CN114480206B - 一种耐高温粪肠球菌及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种耐高温粪肠球菌及其制备方法与应用，本发明通过菌种分离、生理生化鉴定、高温驯化和紫外线诱变处理，筛选得到了一株可耐受高温的粪肠球菌Q68，于2022年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022020。该菌株具有良好的遗传稳定性；50℃过夜培养与37℃过夜培养相比，存活率可达91.9％。本发明提供了其发酵方法，可将发酵产物进一步制备为菌剂，作为益生菌添加剂应用于饲料中，具有降低料肉比、降低腹泻率、生物环保等优点。

Description

一种耐高温粪肠球菌及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物制剂技术领域，具体涉及一种耐高温粪肠球菌及其制备方法与应用。

背景技术

饲料药物添加剂在预防动物疾病、促进动物生长、提高畜禽生产性能等方面作用十分明显，对保障现代养殖业的健康快速发展和促进人民生活水平的提高作用起到了巨大的推动作用。抗菌药物作为抗菌促生长剂添加到饲料中迄今已有半个多世纪的历史了。但对饲料中添加抗菌药物的合理性的争论亦已持续了多年，争论的焦点是其对人体健康的危害和对环境的破坏。

益生菌制剂正是在这种大背景下应运而生的。它可以直接饲喂动物并通过调节动物肠道微生态平衡达到预防和治疗疾病，促进动物生长以及提高饲料报酬的活性微生物或其代谢培养物，以达到调整体内微生态平衡之目的。益生菌制剂不仅可以提高饲料转化率和畜禽的生产性能、防治疾病，并且对改善动物健康状况，降低畜禽产品中胆固醇的含量有着很好的作用。

粪肠球菌为革兰氏阳性菌，属于肠球菌属，是农业部添加剂目录允许使用的安全菌种之一，在动物机体内具有保护屏障功效、营养功效、抑菌功效等作用，其在畜禽上的益生作用也得到了广泛认可。粪肠球菌相较于一般乳酸菌，虽然具有一定的温度耐受性、不同PH适应性及其他恶劣条件耐受性，但其各方面耐受性并不突出，如50℃仅能存活30分钟左右，pH低于3.5或高于9几乎不生长等，因此，筛选到抗逆性较好尤其是温度耐受性较好的粪肠球菌菌株，对生产应用意义重大。

此外，目前国内市场上销售的益生菌制剂往往仅以活菌数菌量来衡量益生菌制剂的好坏，但在生产实践中真实情况却并非如此。有些厂家生产出来的产品质量不同批次之间差异悬殊，即便活菌数大致相同，在实际应用中也很难取得一致的效果。另外，益生菌制剂在保藏、运输和在饲料配制过程中的稳定性，也影响其使用的效果，特别是非芽抱杆菌类益生菌制剂。因此，开发新的菌剂制备工艺，以保持菌株稳定的性能，十分必要。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的缺陷，提供一种耐高温粪肠球菌及其制备方法与应用。

为此，第一方面，本发明提供一种粪肠球菌Q68，其分类命名为粪肠球菌Enterococcus faecalis，于2022年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2022020。

所述粪肠球菌Q68具有下述性质：在MRS固体平板培养基培养后，其菌落呈乳白色或灰白色，圆形，小而中间凸起，湿润，边缘光滑，革兰氏阳性，在显微镜下观察呈球形或双球形。

对所述粪肠球菌Q68进行基因组提取，以基因组为模板，进行16S rDNA 的PCR扩增，将测序结果进行同源比对，确定其为粪肠球菌。将筛选得到的该菌株命名为粪肠球菌Q68，经过鉴定，该菌株具有耐高温性能，50℃过夜培养与37℃过夜培养相比，存活率可达91.9％。

本发明的第二方面，提供所述粪肠球菌Q68的发酵方法，其包括用发酵培养基对所述粪肠球菌Q68进行发酵培养，所述发酵培养基包括：蛋白胨1-5％，葡萄糖1-2％，玉米淀粉1-5％，大豆蛋白胨0.5-1％，氯化钙0.01-0.05％，氯化钠0.01-0.05％，氯化镁0.01-0.05％，磷酸二氢钾0.05-0.1％。

在一些实施方式中，所述发酵培养基包括：蛋白胨2％，葡萄糖1％，玉米淀粉1％，大豆蛋白胨0.5％，氯化钙0.05％，氯化钠0.05％，氯化镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％。

