CN104293696B - 一株粪肠球菌hew-a131及其应用 - Google Patents

一株粪肠球菌hew-a131及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐热性强、耐酸碱范围宽泛、抗逆性、益生性更强的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW‑A131，该菌株已于2014年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9353，分类命名为粪肠球菌Enterococcus faecalis。粪肠球菌HEW‑A131具有优良的微生物学特性、显著的益生性及抗逆性和发酵性能，不但可以提高动物的饲料利用效率，节约成本，而且大大改善了动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收利用，促进动物生长，显著提高了动物的生产性能、免疫性能和繁殖性能，降低了生产成本，提高了经济效益。

Description

一株粪肠球菌HEW-A131及其应用
技术领域
本发明涉及粪肠球菌，特别涉及一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131及其应用。
背景技术
乳酸菌是一类重要的益生菌，是动物肠道中一类重要的优势菌群。乳酸菌制剂作为一种新型的绿色动物微生态制剂，因其无毒、无抗药性、无残留、无副作用而备受饲料界的广泛关注。采用乳酸菌作为益生菌饲喂动物，除了由于乳酸菌具有一定的营养作用和对肠道的粘附作用外，主要在于乳酸菌对于一些腐败菌和有害菌具有抑制作用。第一，乳酸菌可以产生乳酸，创造酸性环境抑制有害菌及不耐酸的腐败菌生长；第二，乳酸菌产生H2O2，激活过氧化氢酶-硫氰酸系统，抑制和杀灭革兰氏阴性菌、过氧化氢酶阳性细菌等；第三，部分乳酸菌可以产生抑菌性的细小蛋白质或肽类，称为细菌素，对大肠杆菌等致病菌有拮抗作用。而且，有了产生抑菌蛋白的乳酸菌，就可以生产细菌素，可以替代抗生素，使动物生产更安全。分离筛选可以产生细菌素的乳酸菌成为现在益生菌开发的研究热点。
粪链球菌又叫粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，其菌体形态为链球或球状，菌体直径大小0.3μm～0.7μm，无芽孢；稀释后在肉汤琼脂平板上形成的菌落圆形、乳白色，表面凸起湿润，有光泽，边缘整齐，大多数成双或短链状排列，通常不运动。粪链球菌是目前微生物青贮接种剂主要菌种之一，它经过系列工艺制成的微生物制剂直接投喂养殖动物后，有利于改善肠道内微生态平衡，防治动物肠道菌丛区系紊乱，还能分解蛋白质为小肽、合成B族维生素等功效。它也能增强巨嗜细胞的活性，促进动物的免疫反应，提高抗体水平。粪链球菌的生理特性有如下几点：(1)粪链球菌分泌的乳酸为L型乳酸，又称为自然乳酸或生理乳酸，可全被动物吸收利用。乳酸杆菌分泌的乳酸L型和D型都有，但D型则不能被动物吸收利用。在动物的肠道里。粪链球菌可在肠内形成生物薄膜附着在肠道粘膜上，可以在肠道内发育、生长、繁殖，繁殖时问很短，19min分裂一次。粪链球菌还可把部分蛋白质分解成酰胺和氨基酸，把大部分的碳水化合物的无氮浸出物转化为乳酸，而且能使饲料里的纤维变软，所以饲料的转化吸收率就比较高。粪链球菌分解的这些特殊营养成分弥补了常规饵料的营养缺陷，对各种养殖动物幼体起到了十分重要的营养强化和促生长作用。(2)粪链球菌产生的抗菌物质大多是肽或蛋白质，被称为细菌素。粪链球菌可分泌两类细菌素，一类仅只是对相关的菌有抑制作用，抗菌谱较窄，可阻碍病原微生物接触肠粘膜细胞；另一类具有广谱抗菌活性， 它们对致病菌如：沙门氏菌、致贺氏病和假单孢菌都有很好的抑制作用。所以，长期在饲料中添加粪链球菌可以减少养殖动物肠炎等疾病的发生。粪链球菌在生长和代谢过程中产生对养殖动物有益的营养物质，如乳酸、氨基酸、维生素、酶及抑菌物质。在畜禽养殖过程中，添加了粪链球菌不仅有利于提高饲料的消化率，同时也相应降低了排泄物中的氨态氮的浓度，减少了排泄物的不消化物，改善了饲养环境，减少了污染，既有防腐作用又增加饲料的风味，促进养殖动物的食欲。(3)由于饲料中饼粕、麦麸等农副产品中的植酸磷含量较高，对钙等矿物质元素利用造成影响，而在粪链球菌的生理作用下通过催化、水解等反应分泌出的L-乳酸，它可以对钙质合成L-乳酸钙，促进养殖动物对钙质的吸收。所以饲料中添加粪链球菌可减少养殖中有机物和矿物质排泄量有效地减少水质污染。
屎肠球菌(Enterococcus faecium)属于肠球菌中的一种，是兼性厌氧的乳酸菌，它不仅是人和动物肠道中常见的正常菌种，还用于改善食品、饲料的质量。屎肠球菌相对于严格厌氧、培养保存条件苛刻的双歧杆菌、乳杆菌来说，它是便于生产和使用的首选菌种。1989年美国FDA就公布它为可直接用于动物的菌种之一。大量实验证明，由屎肠球菌组成的益生素可提高幼年畜禽的体增重，改善饲料报酬，减少腹泻率，降低死亡率。另外，屎肠球菌代谢产生有机酸、双乙酰、过氧化氢、细菌素等物质，这些物质具有抑制病原菌和腐败菌、提高免疫力、改善畜产品品质等生理功效。因此，屎肠球菌在畜牧生产中有着广泛的应用发展前景。其特性主要有以下几点：(1)耐胃酸：新生仔猪胃内的pH值在5～6之间，出生后由于高产酸细菌定植而逐渐下降，数小时后pH值可降到4，然后缓慢下降，在2月龄前pH值仍保持在3左右。屎肠球菌由于其耐胃酸因此它能通过胃而存活下来。