CN113215019A - 一株粪肠球菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物和发酵饲料领域，具体涉及一株粪肠球菌及其应用，本发明的粪肠球菌具体为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）PF95，在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2020852，具有耐温、耐盐、耐酸碱等抗逆性，并能有效抑制有害杂菌的生长或产生；提高了乳酸的含量，同时产生了大量益生菌；尤其是在发酵后打开饲喂的开封阶段，依然能较好地改善饲料的品质；在围产期和哺乳期添加乳酸菌剂饲喂可以提高母猪繁育性能和再繁育性能、优化母猪血清指标、同时可以提高哺乳仔猪的生长性能；添加混合乳酸菌剂饲喂能有效增加仔猪的采食量和生长速度，降低仔猪腹泻率和病死率。

Description

一株粪肠球菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一株粪肠球菌及其应用。
背景技术
表达K88不动杆菌的肠毒性大肠杆菌(ETEC K88)是导致断奶仔猪细菌性腹泻的主要微生物，由仔猪细菌性感染性腹泻造成的经济损失在养猪业中能达26％之多。长期以来，抗生素一直被用于减少断奶仔猪的腹泻和提高生长性能，遗憾的是，抗生素的乱用造成了耐药性、环境污染、人类食品中的残留等诸多问题。欧盟自2006年1月1日起禁止在断奶猪日粮中使用抗生素作为促生长剂(欧共体法规编号1831/2003)，根据农业农村部第194号公告，由于动物和人类出现抗菌素耐药性，我国自2020年1月1日起全面禁止在饲料中使用抗生素。一些研究表明，氧化锌(ZnO)、有机酸、饲料酶、益生菌、低聚糖和粘土矿物质可以改善与ETEC相关的断奶后腹泻，但要考虑对环境的影响、微生物耐药性带来的风险和材料制备的难度。因此，需要替代抗生素生长促进剂，以提高生长性能，预防ETEC K88引起的腹泻。
除了环境和疾病因素外，育肥猪生长缓慢与妊娠母猪饲养和断奶仔猪健康有很大关系，只有妊娠期打好健康基础，母猪分娩后新生仔猪个头大，仔猪才会赢在起跑线上，俗话说“出生重1两，断奶重1斤，出栏重10斤”。豆粕作为畜牧业的主要饲料之一，含有丰富的氨基酸足以平衡动物正常生长所需蛋白质，是畜禽、鱼类等动物的重要植物性日粮蛋白来源，在现代养殖过程中可以大部分或者全部替代鱼粉等优质动物源性饲料，从而大大降低养殖成本。然而，豆粕中含有大量可诱发动物腹泻大分子蛋白和致敏蛋白，会导致饲料利用率低、适口性差等一系列问题。目前针对豆粕中大分子蛋白和致敏蛋白的处理方法，微生物发酵是主要且重要的一种，通过微生物的发酵，可以最大限度地消除豆粕中的抗营养因子、有效降解大豆大分子蛋白为优质小肽，并能产生益生菌、寡肽、谷氨酸、乳酸、维生素、未知生长因子等一系列活性物质；经过发酵的豆粕具有独特酸香味，能够提高适口性、改善营养物质消化吸收、减少腹泻促进生长的功效。目前对发酵豆粕的研究，所用菌种一般为市售，菌株背景不够清晰；最长的发酵周期一般是到64或72小时，发酵的豆粕很难降低到4.5以下，所以杂菌就很难被抑制。
大量报道表明，益生菌可以保护动物免受病原体引起的损伤和炎症，调节肠道微生物菌群，增强消化道功能，改善动物生长性能，降低断奶仔猪的腹泻发生率。乳酸菌是最常见、最典型的应用益生菌之一，在自然界中广泛存在，主要从发酵食品、土壤、动物肠道和粪便中分离出来，多项研究证实LAB可以增强断奶仔猪的肠道屏障功能，植物乳杆菌(Lactobacillus(L.)plantarum)保护断奶仔猪的肠道屏障功能，抵御ETEC K88挑战；L.reuteri降低了断奶仔猪肠道中ETEC K88的含量，影响了病原菌的丰度，尤其是降低了ETEC K88的丰度；L.salivarius增强生长性能，降低ETEC K88引起的腹泻发生率，L.casei通过产生抗菌物质抑制ETEC K88的生长。综上所述，乳酸菌对猪的病原菌有很好的抑制作用，特别是对ETEC K88引起的肠道不平衡有很好的抑制作用。此外，通过对妊娠母猪进行免疫，新生仔猪可从初乳中获得针对ETEC的母源抗体，对ETEC感染引起的腹泻提供早期有效的免疫保护。
目前发酵豆粕所用菌种背景不够清晰，且发酵周期较短，开封后发酵豆粕如何保存、是否会出现二次污染滋生杂菌等问题都没有报道；畜牧业是世界范围内的重要产业，养殖业对益生菌的需求量较大，而饲用益生菌市场尚处于初级阶段，目前商品化的益生菌产品数量较少，因此，本发明旨在通过全面评价猪源乳酸菌菌株在体外和体内对母猪和仔猪均有益的特性，分离筛选出安全且性能良好的抗ETEC K88猪源乳酸菌，此菌株不但可以应用在豆粕发酵中提高连续发酵30天过程中及发酵后再次打开暴露在空气中的豆粕的发酵特性，同时对繁育母猪和仔猪都有良好的效果，从而为发酵豆粕的充分利用和新型发酵饲料开发提供参考，为猪用复合微生态制剂的开发提供益生菌资源。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足而提供一株粪肠球菌及其应用。
本发明的第一个目的是提供一株乳酸菌：粪肠球菌。
本发明所提供的乳酸菌具体为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95，该菌株已于2020年12月4日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2020852。
所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852从中国河南省新乡市某猪场断奶健康仔猪粪便中分离得到的，该菌株在固体培养基上的单菌落外观形态为白色光滑凸起圆形，革兰氏染色阳性，革兰氏染色后显微镜下观察菌体呈球状、不产芽孢，不具有过氧化氢酶，兼性厌氧，发酵葡萄糖不产气，发酵类型为同型发酵；在5℃可以生长，在10和45℃生长良好，50℃时长势微弱，表明该菌株有良好的耐低温和耐高温性；在3.0和6.5％的NaCl中都可以生长，有较好的耐盐性；在pH为3.5、4.0、9.0和10.0时表现为生长，当pH值为4.5～8.0时生长性能良好，表明该菌株具有优良的耐酸碱性能；对羧苄青霉素、头孢美辛、克林霉素和氯霉素均有敏感性，而对阿米卡星和诺氟沙星有抗性，对庆大霉素和青霉素的耐药性处于中等水平，不具有溶血性能；表明该菌株具有良好的生理生化特性和安全性。其16S DNA序列如序列表中序列1所示。
本发明的第二个目的是提供一种菌剂。
本发明所提供的菌剂的活性成分为所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95CCTCC NO：M 2020852。
本发明的第三个目的是提供一种豆粕发酵的接种剂以及豆粕发酵的接种剂在豆粕发酵中的应用。
本发明所提供的豆粕发酵的接种剂的活性成分为所述的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852或其发酵产物或其菌悬液或其培养液或其冻干菌粉，主要抑菌物质成分为有机酸，含量依次为乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。
所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852在所述的豆粕中的接种量为1～20％。所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95CCTCC NO：M2020852添加方式为PF95发酵12～48小时的菌液与豆粕搅拌混匀，或者是PF95发酵12～48小时后制备的的固态菌粉与豆粕搅拌混匀。
本发明的第四个目的是提供一种母猪及仔猪(包括断奶时体重合格(大于等于12kg)和体重偏小(大于等于6kg小于12kg))的饲料添加剂以及饲料添加剂在母猪繁育和仔猪生长中的应用。
本发明所提供的母猪及仔猪饲料添加剂的活性成分为所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95或其发酵产物或其菌悬液或其培养液或其冻干菌粉。所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的接种量为1～10％，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)PF95的添加方式为菌液与饲料搅拌混匀，或者为固态菌粉与饲料搅拌混匀。
