CN106282276A

CN106282276A - 一种芽孢杆菌抗菌肽的制备方法和应用

Info

Publication number: CN106282276A
Application number: CN201510251466.3A
Authority: CN
Inventors: 乔琳; 崔栩; 金忠辉; 张晓华; 王兰; 孙菡聪
Original assignee: BEIJING VICAREN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING VICAREN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2015-05-18
Publication date: 2017-01-04

Abstract

本发明涉及一种芽孢杆菌抗菌肽的制备方法和应用。所用菌株淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4可以产生抗菌肽WJ-1，其对大肠杆菌、沙门氏菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌均有抑菌作用，抑菌圈直径达到20-30 mm。淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4接种、制作摇瓶种子、生产一级种子液，通过二级发酵后，固液分离后，上清液与载体混合再利用喷雾干燥获得干燥活性菌粉，经载体稀释后获得饲料添加剂产品。该添加剂适合畜禽养殖全程使用，可以提高畜禽生产性能，促进畜禽生长，增强畜禽机体免疫力，降低幼龄动物死亡率，降低粪便排泄量，减少粪臭，改善养殖环境。

Description

一种芽孢杆菌抗菌肽的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种芽孢杆菌抗菌肽的制备方法和在畜禽养殖中的应用，尤其适用于畜禽饲料添加剂，属于饲用微生物添加剂技术领域。

背景技术

抗生素在畜禽饲料中的长期使用带来的畜禽类产品的食品安全性问题已经越来越受到人们的关注，因为滥用抗生素导致动物肠道的正常菌群平衡受到破坏，同时，滥用导致耐药性的产生以及药物残留等问题给动物和人类的健康带来了巨大的威胁和危害，所以寻求有效、安全、绿色、天然的饲用抗生素替代产品，成为了畜禽养殖行业关注的热点问题。

抗菌肽是生物体产生一种天然的活性免疫多肽，具有抗菌、抗病毒、抗真菌及提高机体免疫的作用。近年来，抗菌肽作为一种新型饲料添加剂在畜牧中得到了部分应用，其提高养殖动物的健康水平和生产性能的功效已经得到人们的普遍认可，是公认的饲用抗生素的最佳替代品之一。

抗菌肽的生产制备方法有三种，分别为化学合成，生物提取和微生物发酵方法生产。而产用微生物发酵方法生产是一种低廉和高效的制备和生产抗菌肽的方法。许多通过发酵法生产的抗菌肽已经在食品中得到应用，如乳链球菌产生的Nisin目前广泛应用在食品保鲜和防腐。但抗菌肽作为饲料添加剂应用较少，本研究就是针对饲料添加剂方而开发的一种抗菌肽。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1的高效制备方法，按照此方法生产抗菌肽WJ-1的发酵分泌量可达到4.5g/L。所述制备方法的具体步骤如下：

（1）斜面菌种的活化：从淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4的保藏甘油管中挑一环菌液划线于营养琼脂平板，于32-37℃，培养15-20 h，使芽孢杆菌复壮，并长出单菌落，挑单菌落划线于斜面培养基进行活化，所述斜面培养基同样是营养琼脂，配方为：每1000 mL水中含有：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化钠 5 g，琼脂 15-20 g，pH值为7.2-7.4，常规灭菌。

（2）种子摇瓶的制备：从上述活化好的斜面上挑一环菌种接于装有250-300 mL液体种子培养基的1000 mL三角瓶中，于35-37℃，振荡培养20-30 h，即得淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4的摇瓶种子液，活菌数为1×10⁹ CFU/mL，芽孢处于刚开始形成的状态。所述摇瓶种子培养基的配方为：每1000 mL水中含有：蛋白胨 20 g，酵母膏 10 g，三水合磷酸氢二钾 1 g，一水合硫酸锰 0.1 g，pH值为7.4，常规灭菌。

（3）种子罐的培养：将上述制备好的摇瓶种子液按照1%（v/v）的接种量接入装有50 L种子发酵培养基的100 L种子发酵罐中，于35-37℃，培养20-25 h，搅拌转速为250-300 rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂。得到二级种子发酵液，活菌数为3.2×10⁹ CFU/mL，芽孢处于刚开始形成的状态。所述种子发酵培养基与摇瓶种子培养基的配方一致。