(2)耐胆盐：哺乳仔猪胆囊内胆汁分泌量很少，胆汁量在出生后3周内缓慢增加，小肠内胆盐浓度在0.03％～0.30％范围内波动。大量试验表明，筛选得到的屎肠球菌可耐受1.0％的胆盐浓度，甚至高达3.0％和5％～6.5％NaCl高盐。可见，屎肠球菌具有良好的耐胆盐性能及对胃肠道逆性环境的耐受性，具备了在小肠定植的基本条件。(3)具有良好的粘附力：屎肠球菌在消化道中的粘附力仅次干酪乳杆菌。屎肠球菌能顺利通过胃肠不利环境，在肠壁上的粘附是其定植并大量繁殖变成优势种群的前提，另外，其对肠上皮细胞有较强的粘附力是其作为益生菌菌株的重要前提之一。(4)耐药性与抑菌作用：屎肠球菌具有对广谱抗生素的耐药性。有试验表明，屎肠球菌对饲料添加剂中大多数常用抗生素都具有耐药性。除了对抗生素具有耐药性外，还对常见病原菌、强毒菌株有较强的抑制作用，这与是屎肠球菌代谢过程中产生乳酸、乙酸、异丁酸、乙醇、2，3-丁二醇、细菌素等物质有关，这些物质具有抑制病原菌和腐败菌的作用。(5)耐热性：屎肠球菌不仅能抵抗动物胃肠道不利的环境，而且能耐受饲料制粒过程中的高温，但后者往往是许多益生菌无法达到的，这就阻碍了益生菌在颗粒饲料中的广泛利用。
产生细菌素的乳酸菌来源很多，购买的工业菌株和标准菌株，有很多也可以产生细菌素，环境、土壤、泡菜、酸奶中都可以分离乳酸菌。然而益生菌最后要饲喂动物，那么相对于其他来源的菌株，动物无疑是乳酸菌的最好来源。来自动物肠道的乳酸菌可以适应动物肠道环境，耐受动物的胃酸和胆盐的消化，无疑是最好的益生菌来源。可见，通过从动物肠道分离和筛选能够产生细菌素的乳酸菌将是动物用益生菌筛选的重要研究方向。
中国专利CN 102031235 B公开了一种粪肠球菌(Enterococcus faecium)ANSE228，其保藏编号为CGMCC No.4082。还提供上述粪肠球菌ANSE228在抑制鸡白痢沙门氏菌和/或大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌中的应用。所述粪肠球菌ANSE228是通过反复分离、纯化、复壮等工艺得到，具有生物活性强、益生性显著并且抗逆性能好等优点。中国专利CN103074281 A公开了一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)FJL19，其保藏编号为CGMCCNo.6995。同时还提供了上述粪肠球菌FJL19具有抑制鸡肠道中大肠杆菌生长、促进雏鸡生长的作用。从笼养成年蛋鸡空肠中分离出粪肠球菌FJL19，此菌株生长旺盛，18小时培养菌数就可达5.1×109cfu/ml，且具有抑菌作用，可以利用培养基生产抑菌蛋白，降低雏鸡肠道大肠杆菌数量；通过此乳酸菌制备菌制剂饲喂雏鸡，可以提高雏鸡的生长；因此粪肠球菌FJL19在动物饲养尤其是家禽新型饲料添加剂开发和抗生素替代品研究上具有重大的社会意义和经济价值。
上述公开专利中的粪肠球菌耐热性、耐酸碱性、发酵性能、抑菌性能等还不太理想，不能适应日益发展的工业化需求，尤其离目前饲料工业及畜牧养殖业目标还有一定差距，因此，分离、纯化更加适合畜牧业发展需求的益生粪肠球菌菌株仍是本领域技术人员的责任和追求。
发明内容
本发明所解决的技术问题是克服现有粪肠球菌的缺陷，提供一株耐热性强、耐酸碱范围宽泛、抗逆性、益生性更强的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131。
本发明提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131是从笼养成年蛋鸡盲肠内容物中分离的乳酸菌菌株，经过菌落形态观察、发酵性能测试、抑菌性能测试等筛选得到的目标菌株，该菌株耐热性强、耐酸碱范围宽泛、抗逆性、益生性更加显著。
本发明提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131已于2014年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路l号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCCNO.9353，分类命名为粪肠球菌Enterococcus faecalis。
本发明提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131具有以下微生物学特征：粪肠球 菌HEW-A131是革兰氏阳性菌，在肠球菌琼脂培养基上生长迅速，35℃培养24h形成白色、圆形、边缘光滑整齐、凸起、直径为1～1.5mm的菌落，并且周围有蓝黑色环带，菌落形态如图1，显微镜下菌体呈卵圆形、成对成链存在、无芽孢，兼性厌氧生长，经革兰氏染色后菌株形态如图2；粪肠球菌HEW-A131生长适宜温度范围：4℃-65℃，最适生长温度：20℃-45℃；生长适宜pH 1.5-11，最适pH值为6-8。部分生理生化特性如表1。
本发明中所述粪肠球菌HEW-A131的培养方法如下：
取粪肠球菌HEW-A131种子液1-5mL(种子液是挑取的单个菌落在种子液培养基中培养的，其活菌浓度以109CFU/mL计；种子液的培养基和培养条件与发酵的培养基和培养条件相同)，接种到300mL培养基中，进行摇瓶发酵培养。
