CN101933558B - 一种复合微生态制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种复合微生态制剂及其应用，具体地说是涉及包含多种益生菌的复合微生态制剂及其应用。该制剂包含地衣芽孢杆菌CGMCC No.2383菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、粪肠球菌CGMCC No.2386菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉、酿酒酵母CGMCC No.2388菌粉中的任三种或四种，制剂活菌含量高，具有耐胃酸、耐胆盐、耐高温及耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶及抑制病原菌等益生功能。该制剂可根据畜禽及其所处生长阶段不同确定包含的益生菌种类、载体种类及其比例。本发明的复合微生态制剂能提高饲料利用效率，增加肉蛋奶等产量，促进动物生长，提高免疫力和抗病力，替代抗生素，从而改善动物产品品质。

Description

一种复合微生态制剂及其应用

本专利是申请号为CN200810106520.5的分案申请，原申请的申请日：2008.5.14，申请号：200810106520.5，发明创造的名称：一种复合微生态制剂及其应用。

技术领域

本发明涉及一种复合微生态制剂，具体地说是涉及包含多种益生菌的复合微生态制剂及其应用，属于微生态制剂技术领域。

背景技术

目前，对动物疾病的预防和治疗药物基本仍采用抗生素，但由于长期、大量使用抗生素，耐药性、菌群失调、免疫力下降、疾病复发率高、药物残留等种种弊端日益严重，同时也严重危害动物机体及人类健康。当前，世界各国对抗生素各自采取了禁用或限制使用的措施，如：欧盟从2006年全面禁止使用抗生素；世界卫生组织(WTO)提出了“在食用动物中减少抗生素使用的全球原则”；我国已启动“饲料安全工程”，并禁用了一批毒性和残留较大的药物。在此形式下，改变养殖观念、预防重于治疗，并开发应用无毒、无药残的新型绿色饲料添加剂是必然趋势。

微生态制剂是目前常用和研究较多的一种绿色、安全的饲料添加剂，此类制剂是由动物有益菌经工业化发酵生产得到的，包含有很多有益微生物及其代谢产物构成的活菌制剂，可以直接饲喂动物。微生态制剂通过维持肠道内微生态的平衡而发挥作用，具有防病、增强机体免疫力、促进生长、增加体重等多种功能，且无污染，无残留，不产生抗药性，是一种绿色、安全的饲料添加剂。

目前，市场上的微生态制剂存在以下几个方面的主要质量问题：(1)活菌含量低，而研究表明，如果一种菌在盲肠内容物中的浓度低少107个/g，则该菌产生的酶及代谢产物不足以影响宿主，难以满足治疗需要；(2)水分含量偏高，这是影响微生态制剂质量的重要因素之一；(3)不耐抗生素；(4)对胃酸和胆盐不稳定，致使只有少数菌株进入肠道后仍具有活性，达不到发挥作用所需的活菌数量。由于微生态制剂存在的这些质量问题，从而影响了其在动物上的应用效果，限制了微生态制剂的广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种活菌含量高、水分含量低、包含具有耐胃酸、耐胆盐、耐高温及耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶及抑制病原菌等益生功能的多种益生菌的微生态制剂。

本发明的另一目的在于提供该微生态制剂的用途。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一种复合微生态制剂，该制剂包含地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)CGMCC No.2383菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、粪肠球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.2386菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2388菌粉中的任三种或四种。

其中，所述的地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、酿酒酵母具有良好的耐胃酸、耐胆盐、耐高温、耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶、抑制病原菌等益生功能，为申请人从健康动物肠道或粪便中分离、选育得到，经中国农业微生物菌种保藏管理中心鉴定，并于2008年3月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称CGMCC)，保藏号分别为：CGMCC No.2383、CGMCC No.2386、CGMCC No.2388。

嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌可以按常规方法分离得到，也可从市场上购买得到，本发明为从市场上购买得到。

本发明的复合微生态制剂包含嗜酸乳杆菌菌粉、粪肠球菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比为1∶0.8～1.2∶0.8～2.5∶1.5～2.5。

本发明的复合微生态制剂包含地衣芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比为：1～3.5∶0.8～3.5∶0.8～3.5。

本发明的复合微生态制剂包含粪肠球菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比为：1∶0.8～1.2∶1.5～2.5。

本发明的复合微生态制剂包含嗜酸乳杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉，上述各成分的重量配比为：1～1.5∶2～2.5∶2～2.5。

