备具有高抑菌性能，且能提高动物消化功能的抗菌肽，提供了解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供了一种解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，包括以下步骤：
步骤1、将原料混合制备的混合液进行pH调节，并将所述混合液的pH值控制在7-9，pH调节后对所述混合液进行培养基灭菌处理；
步骤2、将种子液按1-4％的接种量接种于步骤1中得到的所述混合液以进行发酵培养，所述发酵培养的条件为：温度32-42℃，搅拌速度100-200rpm，并发酵培养16-32h，得到发酵液；
步骤3、将步骤2中得到的所述发酵液置入离心机进行离心分离5-20min，离心分离后通过微孔滤膜过滤所述发酵液的上层清液，得到的滤液即为抗菌肽制品；
其中，按质量份数计，步骤1中所述混合液的各组成及其用量如下
进一步地，步骤2中的所述种子液的制备方法包括以下步骤：
步骤21、将原料混合得到混合液并对所述混合液进行pH调节至7.0-7.2；
步骤22、对调节pH后的所述混合液进行灭菌处理，灭菌处理时间为10-40min；
步骤23、在灭菌处理完成后，混合液凝固，将一环单菌落接种于混合液固体斜面，固体斜面培养60-80h即得固体斜面种子；
其中，按质量份数计，步骤21中所述混合液的各组成及其用量如下：
进一步地，步骤22中所述灭菌处理的灭菌温度为100-140℃。
进一步地，步骤23中所述混合液在温度30-40℃环境下培养60-80h得到输送斜面种子液。
进一步地，步骤2中的所述种子液的制备方法包括以下步骤：
步骤21、将原料混合得到混合液并对所述混合液进行pH调节至7.0-7.2；
步骤22、对调节pH后的所述混合液进行灭菌处理，灭菌处理时间为10-40min；
步骤23、在灭菌处理完成后，将一环单菌落接种于所述混合液，所述混合液培养60-80h即得固体斜面种子；
步骤24、将步骤23中得到的所述固体斜面种子取二环接种于摇瓶，并在三角瓶内培养16-24h即得摇瓶种子液；
其中，按质量份数计，步骤21中所述混合液的各组成及其用量如下：
进一步地，步骤22中所述灭菌处理的灭菌温度为100-140℃。
进一步地，步骤24中所述固体斜面种子取二环接种于摇瓶种子，并在三角瓶内以温度30-40℃环境下培养16-24h得到所述摇瓶种子液。
进一步地，步骤3中得到的滤液后对所述滤液进行喷雾干燥处理后，得到粉剂抗菌肽产品。
进一步地，步骤3中在所述发酵液离心分离后，通过孔径为0.1um-0.5um的微孔滤膜过滤所述发酵液的上层清液，得到的滤液。
本发明的第二个方面是提供了根据一种上述方法制作的的抗菌肽制品。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的抗菌肽发酵方法所制备的抗菌肽液态抑大肠杆菌菌圈直径可以达到12.4mm效价可以达到24590u/ml，同时丰富了细菌抗菌肽种类，通过本发明提供的发酵生产方法得到的抗菌肽产品具有较好的抑菌活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
本发明实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，按质量份数计算，其组成和含量如下：
上述配方按照下列步骤进行制备材料：
步骤1、对由上述组分混合制备的混合液进行pH调节，并将混合液的pH值控制在7-9，pH调节后对混合液进行培养基灭菌处理；
步骤2、将种子液按1-4％的接种量接种于步骤1中得到的混合液以进行发酵培养，发酵培养的条件为：温度32-42℃，搅拌速度180rpm，并发酵培养16h，得到发酵液；
步骤3、将步骤2中得到的发酵液置入离心机进行离心分离10min，离心分离后通过微孔滤膜过滤发酵液的上层清液，得到的滤液即为抗菌肽制品。
在本实施例中，步骤2中的种子液按质量份数计算，其组成和含量如下：
上述配方按照下列步骤进行制备材料：
步骤21、将上述组分混合得到混合液并对混合液进行pH调节至7.0-7.2；
步骤22、pH调节后对混合液进行灭菌处理，灭菌处理时间为20min；
步骤23、在灭菌处理完成后，将一环单菌落接种于混合液，混合液培养72h即得固体斜面种子。
在本实施例中，步骤22中灭菌处理的灭菌温度为121℃。
在本实施例中，步骤23中混合液在温度37℃环境下培养72h得到输送斜面种子液。
在本实施例中，步骤3中得到的滤液后对滤液进行喷雾干燥处理后，得到粉剂抗菌肽产品。步骤3中在发酵液离心分离后，通过孔径为0.22um的微孔滤膜过滤发酵液的上层清液，得到的滤液。
实施例2