所述粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852或所述的菌剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(a1)抑制ETEC K88；
(a2)抑制细菌；
(a3)制备权利要求3所述的豆粕发酵的接种剂；
(a4)制备权利要求6所述的饲料添加剂；
在所述(a2)中，所述细菌具体为大肠杆菌(Escherichia coli)和/或肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)，和/或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，和/或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，和/或单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes)，和/或藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，和/或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852或所述菌剂对所述细菌的抑制为30～37℃条件下的抑制。
本发明通过豆粕发酵，分析比较了对豆粕发酵过程中微生物、发酵品质(pH、有机酸和氨态氮)的影响。与现有技术相比，本发明的改进在于：通过单因素试验和响应面试验，确定了粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852发酵豆粕工艺，提高了乳酸的含量，同时产生了大量益生菌；尤其是在发酵后打开饲喂的开封阶段，依然能较好地改善饲料的品质。本发明通过对发酵工艺的优化，使所筛选粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852最大程度发酵生产适口性好、营养丰富且含有大量益生菌的生物活性饲料，既为发酵制备替代抗生素的饲料益生菌剂提供基础数据，又对提高豆粕综合利用和资源开发具有重要意义。
本发明所提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852具有耐温、耐盐、耐酸碱等抗逆性，并能有效抑制有害杂菌的生长或产生，同时对母猪繁育和仔猪生长性能都有良好效果。本发明通过围产期和哺乳期母猪的添加混合乳酸菌剂饲喂实验，分析比较了在围产期和哺乳期添加乳酸菌剂饲喂对母猪繁育性能、再繁育性能、血清指标和哺乳仔猪生长性能的影响。发现在围产期和哺乳期添加乳酸菌剂饲喂可以提高母猪繁育性能和再繁育性能、优化母猪血清指标、同时可以提高哺乳仔猪的生长性能；对保育期仔猪进行混合乳酸菌剂饲喂实验，比较在断奶体重合格和断奶体重偏弱的仔猪日粮中添加混合乳酸菌剂，对仔猪生长性能的影响，发现添加混合乳酸菌剂饲喂能有效增加仔猪的采食量和生长速度，降低仔猪腹泻率和病死率。
保藏说明
菌种名称：粪肠球菌
拉丁名：Enterococcus faecalis
菌株编号：PF95
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心
保藏日期：2020年12月4日
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO：M 2020852。
附图说明
图1是本发明的菌株PF95的系统发育树。
图2是本发明实施例4中葡萄糖含量和蛋白胨含量对菌悬液OD600影响的等高线和响应曲面。
图3是本发明实施例4中葡萄糖含量和无机盐含量对菌悬液OD600影响的等高线和响应曲面。
图4是本发明实施例4中蛋白胨含量和蛋白胨含量对菌悬液OD600影响的等高线和响应曲面。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、培养基等如无特殊说明，均可从商业途径和/或公开资料中得到。
实施例1、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852的分离与鉴定
一、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的分离
准确称取20g取自中国河南省濮阳市某猪场断奶健康仔猪粪便样品，放入装有180mL无菌水的三角瓶中，用封口膜封口，放入180r/min的摇床中震荡30分钟，使微生物充分分散，静置20秒，即成10-1的稀释液；吸取100μL 10-1的稀释液，加入装有900μL无菌水的离心管中，充分混匀后，即成10-2稀释液；再吸取100μL 10-2稀释液，加入装有900μL无菌水的离心管中，混匀即成10-3稀释液；用同样方法连续稀释，制成10-4、10-5等一系列稀释菌液。取装有121℃、15分钟灭菌的MRS培养基，用记号笔在每个培养皿的3个120°的扇形标出10-1、10-3、10-5等3种稀释度；然后再分别从10-1、10-3、10-5稀释液管中吸取20μL，滴在对应的培养基表面的扇形区域内，再用涂布棒在培养基上均匀涂抹菌液。涂抹好的培养基静置25分钟后装入厌氧盒中，37℃恒温培养箱培养48小时取出计数，挑取单菌落进行编号，其中一株菌编为PF95，并进一步在灭菌的MRS培养基上纯化培养两次后，保存于-80℃超低温冰箱中待用。
二、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的鉴定
1、形态学鉴定
步骤一中分离得到的菌株PF95，该菌株在固体培养基上的单菌落外观形态为圆形、乳白色、表面凸起有光泽、边缘整齐；革兰氏染色后显微镜下观察菌体呈球状、不产芽孢。
2、生理生化特征鉴定
步骤一中分离并筛选得到的菌株PF95为革兰氏染色阳性，不具有过氧化氢酶，发酵葡萄糖不产气，发酵类型为同型发酵。
检测粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95对常见的35种不同碳源的发酵利用情况。结果如表1所示。
可见，菌株PF95不能发酵利用甘油、D-阿拉伯糖、纤维二糖、L-阿拉伯糖、核糖、D-棉子糖、淀粉、木糖醇和肌醇做碳源；可以发酵利用水杨酸、麦芽糖、乳糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-果糖、海藻糖、甘露糖、L-山梨糖、鼠李糖、葡萄糖酸酯、甘露醇、杏仁苷、山梨糖醇、N-乙酰葡糖胺做碳源。
表1、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95对不同碳源的利用情况
Figure BDA0002934537010000081
Figure BDA0002934537010000091
注：“+”表示阳性，能够利用；“-”表示阴性，不能利用。
3、16S DNA序列同源性分析
步骤一所得的菌株PF95在MRS固体平板上活化培养48h备用。选用细菌的16S rRNA基因扩增的通用引物27F和1492R进行PCR扩增，经过30个循环后，在1％琼脂糖凝胶中电泳，所用Marker含有1.5Kb条带。电泳结束后，用EB溶液染色，在紫外凝胶成像系统下观察。对菌落PCR产物进行测序，将测序所得长度约1500bp左右的16S rDNA序列在GeneBank中使用Blast程序寻找与其最大同源性的序列，确定菌到种的水平。
如图1所示，16S rDNA序列同源性分析结果将步骤一所得的PF95鉴定到粪肠球菌(Enterococcus faecalis)种，并于2020年12月4日，将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，武汉大学保藏中心，邮编430072)，保藏号为CCTCC NO：M 2020852，其分类命名为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852。
实施例2、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95抑制ETEC K88的特性及生理生化特性