（4）生产发酵：将上述制备好的种子发酵液按照1-2%（v/v）的接种量接入装有2500 L发酵培养基的5000 L生产发酵罐中，于35-37℃，发酵25-30 h，搅拌转速为250-300 rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂。发酵结束获得淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4的活菌发酵液。所述发酵培养基的配方为：每1000 mL水中含有：蛋白胨 20 g，酵母膏 5 g，葡萄糖 10 g，三水合磷酸氢二钾 1 g，一水合硫酸锰 0.15 g，七水合硫酸镁 0.3 g，pH值为7.2。

（5）发酵液后处理：发酵结束后的发酵液通过高速管式离心机（15000-20000 rpm）分离菌体和上清液，上清液后转移至混合搅拌罐中，按照载体与菌泥的质量比为3:1的比例向混合搅拌罐中加入载体，载体配方为50%的麦芽糊精+20%海藻糖+30%淀粉，与上清液混合均匀。同时将喷雾干燥设备的蒸汽压力保持在0.3-0.6 MPa，进口温度达到180-200℃，出口温度达到110-140℃，塔内压力保持在-12-18 Pa，然后打开进料罐阀门，开始水喷雾，待压力稳定，出口温度保持在80-90℃时，打开打浆泵，将上清液和载体混合物料打入缓冲罐，开始喷雾干燥，干燥过程中保持罐内压力及进出口温度的稳定，干燥后的干粉为活性抗菌肽干燥菌粉。利用抑菌圈法和高效液相法定性和定量干粉抗菌肽的含量。

本发明的第二个目的是提供抗菌肽WJ-1作为畜禽饲料添加剂在畜禽养殖中的应用，是将该添加剂成品菌粉以0.05-0.1‰的比例拌入畜禽全价饲料，用于畜禽养殖全程。经畜禽饲喂试验证明，本发明的饲料添加剂可以显著提高畜禽生产性能，促进畜禽生长，增强机体的抗病能力，降低幼龄动物死亡率，减少抗生素的使用，降低粪便排泄量，减少粪臭，改善养殖环境。

基于上述特性，本发明提供的淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1具有显著的促生长和减少药物使用的作用。由该菌株制备的抗菌肽可以用作畜禽微生物饲料添加剂，具有提高畜禽生产性能，减少用药，促进畜禽生长，增强畜禽机体免疫力，降低幼龄动物死亡率，降低粪便排泄量，减少粪臭，改善养殖环境的有益功效。

附图说明

图1为抗菌肽WJ-1对人工胃液的耐受性。

图2为抗菌肽WJ-1对肠液的耐受性。

图3为淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1对金黄色葡萄球菌和沙门氏杆菌的抑菌效果，其中无抑菌圈的是空白培养基对照组；有抑菌圈的是淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1的培养液的上清液。

图4为淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4在5000 L生产发酵罐条件下抗菌肽WJ-1的含量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例一：淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1的抑菌活性的测定

1. 培养液上清的制备

从淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4的保藏斜面挑一环菌苔接种于肉汤培养基中，37℃，180 rpm振荡培养22 h，取1mL菌液12000 rpm离心1 min，取上清液。

2. 抑菌活性检测平板的制备

将15 mL完全熔化的LB琼脂培养基倒入培养皿中，待其凝固后垂直放上牛津杯；另取完全熔化的LB琼脂培养基，待其冷却到55℃时加入指示菌混匀，取10 mL混有指示菌的培养基倒入放有牛津杯的培养皿中，待完全凝固后拔出牛津杯，制成检测平板。所述指示菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌。