进一步，所述发酵培养基的pH值为6.5-7.0。

进一步，所述发酵培养的条件包括：温度37-45℃，通气量0.1-0.2vvm。

在一些实施方式中，所述发酵培养的条件包括：温度37℃，通气量0.2vvm。

在一些实施方式中，所述发酵培养的条件包括：45℃，通气量0.2vvm。

在一些实施方式中，所述发酵培养的条件包括：分为两个发酵阶段：阶段 1：从发酵的第0h起，从37℃开始以每8-10min升高1℃的速率进行升温至45℃，通气量0.2vvm；阶段2：45℃，通气量0.2vvm。

在一些实施方式中，所述发酵培养的条件包括：分为两个发酵阶段：阶段 1：从发酵的第0h起，以37℃开始以每10min升高1℃的速率进行升温至45℃，通气量0.1vvm；阶段2：45℃，通气量0.2vvm。

进一步，所述发酵的时间为18-24h，例如18h、20h、24h等。

本发明的第三方面，提供一种菌剂，所述菌剂包括本发明所述的粪肠球菌 Q68。

进一步，所述菌剂按照以下方法制备得到：对所述粪肠球菌进行发酵，离心发酵产物得到菌泥，加入菌泥质量30-60％的水，打成菌浆，向所述菌浆中加入辅料后经喷雾干燥制备得到所述菌剂。

在一些实施方式中，加入菌泥中的水的质量为菌泥的50％。

进一步，所述辅料包括阿拉伯胶和麦芽糊精。

进一步，所述辅料中，阿拉伯胶和麦芽糊精的质量比为1:6-8，例如1:6， 1:7，1:8等。

进一步，所述喷雾干燥的条件为：进风温度130-140℃，进料流量为12.53-14.58ml/min。

本发明的第四方面，提供本发明所述的粪肠球菌Q68或所述菌剂在饲料添加剂中的应用。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下显著的进步：

(1)本发明通过菌种分离、生理生化鉴定、高温驯化和紫外线诱变处理，筛选得到了一株可耐受高温的粪肠球菌，该菌株具有良好的遗传稳定性；50℃过夜培养与37℃过夜培养相比，存活率可达91.9％。

(2)本发明提供了粪肠球菌Q68的发酵方法，可将该发酵产物进一步制备为菌剂，作为益生菌添加剂应用于饲料中，具有降低料肉比、降低腹泻率、生物环保等优点。

(3)由于本发明提供的粪肠球菌具有良好的耐热性，本发明对应提供的菌剂为菌粉，其在保藏、运输和饲料配制过程中稳定性较高，具有良好的实用性。

具体实施方式

下面将更详细地描述本公开的示例性实施方式。应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1菌株的分离

江苏徐州六合猪场选一头40日龄健康仔猪宰杀，取其盲肠肠道内容物，用无菌棉拭子擦拭采集，填入无菌EP管中，取5管，标记1-5号置于冰盒中，送回实验室。在超净工作台上将装有棉拭子的EP管中的生理盐水混匀，挑取一环在MRS平板上划线后放入培养箱，37℃培养48小时。划线5块平板。

挑取在5块MRS培养基上呈乳白色或灰白色，圆形，小而中间凸起，湿润，边缘光滑的菌落。进行革兰氏染色，显微镜下镜检观察。保留镜检状态下为球状或双球状的菌落，共得到6株疑似菌落，编号为1#、2#、3#、4#、5#、6#菌株。

分别挑取上述6株菌株平板菌落在MRS平板上划线，37℃过夜培养，得到纯化菌落。重复上述操作，再次得到纯化菌落。挑取其中1株菌菌落，分别接种于明胶、七叶苷、乳糖、果糖、葡萄糖产气、棉子糖、半乳糖、木糖、葡萄糖酸盐等微量生化反应管中，放入37℃培养箱，恒温培养24小时候观察结果。 1～6#菌株均进行上述操作。

根据细菌生化鉴定管的说明书，粪肠球菌反应结果应为明胶、七叶苷、乳糖、果糖、葡萄糖产气、棉子糖、半乳糖、木糖为阳性；葡萄糖酸盐为阴性。经鉴定，编号为2#和5#的菌株符合粪肠球菌生化反应鉴定结果。