本发明的复合微生态制剂还可进一步包含载体，载体为石粉、葡萄糖、硫酸钾铝、玉米芯粉中的任一种或两种。

本发明的另一目的在于提供该复合微生态制剂在畜禽饲料添加剂中的应用。该复合微生态制剂可以根据畜禽及其所处生长阶段不同确定包含的益生菌种类、载体种类及其比例，以更有针对性的制成各畜禽通用型或专用型的微生态制剂，从而更好的发挥微生态制剂的功能，如：本发明的复合微生态制剂包含嗜酸乳杆菌菌粉、粪肠球菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉，载体为石粉，上述各成分的重量配比为1∶0.8～1.2∶1.5～2.5∶1.5～2.5∶3.5～4.5，即可制成猪通用型复合微生态制剂，总有益菌数达2～5×10⁹cfu/g；复合微生态制剂包含：嗜酸乳杆菌菌粉、粪肠球菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉和葡萄糖，上述各成分的重量配比为：1∶0.8～1.2∶0.8～1.2∶1.5～2.5∶15～20，即制成仔猪专用型复合微生态制剂，总有益菌含量5～9×10⁸cfu/g；复合微生态制剂包含：地衣芽孢杆菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉、硫酸钾铝和石粉，上述各成分的重量配比为：1∶0.8～1.2∶0.8～1.2∶4.5～5.5∶1.5～2.5，即制成母猪专用型复合微生态制剂，总有益菌含量2～5×10⁹cfu/g；复合微生态制剂包含：枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌偻和玉米芯粉，上述各成分的重量配比为：3～3.5∶3～3.5∶2.5～3.5∶0.5～1.5，即制成饲料厂猪产品专用型复合微生态制剂，益生菌总菌含量可达2～5×10¹⁰cfu/g；复合微生态制剂包含：粪肠球菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉和葡萄糖，上述各成分的重量配比为：1∶0.8～1.2∶1.5～2.5∶15～20，即制成雏禽专用型复合微生态制剂，总有益菌含量5～9×10⁸cfu/g；复合微生态制剂包含：嗜酸乳杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉和石粉，上述各成分的重量配比为：1～1.5∶2～2.5∶2～2.5∶5～5.5，即制成肉禽专用型复合微生态制剂，总有益菌数达2×10⁹cfu/g；复合微生态制剂包含地衣芽孢杆菌菌粉、枯草芽胞杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉和石粉，上述各成分的重量配比为：1∶1～1.2∶1～1.2∶7～8，即制成蛋禽专用型复合微生态制剂，总有益菌数达2～5×10⁹cfu/g；复合微生态制剂包含枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌菌粉、酿酒酵母菌粉和玉米芯粉，上述各成分的重量配比为：3∶3～3.5∶3～3.5∶0.5～1.5，即制成饲料厂鸡产品专用型复合微生态制剂，益生菌总菌含量可达2～5×10¹⁰cfu/g。

本发明中所选育的地衣芽孢杆菌、粪肠球菌、酿酒酵母与枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌在制备中采用液体深层高密度发酵技术和喷干或者冻干一系列的后处理加工工艺技术制成菌粉，制剂中的活菌含量高、水分含量低，具有耐胃酸、耐胆盐、耐高温及耐受常用抗生素等抗逆性能和产酸、产酶及抑制病原菌等益生功能。

本发明的复合微生态制剂能提高饲料利用效率，增加肉蛋奶等产量，促进动物生长，提高免疫力和抗病力，替代抗生素，从而改善动物产品品质。

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CGMCC No.2383、粪肠球菌(Enterococcus faecium)CGMCC No.2386菌粉、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCC No.2388菌种的分离、选育及其菌粉的制备过程如下：

1、增菌培养：将健康动物(猪或者家禽)的新鲜粪便或肠道内容物样品接种于增殖液体培养基中，在30～37℃恒温培养增殖；

2、分离纯化：对步骤1增菌培养物在增殖培养基平板上进行划线培养，从中挑取各个具有特征形态的菌落再划线培养和分离，直至为纯菌落为止，革兰氏染色镜检，将分离的疑似纯菌落接种试管斜面中增殖，然后将斜面菌种保藏于4℃冰箱中，待用；

其中所述增殖培养基为BPY培养基、MRS培养基、98号培养基中的一种；

3、抗逆性强的优良菌种的选育：对步骤2所分离、纯化的菌株进行抗逆性筛选，可以对所分离、纯化的菌种直接进行抗逆性能测定，从中筛选出抗逆性强的天然优良菌种；或通过梯度培养逐渐增加溶液的酸性(至pH为1.5左右)及胆汁盐浓度，选出具有耐酸及耐胆汁特性的菌株；或通过传统的物理、化学诱变方法、现代基因工程技术，定向选育出抗逆性强的菌种；再做菌种鉴定及生物学性能测定：

1)耐酸性测定：将斜面菌种接种到种子培养基中活化，30～37℃静置培养8～20h，按5～10％接种量分别接种于pH值2.0、3.0、4.0的人工模拟胃液中，0h计数作对照，2h、6h取样用磷酸缓冲液按10倍系列稀释，进行平板活菌计数，计算存活率；

其中所述种子培养基为BPY培养基、MRS培养基、98号培养基中的一种；

2)耐胆盐测定：将斜面菌种接种于培养基中，30～37℃静置培养8-24h活化，按5～10％接种量分别接种于0.03％、0.1％、0.2％、0.3％不同浓度的猪胆盐溶液中，0h计数作对照，2h、6h取样用生理盐水按10倍系列稀释计数，进行平板活菌计数，计算存活率；

3)耐高温测定：将斜面菌种接种于种子培养基中，30～37℃培养16-24h活化，分别于50℃～80℃水浴处理15～30min，处理前的做对照，计算存活率；

4)耐药性测定：采用药敏性纸片法；

5)产酶测定：采用中华人民共和国轻工业行业标准，工业用α-淀粉酶制剂(QB/T1805.1-1993)，工业酶制剂通用试验方法(QB/T1803-1993)对地衣芽孢杆菌进行淀粉酶活力测定；采用行业标准：工业用蛋白酶制剂(QB/T1805.3-1993)，对地衣芽孢杆菌进行蛋白酶活力测定；