一、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95抑制ETEC K88能力测定采用琼脂块扩散法测定粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95对ETEC K88的拮抗作用。将目标菌ETEC K88在Luria-Bertani(LB)液体培养基中过夜培养后取100uL过夜培养物在LB琼脂培养基中加入K88并冷却至50℃，混合均匀，倒入已经凝固的LB琼脂板的表面；凝固后，用直径10.00mm的打孔器在琼脂板中心打孔，加入200uL培养16h的PF95菌液。分别以未接种的空白MRS肉汤和青霉素为阴性和阳性对照。在4℃下扩散2h后测定抑菌圈直径，发现PF95的直径为30mm。
二、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95在不同温度、pH及盐浓度下的生长
1、不同pH下粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的生长
分别在pH为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、8.0、9.0和10.0的液体MRS培养基(pH6.5)中接种PF95，同时设置不加菌液的MRS液体培养基作对比，37℃下放置于恒温培养箱培养7天后，用分光光度计测定600nm处光吸收值。实验设置3个重复，结果取平均值。
表2、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的耐pH情况
Figure BDA0002934537010000101
注：“++”表示生长良好，“+”表示能够生长，“w”表示能够微弱生长(OD600大于等于0.4为生长良好，大于等于0.3小于0.4为能够生长，小于0.3大于0.2为微弱生长)。
结果如表2所示，在pH为3.5、4.0、9.0和10.0时，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)PF95表现为生长，当pH值为4.5～8.0时表现出良好生长性能，表明该菌株具有优良的耐酸碱性能。
2、不同温度下粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的生长
将活化的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95接种于MRS液体培养基，分别在4℃、10℃和50℃温度下恒温培养，不加菌液的MRS液体培养基做空白对照；其中4℃和10℃条件分别培养14天，50℃下培养7天，用分光光度计测定600nm处光吸收值。实验设置3个重复，结果取平均值。
表3、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的耐温情况
Figure BDA0002934537010000111
注：“++”表示生长良好，“+”表示能够生长，“w”表示能够微弱生长(OD600大于等于0.4为生长良好，大于等于0.3小于0.4为能够生长，小于0.3大于0.2为微弱生长)。
结果如表3所示，可见粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95在5℃可以生长，在10和45℃生长良好，50℃时长势微弱，说明该菌株有较好的耐低温和良好的耐高温性能。
3、不同盐浓度下粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的生长
将活化的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95分别接种在3.0％和6.5％(w/v)NaCl的液体MRS培养基(pH 6.5)中，设置不加菌液的MRS液体培养基做对比，37℃下放置于恒温培养箱培养48小时，用分光光度计测定600nm处光吸收值。实验设置3个重复，结果取平均值。
表4、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的耐盐情况
Figure BDA0002934537010000112
注：“+”表示能够生长(OD600大于等于0.3小于0.4为能够生长)。
结果如表4所示，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95在3.0％和6.5％的盐浓度下均可以生长，表明该菌株具有较好的耐盐性。
4、不同酸度下粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的生长
用pH 2.5的MRS液体培养基评估粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的低pH耐受性，设置pH 6.2作为对照。将LAB PF95分别在pH 2.5和pH 6.2条件下30℃培养2、4、6小时，然后在30℃孵育20小时后，用分光光度计测定600nm处光吸收值。实验设置3个重复，结果取平均值。
表5、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95在不同酸度下生长情况
Figure BDA0002934537010000113
Figure BDA0002934537010000121
结果如表5所示，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95在pH 2.5的酸性条件下培养2和4h后，OD依然达到1.25和1.20，生长良好，表明该菌株具有较好的耐酸性。
实施例3、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的耐胆盐、模拟胃肠道及抑菌谱测定
一、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的耐胆盐测定
将活化的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的种子液按2％的比例与0.2％的胆盐溶液混合均匀，在室温条件下分别在0、1、2、3和4小时取样，每次取样20μl滴加在MRS平板上，30℃培养48小时，用MRS平板菌落计数法测定各样品菌落数。实验重复3次，结果取平均值。
表6、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的耐胆盐情况
菌株 0小时菌数 1小时存活菌数 2小时存活菌数 3小时存活菌数 4小时存活菌数
PF95 2.65×10<sup>6</sup> 3.21×10<sup>6</sup> 3.96×10<sup>6</sup> 5.63×10<sup>6</sup> 4.53×10<sup>6</sup>
结果如表6所示，在3小时的胆盐耐受实验中，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的存活数达到最大，为5.63×106cfu/mL，与0小时起始菌株的2.65×106cfu/mL相比活菌数增加了52.93％；4小时后粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的存活数为4.53×106cfu/mL，比起始菌数仍有41.50％的增加，表明其具有较好的胆盐耐受性。
二、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的模拟胃肠道测定
将活化两代的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95发酵液2mL，12000r/min离心2分钟，加入2mL无菌生理盐水重悬，按2％接种量接种到人工胃液(pH 3.0)、肠液和无菌生理盐水中，30℃培养3小时。每个实验组各取20μL样液，均匀涂布在MRS固体培养基上，30℃培养48小时，计算各个实验组的菌落数。实验重复3次，结果取平均值。
表7、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95在模拟胃肠道实验中的存活情况(cfu/mL)
Figure BDA0002934537010000131
结果如表7所示，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95菌株活菌数在人工胃液中3个小时仍能够维持2.06×107cfu/mL，与0小时的活菌数5.11×107cfu/mL比仍有48.94％的存活率，表明其具有一定的胃液耐受性；PF95菌株活菌数在3小时肠液中处理后，存活数有2.34×107cfu/mL，比起始的2.11×106cfu/mL增加一个数量级，表明其具有良好的肠液耐受性。