分别提取编号为2#和5#的菌株的基因组，采用16S rDNA细菌通用引物进行扩增(引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R： GGTTACCTTGTTACGACTT)，通过16S rDNA对比分析，确定编号为2#的菌株为粪肠球菌。

实施例2菌株的紫外诱变与筛选

挑取实施例1得到的2#菌落，接种于20ml MRS液体培养基中，37℃培养 24小时。取上述培养液1ml，接种于50ml MRS液体培养基中，45℃过夜培养。取上述培养液1ml，接种于50ml MRS液体培养基中，45℃过夜培养，重复上述步骤3次，得到培养液。挑取一环得到的培养液于MRS平板上划线，45℃培养，挑取较大的一单菌落，按照以下步骤处理：

(1)挑取单菌落，接种于装有30ml MRS的100mL摇瓶中，37℃恒温培养12小时，取10ml该培养物于90ml无菌水中稀释成10^-1稀释度的菌悬液。

(2)吸取稀释得到的菌悬液至灭菌的带转子的空平板中，置于在带磁力搅拌器的紫外诱变箱中(已经开启紫外，预热30分钟)，根据经验值选用30W 紫外灯进行诱变照射，照射距离45cm，开启搅拌，照射剂量分别为0s、5s、10s、 15s、20s、25s、30s、35s、45s、60s，盖上培养皿盖，关闭紫外灯，黑布包好平板，避光稀释涂布于MRS平板上。37℃避光培养3天，计算诱变处理后的活菌数，以未经诱变的平板作为对照组计算致死率。实验得出，30W紫外灯照射距离45cm，照射时间35s，致死率为90％。紫外照射处理菌体悬液后，吸取 1ml紫外处理液于50ml液体MRS培养基摇瓶中，50℃过夜培养，选取浑浊度高的摇瓶培养液，于MRS平板上划线，37℃恒温培养，挑选菌落较大的菌株8 株，分别编号为2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8。

分别挑取上述编号后的菌落，分别接种于装有20ml MRS的50ml摇瓶中， 50℃培养24小时，取菌液稀释20倍后测量OD₆₆₀。挑取上述培养液，于MRS 平板上划线，37℃培养，得到单菌落。循环上述操作，再进行两轮培养，分别记录不同编号的菌株对应循环次数的OD值，测量结果如表1所示。

表1

综合比较，编号为2-5的菌株性能较优，50℃耐受性最稳定，将其命名为粪肠球菌Q68，并进行甘油管冷冻保藏。

实施例3粪肠球菌Q68性能评价

将甘油管保藏的粪肠球菌Q68在MRS平板上划线活化，然后接种于50ml MRS液体培养基中，37℃培养10h，得种子液。取种子液进行以下实验：

(1)人工胃液及肠液耐受试验

取1ml种子液加入9ml人工胃液(pH2.5的盐酸缓冲液，含1％胃蛋白酶)，混匀后于37℃静置培养2h，取出培养液并立即计算存活率(与经人工胃液处理前的活菌数进行比较)。取1ml经人工胃液处理得到的培养液，加入9ml人工肠液(pH为6.8的磷酸缓冲液，含1％胰蛋白酶)，混匀后于37℃静置培养2h，测定其存活率(与经人工胃液处理前的活菌数进行比较)。上述实验设三组平行，并计算平均值，经检测，粪肠球菌Q68经人工胃液处理后的存活率为 97.10％，经人工肠液处理后的存活率为96.41％，具有较强的耐胃液和肠液能力。

(2)耐胆盐性

取种子液加入不同质量分数的胆盐溶液，处理2h后测定其存活率。上述实验设三组平行，并计算平均值，经检测，粪肠球菌Q68经0.15％的胆盐溶液处理后的存活率为95.93％，经0.3％的胆盐溶液处理后的存活率为89.87％，具有良好的耐胆盐能力。

(3)耐热性

将种子液用无菌水进行梯度稀释，得到10^-8稀释菌液，取0.1ml涂布于MRS 平板上，分别于37℃、50℃过夜培养，通过计数长出的菌落数计算粪肠球菌 Q68在50℃下的存活率(与37℃下的菌落数进行比较)。上述实验设三组平行，并计算平均值，经检测，50℃过夜培养与37℃过夜培养相比，粪肠球菌Q68的存活率可达91.99％。