6)产酸测定：采用离子色谱法对粪肠球菌CGMCC No.2386进行有机酸产量测定；

7)抑菌试验：采用牛津杯法(又称管碟法)对常见致病菌进行抑菌测定；

本发明所选育的地衣芽孢杆菌CGMCC No.2383在人工模拟胃液(pH2.0～4.0)中处理6h，存活率在49.5％以上；在猪胆盐溶液(浓度0.3-3g/kg)处理6h，存活率为100％；50～80℃处理15～30min，存活率为100％；对青霉素G、阿莫西林、大观霉素、红霉素、吉他霉素、杆菌肽锌、林可霉素7种抗生素有耐药性；对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌三种致病菌均有较好的抑制作用，抑菌圈直径在12～20mm；产蛋白酶活力为1000u/ml；产淀粉酶活力为：800u/ml。

本发明所选育的粪肠球菌CGMCC No.2386在人工模拟胃液(pH2.0～4.0)中处理6h，存活率在18.0％以上；在猪胆盐溶液(浓度0.3-3g/kg)处理6h，存活率为12.6％以上；50～80℃处理15～30min，存活率为0.43％；对青霉素G、头孢噻肟、庆大霉素、大观霉素、新霉素、红霉素、吉他霉素、杆菌肽锌、林可霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、复方磺胺甲基异恶唑13种抗生素有耐药性；对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌三种致病菌均有很好的抑制作用，抑菌圈直径在16～21mm；乳酸、乙酸、异丁酸总酸产量为4.2g/L，乳酸产率达到89.4％。

本发明所选育的酿酒酵母CGMCC No.2388在人工模拟胃液(pH2.0～4.0)中处理6h，存活率在15.4％以上；在猪胆盐溶液(浓度0.3-3g/kg)处理6h，存活率为11.5％以上；50～80℃处理15～30min，存活率为0.19％；

4、菌粉的制备

地衣芽孢杆菌CGMCC No.2383菌粉的制备方法，包括如下的步骤：

1)平板培养复壮：将地衣芽孢杆菌菌种接种于BPY平板培养基上，于30-37℃培养12-24h，使地衣芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种于斜面培养基上，于30-37℃培养24-36h；

2)一级种子的制备：将步骤1)培养的地衣芽孢杆菌菌种转接茄子瓶BPY斜面培养基上，于30～37℃培养12～16h，使其处于对数中后期，得一级种子；

3)二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有1-1.6M³ BPY种子培养基的2M³种子罐中，温度30～37℃，转速200～250rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1∶0.6～0.8(14.4～19.2M³/h)，培养10～14h，为二级种子液；

4)地衣芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照3～10％的接种量接种到装有12～16M³发酵培养基的发酵罐中，温度30～37℃，转速220～300rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1∶0.6～0.8，培养16～20h，至芽孢形成率90％以上，活菌数为1～2×10¹⁰cfu/ml，则中止发酵，得地衣芽孢杆菌发酵液；

所述的发酵培养基为：麸皮1～2％，豆粕1～2％，氯化钠0.2～0.8％，硫酸镁0.01～0.05％；

5)地衣芽孢杆菌菌粉的制备：在步骤4)制备的发酵液中加入20～25％的填充物，混匀，进行喷雾干燥，进风温度120～130℃，排风温度40～50℃，雾化器转速15000～18000rpm，得到水分含量＜5％的地衣芽孢杆菌菌粉。

所述的填充物为：米糠、沸石粉、稻壳粉中的任一种。

B、粪肠球菌CGMCC No.2386菌粉的制备方法，包括如下的步骤：

1)平板培养复壮：将粪肠球菌菌种接种于MRS平板培养基上，于32～37℃培养12～24h，使粪肠球菌菌复壮，并形成单菌落；挑取单菌落接种于斜面培养基上，于32～37℃培养24～36h；

2)一级种子的制备：将步骤1)培养的粪肠球菌斜面菌种转接到装有250ml～300ml MRS培养基的500mL三角瓶中，于32～37℃培养12～16h，转速100～150rpm，使其处于对数中后期，为一级种子；

3)二级种子的制备：将步骤2)培养的乳酸杆菌一级种子转接到装有1.2～1.6L MRS培养基的2.0L三角瓶中，于32～37℃静止培养12～16h，为二级种子液；

4)发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照3～6％的接种量接种到装有12～16M3发酵培养基的发酵罐中，温度35～37℃，转速120～160rpm，罐压0.05Mpa，培养16～20h，至活菌数为2～5×10⁹cfu/ml，中止发酵；

所述的发酵培养基为：葡萄糖1～2％，大豆蛋白胨1～2％，硫酸铵0.5～1.0％，氯化钠0.2～0.8％，硫酸镁0.01～0.05％；

5)粪肠球菌菌粉的制备：将步骤4)制备的发酵液，3500～5000rpm离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量/体积百分比为15～20％的冻干保护剂，混匀，于-25℃～-45℃冷冻干燥，得到水分含量＜5％的粪肠球菌菌粉。

所述的冻干保护剂为：脱脂奶粉、甘油、蔗糖、麦芽糊精和谷氨酸钠的混合物，按照：脱脂奶粉∶甘油∶蔗糖∶麦芽糊精∶谷氨酸钠＝2∶0.5～1.0∶0.5～1.0∶0.5～1.5∶0.5～1.0的比例混合而成。