所述培养基由如下组分组成：蔗糖1-5％，大豆蛋白胨0.5-2.5％，酵母提取物0.1-1.0％，MgSO4·7H2O0.05-0.2％，MnSO4·4H2O0.01-1.0％，NaCl0.1-2.0％，柠檬酸二铵0.1-0.5％，CaCO30.1-1.0％，余量为水，pH7.0±0.2；其中，优选为：蔗糖2.5％，大豆蛋白胨1.8％，酵母提取物0.4％，MgSO4·7H2O0.2％，MnSO4·4H2O 0.045％，NaCl0.2％，柠檬酸二铵0.2％，CaCO30.6％，余量为水，pH7.0±02。
所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度30-45℃，发酵时间5-20h，pH值6.5-7.5，转速为100-300r/m；优选为：发酵温度为35℃、pH值7.0、搅拌转速180r/m，发酵时间7h。
50L发酵罐中试培养基与摇瓶发酵培养基相同。50L发酵罐中试发酵条件为：装液量为20-40L培养基，接种量为200-600mL摇瓶种子液，发酵温度为30-45℃，发酵时间5-20h，pH值6.5-7.5，搅拌转速100-300r/min。其中，优选为：装液量为30L培养基，接种量为300mL，发酵温度为35℃，发酵时间8h，pH值7.0，搅拌转速110r/min。
本发明粪肠球菌HEW-A131具有显著的益生性，可有效抑制大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)、志贺氏菌属(Shigella sp.)、韦荣氏球菌(Veillonella sp.)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的生长繁殖。
本发明粪肠球菌HEW-A131具有较强的抗逆性，可以耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高温环境，并且能保持90％以上的活菌存活率。
本发明粪肠球菌HEW-A131可有效维持动物肠道菌群平衡，改善肠道性能，提高动物生产性能。
本发明粪肠球菌HEW-A131的益生性的检验方法如下：
在无菌操作台上，将病原菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、 志贺氏菌属、韦荣氏球菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、多杀性巴氏杆菌)浓度为109CFU/mL的菌悬液10mL与90mL与冷却至45℃的NA固体培养基(灭菌后)混匀，制备成厚度4mm左右的病原菌NA平板，将灭菌的牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑)放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别向各小管中滴加200μL的本发明制备的发酵液，勿使其外溢，30℃-40℃培养20-36h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值。
其中，所述病原菌NA平板是将121℃高温灭菌后的NA培养基与病原菌菌悬液混匀后，倒入灭菌后的平板，冷却后形成表面光滑的4mm厚的病原菌NA平板。所述NA固体培养基的配方为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，琼脂2％，NaCl 0.5％，余量为水，pH 7.2±0.2。
本发明粪肠球菌HEW-A131抗逆性的检验方法如下：
1、高温耐受试验：取10mL本发明制备得到的发酵液注入到试管1中，采用十倍逐级稀释，取1mL稀释液在平板上，将灭菌后冷却至45℃的MRS琼脂培养基倾注在平板(灭菌)上，迅速摇匀。再将装有10mL本发明制备得到的发酵液的试管2置于80℃水浴锅中加热15min，取加热后的粪肠球菌HEW-A131发酵液进行十倍逐级稀释，取1mL稀释液在平板上，将灭菌后冷却至45℃的MRS琼脂培养基倾注在平板(灭菌)上并迅速摇匀。最后将加热前和加热后的平板均在35℃条件下培养24h，计算粪肠球菌HEW-A131加热前后的数量。
2、模拟胃液及肠液的耐受试验：取100g/L的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为1.5、2.5和3.5，取100mL稀盐酸溶液，分别加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰蛋白酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，得模拟肠液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取1mL粪肠球菌HEW-A131发酵液加入到9mL的模拟胃液中(即十倍逐级稀释)，并迅速在振荡器上充分混匀，然后置于30-45℃静置培养2-4h。分别在1h、2h、3h、4h的时候取出培养液并立即计数残存活菌数，与原活菌数进行比较。
3、模拟胆盐的耐受试验：用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.3％的猪胆盐，用10％的Na0H调整pH为8.0，然后用0.45μm微滤膜过滤并除菌。将0.5mL粪肠球菌HEW-A131发酵液接种到4.5mL模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计数残存粪肠球菌HEW-A131的活菌数，与原活菌数进行比较。
模拟胃液及肠液和模拟胆盐耐受试验中的计数方法：