三、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的广谱抑菌试验
本试验所用指示菌为引起肠胃问题的常见菌株：大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和/或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
将活化两代的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95传代液体MRS培养基制成发酵液，采用琼脂扩散法，将指示菌接种于营养肉汤培养基，在37℃下培养24小时，用生理盐水将菌悬液的活菌数调节为107cfu/mL，然后取20μL接到20mL冷却到45℃的MRS液体培养基中，充分混合均匀，待其完全凝固之后，用直径1cm的打孔器打孔，然后将培养好的产蛋白酶菌液加入到各孔中，每个孔中加200μL菌液，在37℃条件下培养48小时，观察抑菌圈的直径，以MRS液体培养基取代发酵液作为对照。实验重复3次，结果取平均值。
表8、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95的抑菌活性
菌株 铜绿假单胞菌 单核细胞李斯特菌 藤黄微球菌 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 肠炎沙门氏菌
PF95 ++ ++++ ++++ +++ ++++ ++++
注：“++”表示抑菌圈直径在13.00～17.00mm，“+++”表示抑菌圈直径在18.00～22.00mm，“++++”表示抑菌圈直径大于22.00mm。
结果如表8所示，可见：在37℃培养条件下，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95对铜绿假单胞菌、单核细胞李斯特菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和肠炎沙门氏菌6种指示菌均有不同程度的抑制作用，其中对单核细胞李斯特菌和大肠杆菌有明显的抑制作用。
实施例4、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95抑菌物质的确定
一、鉴定PF95产生的抗菌物质
pH值、酶、过氧化氢对PF95对ETEC K88抗菌活性的影响见表9。PF95的发酵液和上清液的抑菌圈直径均在18.00mm以上。结果总结，根据抑菌圈直径，双氧水并不影响PF95的抗菌活性，经双氧水处理后仍在18.00mm以上。同时，经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，抑菌圈直径仍在18.00mm以上。至于蛋白酶K，其直径也在14.00～18.00mm之间。但测试不同pH值的影响时，PF95的抗菌活性随pH值的升高而降低，在pH 3.0和4.0时明显不受影响，但在pH值4.5时略有降低，在pH值为5.5～10.0时，活性完全丧失。因此，可以确定PF95产生的抗菌物质是酸。
表9、PF95对ETECK88不同处理后的抗菌活性
Figure BDA0002934537010000141
注：“++”表示抑菌圈直径在13.00～17.00mm，“+++”表示抑菌圈直径在18.00～22.00mm，“-”表示未发现抑菌圈。二、PF95发酵产生的有机酸
采用液相色谱法分析PF95发酵24h后的产酸情况。结果显示，发酵液中主要检测到4种有机酸：柠檬酸、琥珀酸、乳酸和乙酸，含量分别为0.82、0.58、2.55和1.73mg/mL。表明PF95所产的机酸主要是乳酸和乙酸。
实施例5、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95培养基优化
一、单因素实验
1、碳源种类及含量筛选
以MRS培养基为基础，分别选择葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖作为碳源，培养基其他成分保持不变。无菌操作条件下，按照2％的接种量接种PF95的种子液，在37℃恒温的条件下厌氧培养24小时，测定培养后菌液的OD600。
确定最佳碳源后，对碳源添加量进行进一步的优化。选择1％、2％、3％、4％的碳源添加量进行试验，分别配制不同添加量的培养基，并接种2％的PF95种子液，37℃恒温厌氧培养24小时，并对不同试验组的样品进行OD600测定分析，选出最佳碳源的添加量。
2、氮源种类及含量筛选
确定最佳碳源后，以最佳碳源MRS培养基为基础，分别选择蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨作为氮源，培养基其他成分保持不变。无菌操作条件下，按照2％的接种量接种PF95的种子液，在37℃恒温的条件下厌氧培养24小时。测定培养后菌液的OD600。
确定最佳氮源后，对氮源添加量进行进一步的优化。选择0.5％、1％、2％、3％的该氮源添加量进行试验，分别配制不同添加量的培养基，并接种2％的PF95种子液，37℃恒温厌氧培养24小时，并对不同试验组的样品进行OD600测定分析，选出最佳氮源的添加量。
3、无机盐含量筛选
确定最佳氮源含量后，对无机盐含量进行进一步的优化。选择0％、0.47％、0.98％、1.47％的无机盐含量进行试验，分别配制不同添加量的培养基，并接种2％的95种子液，37℃恒温厌氧培养24小时，并对不同试验组的样品进行OD600测定分析，选出最佳无机盐的添加量。
根据单因素实验结果，确定最佳碳源为葡萄糖，含量为2％，最佳氮源为蛋白胨，含量为1％，无机盐含量为1.47％。
二、响应面实验
根据单因素试验结果，以培养后菌悬液OD600为响应值设定三因素三水平响应面优化实验。因素水平表和响应面试验设计表分别见表10和11。
表10、响应面水平因子设计和编码
Figure BDA0002934537010000161
表11、响应面优化实验设计方案及实验结果
Figure BDA0002934537010000162
Figure BDA0002934537010000171
对响应面试验进行方差分析，见表12，分析模型的回归性和稳定性，以及各因素对响应值影响力的大小。
表12、响应面回归方程方差分析结果
模型项 平方和 自由度 均方 F值 概率p>F 显著性
模型 0.068 6 1.10E-02 13.74 0.0003 **
X<sub>1</sub> 0.023 1 0.023 28.39 0.0003 **
X<sub>2</sub> 1.60E-02 1 1.60E-02 18.82 0.0015 **
X<sub>3</sub> 2.70E-02 1 2.70E-02 33.04 0.0002 **
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub> 1.53E-03 1 1.53E-03 1.85 0.2037
X<sub>1</sub>X<sub>3</sub> 1.44E-03 1 1.44E-03 1.75 0.2159
X<sub>2</sub>X<sub>3</sub> 3.04E-03 1 3.04E-03 3.68 0.0841 *
残差 8.27E-03 10 8.27E-04
总和 0.076 16
注：*表示差异显著(p≤0.05)，**表示极显著(p≤0.01)。
三元二次多项回归方程如下:
OD＝+0.65-0.051*X1+0.039*X2+0.060*X3-0.019*X1*X2-0.019*X1*X3+0.027*X2*X3
用软件预测最优值，得知葡萄糖含量为2％，蛋白胨含量1.97％，无机盐含量1.46％，为最优培养基，此时菌悬液OD值为0.77。
实施例6、添加粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95混合发酵豆粕的优化
一、单因素实验
在200g豆粕按照10％接种量加入PF95，分别加入1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.2料液比(Kg/L)的无菌水，室温下发酵72小时。