C、酿酒酵母CGMCC No.2388菌粉的制备方法，包括如下的步骤：

1)平板培养复壮：将冰箱保藏的酿酒酵母斜面菌种采用划线接种的方法在98号平板培养基上划线接种，于28～32℃培养24～36h，使酿酒酵母复壮，并形成单菌落；挑取单菌落于新鲜的98号斜面培养基上，于28～32℃培养24～36h，放置冰箱备用；

2)一级种子的制备：将步骤1)培养好的酿酒酵母新鲜斜面菌种转接到装有200～250ml 98号培养基的500mL三角瓶中，于28～32℃培养12～16h，转速100～150rpm，使其处于对数中后期，为一级种子；

3)二级种子的制备：将步骤2)培养好的酿酒酵母种子液转接到装有1.0～1.2L 98号培养基的2.0L三角瓶中，于28～32℃静止培养12～16h，为二级种子液；

4)发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子按照3～10％的接种量接种到装有15～16M³发酵培养基的发酵罐中，温度28～32℃，转速150～200rpm，罐压0.05Mpa，培养12～16h中止发酵，此时活菌数为1～3×10⁹cfu/ml；

所述的发酵培养基为：红糖1～2％，大豆蛋白胨1～2％，酵母膏0.2～0.5％，氯化钠0.5～1.0％，硫酸镁0.01～0.05％，磷酸氢二钾0.2～0.5％；

5)酿酒酵母菌粉的制备：将步骤4)制备的发酵液，2000～3000rpm离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量/体积百分比为10～15％的冻干保护剂，混匀后于-25℃～-45℃冷冻干燥，得到水分含量＜5％的酿酒酵母菌粉；

所述的冻干保护剂为脱脂奶粉、甘油、麦芽糊精按照：2∶0.5～1∶1～2比例混合而成。

通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围。

具体实施方式

实施例1、优良菌种的的分离、筛选、选育及鉴定

1)增菌培养：将健康动物(猪或者家禽)的新鲜粪便、肠道内容物样品接种于BPY液体培养基中，在37℃恒温培养增殖48h；

2)地衣芽孢杆菌的分离纯化：对步骤1)增菌培养物100℃水浴5min，然后在BPY培养基平板上进行划线培养，从中挑取各个具有特征形态的菌落再划线培养和分离，直至为纯菌落为止，革兰氏染色镜检，将分离的疑似纯菌落接种试管斜面中增殖，然后保存于4℃冰箱中，待用；

菌落形态：菌落表面粗糙，不光泽，乳白色不透明，边缘不整齐，直径2-3mm，随着培养时间的延长，变为红褐色；镜检：细胞为杆菌1.6～3.8μm×0.6～1.2μm，革兰氏阳性，芽孢中生，椭圆形，不膨大，初步确定为地衣芽孢杆菌；

3)粪肠球菌的分离纯化：对步骤1)增菌培养基在MRS培养基平板上进行划线培养，从中挑取各个具有特征形态的菌落再划线培养和分离，直至为纯菌落为止，革兰氏染色镜检，将分离的疑似纯菌落接种试管斜面中增殖，然后保存于4℃冰箱中，待用；

菌落形态：菌落圆整，表面光滑，呈乳白色，大小1-3mm；细胞圆形或卵圆形，直径0.5～1.0um，大多数成短链或对，革兰氏染色阳性；

4)酿酒酵母的分离纯化：对步骤1)增菌培养基在98号培养基平板上进行划线培养，从中挑取各个具有特征形态的菌落再划线培养和分离，直至为纯菌落为止，革兰氏染色镜检，将分离的疑似纯菌落接种试管斜面中增殖，然后保存于4℃冰箱中，待用；

菌落形态：菌落为软而湿润，乳酪色、有光泽、平坦或稍凸起、边缘整齐；细胞为球形或卵形，直径5～10um，繁殖方式芽殖；

对步骤3)或者4)所分离、纯化的粪肠球菌或者酿酒酵母菌株进行抗逆性筛选，可以对所分离、纯化的菌种直接进行抗逆性能测定，从中筛选出抗逆性强的天然优良菌种；或通过梯度培养逐渐增加溶液的酸性(至pH为1.5左右)及胆汁盐浓度，选出具有耐酸及耐胆汁特性的菌株；或通过传统的物理、化学诱变方法、现代基因工程技术，定向选育出抗逆性强的菌种；并对其进行菌种鉴定，最后对选育出的菌株进行抗逆性性能测定。

实施例2、3株优良菌种的抗逆性和生物学性能测定

3株菌种：地衣芽孢杆菌CGMCC No.2383、粪肠球菌CGMCC No.2386、酿酒酵母CGMCC No.2388的生物学性能和抗逆性能测定：

1)地衣芽孢杆菌CGMCC No.2383培养物的制备：将冰箱保藏的斜面菌种接种到BPY种子培养基中活化，37℃、200rpm培养18h，得到芽孢率在95％以上的培养物；

2)粪肠球菌CGMCC No.2386培养物的制备：将冰箱保藏的斜面菌种接种到MRS种子培养基中活化，35℃、100rpm培养16h，即得；

3)酿酒酵母CGMCC No.2388培养物的制备：将冰箱保藏的斜面菌种接种到98号种子培养基中活化，30℃、150rpm培养16h，即得；

4)耐酸性测定：将上述制备的培养物按5％接种量分别接种于pH值2.0、3.0、4.0的人工模拟胃液中，0h计数作对照，2h、6h取样用磷酸缓冲液按10倍系列稀释，进行平板活菌计数，计算存活率。