样品用无菌生理盐水十倍梯度稀释，选择合适的稀释度用于计数。取1mL稀释液于灭菌平板上，将灭菌后冷却至45℃的MRS琼脂培养基倾注在平板上，迅速摇匀，待平板凝固后在 35℃培养24h。
本发明粪肠球菌HEW-A131维持和改善肠道性能的检验方法：
选取普通昆明小白鼠60只，雌雄各半，18-20g，常规词养。从中随机挑选40只，每天早晨9:00灌胃盐酸林可霉素0.2mL(20mg)/只，其它作为对照组，每天同一时间灌胃等量灭菌生理盐水，连续一周，制备肠道菌群失调的小鼠模型。模型组小鼠饮食下降，未出现死亡和明显的腹泻现象，排软粪，外形正常含水分较多，垫料潮湿。将40只肠道菌群失调小鼠，随机分为2组，一组20只作为粪肠球菌HEW-A131治疗组，每天灌胃本发明制备的发酵液0.5ml(2×1010cfu/mL)/只，另20只作为自然恢复组，与对照组相同处理，每天同一时间灌胃等量灭菌生理盐水，连续两周。整个试验期21天，每天观察小白鼠的生长和排便情况，于第8、21天对菌株治疗组和自然恢复组的小鼠进行称重，计算各组体重平均增长率；每5天测各组小鼠粪便大肠杆菌数量，取小鼠粪便约0.1g，于无菌操作台内加入3粒玻璃珠(以0.1g粪样加0.5mL稀释液)，稀释并接种麦康凯琼脂培养基，计算每克湿便中的大肠杆菌数。
本发明另一目的是所述粪肠球菌HEW-A131在微生态制剂的制备及畜禽养殖过程的应用，所述微生态制剂是将发酵力强、益生性显著并且抗逆性能良好的粪肠球菌HEW-A131，经过液体深层发酵等生产工艺得到发酵液，然后经离心、干燥后制得。
有益效果：
1.本发明的粪肠球菌HEW-A131耐热性强(生长适宜温度：4℃-65℃，最适生长温度：20℃-45℃)；耐酸碱范围宽泛(生长适宜pH 1.5-11，最适pH值为6-8)；发酵力强、生长旺盛；经发酵工艺改进和培养基优化，35℃发酵8h，发酵液活菌数可达到1.1×1010CFU/mL，更加适合饲料工业和畜禽养殖业发展的迫切需要，为今后应用过程中降低生产成本、提高经济效益奠定了坚实的菌种基础。
2.本发明的粪肠球菌HEW-A131具有显著的益生性，能显著抑制大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellasp.)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella peneumoniae)、志贺氏菌属(Shigella sp.)、韦荣氏球菌(Veillonella sp.)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)等病原菌的生长繁殖，具有广谱抑菌性。
3.本发明的粪肠球菌HEW-A131具有较强的抗逆性，能够耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高温环境，并且能保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达到93-99％，更加适合饲料工业和畜牧养殖业的要求。
4.本发明中粪肠球菌HEW-A131可有效维持动物肠道菌群平衡，改善肠道性能，提高动物生产性能。经小鼠肠道性能试验，HEW-A131治疗组小鼠体重平均增长率(44.78％)显著 高于自然恢复组(32.14％)；饲喂HEW-A131益生菌后肠道大肠杆菌数量显著下降，降低73.32％，显著低于自然恢复组(24.78％)，表明HEW-A131在小白鼠肠道内迅速定植，形成优势菌群，并有效抑制大肠杆菌等病原菌的生长繁殖。
5.本发明的粪肠球菌HEW-A131具有优良的微生物学特性、显著的益生性及抗逆性和超强的发酵性能，不但可以提高动物的饲料利用效率，节约成本，而且大大改善了动物体内消化道内环境的稳态，促进营养的吸收利用，促进动物生长，显著提高了动物的生产性能、免疫性能和繁殖性能，降低了生产成本，提高了经济效益。在其用量较少，例如在饲料中仅为106CFU/kg时即可发挥显著作用，具体表现在：1)可显著提高种鸡的生产性能及繁殖性能：与对照组相比，试验组料蛋比降低24.81％，死淘率降低57.14％，种蛋合格率提高2.02％，种蛋受精率提高2.5％，健雏率提高2.49％。2)可显著提高了肉鸡的生产性能及免疫性能，与对照组相比，料肉比降低35.77％，死淘率降低56％。3)可显著提高蛋鸡的生产性能、免疫性和鸡蛋品质，有效替代抗生素添加剂，适合大规模推广使用。其中，料蛋比抗生素组降低14.98％，比普通组降低25.11％；死淘率比抗生素组降低13.54％，比普通组降低34.65％；鸡蛋质量指标光泽、蛋壳厚度、哈氏单位、蛋黄颜色明显优于抗生素组和普通组。4)可显著提高仔猪的生产性能、免疫性能和猪舍环境质量，能有效替代抗生素添加剂，适合大规模推广使用。与抗生素组和普通组相比，其中料重比分别降低13.73％和25.84％；腹泻率分别降低43％和66.14％；死淘率分别降低99.19％和99.59；发病率分别降低4.5％和21.75％；试验组比普通组猪舍环境指标显著提高。
附图说明
图1是粪肠球菌HEW-A131在肠球菌琼脂培养基上的菌落形态；
图2是粪肠球菌HEW-A131经革兰氏染色显微镜下的菌株形态；
图3是粪肠球菌HEW-A131发酵液不同处理后的抑菌效果；
图中CK为培养液，1为溶解液，2为上清液，3为酶解液；
图4是粪肠球菌HEW-A131的生长曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发 明的保护范围。