在200g豆粕里面加入1:1.0的料液比(L/Kg)的无菌水，分别加入5.0％、7.5％、10％、12.5％、15％接种量的PF95，室温下发酵72小时。
在200g豆粕里面按照10％接种量加入PF95，1:1.0料液比(L/Kg)的无菌水，分别在室温下发酵24、36、48、60、72小时。
利用福林法分别测定各组发酵后的酶活。根据单因素结果，最佳发酵时间为36小时，接种量为12.5％，料液比为1:1。
二、正交试验
根据单因素试验结果，设定三因素三水平L9(33)正交试验如表13和表14所示。
表13、正交试验设计
Figure BDA0002934537010000181
表14、乳酸菌液体发酵液发酵豆粕正交试验L9(33)结果分析表
Figure BDA0002934537010000182
表15、乳酸菌液体发酵液发酵豆粕正交试验L9(33)方差分析表
Figure BDA0002934537010000183
由表15可知，三个因素的影响程度依次为C>A>B，即料液比>发酵时间>接种量，且对于A、B和C三个因素，效果最佳的事K1、K1和K3，即豆粕的最佳发酵条件为：发酵时间36小时，接种量10％，料液比1:1，但由于该组方案并不在正交表中，于是对该组进行了验证实验。经验证，该组的酸性蛋白酶活力为191，高于九组中的最高蛋白酶活力，即证明，验证的实验方案为最优发酵方案。
实施例7、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95添加豆粕发酵过程中pH变化
以粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852作为饲料添加剂制备发酵豆粕饲料。
将PF95在固体MRS平板上活化两代后，挑取单菌落于1mL MRS液体培养基中制成种子液，调OD使菌液浓度相同，然后再按2％的接种量转到50mL液体MRS培养基中，37℃过夜培养，培养至对数期时备用。
试验设置：空白组(豆粕)和PF95组(豆粕+PF95)，每个组3个重复。接种时把发酵好的乳酸菌PF956000r/min离心以便除去MRS液体培养基，然后把沉积于离心管底部的菌体用无菌水调OD值至0.8，按照2％的接种量，用喷壶均匀的喷洒于豆粕上，戴上手套抓拌混合均匀，称取100g装入发酵专用袋，然后利用真空包装机抽真空后密封，每个组制备33袋，室温避光储存(温度变化范围为21～29℃，平均温度约为25℃)，分别于发酵的第0、12、24、36、48、60及72小时，7、12、18和30天进行开封取样；同时，发酵72小时和30天开封后，分别进行开袋暴露于空气中3天和7天的二次发酵处理。每次开封3袋，作为3个平行。每次开封时，每个处理取豆粕混合发酵饲料10g加入90mL的无菌蒸馏水中在旋涡振荡器上震荡均匀，然后用四层纱布过滤，用玻璃电极pH计测量pH值。
表16、豆粕发酵过程中pH变化
Figure BDA0002934537010000191
Figure BDA0002934537010000201
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
由表16结果可知，PF95组发酵12小时pH即降到了5.26，36小时到4.77，且一直到发酵结束，pH都处于下降状态；而空白组发酵3天暴露3天时，pH降低到了4.75，但是到了暴露第7天时又升高到了6.74，而PF95组一直维持在暴露阶段一直维持在4的水平；发酵30天开封暴露3天和7天时，PF95组都是4.5以下的水平，低于空白组。以上结果表明，添加粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95能使得发酵豆粕处于稳定抑制杂菌生长的酸性环境，具有显著的优良作用。
实施例8、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95添加豆粕发酵过程中有机酸和氨态氮变化
以粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852作为饲料接种剂制备发酵饲料。
挑取粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852单菌落置于1mL MRS液体培养基中过夜培养制成种子液，按2％的接种量转到50mL液体MRS培养基中，37℃过夜培养，培养至对数期6000r/min离心除去MRS液体培养基，冷冻干燥制备冻干菌粉备用。
试验设置：空白组(豆粕)和PF95组(豆粕+PF95)，每个组3个重复。接种时把乳酸菌PF95的冻干菌粉，按2％的接种量转到100mL液体MRS培养基中37℃过夜培养后，6000r/min离心以便除去MRS液体培养基，用无菌水调OD值至0.8后，按照2％的接种量喷洒于豆粕上，混合均匀并称取100g装入发酵专用袋，真空后密封。每个组制备33袋，室温避光储存(温度变化范围为31～39℃，平均温度约为35℃)，分别于发酵的第0、12、24、36、48、60及72小时，7、12、18和30天进行开封取样；同时，发酵72小时和30天开封后，分别进行开袋暴露于空气中3天和7天的二次发酵处理。每次开封3袋，作为3个平行，检测其中有机酸和氨态氮变化。
每个处理取豆粕发酵饲料10g加入90mL的无菌蒸馏水中在旋涡振荡器上震荡均匀，然后用四层纱布过滤，滤液经0.22μm滤膜过滤后，采用高效液相色谱仪进行有机酸分析，以甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸和柠檬酸作为标准品，配制一系列浓度梯度溶液，确定其保留时间并绘制标准曲线，条件为：柱温55℃，流动相流速0.6mL/min，进样量10μL，紫外吸收检测器进行检测。根据样品的出峰时间和峰面积与标准品的比对，对各样品中各种有机酸进行定性和定量分析。
表17、豆粕发酵过程中有机酸和氨态氮变化
Figure BDA0002934537010000211
Figure BDA0002934537010000221
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
在发酵饲料中，乳酸能维持动物肠道菌群平衡、减少腹泻、促进钙吸收。如表17所示，在发酵12小时，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852组的乳酸含量迅速升到36.03g/Kg(下同)，而对照组只有9.39，且直到发酵3天暴露3天时对照组的含量才达到40以上水平；在两个开封暴露阶段，PF95组在发酵3天暴露7天时，乳酸含量上升到了88.04，而对照组依然维持在40的水平，对照组在发酵30天暴露阶段开始后，乳酸含量处于显著下降趋势，尤其是暴露3天时，PF95组在3天暴露时略有下降，但到7天时又升高到100以上的水平。
制备成功的发酵饲料pH值应该是4.5左右，含有较多的有机酸，其中之一就是乙酸。在本发明中，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852组的乙酸含量一直都存在，且在发酵3天、两个有氧暴露阶段都高于空白组，尤其是发酵3天、发酵3天暴露7天、发酵30天的两个暴露阶段，PF95组都显著高于空白对照组。
在本发明中，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852组的氨态氮含量除了在发酵48小时时和空白组的一样，前12天的发酵都高于空白组，包括发酵3天后两次开封暴露阶段。因为氨态氮与总氮的比值是反映饲料中蛋白质及氨基酸分解的程度，比值越大，说明蛋白质分解越多，而本发明的目的是促进豆粕中大分子蛋白降解为小分子更利于吸收利用，所以表明粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M2020852在豆粕发酵贮存期间能够促进饲料中蛋白质降解。
实施例9、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95添加豆粕发酵过程中微生物含量变化
以粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852作为饲料接种剂制备发酵饲料
将PF95在固体MRS平板上活化两代后，挑取单菌落于1mL MRS液体培养基中制成种子液，调OD使菌液浓度相同，然后再按2％的接种量转到50mL液体MRS培养基中，37℃过夜培养，培养至对数期时备用。