3. 抑菌活性的测定

取200 µL培养液上清加入检测平板的孔中，4℃放置24 h后放入37℃培养箱中培养20 h，测得抑菌圈直径大小为20-30 mm。

实施例二：淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1的定量测定

从淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4的保藏斜面挑一环菌苔接种于肉汤培养基中，37℃，180 rpm振荡培养22 h，取1mL菌液12000 rpm离心1 min，取上清液。抗菌肽粉按照5%溶到去离子水溶液中。采用高效液相色谱法测定枯草菌素抗菌肽WJ-1含量。色谱柱：Poroshell 120 EC-C8 2.7μm 3.0*50mm；色谱方法：流速0.8mL/min，柱压200bar；流动相A：水+0.1% TFA，流动相B：80%乙腈+0.085%TFA；柱温：30℃；进样体积为50μl，每个样品检测3 次，样品检测完后再次检测内控品，洗脱程序见表1。其出峰时间为3.932min。根据样品峰面积与浓度之间的正比关系，通过制作标准曲线测定出不同菌株发酵上清液中的枯草菌素抗菌肽WJ-1的含量。

表1 梯度洗脱程序

实施例三：淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1耐受人工胃肠消化液。

从淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4发酵液离心后，得到发酵代谢产物抗菌肽WJ-1。吸取10 mL发酵代谢产物抗菌肽WJ-1分别接于装有90 mL pH 3=3.5的人工胃液以及pH=6.5人工胰液三角瓶中。然后在37℃，静置培养2h，分别通过抑菌圈法测定0 、0.5、1、1.5、2 h对培养物的抑菌活性，即抑菌圈的直径，初步推断人工胃液和胰液处理后抗菌肽的抗菌活性。

测定结果显示，淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1在人工胃液和胰液处理后，仍然具有抗菌活性，说明其能够耐受胃液和胰液的消化。

实施例四：淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1作为畜禽饲料添加剂的制备

根据淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4产抗菌肽的特性，经过培养基优化和发酵条件优化，最终形成了最优的制备工艺。具体如下：

（1）斜面菌种的活化：从淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1的保藏甘油管中挑一环菌液划线于营养琼脂平板，于32-37℃，培养15-20 h，使芽孢杆菌复壮，并长出单菌落，挑单菌落划线于斜面培养基进行活化，所述斜面培养基同样是营养琼脂，配方为：每1000 mL水中含有：蛋白胨 10 g，牛肉膏 3 g，氯化钠 5 g，琼脂 15-20 g，pH值为7.2-7.4，常规灭菌。

（2）种子摇瓶的制备：从上述培养好的斜面上挑一环菌种接于装有250 mL液体种子培养基的1000 mL三角瓶中，于35-37℃，振荡培养20-30 h，即得淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4的摇瓶种子液，活菌数为2×10⁹ CFU/mL，芽孢处于刚开始形成的状态。所述摇瓶种子培养基的配方为：每1000 mL水中含有：蛋白胨 20 g，酵母膏 10 g，三水合磷酸氢二钾 1 g，一水合硫酸锰 0.1 g，pH值为7.4，常规灭菌。

（3）种子罐的培养：将上述制备好的摇瓶种子液按照1%（v/v）的接种量接入装有50 L种子发酵培养基的100 L种子发酵罐中，于35-37℃，培养20-25 h，搅拌转速为250-300 rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂，得到一级种子发酵液，活菌数为3.2×10⁹ CFU/mL，芽孢处于刚开始形成的状态。所述种子发酵培养基与摇瓶种子培养基的配方一致。

（4）生产发酵：将上述制备好的种子发酵液按照1-2%（v/v）的接种量接入装有2500 L发酵培养基的5000 L生产发酵罐中，于35-37℃，发酵25-30 h，搅拌转速为250-300 rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂。发酵结束获得淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4发酵液。所述发酵培养基的配方为：每1000 mL水中含有：蛋白胨 20 g，酵母膏 5 g，葡萄糖 10 g，三水合磷酸氢二钾 1 g，一水合硫酸锰 0.15 g，七水合硫酸镁 0.3 g，pH值为7.2。

实施例五：淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1作为畜禽饲料添加剂对于蛋鸡生产性能的影响

试验选用北京郊区某蛋鸡养殖场提供的150日龄海兰褐蛋鸡7200只，分为4组，每组6个重复，每个重复300只鸡。对照组饲喂基础日粮（表2），试验1、2、3组分别饲喂在基础日粮中添加0.05‰、0.1‰和0.15‰本发明提供的淀粉液化芽孢杆菌（B.amylolique） ES-2-4代谢产物抗菌肽WJ-1成品粉剂的日粮。试验期所有实验条件保持一致，密闭式鸡舍，阶梯式两层笼养，每笼15只，专人负责，每天光照恒定16 h，自然通风，自由采食、饮水，保持栏舍清洁卫生，同时按照鸡场保健程序进行免疫和保健。预饲期7天，正试期56天，试验在提供试验动物的蛋鸡养殖场进行。试验期间每天观察鸡群健康状况及采食状况，测定并记录各项参数指标，结果见表3和表4。