实施例1 粪肠球菌HEW-A131的分离筛选、鉴定及保藏
1、乳酸菌的分离纯化：
在无菌条件下采集健康笼养成年蛋鸡盲肠肠道内容物1g，置于盛有4.5mL灭菌生理盐水的离心管中，充分震荡混匀，然后吸取0.5mL混合液于盛有4.5mL灭菌生理盐水的离心管中，此稀释度为10-2，重复以上过程做10倍梯度稀释，至10-6稀释浓度，选择10-4～10-6三个稀释度，吸取0.1mL涂布于肠球菌培养基(肠球菌固体培养基)平板上，平板涂布后采用厌氧培养法(5％CO2)，将涂好的平板于35℃培养24h后，用接种环挑取有蓝黑色环带且形态不同的菌落在MRS固体培养基平板上进行划线分离培养，经48h培养后，挑取分离效果较好的菌落，用接种环转接于MRS斜面培养基上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后置于4℃冰箱保存备用。
2、菌落形态的观察
将步骤1保存的斜面菌种，经2-3次活化，取干净的载玻片，滴一滴无菌水于载玻片上，然后挑取1-2接种环的上述活化菌种，涂匀，干燥后固定。革兰氏染色：先用草酸铵结晶紫染液染色1-2min，用水冲洗，接着滴加卢氏碘液覆盖1-2min，用水冲洗，然后滴加95％乙醇至乙醇液不再呈现紫色时停止约30s，最后用番红染液复染2-3min，水洗。镜检选取革兰氏染色为阳性的球状菌株作为备用。
3、抑菌性乳酸菌的筛选：
(1)产酸能力测定：将步骤2筛选出的革兰氏阳性球状菌株活化2-3代后，按1％(v/v)的接种量各自接至新鲜的MRS液体培养基中，35℃厌氧培养，分别0h、24h两个时间点用酸度计测各实验菌株5mL发酵液的pH值。每个实验菌株发酵液作3个重复，取平均值。用0h、24h两个时间点各实验菌株发酵液的pH值变化，即ΔpH来衡量乳酸菌的产酸能力。选取产酸能力高的乳酸菌发酵液进行下一步测定。
(2)抑菌试验：取致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、志贺氏菌属、韦荣氏球菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、多杀性巴氏杆菌)浓度为109CFU/mL的菌悬液50mL与等体积冷却至45℃的NA固体培养基(灭菌后)混匀，制备成4mm左右的病原菌NA平板若干个，每个病原菌NA平板在无菌条件下用无菌镊子夹取4个灭菌牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑)对称放在平皿上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，然后分别吸取200μL步骤(1)产酸能力高的乳酸菌发酵液于3个牛津杯中，另一个牛津杯中加入等量的MRS培养基作为对照，于35℃下恒温培养28h。每个乳酸菌发酵液做2个重复，用游标卡尺测其抑菌圈直径的大小，取平均值，选择抑菌圈大的乳 酸菌9株，并分别标号为HEW-A13-1、HEW-A13-2、HEW-A13-3、HEW-A13-4、HEW-A13-5、HEW-A13-6、HEW-A13-7、HEW-A13-8、HEW-A13-9。用接种环转接于MRS斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后置于4℃冰箱保存备用，进行下一步的研究。
4、产细菌素乳酸菌的筛选
1)目标菌株的确定：将步骤3中筛选获得的9个乳酸菌于MRS斜面培养基上进行菌种活化3-4次，取1-2环转接于装有300mLMRS液体培养基的摇瓶中35℃培养18h，转速为180r/m，对培养液用1mol/L NaOH溶液调节pH值至6.8，然后分别吸取200μL培养液替代上述步骤(2)中的产酸能力高的乳酸菌发酵液，采用上述步骤(2)的抑菌试验方法，选择抑菌圈最大的乳酸菌HEW-A13-1为本发明筛选的目标乳酸菌，暂时命名为乳酸菌HEW-A131。
2)抑菌蛋白的确认：将步骤1)HEW-A13-1培养液中加入硫酸铵至到培养液中不再有沉淀析出，收集沉淀和上清液，将沉淀透析、去盐后溶于与上清液等体积的超纯水，均匀混合，得溶解液，取适量溶解液加入0.1mg/mL的蛋白酶37℃酶解2h。取培养液、上清液、溶解液、酶解液做抑菌试验，结果如图3所示。进一步确定乳酸菌HEW-A131发酵产生的抑菌物质为抑菌蛋白。
所述肠球菌固体培养基组成为：胰蛋白胨1.7％，牛肉膏0.3，酵母膏0.5％，牛胆粉(盐)1％，氯化钠0.5％，柠檬酸三钠0.1％，七叶苷(灵)0.1％，柠檬酸铁铵0.05％，叠氮化钠0.025％，琼脂1.8％，余量为水，pH7.1±0.2。
所述MRS固体或斜面培养基组成为：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，柠檬酸二铵0.2％，醋酸钠0.5％，牛肉膏1％，吐温-80 0.1％，K2HPO40.2％，MgSO4·7H2O0.0058％，MnSO4·4H2O0.025％，琼脂粉1.5％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述MRS液体培养基组成为：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，柠檬酸二铵0.2％，醋酸钠0.5％，牛肉膏1％，吐温-80 0.1％，K2HPO40.2％，MgSO4·7H2O0.0058％，MnSO4·4H2O0.025％，余量为水，pH 7.0±0.2。
