CN111979153B - 一株植物乳杆菌e-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株植物乳杆菌E‑1及其应用。本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)E‑1，保藏登记号为CGMCC No.19890。植物乳杆菌E‑1不耐热，耐酸、耐胆盐能力强。植物乳杆菌E‑1生长较快，繁殖量大，能迅速进入对数生长期。本发明还保护一种菌剂，包括植物乳杆菌E‑1。本发明还保护植物乳杆菌E‑1的发酵上清。本发明还保护植物乳杆菌E‑1、所述菌剂或所述发酵上清在制备细菌抑制剂中的应用，在制备饲料或饲料添加剂中的应用，作为饲料添加剂的应用。本发明具有良好的产业价值和推广价值。

Description

一株植物乳杆菌E-1及其应用

技术领域

本发明涉及一株植物乳杆菌E-1及其应用。

背景技术

我国是畜禽养殖大国，养殖量和畜产品数量均占世界前列，畜牧业产值超过3万亿元、吸纳农村就业人口超过2亿的基础性产业。畜牧业收入占农民纯收入60％以上，是国民经济的基础，是现代农业的重要组成部分。但当前养殖业面临疫病频发、饲料抗生素滥用和畜产品质量下降等问题困扰，每年养殖业用抗生素6.5万吨，占全国抗生素总用量的60％。抗生素的过度使用已成为耐药性和食品安全的严重问题，且细菌耐药性问题是我国最重大的公共卫生安全问题之一，也是全球性问题。由于耐药性细菌越来越多、新抗生素研发滞后，专家估计(O’Neill，2014，PNAS)，到2050年全球将有1000万人死于细菌耐药性问题，超过所有癌症导致死亡人数的总和，我国这个数据将超过300万。

2006年以来，欧盟、日本、韩国、美国等国家先后全面禁止抗生素在饲料中使用。我国农业农村部《遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)》明确要求，药物饲料添加剂将在2020年底全部退出。研究开发微生态制剂、抗菌肽等抗生素替代技术和产品，不仅是我国生物医药、生物兽药产业振兴的需求，还事关我国大国形象和国家经济与政治安全，意义十分重大。

发明内容

本发明的目的是提供一株植物乳杆菌E-1及其应用。

本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)E-1已于2020年05月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.19890。

植物乳杆菌E-1不耐热，耐酸、耐胆盐能力强。

植物乳杆菌E-1生长较快，繁殖量大，能迅速进入对数生长期(接种后培养5h)。

发酵温度、热处理以及添加特殊代谢因子等对植物乳杆菌E-1的稳定性无明显影响。

本发明还保护植物乳杆菌E-1作为益生菌的应用。

本发明还保护一种菌剂，包括植物乳杆菌E-1。

所述菌剂可为粉末菌剂，也可为颗粒菌剂，也可为其他形式的菌剂。

本发明还保护一种菌剂的制备方法(方法甲)，包括如下步骤：

(1)进行植物乳杆菌E-1的发酵；

(2)进行干燥，得到干物质，即为菌剂。

所述方法甲中，步骤(1)和步骤(2)之间还包括如下步骤：加入保护剂或包埋剂。

本发明还保护一种粉末菌剂的制备方法(方法乙)，依次包括如下步骤：

(1)进行植物乳杆菌E-1的发酵；

(2)加入保护剂；

(3)进行干燥，得到粉末状干物质，即为粉末菌剂。

粉末菌剂又称为菌粉。

所述步骤(2)具体可为：完成步骤(1)的发酵后，在体系中加入脱脂奶粉(使其在体系中的浓度为10g/100mL)、海藻糖(使其在体系中的浓度为1.5g/100mL)、甘油(使其在体系中的浓度为0.5g/100mL)和山梨醇(使其在体系中的浓度为2g/100mL)。

所述步骤(2)具体可为：完成步骤(1)的发酵后，在体系中加入大豆分离蛋白(使其在体系中的浓度为10g/100mL)、海藻糖(使其在体系中的浓度为5g/100mL)和山梨醇(使其在体系中的浓度为5g/100mL)。

所述粉末菌剂的含水率优选为4.5％-5.1％。

本发明还保护一种颗粒菌剂的制备方法(方法丙)，依次包括如下步骤：

(1)进行植物乳杆菌E-1的发酵；

(2)加入包埋剂；

(3)进行干燥，得到颗粒状干物质，即为颗粒菌剂。

所述步骤(2)具体可为：完成步骤(1)后，在体系中加入海藻酸钠(使其在体系中的浓度为10g/100mL)。

以上任一所述保护剂具体可由脱脂奶粉、海藻糖、甘油和山梨醇组成。保护剂中各组分的配比为：10质量份脱脂奶粉：1.5质量份海藻糖：0.5质量份甘油：2质量份山梨醇。保护剂中各组分的工作浓度为：脱脂奶粉10g/100mL、海藻糖1.5g/100mL、甘油0.5g/100mL、山梨醇2g/100mL。

以上任一所述保护剂具体可由大豆分离蛋白、海藻糖和山梨醇组成。保护剂中各组分的配比为：10质量份大豆分离蛋白：5质量份海藻糖：5质量份山梨醇。保护剂中各组分的工作浓度为：大豆分离蛋白10g/100mL、海藻糖5g/100mL、山梨醇5g/100mL。