本发明实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，按质量份数计算，其组成和含量如下：
上述配方按照下列步骤进行制备材料：
步骤1、对由上述组分混合制备的混合液进行pH调节，并将混合液的pH值控制在7-9，pH调节后对混合液进行培养基灭菌处理；
步骤2、将种子液按1-4％的接种量接种于步骤1中得到的混合液以进行发酵培养，发酵培养的条件为：温度32℃，搅拌速度100rpm，并发酵培养32h，得到发酵液；
步骤3、将步骤2中得到的发酵液置入离心机进行离心分离20min，离心分离后通过微孔滤膜过滤发酵液的上层清液，得到的滤液即为抗菌肽制品。
在本实施例中，步骤2中的种子液按质量份数计算，其组成和含量如下：
上述配方按照下列步骤进行制备材料：
步骤21、将上述组分混合得到混合液并对混合液进行pH调节至7.0-7.2；
步骤22、pH调节后对混合液进行灭菌处理，灭菌处理时间为40min；
步骤23、在灭菌处理完成后，将一环单菌落接种于混合液，混合液培养60h即得固体斜面种子。
在本实施例中，步骤22中灭菌处理的灭菌温度为110℃。
在本实施例中，步骤23中混合液在温度30℃环境下培养80h得到输送斜面种子液。
在本实施例中，步骤3中得到的滤液后对滤液进行喷雾干燥处理后，得到粉剂抗菌肽产品。步骤3中在发酵液离心分离后，通过孔径为0.5um的微孔滤膜过滤发酵液的上层清液，得到的滤液。
实施例3
本发明实施例提供了一种解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，按质量份数计算，其组成和含量如下：
上述配方按照下列步骤进行制备材料：
步骤1、对由上述组分混合制备的混合液进行pH调节，并将混合液的pH值控制在7-9，pH调节后对混合液进行培养基灭菌处理；
步骤2、将种子液按1-4％的接种量接种于步骤1中得到的混合液以进行发酵培养，发酵培养的条件为：温度42℃，搅拌速度200rpm，并发酵培养32h，得到发酵液；
步骤3、将步骤2中得到的发酵液置入离心机进行离心分离5min，离心分离后通过微孔滤膜过滤发酵液的上层清液，得到的滤液即为抗菌肽制品。
在本实施例中，步骤2中的种子液按质量份数计算，其组成和含量如下：
上述配方按照下列步骤进行制备材料：
步骤21、将上述组分混合得到混合液并对混合液进行pH调节至7.0-7.2；
步骤22、pH调节后对混合液进行灭菌处理，灭菌处理时间为25min；
步骤23、在灭菌处理完成后，将一环单菌落接种于混合液，混合液培养78h即得固体斜面种子；
步骤24、将步骤23中得到的固体斜面种子取二环接种于摇瓶，并在三角瓶内培养24h即得摇瓶种子液。
在本实施例中，步骤22中灭菌处理的灭菌温度为110℃。
在本实施例中，步骤24中二环斜面种子改成固体斜面种子取二环接种于摇瓶种子，并在三角瓶内以温度37℃环境下培养24h得到摇瓶种子液。
在本实施例中，步骤3中得到的滤液后对滤液进行喷雾干燥处理后，得到粉剂抗菌肽产品。步骤3中在发酵液离心分离后，通过孔径为0.1um-0.5um的微孔滤膜过滤发酵液的上层清液，得到的滤液。
本实施例提供了一种通过指示平板测定抑菌性能的方法，其中指示平板的制备方法为：在100ml/250锥形瓶LB培养基(50℃)中加入1ml OD600nm＝1的指示菌菌悬液摇匀，再准确吸取10ml指示菌菌悬液并转移至直径90mm的培养皿内，轻摇后水平放置，使之形成均匀一致的指示菌平板。取制备好的检测培养基平板，用已经灭菌处理过的打孔器(孔径Φ2.7mm)打孔，每孔中分别加入若干5ul实施例1-3的产品，置于37℃培养箱中，培养16-20小时后，用游标卡尺测定抑菌圈直径大小，计算平均值；
其中，LB培养基按质量份数计算，其组成和含量如下：胰蛋白胨1％，酵母浸粉0.5％，NaCl 1％，葡萄糖0.5％琼脂1.5％～2％，水95-95.5％。将上述组分混合并将其pH值调至7.0～7.2，在温度121℃下进行灭菌处理20min后，将取100ml混合液置入在三角内并接种一环该菌单菌落瓶于37℃，搅拌速度180rpm培养16-24H即得LB培养基。
其中，指示菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、腐生葡萄球菌、副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌、柠檬酸杆菌、单核细胞增生李斯特菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸乳球菌、肠膜明串珠菌、乳酸肠球菌、希氏乳杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、棒状乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、酿酒酵母、汉逊德巴利酵母、近平滑假丝酵母、解脂假丝酵母。