所述NA固体培养基组成为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，琼脂2％，NaCl 0.5％，余量为水，pH7.2±0.2。
5、菌株属的鉴定
对HEW-A131菌株进行生理生化鉴定，过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验和硫化氢试验均为阴性，表明HEW-A131菌株为乳酸菌属。通过马尿酸盐水解试验、精氨酸水解试验、4℃和65℃生长试验，及各类糖发酵试验，结果与《常见细菌系统鉴定手册》和《乳酸细菌的分类鉴定》对照。鉴定结果显示HEW-A131菌株为粪肠球菌。
表1 粪肠球菌HEW-A131部分生理生化特性
鉴定项目 HEW-A131 鉴定项目 HEW-A131
革兰氏染色 + 乳糖 +
接触酶 - 麦芽糖 -
氧化酶 - 蔗糖 +
4℃生长 + 山梨糖 +
65℃生长 + 鼠李糖 -
耐6.5％NaCl + 棉籽糖 -
0.04％亚碲酸钾 + 木糖 -
精氨酸双水解酶 + 甘露醇 +
葡萄糖 + 山梨醇 +
阿拉伯糖 - 蜜二糖 -
棉籽糖 - 松三糖 +
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。
6、16SrDNA测序测定
采用CTAB法提取HEW-A131菌株基因组DNA。利用引物F和R对HEW-A131菌株的16SrDNA基因片段进行PCR扩增，PCR扩增体系(25μL)包括引物F和R各1.0μL，TaqDNA聚合酶1.5U，10×Taq buffer2.5μL，Mg2+(25mmoL/L)1.5μL，菌株基因组DNA50ng。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性40s，53℃退火1min，72℃延伸1min30s，共30个循环，72℃温浴10min。反应结束后取3μL PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳检测。所得PCR产物回收纯化，送生物工程(上海)有限公司进行DNA序列的测定。将所测得的序列与GenBank中的16S rDNA序列进行BLAST分析比对，可以看出菌株HEW-A131与粪肠球菌的同源性达到99.93％。通过菌株HEW-A131的形态特征、生理生化特征、16SrDNA特征，确定菌株HEW-A131为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)。
7.菌株保藏
上述经分离、纯化、筛选得到的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131已于2014年6月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.9353，分类命名为粪肠球菌Enterococcus faecalis。
实施例2 粪肠球菌HEW-A131发酵液的制备
取粪肠球菌HEW-A131(保藏编号为CGMCC No.9353)种子液(活菌浓度为109CFU/mL)3mL，接种于300mL培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为35℃、pH 7.0、180r/min，发酵时间7h。
其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：蔗糖2.5％，大豆蛋白胨1.8％，酵母提取物0.4％，MgSO4·7H2O0.2％，MnSO4·4H2O0.045％，NaCl 0.2％，柠檬酸二铵0.2％，CaCO30.06％，余量为水，pH7.0±0.2。
摇瓶发酵结束后进行发酵罐中试试验，取0.30L摇瓶发酵种子液接种到50L发酵罐中，装液量为30L、发酵温度为35℃、pH值7.0，搅拌转速110r/min，发酵时间8h。发酵罐中试培养基组成同摇瓶发酵。
发酵结束后，检测发酵液活菌数为1.1×1010CFU/mL，发酵生长曲线如图4所示，发酵液于4℃保存在冰箱内备用。
实施例3 粪肠球菌HEW-A131益生性验证
在无菌操作台上，将病原菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、志贺氏菌属、韦荣氏球菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、多杀性巴氏杆菌)浓度为109CFU/mLd的菌悬液50mL与等体积冷却至45℃的NA培养基(灭菌后)混匀，制备成4mm左右的病原菌NA平板，将灭菌的牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑)放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别向各小管中滴加200μL保存好的实施例2制备的发酵液，勿使其外溢，35℃培养28h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值，结果如表2。
其中，所述病原菌NA平板是将121℃高温灭菌后的NA培养基与病原菌菌悬液混匀后，倒入灭菌后的平板，冷却后形成表面光滑的4mm厚的病原菌NA平板。所述NA培养基的配方为：蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，NaCl 0.5，pH 7.2±0.2。