试验设置：空白组(豆粕)和PF95组(豆粕+PF95)，每个组3个重复。接种时把过夜培养好的乳酸菌PF95按照2％的接种量，用喷壶均匀的喷洒于豆粕上，戴上手套抓拌混合均匀，称取100g装入发酵专用袋，然后利用真空包装机抽真空后密封，每个组制备33袋，室温避光储存(温度变化范围为21～29℃，平均温度约为25℃)，分别于发酵的第0、12、24、36、48、60及72小时，7、12、18和30天进行开封取样；同时，发酵72小时和30天开封后，分别进行开袋暴露于空气中3天和7天的二次发酵处理。每次开封3袋，作为3个平行，检测其中微生物分布。
每次开封时，在无菌超净工作台打开发酵豆粕真空袋，每袋取20g样品与180mL无菌水混合震荡，以10倍梯度稀释依次至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，从中选取10-1、10-3和10-5的稀释液涂布在相应均分成三份的半选择性固体平板上，其中乳酸菌用MRS培养基，一般好氧细菌用NA培养基，霉菌和酵母菌用PDA培养基(二者可根据菌落形态进行区分)，梭菌用CLO培养基，大肠杆菌用EMB培养基。每个处理组做三组平行。因为芽孢杆菌和梭菌具有耐热的性质，因此在筛选这两种菌的时候要经过75℃15分钟加热处理，以便杀死其他杂菌。涂布结束之后，把MRS和CLO平板放在恒温厌氧箱、其余各平板置于恒温培养箱中，37℃培养48小时，结束之后计数分析，结果如表18所示。
表18、豆粕发酵过程中微生物含量变化
Figure BDA0002934537010000241
注：3d-3d，发酵3天后开封暴露3天；3d-7d，发酵3天后开封暴露7天；30d-3d，发酵30天后开封暴露3天；30d-7d，发酵30天后开封暴露7天。
如表18所示，在发酵12小时加入粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95CCTCCNO：M2020852组的乳酸菌数量达到9.87log CFU/g FM(下同)，24小时甚至达到了10.25，且10以上的水平一直维持到发酵12天，而空白对照组在整个发酵过程中都没有达到10以上的水平；发酵3天后开封暴露3天时，PF95组仍然是10.01，到第7天下降到了9.37，而空白对照组在暴露3天时是9.77，但到了第7天则是6.95，与PF95组差别显著。乳酸菌的作用很多，主要有平衡胃肠道内的菌群，使有益菌增多，有害菌减少，进而提高胃肠道功能；改善动物对食物的消化能力，提高食物的生物效价，提高机体免疫力；减少血清中胆固醇含量，降血压；增加食品风味、抗肿瘤及抗氧化等。
空白处理组的好氧细菌，在发酵3天时候是9.87，发酵3天后开封暴露3天和7天时分别是9.78和10.06，加入粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95CCTCC NO：M 2020852组发酵3天时候是9.82，发酵3天后开封暴露3天时是9.97，都和空白组相差无几，但是到了暴露7天时降到了4.62，相比对照组和本组前一次开封，都有显著下降。表明粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852对于豆粕和汤阴北艾混合发酵中的好氧细菌，具有较好地抑制作用。
至于条件致病菌大肠杆菌，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M2020852组在发酵12小时即降到了4.0，而此时的对照组依然是8.87，并且对照组在发酵24小时时候上升到了9.12的水平，9以上的水平依然持续到发酵12天；发酵3天后开封暴露3天和7天时依然是9.81和9.66，而PF95组暴露3天时是4.27，7天时没有检测到；到发酵30天时，空白组是5.39，PF95组也没有检测到，对照组是9.81，发酵30天后开封暴露3天和7天，空白组都仍然高达5.92和5.13，PF95组暴露3天没有检测到。以上数据表明，PF95对于大肠杆菌具有良好的抑制作用。
芽孢杆菌的内生孢子能耐受极高和极地的环境温度，难易消除，而被芽孢杆菌污染的饲料，对人和动物是有致病性的。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852组在发酵24小时降低到了4.32，而空白对照组整个发酵过程中除了第18天时，其余一律没有低于此水平；发酵3天时，对照组是5.33，而PF95组则没有检测到；在发酵3天后开封暴露7天时，对照组芽孢杆菌含量是PF95组的近2倍。说明粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852对芽孢杆菌也有抑制效果。
酵母菌的存在会消耗发酵饲料能量。在本发明中，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852组的酵母菌，从发酵7天开始都没有检测到，而空白对照组则在发酵18天和30天时，含量分别为5.89和9.2。表明粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852对于酵母菌有一定抑制效果。
发酵产生的霉菌会产生霉菌毒素，而这些毒素不仅会导致饲料质量降低、营养物质流失，还会严重侵害动物的消化和免疫系统。本发明中，粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852组的霉菌只有在发酵30天后开封暴露7天时候被检测到，含量为4.1，而空白组在发酵3天后开封暴露3天、发酵30天时、发酵30天后开封暴露3天和7天都检测到了，且最低值为5.02。表明粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCCNO：M 2020852对于霉菌有良好抑制。
综上，可见粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852在豆粕发酵中具有较好抑制杂菌的作用。
实施例10、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95饲喂母猪试验
表19、母猪每个阶段基础日粮的成分和营养水平
项目 妊娠(％) 哺乳(％)
玉米 57.34 60.36
豆粕 12.80 23.20
鱼粉 0 3.00
乳清粉 4.00 4.50
麦麸 22.10 5.00
石灰石 1.50 1.40
CaHPO<sub>4</sub> 0.96 0.99
NaCl 0.40 0.40
L-赖氨酸盐酸盐 0.15 0.30
DL-蛋氨酸 0 0.15
氯化胆碱 0.15 0.15
苏氨酸 0.05 0
维生素-矿物质预混料<sup>a</sup> 0.55 0.55
合计 100 100
消化能(MJ/kg) 12.11 13.59
粗蛋白(％) 14.66 17.76
Ca(％) 1.05 1.08
赖氨酸(％) 0.73 1.11
蛋氨酸(％) 0.40 0.56
a每公斤母猪预混料：25000国际单位(internationalunit，IU)维生素A、4500IU维生素D3、20IU维生素E、2.5mg维生素K、8mg维生素B2、1mg维生素B1、8mg维生素B11、4mg维生素B6、0.08mg生物素、0.015mg维生素B12、200mg胆碱、12mg泛酸、3mg叶酸、20mg烟酸、150mg铁(FeSO4)、20mg铜(CuSO4)、40mg锰(MnO)、150mg锌(ZnO)、10mg碘(KI)、0.5mg硒(Na2SeO3)。
从河南濮阳某猪场选取怀孕80～85天，体重相近、胎次相同的母猪共36头，随机分为2组：对照组在怀孕和哺乳期分别饲喂基础日粮单独配方(表19)；将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95 CCTCC NO：M 2020852冻干菌粉按2％的接种量加入50mL液体MRS培养基中活化，37℃过夜培养，培养至对数期时6000r/min离心除去MRS液体培养基，然后把沉积于离心管底部的菌体用无菌水调OD值至0.8，试验组在基础日粮的基础上添加此6％的菌液作为日粮补充。每个处理有3个重复，每个栏位有6头母猪，试验持续55天至哺乳期结束，产房温度保持25±1℃，相对湿度60％。
在整个实验过程中，基础日粮的成分和营养水平均满足国家研究委员会(2012)推荐的营养需求。所有的猪圈都配备了一个自动喂食器和一个乳头饮水器，以保证自由采食和喝水。