根据上述的指示平板测定抑菌性能的方法得到表1。
抑指示菌菌圈直径(mm) 生物效价(单位/g)
实施例1 12.3 24582
实施例2 12.3 24583
实施例3 12.4 24590
本发明针对如何将饲料中对人类健康有危害的抗生素和抗菌类药物替换成具有高抑菌性能的抗菌肽等问题，本发明提供的抗菌肽发酵方法所制备的抗菌肽液态抑大肠杆菌菌圈直径可以达到12.4mm效价可以达到24590u/ml，同时丰富了细菌抗菌肽种类，通过本发明提供的发酵生产方法得到的抗菌肽产品具有较好的抑菌活性。
以上对本发明解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽及其发酵生产方法的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将原料混合制备的混合液进行pH调节，并将所述混合液的pH值控制在7-9，pH调节后对所述混合液进行培养基灭菌处理；
步骤2、将种子液按1-4％的接种量接种于步骤1中得到的所述混合液以进行发酵培养，所述发酵培养的条件为：温度32-42℃，搅拌速度100-200rpm，并发酵培养16-32h，得到发酵液；
步骤3、将步骤2中得到的所述发酵液置入离心机进行离心分离5-20min，离心分离后通过微孔滤膜过滤所述发酵液的上层清液，得到的滤液即为抗菌肽制品；
其中，按质量份数计，步骤1中所述混合液的各组成及其用量如下
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，其特征在于，步骤2中的所述种子液的制备方法包括以下步骤：
步骤21、将原料混合得到混合液并对所述混合液进行pH调节至7.0-7.2；
步骤22、对调节pH后的所述混合液进行灭菌处理，灭菌处理时间为10-40min；
步骤23、在灭菌处理完成后，混合液凝固，将一环单菌落接种于混合液固体斜面，固体斜面培养60-80h即得固体斜面种子；
其中，按质量份数计，步骤21中所述混合液的各组成及其用量如下：
3.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，其特征在于，步骤22中所述灭菌处理的灭菌温度为100-140℃。
4.根据权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，其特征在于，步骤23中所述混合液在温度30-40℃环境下培养60-80h得到输送斜面种子液。
5.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，其特征在于，步骤2中的所述种子液的制备方法包括以下步骤：
步骤21、将原料混合得到混合液并对所述混合液进行pH调节至7.0-7.2；
步骤22、对调节pH后的所述混合液进行灭菌处理，灭菌处理时间为10-40min；
步骤23、在灭菌处理完成后，将一环单菌落接种于所述混合液，所述混合液培养60-80h即得固体斜面种子；
步骤24、将步骤23中得到的所述固体斜面种子取二环接种于摇瓶，并在三角瓶内培养16-24h即得摇瓶种子液；
其中，按质量份数计，步骤21中所述混合液的各组成及其用量如下：
6.根据权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，其特征在于，步骤22中所述灭菌处理的灭菌温度为100-140℃。
7.根据权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，其特征在于，步骤24中所述固体斜面种子取二环接种于摇瓶种子，并在三角瓶内以温度30-40℃环境下培养16-24h得到所述摇瓶种子液。
8.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，其特征在于，步骤3中得到的滤液后对所述滤液进行喷雾干燥处理后，得到粉剂抗菌肽产品。
9.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽的发酵生产方法，其特征在于，步骤3中在所述发酵液离心分离后，通过孔径为0.1um-0.5um的微孔滤膜过滤所述发酵液的上层清液，得到的滤液。
10.一种如权利要求1-9任一项所述方法制作的的解淀粉芽孢杆菌抗G-细菌抗菌肽。
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