表2 粪肠球菌HEW-A131对病原菌的抑菌效果
病原菌 抑菌直径(mm)
大肠杆菌Escherichia coli 22.4
金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 29.9
沙门氏菌Salmonella sp. 17.5
肺炎克雷伯氏菌Klebsiella peneumoniae 19.7
志贺氏菌属Shigella sp. 17.6
韦荣氏球菌Veillonella sp. 23.3
绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa 14.1
嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila 13.1
多杀性巴氏杆菌Pasteurella multocida 18.5
实施例4 粪肠球菌HEW-A131抗逆性验证
1、取保存好的10mL实施例2制备得到的发酵液注入到试管1中，采用十倍逐级稀释至10-8， 取1mL稀释液在平板上，将灭菌后冷却至45℃的MRS琼脂培养基倾注在平板(灭菌)上，迅速摇匀。再将装有10mL实施例2制备得到的发酵液的试管2置于80-90℃水浴锅中加热15-25min，取加热后的粪肠球菌菌液进行十倍逐级稀释至10-8，取1mL稀释液在平板上，将灭菌后冷却至45℃的MRS琼脂培养基倾注在平板(灭菌)上并迅速摇匀。最后将加热前和加热后的平板均在35℃条件下培养24h，计算粪肠球菌HEW-A131加热前后的数量。
结果表明，活菌存活率达到了93％。
2、模拟胃液及肠液的耐受试验：取100g/L的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为1.5、2.5和3.5，取100mL稀盐酸溶液，分别加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰蛋白酶10g，加水100mL使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，得模拟肠液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取1mL保存好的实施例2制备的发酵液加入到9mL的模拟胃液中(即十倍逐级稀释)，并迅速在振荡器上充分混匀，然后置于30-45℃静置培养2-4h。分别在1h、2h、3h、4h的时候取出培养液并立即计数残存活菌数，与原活菌数进行比较，结果表明，活菌存活率为97％。然后取人工胃液中消化在不同时间的培养液各1mL，分别接种于9mL pH值为6.8的人工肠液中，置于30-45℃静置培养2-4h，并分别在0、3、6、24h取样，测定其活菌数，与原活菌数进行比较，结果表明活菌存活率为99％。
3、模拟胆盐的耐受试验：用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.3％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH为8.0，然后用0.45μm微滤膜过滤并除菌。将0.5mL保存好的实施例2制备的发酵液接种到4.5mL模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计数残存粪肠球菌HEW-A131的活菌数。将培养液在灭菌生理盐水中十倍逐级稀释至10-8，并用MRS倾注，然后置于35℃静置培养24h。结果表明活菌存活率为99％。
实施例5 小鼠肠道性能试验
选取普通昆明小白鼠60只，雌雄各半，18-20g，常规词养。从中随机挑选40只，每天早晨9:00灌胃盐酸林可霉素0.2mL(20mg)/只，其它作为对照组，每天同一时间灌胃等量灭菌生理盐水，连续一周，制备肠道菌群失调的小鼠模型。模型组小鼠饮食下降，未出现死亡和明显的腹泻现象，排软粪，外形正常含水分较多，垫料潮湿。将40只肠道菌群失调小鼠，随机分为2组，一组20只作为HEW-A131治疗组，每天灌胃保存好的实施例2制备的发酵液0.5ml(2×1010cfu/ml)/只，另20只作为自然恢复组，与对照组相同处理，每天同一时间灌胃等量灭菌生理盐水，连续两周。整个试验期21天，每天观察小白鼠的生长和排便情况，于第8、21天对菌株治疗组和自然恢复组的小鼠进行称重，计算各组体重平均增长率，结果如表3；每5天测各组小鼠粪便大肠杆菌数量，计算平均数，结果如表4。取小鼠粪便约0.1g，于无菌操作台内加入3粒玻璃珠(以0.1g粪样加0.5mL稀释液)，稀释并接种麦康凯琼脂培养基，计算每克湿便中的大肠杆菌数。
表3 小鼠增重情况
分组 平均始重(g/只) 平均末重(g/只) 平均增长率(％)
自然恢复组 20.69±1.33 27.34±1.59 32.14a
HEW-A131治疗组 20.41±1.45 29.55±1.78 44.78b
表4 小鼠粪便中大肠杆菌数的情况
HEW-A131治疗组小鼠体重平均增长率(44.78％)显著高于自然恢复组(32.14％)；饲喂HEW-A131益生菌后肠道大肠杆菌数量显著下降，降低73.32％，显著低于自然恢复组(24.78％)，表明HEW-A131在小白鼠肠道内迅速定植，形成优势菌群，并有效抑制大肠杆菌等病原菌的生长繁殖。
实施例6 肉种鸡生产性能和繁殖性能试验