由表3的结果可以看出抗菌肽WJ-1对于蛋鸡产蛋性能的影响。与对照组相比，试验1、2组的全期平均蛋重、平均日产蛋量、产蛋率显著提高，死淘率、破蛋率和料蛋比显著降低，表明抗菌肽WJ-1的成品菌粉在基础日粮中的添加剂量为0.05-0.1‰时，可以明显提高蛋鸡对饲料的消化利用率和生产性能。然而，当添加剂量增加至0.15‰时，与对照组相比，蛋鸡的全期平均蛋重显著降低，死淘率明显升高，平均日产蛋量、产蛋率和平均日耗料量均没有显著改善，虽然破蛋率明显低于对照组，但是却显著高于其余两个剂量组，这些结果表明，抗菌肽WJ-1成品菌粉在基础日粮中的添加剂量过高（> 0.1‰）并不能对蛋鸡的产蛋性能产生更好的影响。

由表4的结果可以看出抗菌肽WJ-1对于蛋鸡蛋品质的影响。与对照组相比，试验1、2组的A级蛋的比例、蛋比重、蛋黄比率、蛋壳厚度均有显著增加，蛋形指数更适合孵化率的提高。但是当成品菌粉的添加剂量增加至0.15‰时，这些指标与对照组相比均没有显著差异，表明抗菌肽WJ-1成品菌粉在蛋鸡基础日粮中的添加剂量不是越高越好，最佳剂量可以控制在0.05-0.1‰。

表2 基础日粮组成及营养水平

项目	含量	项目	含量
				日粮组成（%）		营养成分
玉米	62.05	粗蛋白（%）	15.8
				豆粕	25	代谢能（MJ/Kg）	11.6
大豆油	1	钙（%）	3.8
				石粉	9	有效磷（%）	0.35
磷酸氢钙	1.5	赖氨酸（%）	0.83
				蛋氨酸	0.15	蛋氨酸（%）	0.4
食盐	0.3
				预混料^*	1

注：*预混料可为每kg 全价料提供：V_A 8800 IU，V_D3 1980 IU，V_E 11 IU，V_K3 1.1 mg，V_B1 1.6 5mg，V_B2 6.6 mg，V_B3 2.42 mg，V_B5 22 mg，V_B6 2.2 mg，V_B12 0.033 mg，生物素 0.88 mg，叶酸 0.88 mg，Cu 24 mg，Fe 1.08 mg，Mn 84 mg，Zn 72 mg，I 0.456 mg，Se 0.24 mg。

表3 不同添加剂量组对蛋鸡产蛋性能的影响

	对照组	试验1组	试验2组	试验3组
					全期平均蛋重（g/个）	61.24±0.38^a	62.89±0.56^b	63.02±0.23^b	60.55±0.78^c
平均日产蛋量（g/（只·日））	50.59±0.72^a	51.87±1.39^a	52.42±0.92^b	51.62±1.02^a
					产蛋率（%）	82.19±3.22^a	83.79±4.56^b	84.43±6.24^c	81.78±5.82^a
死淘率（%）	1.49±0.59^a	0.75±0.34^b	0.79±0.92^b	1.99±0.78^c
					平均日耗料量（g/只·日）	113.09±4.88^a	112.49±5.62^a	114.55±6.13^a	111.97±6.22^a
破蛋率（%）	2.25±0.89^a	1.78±0.22^b	1.98±0.34^b	2.10±0.72^c
					料蛋比	2.19±0.45^a	2.16±0.31^b	2.18±0.64^b	2.16±0.83^b

注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P<0.05），肩标相同字母表示差异不显著（P>0.05）