分别记录每头母猪的总产仔数、活仔数、弱仔数、初生个体重和窝重。
仔猪21天断奶时，每组随机挑选5头(共10头)，用真空采血管耳缘静脉采血10mL，离心后将分离的血清放入-20℃保存备用，分别测定其在550、520和532nm的OD值，计算血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量。
测定并分别统计对照组和实验组母猪断奶至再发情的时间间隔、断奶后1～7天和8～14天内母猪的发情数、发情期受胎率。
从表20可以看出，实验组比对照组产仔数多的情况下，死胎数活仔数相同、弱仔数稍低、出生活仔率、仔猪出生重、母猪带仔数、断奶存活数都有优势。
表20、饲喂乳酸菌对母猪繁殖性能的影响
项目 对照组 实验组
母猪数(头) 10 10
平均产仔数(头) 11.6 12.5
平均活仔数(头) 11.2 12.3
平均死胎数(头) 0.30 0.15
平均弱仔数(头) 1.2 0.9
出生活仔率(％) 96.55 98.40
弱仔率(％) 10.71 7.32
平均仔猪出生重(Kg) 1.43 1.51
平均母猪带仔数 10.2 12.7
平均断奶存活数 9.1 11.8
断奶存活率(％) 89.22 92.91
由表21可知，与对照组相比，实验组仔猪断奶重、平均日增重均极显著提高。
表21、饲喂乳酸菌对出生仔猪生长性能的影响
项目 对照组(Kg) 实验组(Kg)
仔猪出生重 1.51 1.52
仔猪断奶重 5.33 6.03
出生窝重 16.12 17.87
断奶窝重 54.85 68.76
从表22可以看出，实验组所有母猪都在断奶后1～14天内均正常发情，且情期受胎率为100.0％；而对照组有8.0％未正常发情，而且22.0％发生情期返情情况，情期受胎率也只有70.0％。
表22、乳酸菌对母猪再繁殖性能的影响
项目 对照组 实验组
断奶7天内发情间隔天数 4.39 4.12
1～7天内发情率(％) 80.0 92.0
8～14天内发情率(％) 12.0 8.0
未正常发情率(％) 8.0 0.0
情期受胎率(％) 70.0 100.0
情期返情率(％) 22.0 0
从表23可以看出，实验组T-SOD活性和T-AOC大于对照组，而MDA含量有下降趋势，低于对照组，说明乳酸菌剂对母猪血清抗氧化指标有优化能力。
表23、乳酸菌对母猪血清抗氧化指标的影响
项目 对照组 实验组
总超氧化歧化酶(U/mL) 31.36 32.15
总抗氧化能力(U/mL) 13.77 14.55
丙二醛(nmol/mL) 10.34 9.87
实施例11、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95饲喂仔猪情况
表24、仔猪基础日粮的成分和营养水平
Figure BDA0002934537010000291
Figure BDA0002934537010000301
a每公斤仔猪预混料：6000IU维生素A、200IU维生素D3、40IU维生素E、2mg维生素K、200mg胆碱、8mg泛酸、3mg维生素B2、3mg叶酸、25mg烟酸、6mg维生素B11、6mg维生素B6、0.08mg生物素、0.01mg维生素B12、100mg铁(FeSO4)、10mg铜(CuSO4)、45mg锰(MnO)、100mg锌(ZnO)、100碘(KI)、2mg硒(Na2SeO3)。一、添加粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95对断奶体重合格的断奶仔猪生长性能的影响
选取60头体重相近(12kg左右)、日龄相近(35天左右)、且已适应猪场仔猪基础日粮(表24)的仔猪，随机平均分为对照组和乳酸菌剂两组。
对照组：饲喂常规的仔猪基础日粮；
乳酸菌组：将PF95在固体MRS平板上活化两代后，挑取单菌落于1mL MRS液体培养基中制成种子液，然后再按2％的接种量转到50mL液体MRS培养基中，37℃过夜培养至对数期时，在仔猪基础日粮里按2％的量添加。
每天定时定量添料，仔猪自由采食。
于实验开始和结束时称重，期间记录仔猪拉稀、增重、病及死缺失情况。
表25、乳酸菌剂对断奶体重合格仔猪的生长性能的影响
Figure BDA0002934537010000302
通过表25可以看出，对照组和乳酸菌组的初始均重相差无几，7天饲喂之后，乳酸菌组仔猪均重明显大于对照组，料肉比也明显降低，表明在饲料中加入乳酸菌剂可以提升仔猪的生长速度，降低料肉比，节省喂养成本，而且实验组中仔猪没有出现腹泻现象。
二、添加粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95对断奶体重较小的仔猪生长性能的影响
选取60头体重相近、35日龄、体重较轻(平均6.45kg)、且已适应猪场仔猪基础日粮(见表26)的断奶仔猪，随机平均分为两组，每组30头。
对照组：喂食常规的仔猪基础日粮；
乳酸菌组：在仔猪基础日粮里按2％的量添加乳酸菌菌剂。
饲喂、管理、数据记录，与体重合格组小猪相同。
表26、乳酸菌剂对断奶体重较小仔猪的生长性能的影响
Figure BDA0002934537010000311
通过表26可以看出断奶体重较小的仔猪采食量和生长速度明显低，料肉比也明显高于断奶体重合格的仔猪，此外，断奶体重较小的仔猪更容易发生腹泻和死亡。
对照组和乳酸菌组仔猪初始均重相近，在经过7天饲喂之后，在每天饲喂量相同的情况下，乳酸菌组的平均体重、日增重明显高于对照组，料肉比则明显、腹泻率和死亡率都明显要低。可见通过在断奶体重较小的仔猪日粮中加入乳酸菌剂可以显著改善断奶体重较小仔猪的生长速度慢，降低料肉比、腹泻率和死亡率。
综上，在围产期和哺乳期的母猪日粮中添加粪肠球菌(Enterococcus faecalis)PF95乳酸菌剂，可以提高母猪繁育性能和再繁育性能、优化母猪血清指标，同时可以提高哺乳仔猪的生长性能；对断奶仔猪进行饲喂发现，添加乳酸菌剂无论对断奶体重合格还是体重较小的仔猪，都能够增加日增重、降低料肉比和腹泻率。
SEQUENCE LISTING
<110>郑州大学
<120>一株粪肠球菌及其应用
<160>1
<210>1
<211>1438
<212>DNA
<213>粪肠球菌(Enterococcus faecalis)
<400>1
GGTGCTATAC ATGCAAGTCG AACGCTTCTT TCCTCCCGAG TGCTTGCACT CAATTGGAAA 60
GAGGAGTGGC GGACGGGTGA GTAACACGTG GGTAACCTAC CCATCAGAGG GGGATAACAC 120
TTGGAAACAG GTGCTAATAC CGCATAACAG TTTATGCCGC ATGGCATAAG AGTGAAAGGC 180
GCTTTCGGGT GTCGCTGATG GATGGACCCG CGGTGCATTA GCTAGTTGGT GAGGTAACGG 240
CTCACCAAGG CCACGATGCA TAGCCGACCT GAGAGGGTGA TCGGCCACAC TGGGACTGGA 300
CACGGCCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TAGGGAATCT TCGGCAATGG ACGAAAGTCT 360
GACCGAGCAA CGCCGCGTGA GTGAAGAAgG TTTTCGGATC GTAAAACTCT GTtGtTAGAG 420
aAGaACAAGG ACGTTAGTAA CTGAACGTCC cTGACGGTAT CTAACCAGAA AGCCACGGCT 480
AACTACGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACGT AGGTGGCAAG CGTTGTCCGG AtTTATTGGG 540
CGTAAAGCGA GCGCAGGCGG TTTCTTAAGT CTGATGTGAA AGCCCCCGGC TCAACCGGGG 600
AGGGTCATTG GAAACTGGGA GACTTGAGTG CAGAAGAGGA GAGTGGAATT CCATGTGTAG 660
CGGTGAAATG CGTAGATATA TGGAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGGCTCT CTGGTCTGTA 720