本发明选育的3株菌种：地衣芽孢杆菌CGMCC No.2383、粪肠球菌CGMCC No.2386、酿酒酵母CGMCC No.2388在胃酸中存活率结果见表1。

人工模拟胃液的制备：量取9.5％～10.5％浓盐酸16.4毫升，加蒸馏水至1000毫升，做基础人工胃液，用盐酸或氢氧化钠调pH值2.0、3.0、4.0，各取10mL(9mL)，分装于试管中，100℃下蒸汽灭菌15分钟，在无菌条件下，每10mL液体中加入0.100g胃蛋白酶。

表1  3株菌种在人工模拟胃液中的存活率

5)耐胆盐测定：将上述制备的3株菌种的培养物，按5％接种量分别接种于0.03％、0.1％、0.2％、0.3％不同浓度的猪胆盐溶液中，0h计数作对照，2h、6h取样用生理盐水按10倍系列稀释计数，进行平板活菌计数，计算存活率。

本发明所选育的3株菌种：地衣芽孢杆菌CGMCC No.2383、粪肠球菌CGMCC No.2386、酿酒酵母CGMCC No.2388在胆盐中存活率结果见表2。

胆盐的制备：0.85％生理盐水中各9mL，分装于试管中，121℃下蒸汽灭菌30分钟，在无菌条件下，制成0.03％、0.1％、0.2％、0.3％不同浓度的猪胆盐溶液。

表2  3株菌种在不同浓度猪胆盐中处理6h的存活率

6)耐高温测定：将上述制备的3株菌种的培养物，分别于50℃、60℃、70℃、80℃水浴处理15min、30min，计算存活率。

表3  3株菌种在不同高温下处理不同时间的存活率(％)

7)耐药性测定：采用药敏纸片法。

表4  3株菌种的耐药性测定结果

8)产酶测定：采用中华人民共和国轻工业行业标准，工业用α-淀粉酶制剂(QB/T1805.1-1993)，工业酶制剂通用试验方法(QB/T1803-1993)对地衣芽孢杆菌进行淀粉酶活力测定；采用行业标准：工业用蛋白酶制剂(QB/T1805.3-1993)，对地衣芽孢杆菌进行蛋白酶活力测定。

地衣芽孢杆菌CGMCC No.2383淀粉酶活力为：800u/ml；蛋白酶活力为1000u/ml。

9)产酸测定：采用离子色谱法对粪肠球菌CGMCC No.2386发酵液进行了产酸测定。

产酸结果表明，粪肠球菌CGMCC No.2386总有机酸量为4.2g/L，其中乳酸量为3.76g/L，乙酸量为0.39g/L，还有少量的异丁酸。

10)抑菌试验：采用牛津杯法对常见致病菌进行抑菌测定。

a、在装有10mL营养肉汁培养基的试管中活化三株致病菌：K99、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌，37℃恒温培养20h；

b、双层平板的制备：取直径90mm的平板，注入灭菌的营养琼脂15～20mL，水平放置使之凝固，作为底层，另取营养琼脂(冷至50℃左右)与37℃240h培养的指示菌液适量(50mL培养基加8mL左右)混匀，吸取10mL浇在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层；

c、加样品：用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。在牛津杯中加满相同量的发酵液上清液(约200uL)，每个样品2个重复。将加完样的双碟小心放入37℃恒温箱内，培养16-18h后，取出测量抑菌圈大小。

表5  3株菌种对常见致病菌的抑菌结果

实施例3、地衣芽孢杆菌CGMCC No.2383菌粉的制备

1)平板培养复壮：将地衣芽孢杆菌菌种接种于BPY平板培养基上，于37℃培养24h，使地衣芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种于斜面培养基上，于37℃培养36h；

2)一级种子的制备：将步骤1)培养的地衣芽孢杆菌菌种转接茄子瓶斜面培养基上，于37℃培养12h，使其处于对数中后期，得一级种子；

所述的斜面培养基为BPY固体培养基；

3)二级种子的制备：将步骤2)制备的一级种子用无菌水制成菌悬液，接种到装有1.6M³ BPY种子培养基的2M³种子罐中，温度37℃，转速200rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1∶0.6～0.8(14.4～19.2M³/h)，培养10～14h，为二级种子液；

4)地衣芽孢杆菌发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照10％的接种量接种到装有16M³发酵培养基的发酵罐中，温度37℃，转速220rpm，罐压0.05Mpa，通风比：1∶0.6～0.8，培养20h，至芽孢形成率90％以上，活菌数为1～2×10¹⁰cfu/ml，则中止发酵，得地衣芽孢杆菌发酵液；

所述的发酵培养基为：麸皮2％，豆粕1％，氯化钠0.8％，硫酸镁0.01％。

5)地衣芽孢杆菌菌粉的制备：在步骤4)制备的发酵液中加入25％的填充物米糠，混匀，进行喷雾干燥，进风温度120～130℃，排风温度40～50℃，雾化器转速15000～18000rpm，得到水分含量＜5％的地衣芽孢杆菌菌粉。