表4 不同添加剂量组对蛋品质的影响

	对照组	试验1组	试验2组	试验3组
					蛋颜色（A级蛋比例%）	52.65±0.34^a	54.78±0.56^b	55.82±0.83^c	51.99±0.12^a
蛋形指数	1.26±0.22^a	1.3±0.38^b	1.33±0.43^b	1.28±0.55^a
					蛋比重（g/cm3）	1.072±0.66^a	1.097±0.72^b	1.103±0.98^b	1.088±0.83^a
哈夫单位	83.78±1.34^a	83.12±1.25^a	83.55±0.91^a	84.05±1.97^a
					蛋黄比率（%）	23.45±1.77^a	25.62±2.34^b	26.13±1.82^b	24.01±2.57^a
蛋壳厚度（mm）	0.387±0.066^a	0.402±0.083^b	0.408±0.072^b	0.397±0.025^a

实施例八：抗菌肽WJ-1作为畜禽饲料添加剂对断奶仔猪的影响

本次饲喂试验在北京郊区某生猪养殖场进行，并从该猪场选用25日龄杜洛克×长白×大白三元杂交健康断奶仔猪240头，所有仔猪的出生日期相差3天以内，且21日龄左右断奶，体重相近，母猪的胎次、仔猪的性别比例尽量保持一致，随机分为4组，每组6个重复，每个重复10头，组间体重差异不显著，每组的性别比例尽量一致。对照组饲喂基础日粮（表5），试验1、2、3组分别饲喂在基础日粮中添加0.025‰、0.05‰和0.1‰本发明提供的抗菌肽WJ-1成品菌粉的日粮。饲喂时间共37天，预饲期7天，正试期30天，试验期间，试验猪和对照猪在相同环境和管理条件下饲养，自由采食，自由饮水，按照猪场正常程序注射疫苗、驱虫和去势。

试验起始和结束时早晨空腹称重，记录每天的饲料实际消耗量，每天上午定时观察仔猪健康状况和排便情况，并做记录。于实验结束时的早晨8点，对空腹仔猪进行前腔静脉采血15 mL，用于测定血清免疫学指标，同时收集仔猪粪便，利用相应的分离培养基和培养条件对粪便中不同微生物进行活菌计数，利用复合式气体自动检测仪测定粪样中氨气含量。试验结果见表6-表9。

由表6的结果可以看出抗菌肽WJ-1对于断奶仔猪生长性能的影响。与对照组相比，当抗菌肽WJ-1的成品菌粉添加剂量在0.05-0.1‰的范围内时，断奶仔猪的体重增加量明显高于对照组，而添加剂量为0.025‰时仔猪的体重增加与对照组没有显著差异，表明抗菌肽WJ-1对于断奶仔猪具有促生长作用，且最适添加剂量为0.05-0.1‰。同样地，试验1组与对照组的头均耗料量差异不显著，但是试验2、3组的头均耗料量比对照组明显增加，说明饲料中添加一定剂量的抗菌肽WJ-1有助于提高断奶仔猪的采食量，增进猪只的食欲；从料重比的结果来看，抗菌肽WJ-1的成品菌粉添加剂量在0.05-0.1‰的范围内时，料重比显著优于试验1组和对照组，说明本发明的芽孢杆菌制剂还可以促进断奶仔猪对于饲料营养成分的消化吸收，大大提高了猪场的养殖效率。

由表7的结果可以看出抗菌肽WJ-1对于断奶仔猪健康水平的影响。在整个试验期间，对照组猪只的皮毛肤色相对实验组暗，且有疾病和因病死亡的情况发生，而实验组的猪只则皮红毛亮、食欲旺盛，体型均匀，整齐度良好，虽然试验1组也出现疾病和因病死亡的情况，但是发病率和死亡率均明显低于对照组，而试验2、3组均没有出现疾病和死亡的情况。另外，从腹泻率的统计结果来看，猪只食用抗菌肽WJ-1后腹泻率均比对照组显著下降，而且以试验2、3组最低。说明抗菌肽WJ-1能够显著提高断奶仔猪的健康水平和疾病抵抗能力，能够显著降低幼龄动物的死亡率，添加剂量以0.05-0.1‰为最佳。