实施例4发酵培养

将粪肠球菌Q68经菌种活化后，然后接种于50ml MRS液体培养基中，37℃培养10h，得种子液。将种子液接入10L发酵罐，发酵罐装液量6L。培养基组成为：蛋白胨2％，葡萄糖1％，玉米淀粉1％，大豆蛋白胨0.5％，氯化钙0.05％，氯化钠0.05％，氯化镁0.05％，磷酸二氢钾0.05％；培养条件为：pH6.8，转速 100r/min。

针对通气和温度条件，设置以下实验组：实验组1，37℃，通气量0.2vvm；实验组2，45℃，通气量0.2vvm；实验组3，分为两个发酵阶段：阶段1：从发酵的第0h起，从37℃开始以每10min升高1℃的速率进行升温至45℃，通气量0.2vvm；阶段1升温至45℃后进行阶段2：45℃，通气量0.2vvm；实验组4，分为两个发酵阶段：阶段1：从发酵的第0h起，以37℃开始以每10min升高1℃的速率进行升温至45℃，通气量0.1vvm；阶段1升温至45℃后进行阶段2：45℃，通气量0.2vvm。以上实验组均发酵20h。

分别将各实验组的发酵液离心得到菌泥，各实验组收获的菌体量为：实验组1＞实验组3、实验组4＞实验组2，其中，实验组4的菌体粘附性显著更高。

实施例5菌粉制剂

对于实施例4各实验组得到的菌泥，加入菌泥重量的50％的水，打成菌浆，加入由阿拉伯胶与麦芽糊精按质量比1:8组成的辅料，辅料加入量为15％(w/v)；然后进行喷雾干燥：进风温度为130℃，进料流量为12.53ml/min，制得相应菌粉。

选用(28±2)日龄体重相近的“杜×长×大”断奶仔猪120头，随机分为4 个实验组和1个对照组，每组24头；对照组饲喂基础日粮；各实验组分别在基础日粮中加入200mg/kg对应菌粉。试验仔猪在封闭猪舍中饲养，水泥地面，自由采食和饮水，驱虫、消毒及免疫均按猪场常规饲养管理程序进行，试验期31 天。试验期内每天观察仔猪粪便，记录腹泻头次，按照以下公式计算腹泻率：腹泻率(％)＝100×试验期内每组仔猪腹泻头次/(试验天数×每组仔猪头数)。试验期满后统计各组仔猪的腹泻率及生长性能的平均值，如表2所示。

表2

结果表明，本发明提供的粪肠球菌Q68用于动物饲料添加剂，可有效改善料重比和降低腹泻率。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 江苏三仪生物工程有限公司

大连三仪动物药品有限公司

<120> 一种耐高温粪肠球菌及其制备方法与应用

<141> 2022-02-22

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (11)

1.一种粪肠球菌Q68，其特征在于，所述粪肠球菌Q68的分类命名为粪肠球菌（Enterococcus faecalis），于2022年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉，保藏编号为CCTCC NO:M 2022020。

2.权利要求1所述的粪肠球菌Q68的发酵方法，其特征在于，包括用发酵培养基对所述粪肠球菌Q68进行发酵培养，所述发酵培养基包括：蛋白胨1-5%，葡萄糖1-2%，玉米淀粉1-5%，大豆蛋白胨0.5-1%，氯化钙0.01-0.05%，氯化钠0.01-0.05%，氯化镁0.01-0.05%，磷酸二氢钾0.05-0.1%。

3.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH值为6.5-7.0。

4.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的条件包括：温度37-45℃，通气量0.1-0.2vvm。

5.如权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵的时间为18-24h。

6.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求1所述的粪肠球菌Q68。

7.如权利要求6所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂按照以下方法制备得到：对所述粪肠球菌Q68进行发酵，离心发酵产物得到菌泥，加入菌泥质量30-60%的水，打成菌浆，向所述菌浆中加入辅料后经喷雾干燥制备得到所述菌剂。

8.如权利要求7所述的菌剂，其特征在于，所述辅料包括阿拉伯胶和麦芽糊精。

9.如权利要求8所述的菌剂，其特征在于，所述辅料中，阿拉伯胶和麦芽糊精的质量比为1:6-8。

10.如权利要求7所述的菌剂，其特征在于，所述喷雾干燥的条件为：进风温度130-140℃，进料流量为12.53-14.58ml/min。

11.权利要求1所述的粪肠球菌Q68或权利要求6-10任一项所述的菌剂在制备饲料添加剂中的应用。