所述的填充物为：米糠、沸石粉、稻壳粉中的任一种。

实施例4、粪肠球菌CGMCC No.2383菌粉的制备

1)平板培养复壮：将粪肠球菌菌种接种于MRS平板培养基上，于37℃培养24h，使粪肠球菌菌复壮，并形成单菌落；挑取单菌落接种于斜面培养基上，于37℃培养24h；

2)一级种子的制备：将步骤1)培养的粪肠球菌斜面菌种转接到装有300mlMRS培养基的500mL三角瓶中，于37℃培养12h，转速100rpm，使其处于对数中后期，为一级种子；

3)二级种子的制备：将步骤2)培养的粪肠球菌一级种子转接到装有1.6LMRS培养基的2.0L三角瓶中，于37℃静止培养12h，为二级种子液；

4)发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子液按照3％的接种量接种到装有16M³发酵培养基的发酵罐中，温度37℃，转速120rpm，罐压0.05Mpa，培养16h，至活菌数为2×10⁹cfu/ml，中止发酵；

所述的发酵培养基为：葡萄糖2％，大豆蛋白胨1％，硫酸铵0.5％，氯化钠0.2％，硫酸镁0.05％。

5)粪肠球菌菌粉的制备：将步骤4)制备的发酵液，5000rpm离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量/体积百分比为20％的冻干保护剂，混匀，于-45℃冷冻干燥，得到水分含量＜5％的粪肠球菌菌粉；

所述的冻干保护剂为：脱脂奶粉、甘油、蔗糖、麦芽糊精和谷氨酸钠的混合物，按照：脱脂奶粉∶甘油∶蔗糖∶麦芽糊精∶谷氨酸钠＝2∶1.0∶1.0∶1.5∶1.0的比例混合而成。

实施例5、酿酒酵母CGMCC No.2383菌粉的制备

1)平板培养复壮：将冰箱保藏的酿酒酵母斜面菌种采用划线接种的方法在98号平板培养基上划线接种，于30℃培养46h，使酿酒酵母复壮，并形成单菌落；挑取单菌落于新鲜的98号斜面培养基上，于30℃培养36h，放置冰箱备用；

2)一级种子的制备：将步骤1)培养好的酿酒酵母新鲜斜面菌种转接到装有200ml 98号培养基的500mL三角瓶中，于30℃培养12～16h，转速150rpm，使其处于对数中后期，为一级种子；

3)二级种子的制备：将步骤2)培养好的酿酒酵母种子液转接到装有1.2L98号培养基的2.0L三角瓶中，于30℃静止培养12h，为二级种子液；

4)发酵液的制备：将步骤3)制备的二级种子按照10％的接种量接种到装有15～16M³发酵培养基的发酵罐中，温度30℃，转速200rpm，罐压0.05Mpa，培养16h中止发酵，此时活菌数为1.5×10⁹cfu/ml；

所述的发酵培养基为：红糖1％，大豆蛋白胨1％，酵母膏0.2％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.2％。

5)酿酒酵母菌粉的制备：将步骤4)制备的发酵液，2000pm离心，得到菌泥，加入与菌泥的重量/体积百分比为10～15％的冻干保护剂，混匀后于-25℃冷冻干燥，得到水分含量＜5％的酿酒酵母菌粉；

所述的冻干保护剂为脱脂奶粉、甘油、麦芽糊精按照：2∶0.5∶1比例混合而成。

实施例6、复合微生态制剂的制备

表6  复合微生态制剂的制备

实施例7、实施例6制备的仔猪专用型复合微生态制剂对仔猪的功效试验

试验动物：选用35日龄断奶，体重在9kg左右的长白x大白杂交仔猪作为试验动物，共120头，试验猪来源于饲养管理规范、防疫措施严格的北京全利民猪场，一批选齐，出生日期相差不超过7天。

试验设计：采用随机单因子设计。试验分四组，每组有三个重复，每个重复10头断奶仔猪，组间和重复间体重差异不超过平均体重的5％。

试验日粮：采用玉米一豆粕型日粮作基础日粮，对照组饲喂基础日粮，试验组I为在基础日粮上添加1‰仔猪专用型复合微生态制剂，试验组II为在基础日粮上添加100g/T预防拉稀的抗生素阿散酸，试验组III为在基础日粮上添加1‰仔猪专用型复合微生态制剂+添加100g/T预防拉稀的抗生素阿散酸。基础日粮组成及营养水平见表7。

饲养管理：采用地面平养饲养，各组间除日粮不同外，其它条件完全一致，按常规进行。人工投料、自由采食、自由饮水，保持猪舍清洁。试验期30天，预饲期7天。

表7  饲喂基础日粮组成及营养水平

测试指标及方法：在试验开始和结束时早晨空腹对猪只称重，分别以重复组为单位进行全群称重、计算耗料量、日增重、料肉比、腹泻率等指标，并进行差异性显著检验。试验结果如下：

(1)生产性能

试验仔猪的生产性能见表8。从表8可以看出，在平均日增重仔猪试验组I、试验组II和试验组III比对照组分别提高7.3％、7.5％、9.5％；在料肉比方面试验组I、试验组II和试验组III比对照组分别降低5.5％、5.2％、8.0％；在腹泻率方面试验组I、试验组II和试验组III比对照组分别降低67.3％、47.7％、70.1％。试验组I与试验组II相比在日增重、料肉比方面差异不显著，但是在预防腹泻方面差异显著，说明仔猪专用型复合微生态制剂可以替代饲料中预防腹泻的抗生素。试验组III在日增重、料肉比和腹泻方面都好于试验组I、试验组II和对照组，说明仔猪专用型复合微生态制剂与抗生素合用有协同作用。在平均耗料方面各组之间差异不显著。