由表8的结果可以看出抗菌肽WJ-1对于断奶仔猪机体免疫力的影响。通过测定对照组与试验组的IgG、IgM和IgA，以及补体C3和C4的含量水平，结果表明，虽然实验组的补体水平与对照组没有显著差异，但是三种抗体的水平尤其是试验2、3组显著高于对照组，说明抗菌肽WJ-1可以显著提高断奶仔猪体液特异性免疫功能，而且添加剂量以0.05-0.1‰为最佳。

由表9的结果可以看出抗菌肽WJ-1对于断奶仔猪粪便微生物组成及粪臭的影响。与对照组相比，试验组粪便中的大肠杆菌数量明显降低，乳酸菌与双歧杆菌的数量显著增加，表明肠道中的有益菌数量明显升高。试验2、3组的粪便氨气含量明显低于对照组和试验1组，而且试验期间，观察猪舍的卫生情况，试验2、3组的粪便排泄量、粪臭及猪舍环境均好于对照组，试验1组略好于对照组。说明猪只服用抗菌肽WJ-1后，对于降低断奶仔猪的粪便排泄量，减少粪臭，改善猪舍养殖环境有显著的功效。

表5 基础日粮组成及营养水平

项目	含量	项目	含量
				日粮组成（%）		营养成分
玉米	70.15	粗蛋白（%）	21
				46%豆粕	24	代谢能（MJ/Kg）	13
鱼粉	2	钙（%）	1.26
				植物油	1	磷（%）	0.75
多维500	0.04	赖氨酸（%）	1.2
				98%甜味剂	0.04	蛋氨酸+胱氨酸（%）	0.75
香味剂	0.04
				防霉剂	0.1
抗氧化剂	0.03
				通用多矿	0.15
赖氨酸98	0.4
				石粉	0.4
食盐	0.45

表6 不同添加剂量组对断奶仔猪生长性能的影响

	对照组	试验1组	试验2组	试验3组
					试验头数（头）	60	60	60	60
试验天数（d）	30	30	30	30
					初始均重（kg）	7.65±0.22^a	7.73±0.34^a	7.58±0.28^a	7.69±0.37^a
终末均重（kg）	21.78±0.75^a	22.09±0.82^a	23.62±0.93^b	23.39±0.88^b
					平均净增重（kg）	14.13±2.25^a	14.36±1.96^a	16.04±2.33^b	15.7±2.18^b
平均日增重（g）	471±0.33^a	478.7±0.19^a	534.7±0.22^b	523.3±0.15^b
					总耗料（kg）	1815	1834.8	1966.8	2007.6
头均耗料（kg）	30.25^a	30.58^a	32.78^b	32.82^b
					料重比	2.14^a	2.13^a	2.04^b	2.09^b

表7 不同添加剂量组对断奶仔猪健康水平的影响

	对照组	试验1组	试验2组	试验3组
					发病率（%）	12.34±1.58^a	1.29±0.55^b	0	0
腹泻率（%）	8.95±1.22^a	7.62±0.89^b	6.14±0.73^c	5.98±0.92^c
					死亡率（%）	5.25±0.23^a	2.47±0.28^b	0	0

表8 不同添加剂量组对断奶仔猪血清免疫学指标的影响

	对照组	试验1组	试验2组	试验3组
					IgG（g/L）	2.07±0.032^a	2.32±0.045^b	3.15±0.078^c	3.21±0.086^c
IgM（g/L）	3.25±0.054^a	3.38±0.071^a	3.88±0.069^b	3.97±0.103^b
					IgA（g/L）	1.23±0.091^a	1.29±0.082^b	1.45±0.033^c	1.39±0.048^c
C3（g/L）	0.53±0.021^a	0.54±0.032^a	0.54±0.041^a	0.55±0.058^a
					C4（g/L）	0.32±0.038^a	0.31±0.022^a	0.33±0.045^a	0.34±0.051^a

表9 不同添加剂量组对断奶仔猪粪便微生物数量及粪便氨气产量的影响

	对照组	试验1组	试验2组	试验3组
					大肠杆菌（LogCFU/g）	8.3^a	8.1^b	7.6^c	7.5^c
乳酸菌（LogCFU/g）	8.0^a	8.6^b	8.9^b	9.1^b
					双歧杆菌（LogCFU/g）	8.1^a	8.8^b	9.2^c	9.2^c
氨气产生量（μL/L）	12.5±0.14^a	11.6±0.89^a	10.1±0.18^b	9.7±0.32^b