ACTGACGCTG AGGCTCGAAA GCGTGGGGAG CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC 780
GCCGTAAACG ATGAGTGCTA AGTGTTGGAG GGTTTCCGCC CTTCAGTGCT GCAGCAAACG 840
CATTAAGCAC TCCGCCTGGG GAGTACGACC GCAAGGTTGA AACTCAAAGG AATTGACGGG 900
GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGAAGC AACGCGAAgA ACCTTAcCAG 960
GTCTTGACAT CCTTTGACCA CTCTAGAGAT AGAGCTTTCC CTTCGGGGAC AAAGTGACAG 1020
GTGGTGCATG GTTGTCGTCA GCTCGTGTCG TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC 1080
GCAACCCTTA TTGTTAGTTG CCATCATTTA GTTGGGCACT CTAGCGAGAC TGCCGGTGAC 1140
AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA TCATCATGCC CCTTATGACC TGGGCTACAC 1200
ACGTGCTACA ATGGGAAGTA CAACGAGTCG CTAGACCGCG AGGTCATGCA AATCTCTTAA 1260
AGCTTCTCTC AGTTCGGATT GCAGGCTGCA ACTCGCCTGC ATGAAGCCGG AATCGCTAGT 1320
AATCGCGGAT CAGCACGCCG CGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA 1380
CACCACGAGA GTTTGTAACA CCCGAAGTCG GTGAGGTAAC CTTTTGGAGC CAGCCGCG 1438
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<110> 郑州大学
<120>一株粪肠球菌及其应用
<160> 1
<210> 1
<211> 1438
<212> DNA
<213>粪肠球菌（Enterococcus faecalis）
<400> 1
ggtgctatac atgcaagtcg aacgcttctt tcctcccgag tgcttgcact caattggaaa 60
gaggagtggc ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctac ccatcagagg gggataacac 120
ttggaaacag gtgctaatac cgcataacag tttatgccgc atggcataag agtgaaaggc 180
gctttcgggt gtcgctgatg gatggacccg cggtgcatta gctagttggt gaggtaacgg 240
ctcaccaagg ccacgatgca tagccgacct gagagggtga tcggccacac tgggactgga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tcggcaatgg acgaaagtct 360
gaccgagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatc gtaaaactct gttgttagag 420
aagaacaagg acgttagtaa ctgaacgtcc ctgacggtat ctaaccagaa agccacggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg 540
cgtaaagcga gcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600
agggtcattg gaaactggga gacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccatgtgtag 660
cggtgaaatg cgtagatata tggaggaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgta 720
actgacgctg aggctcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780
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caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cttttggagc cagccgcg 1438

Claims (9)

1.粪肠球菌（Enterococcus faecalis）PF95，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2020852。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）PF95。
3.一种豆粕发酵的接种剂，其特征在于：所述豆粕发酵的接种剂的活性成分为权利要求1所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）PF95或其发酵产物或其菌悬液或其培养液或其冻干菌粉，主要抑菌物质成分为有机酸，含量依次为乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。
4.根据权利要求3所述的豆粕发酵的接种剂，其特征在于：所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）PF95在豆粕中的接种量为1～20%，粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）PF95的添加方式为PF95发酵12～48小时的菌液与豆粕搅拌混匀，或者是P15发酵12～48小时后制备的的固态菌粉与豆粕搅拌混匀。
5.权利要求3所述的豆粕发酵的接种剂在豆粕发酵中的应用。
6.一种饲料添加剂，其特征在于：所述饲料添加剂的活性成分为权利要求1所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）PF95或其发酵产物或其菌悬液或其培养液，主要抑菌物质成分为有机酸，含量依次为乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。
7.权利要求6所述的饲料添加剂在母猪繁育和仔猪生长中的应用。
8.权利要求1所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）PF95或权利要求2所述的菌剂在如下任一中的应用：
（a1）抑制ETEC K88；
（a2）抑制细菌；
（a3）制备权利要求3所述的豆粕发酵的接种剂；
（a4）制备权利要求6所述的饲料添加剂；
在所述（a2），所述细菌具体为大肠杆菌（Escherichia coli）和/或肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica），和/或金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），和/或铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），和/或单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes），和/或藤黄微球菌（Micrococcus luteus），和/或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的粪肠球菌（Enterococcusfaecalis）PF95或所述菌剂对所述细菌的抑制为30～37℃条件下的抑制。
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