表8  试验仔猪的生产性能

实施例8、实施例6制备的母猪专用型复合微生态制剂对哺乳母猪的功效试验

1、试验方法

试验猪的选择：从猪场选择临产前1周左右分娩的母猪，选取健康无病、年龄、胎次、体重基本一致的猪18头随机分成两组，试验组和对照组各9头。

饲料组成：对照组饲喂基础日粮，试验组为在基础日粮上添加1‰母猪专用型复合微生态制剂。

饲养管理：试验在本场的同一产房内进行，由同一饲养人员饲喂，饲养管理条件一致，饲料采取干料加水拌湿后饲喂，在试验母猪转入产床时开始饲喂试验料，日喂3次，自由采食，以吃饱不剩料为原则。试验组和对照组分别统计耗料量、仔猪出生重和28天断奶体重，采取全天供水的办法，任猪自由饮水。每日由饲养员清理粪便，打扫圈舍一次，随时观察试验组的生长和健康情况，不论是哺乳母猪还是仔猪，发生疾病，及时治疗。

2、试验结果及分析

在试验期内，添加饲喂0.1％母猪专用型复合微生态制剂的试验组28天断奶均重为8.27kg，而未添加母猪专用型复合微生态制剂的对照组28天断奶均重为7.54kg，试验组比对照组多增重0.73kg，经t检验，两组差异显著(p＜0.05)，且试验组成活率明显高于对照组，其成活率分别为95.83％和91.67％。结果见表9。

表9  母猪专用型复合微生态制剂对哺乳母猪生产性能的影响

采食与健康情况：整个试验过程中，添加母猪专用型复合微生态制剂的哺乳母猪表现喜食、采食速度快、采食量比对照组略有增加，且毛色红润光亮。耗材情况：试验期间试验组和对照组平均每头哺乳母猪耗料6.42kg和6.31kg。试验组母猪在产仔8天后出现明显的溢乳现象，表明母猪专用型复合微生态制剂能够提高母猪的泌乳量。试验后期，试验组和对照组均有仔猪拉稀现象，肌注恩诺沙星和口服乳酶生治疗后排粪正常，且试验仔猪毛较稀，皮肤红润，粪便减少且干燥，臭味也减少，说明饲喂母猪专用型复合微生态制剂对于调节哺乳母猪肠道内微生物菌群平衡，防止仔猪腹泻增强母猪的抗病能力，有一定作用。

3、结论

(1)母猪专用型复合微生态制剂作为饲料添加剂可以提高哺乳母猪乳汁的分泌，解决母猪乳汁不足的问题；

(2)在饲料中添加0.1％母猪专用型复合微生态制剂可提高仔猪断奶重和成活率，经济效益显著。

实施例9、实施例6制备的蛋禽专用型复合微生态制剂对蛋鸡的功效试验

1、试验方法：

试验动物与日粮：随机选用60周龄矮小蛋鸡3000只，随机分为2组，每组1500只，按照随机分组安排试验。

试验日粮分别为：I.空白对照组(基础日粮组)；II.试验组(基础日粮+0.1％蛋禽专用型复合微生态制剂)。基础日粮其组成和营养成分见表10。试验鸡为三层笼养，每笼3只，自由采食和饮水，按常规进行饲养管理，试验在北京密云水泉村蛋鸡场进行。

表10  基础日粮组成和营养成分

成分

含量(％)

营养成分

玉米	56.0	代谢能(MJ/kg)	12.59
				豆粕	14.6	粗蛋白(％)	17.06
菜粕	3.4	钙(％)	3.57
				花生饼	3.0	总磷(％)	0.55
鱼粉	2.0	蛋氨酸(％)	0.738
				玉米蛋白粉	2.0	蛋氨酸+胱氨酸(％)	0.676
酒精蛋白粉	5.0
				石粉	5.8
沸石	1.0
				磷酸氢钙	1.8
预混料	5

注：每千克日粮中：维生素A12000IU，维生素D31500IU，维生素E25IU，维生素K31.0mg，硫胺素5.5mg，核黄素5.0mg，泛酸16mg，维生素B6 8.0mg，生物素0.3mg，胆碱500mg，叶酸1.8mg，维生素B 120.008mg，铁90mg，铜20mg，碘0.45mg，锰80mg，锌80mg，硒0.2mg，DL-蛋氨酸1.50g.

测定指标：每天观察记录每重复产蛋数、蛋重、不合格蛋数和鸡只死淘情况；每周末统计耗料量；分别统计每组鸡产蛋后期的产蛋率、蛋重、破损率、死亡率、采食量和料蛋比。

2、结果与分析

2.1、蛋禽专用型复合微生态制剂对矮小蛋鸡生产性能的影响

试验结果如表11所示，在产蛋后期，添加0.1％蛋禽专用型复合微生态制剂组II产蛋率分别比空白对照组提高2.53％，蛋重有所增加；在蛋鸡死亡率和蛋壳破损率方面下降。