综合实施例七和例八的结果可以看出，本发明提供的抗菌肽WJ-1的活性粉产品适合用作畜禽微生物饲料添加剂，当以日粮的0.05-0.1‰的剂量添加时，可以提高畜禽生产性能，促进畜禽生长，增强畜禽机体免疫力，降低幼龄动物死亡率，降低粪便排泄量，减少粪臭，改善养殖环境。

N-Lys Gly Val Arg Lys G1y A1a Lys Arg Gln Gly Cys Lys Lys Leu Ala Arg Lys Ala Leu Lys-C

Claims

1.一种芽孢杆菌抗菌肽的制备方法，具体步骤如下：

①斜面菌种的活化：从淀粉液化芽孢杆菌的保藏甘油管中挑一环菌液划线于营养琼脂平板，于32-37℃，培养15-20 h，使芽孢杆菌复壮，并长出单菌落，挑单菌落划线于斜面培养基进行活化，所述斜面培养基同样是营养琼脂，配方为：每1000 mL水中含有：蛋白胨 10 g，牛肉膏3 g，氯化钠 5 g，琼脂 15-20 g，pH值为7.2-7.4，常规灭菌；

②种子摇瓶的制备：从上述活化好的斜面上挑一环菌种接于装有250-300 mL液体种子培养基的1000 mL三角瓶中，于35-37℃，振荡培养20-30 h，即得淀粉液化芽孢杆菌的摇瓶种子液，活菌数为1×10⁹ CFU/mL，芽孢处于刚开始形成的状态，所述摇瓶种子培养基的配方为：每1000 mL水中含有：蛋白胨 20 g，酵母膏 10 g，三水合磷酸氢二钾 1 g，一水合硫酸锰 0.1 g，pH值为7.4，常规灭菌；

③种子罐的培养：将上述制备好的摇瓶种子液按照1%的接种量接入装有50 L种子发酵培养基的100 L种子发酵罐中，于35-37℃，培养20-25 h，搅拌转速为250-300 rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂，得到二级种子发酵液，活菌数为3.2×10⁹ CFU/mL，所述种子发酵培养基与摇瓶种子培养基的配方一致；

④生产发酵：将上述制备好的种子发酵液按照1-2%的接种量接入装有2500 L发酵培养基的5000 L生产发酵罐中，于35-37℃，发酵25-30 h，搅拌转速为250-300 rpm，控制适当通气量，并加入适量消泡剂，发酵结束获得淀粉液化芽孢杆菌的活菌发酵液，所述发酵培养基的配方为：每1000 mL水中含有：蛋白胨 20 g，酵母膏 5 g，葡萄糖 10 g，三水合磷酸氢二钾 1 g，一水合硫酸锰 0.15 g，七水合硫酸镁 0.3 g，pH值为7.2；

⑤发酵液后处理：发酵结束后的发酵液通过高速管式离心机分离菌体和上清液，上清液后转移至混合搅拌罐中，按照载体与菌泥的质量比为3:1的比例向混合搅拌罐中加入载体，载体配方为50%的麦芽糊精+20%海藻糖+30%淀粉，与上清液混合均匀，同时将喷雾干燥设备的蒸汽压力保持在0.3-0.6 MPa，进口温度达到180-200℃，出口温度达到110-140℃，塔内压力保持在-12-18 Pa，然后打开进料罐阀门，开始水喷雾，待压力稳定，出口温度保持在80-90℃时，打开打浆泵，将上清液和载体混合物料打入缓冲罐，开始喷雾干燥，干燥过程中保持罐内压力及进出口温度的稳定，干燥后的干粉为活性抗菌肽干燥菌粉，利用抑菌圈法和高效液相法定性和定量干粉抗菌肽的含量。

2.淀粉液化芽孢杆菌代谢产物抗菌肽作为畜禽饲料添加剂的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：适用于畜禽养殖全程使用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：按照0.05-0.1‰拌全价饲料。