选用30周龄AA父母代肉种鸡4000只，随机分成2处理，每处理4个重复，每个重复500只鸡。试验日粮饲喂阶段30-39周龄。对照组为原基础日粮组，试验组在基础日粮中添加2×106CFU/kg的粪肠球菌HEW-A131微生态制剂。
表5 粪肠球菌HEW-A131对种鸡生产性能的影响
组别 对照组 试验组
产蛋率(％) 77.14±2.08a 78.53±2.03a
蛋重(g/枚) 60.25±1.46a 60.93±2.31a
采食量(g/只/天) 163.52±6.78a 161.24±7.89a
料蛋比 3.91±0.19b 2.94±0.03a
死淘率(％) 0.07±0.00b 0.03±0.00a
种蛋合格率(％) 92.66±1.46a 94.53±2.07b
注：同行数据肩标不含相同字母者表示差异显著(P＜0.05)(下同)
表6 粪肠球菌HEW-A131对种鸡孵化性能的影响
组别 对照组 试验组
种蛋受精率(％) 90.12±1.27a 92.37±1.74b
种蛋孵化率(％) 93.41±1.46a 94.03±2.01a
健雏率(％) 92.49±2.89a 94.79±2.47b
本试验结果显示，粪肠球菌HEW-A131可显著提高种鸡的生产性能及繁殖性能：与对照组相比，试验组料蛋比降低24.81％，死淘率降低57.14％，种蛋合格率提高2.02％，种蛋受精率提高2.5％，健雏率提高2.49％。
实施例7 肉鸡生长性能试验
选用2000只1日龄健康AA白羽肉鸡45g，43天后称重，随机分成4个实验组，每个处理设5个重复，每个重复200只鸡，公母各占1/2。试验组饲料分别为：(1)饲料中添加2×106CFU/kg的粪肠球菌HEW-A131微生态制剂(试验组)；(2)普通饲料(对照组)。试验组和对照组饲料配方和饲喂量一样，试验鸡自由采食和饮水，饲养管理和免疫程序参照肉鸡饲养管理手册。
表7 粪肠球菌HEW-A131对肉鸡生长性能的影响
本试验结果显示，粪肠球菌HEW-A131可显著提高了肉鸡的生产性能及免疫性能，与对照组相比，料肉比降低35.77％，死淘率降低56％。
实施例8 蛋鸡生产性能试验
试验为单因子设计，1800只24周龄，体重相近、健康的海兰褐蛋鸡，随机分为3个处理，每个处理6个重复，每个重复10个笼，每笼10只鸡。试验期6周，处理1为抗生素组，在基础日粮基础上添加四环素15mg/kg；处理2为普通组，饲喂基础日粮；处理3在基础日粮基础上添加2×106CFU/kg的粪肠球菌HEW-A131微生态制剂。试验鸡自由采食和饮水，饲养管理和免疫程序参照蛋鸡饲养管理手册。
表8 粪肠球菌HEW-A131对蛋鸡生产性能的影响
试验中期，每个组随机抽取10枚鸡蛋，即每个实验组60枚，利用蛋品质测定仪测试抽取蛋样的蛋品质。
表9 粪肠球菌HEW-A131对鸡蛋品质的影响
本试验的结果显示，粪肠球菌HEW-A131可显著提高蛋鸡的生产性能、免疫性和鸡蛋品质，有效替代抗生素添加剂，适合大规模推广使用。其中，料蛋比抗生素组降低14.98％，比普通组降低25.11％；死淘率比抗生素组降低13.54％，比普通组降低34.65％；鸡蛋质量指标光泽、蛋壳厚度、哈氏单位、蛋黄颜色明显优于抗生素组和普通组。
实施例9 仔猪生长性能试验
本试验选用35±1日龄、平均体重7.86±0.06kg健康的三元(杜×长×大)杂交断奶仔猪90头，分配进三个处理，每个处理5个重复，每个重复6头仔猪(公母各半)，各重复组间初始体重无明显差异(p＞0.05)，试验期21天。三个处理分别为：普通组、抗生素组(75mg/kg金霉素)和试验组(添加2×106CFU/kg粪肠球菌HEW-A131微生态制剂)。试验猪自由采食和饮水，饲养管理和免疫程序参照仔猪饲养管理手册。
表10 粪肠球菌HEW-A131对仔猪生长性能的影响
表11 粪肠球菌HEW-A131对猪舍环境的影响
本试验结果显示粪肠球菌HEW-A131可显著提高仔猪的生产性能、免疫性能和猪舍环境质量，能有效替代抗生素添加剂，适合大规模推广使用。与抗生素组和普通组相比，其中料重比分别降低13.73％和25.84％；腹泻率分别降低43％和66.14％；死淘率分别降低99.19％和99.59；发病率分别降低4.5％和21.75％；试验组比普通组猪舍环境指标显著提高。

Claims (5)

1.一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)HEW-A131，其保藏编号为CGMCC NO.9353。
2.一种如权利要求1所述的粪肠球菌HEW-A131的培养方法，其特征在于，取粪肠球菌HEW-A131种子液1-5mL，接种到300mL培养基中进行摇瓶发酵培养。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述培养基由如下组分组成：蔗糖1-5％，大豆蛋白胨0.5-2.5％，酵母提取物0.1-1.0％，MgSO4·7H2O0.05-0.2％，MnSO4·4H2O0.01-1.0％，NaCl0.1-2.0％，柠檬酸二铵0.1-0.5％，CaCO30.1-1.0％，余量为水，pH7.0±0.2。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度30-45℃，发酵时间5-20h，pH值6.5-7.5，转速为100-300r/m。
5.如权利要求1所述的粪肠球菌HEW-A131在微生态制剂的制备及畜禽养殖过程的应用。
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