表11  蛋禽专用型复合微生态制剂对矮小蛋鸡生产性能的影响

3、结论

(1)在饲料中添加0.1％蛋禽专用型复合微生态制剂能显著提高蛋鸡的产蛋率，产蛋率提高2.53％；

(2)在饲料中添加0.1％蛋禽专用型复合微生态制剂能减少疾病的发生和降低蛋鸡的死亡率；

(3)在饲料中添加0.1％蛋禽专用型复合微生态制剂能能提高机体的免疫能力，预防由于热应激或接种疫苗等方面引起的应激反应。

综上所述，本发明的微生态制剂添加到饲料中，对保证鸡只健康状态、协调促进机体消化吸收能力、提高蛋鸡生产性能和饲料的消化利用率等均有很好的作用。

实施例10、实施例6制备的肉禽专用型复合微生态制剂对肉鸡的功效试验

1、试验材料与方法

试验动物与分组：选用1日龄商品代艾维因混合健雏480只，采用完全随机单因子设计分4组进行试验。每组设4个重复，每重复30只(开始体重组间差异不显著，P＞0.05)。试验期49天。

试验设计：以维吉尼亚霉素作为抗生素对照，对照组：基础日粮，试验组1：基础日粮+1‰肉禽专用型复合微生态制剂，试验组II：基础日粮+5mg/kg维吉尼亚霉素。

供试日粮与饲养管理：本试验基础日粮配方及营养水平各组完全相同(见表12)，饲养管理条件各组完全一致。

表12  基础日粮组成及营养水平

日粮组成	0～21日龄(％)	22～42日龄(％)
			玉米	57.9	62.3
豆粕	32.0	28.8
			鱼粉	3.0	2.0
石粉	0.9	0.9
			磷酸氢钙	1.4	1.4
食盐	0.3	0.3
			豆油	3.5	3.3
预混料	1.0	1.0
			ME(MJ/Kg)	12.47	12.59
CP(％)	20.62	19.0
			Ca(％)	0.97	0.89
有效P(％)	0.50	0.46
			Lys(％)	1.05	0.94
Met(％)	0.36	0.33

2、试验结果

2.1体增重：各试验组的体增重均极显著高于对照组(P＜0.01〕，试验II组最高，但与试验1组相比，差异不显著(P＞0.05)，两个试验组体增重分别比对照组提高10.24％和12.48％，说明各试验组的增重效果均好于对照组。各阶段增重效果详见表13。

表13.供试鸡体重统计表    单位：g

对照组

试验组1

试验组II

0～21日龄	始重	44.13±1.14	44.25±0.57	44.13±1.21
						末重	474.82±11.61	515.65±16.29	526.31±18.58
	增重	430.69±11.98	471.40±16.57	482.18±17.30
					22～42日龄	末重	1654.09±45.18	1692.89±29.25	1760.41±50.14
	增重	1179.27±44.75	1177.24±30.64	1234.10±53.13

2.2采食量：各组全期总采食量差异不显著(P＞0.05)，详见表14。

表14  采食量统计表    单位：克/只

	对照组	试验组1	试验组II
				0～21日龄	918.78±19.85	899.44±14.90	750.28±28.83
22～42日龄	3172.33±47.70	2715.76±106.84	3055.59±55.57

2.3料重比、死亡率见表15

表15  料重比、死亡率分析表

组别	全期增重(克/只)	全期耗料(克/只)	料重比	死亡率(％)
					试验组1	2073.68±89.83	4595.90±149.60	2.22±0.04	2.35
试验组II	2115.97±29.57	4580.09±47.27	2.17±0.04	1.65
					对照组	1880.88±33.05	4519.75±40.76	2.40±0.04	9.65

各试验组料重比均明显低于对照组(P＜0.01)，分别比对照组降低了7.50％和9.58％；死亡率各试验组均显著低于对照组(P＜0.01)，分别比对照组下降75.65％和82.90％；试验1组、试验II组之间差异不显著。

2.4经济效益分析

试验组1：多耗料：多耗料(克/只)(4595.9-4519.75)×饲料价格(元/克)(0.0028)＝0.21322元

菌粉成本：全期耗菌粉(克/只)(4595.90×0.1％)×菌粉价格(元/克)(0.06)＝0.2757元

增重效益：全期增重(克/只)(2073.68-1880.88)×销售价格(元/克)(0.01)＝1.928元

每只肉鸡可多增收：增重效益-多耗料成本-菌粉投入(1.928-0.21322-0.2757)＝1.439元

3.结论

3.1艾维因肉仔鸡日粮中添加1‰肉禽专用型复合微生态制剂可使体增重提高10.24％、料重比降低7.50％、发病死亡率下降75.65％。

3.2艾维因肉仔鸡日粮中添加1‰肉禽专用型复合微生态制剂组与添加5mg/kg维基尼亚霉素组在体增重、料重比、发病死亡率等指标上均差异不显著(P＞0.05)。

3.3艾维因肉仔鸡日粮中添加1‰肉禽专用型复合微生态制剂可使每只鸡增收1.439元，艾维因肉仔鸡日粮中添加1‰凝结芽孢杆菌可使每只鸡增收1.308元。

Claims (3)

1.一种复合微生态制剂，其特征在于包含嗜酸乳杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌CGMCCNo.2383菌粉、酿酒酵母CGMCC No.2388菌粉，上述各成分的重量配比为：1～1.5∶2～2.5∶2～2.5。

2.如权利要求1所述的复合微生态制剂，其特征在于进一步包含载体，载体为石粉、葡萄糖、硫酸钾铝、玉米芯粉中的任一种或两种。

3.权利要求1～2任一项所述的复合微生态制剂在制备畜禽饲料添加剂中的应用。