以上任一所述包埋剂为海藻酸钠。所述包埋剂的工作浓度为10g/100mL。

以上任一所述干燥的方法为低温真空干燥。

低温真空干燥的参数具体可为：42℃，极限真空度600pa。

低温真空干燥的时间具体可为：10-12小时。

应用中，所述菌剂优选采用真空包装。

应用中，所述菌剂低温(例如4℃)储存或室温储存。

以上任一所述进行植物乳杆菌E-1的发酵具体包括如下步骤：

(1)挑取植物乳杆菌E-1单菌落，接种至200mL发酵培养基，37℃静置培养14-16h；

(2)取步骤(1)得到的菌液，以1％接种量接种至装有1.5L发酵培养基的种子罐，培养12小时；培养条件：温度控制为36℃-37℃，pH控制为6.4-6.6，通气量为0.5m³/h，搅拌速度为80r/min；

(3)取步骤(2)得到的菌液，以1％接种量接种至装有15L发酵培养基的发酵罐，发酵10-14小时；发酵条件：温度控制为36℃-37℃，pH控制为6.4-6.6，通气量为0.5m³/h，搅拌速度为80r/min。

示例性的，可以采用如下发酵培养基：蔗糖20g/L、酵母浸粉10g/L、蛋白胨12g/L、NaCl 2g/L、KOH 1.2g/L、NaH₂PO₄·H₂O 5g/L、MnSO₄ 0.02g/L、MgSO₄ 0.5g/L、吐温-801mL/L，余量为水。

本发明还保护以上任一所述方法制备得到的菌剂。

以上任一所述菌剂中，植物乳杆菌E-1的含量为10⁹-10¹²cfu/g。

本发明还保护植物乳杆菌E-1的发酵上清。示例性的，所述发酵上清的制备方法如下：将植物乳杆菌E-1接种至pH6.8的MRS液体培养基，37℃静置培养24h，然后离心，收集上清液，即为发酵上清。

本发明还保护植物乳杆菌E-1、以上任一所述菌剂或以上任一所述发酵上清在制备细菌抑制剂中的应用。所述细菌为革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为大肠杆菌或沙门氏菌或志贺氏菌。沙门氏菌具体可为鸡白痢沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌。

本发明还保护植物乳杆菌E-1、以上任一所述菌剂或以上任一所述发酵上清在制备饲料或饲料添加剂中的应用。

本发明还保护植物乳杆菌E-1、以上任一所述菌剂或以上任一所述发酵上清作为饲料添加剂的应用。

本发明还保护植物乳杆菌E-1在制备抗菌肽中的应用。所述应用中，植物乳杆菌E-1作为受体菌，通过在受体菌中导入抗菌肽基因并表达，得到抗菌肽。

本发明提供的植物乳杆菌E-1具有良好的性能，可用于制备细菌抑制剂、饲料添加剂和抗菌肽等多种用途。本发明具有良好的产业价值和推广价值。

附图说明

图1为实施例4中植物乳杆菌E-1的生长曲线。

图2为实施例5中植物乳杆菌E-1表达的抗菌肽Microcin V的抑菌效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，实施例中的定量试验均设置3个以上重复处理，结果取平均值。大豆蛋白：购自德州大王集团有限公司。阿拉伯树胶：购自西安浩天生物工程有限公司。维生素C钠盐：购自广州市江顺化工科技有限公司，货号HS000491-500g。

实施例1、菌株的分离、鉴定和保藏

一、菌株E-1的分离纯化

取1g样品(青贮饲料样品)于装有9mL无菌生理盐水的试管中，涡漩震荡混匀，然后进行十倍递增稀释，选择3个适宜梯度的稀释液各100μL涂布于MRS琼脂培养基，37℃厌氧培养48-72h，观察并记录菌落形态，挑取长势良好的特征单菌落于MRS液体培养基中，进行划线分离纯化，添加保护剂后-80℃保存。

获得大量纯培养的菌株，其中一株菌具有良好的性能，将该株菌命名为菌株E-1。

二、菌株E-1的鉴定

形态特征：在MRS琼脂培养基平板上的生长状态良好，菌落呈乳白色或淡黄色，边缘规则，表面湿润且光滑，有光泽，不透明，菌落直径在1.0-2.0mm之间；革兰氏染色阳性，无鞭毛。

生理生化鉴定的结果见表1。

表1 菌株的理化鉴定结果

生理生化指标	反应特征	生理生化指标	反应特征
				氢化酶反应	-	明胶液化检验	-
酶触反应	-	H<sub>2</sub>S检验	-
				MR检验	-	VP检验	+
鼠李糖	--	水杨苷	+
				菊糖	+	七叶苷	+
纤维二糖	+	麦芽糖	+
				甘露糖	+	棉籽糖	+
甘露醇	+	蔗糖	+
				山梨醇1	+	乳糖	+

分子鉴定：16SrDNA如序列表的序列1所示。

根据上述鉴定结果，菌株E-1属于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，因此又称为植物乳杆菌E-1。

三、菌株E-1的保藏

植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)E-1已于2020年05月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.19890。

实施例2、发酵参数的优化

发酵培养基：蔗糖20g/L、酵母浸粉10g/L、蛋白胨12g/L、NaCl 2g/L、KOH 1.2g/L、NaH₂PO₄·H₂O 5g/L、MnSO₄ 0.02g/L、MgSO₄ 0.5g/L、吐温-80 1mL/L，余量为水。

一、发酵pH的优化

1、挑取植物乳杆菌E-1单菌落，接种至200mL发酵培养基，37℃静置培养14-16h。

2、取步骤1得到的菌液，以1％接种量接种至装有1.5L发酵培养基的3L容量种子罐，培养12小时。

培养条件：36℃-37℃，通气量为0.5m³/h(微通气，目的是维持罐压)，搅拌速度为80r/min。

3、取步骤2得到的菌液，以1％接种量接种至装有15L发酵培养基的20L容量发酵罐，发酵14h小时。

发酵条件：36℃-37℃，通气量为0.5m³/h(微通气，目的是维持罐压)，搅拌速度为80r/min。

步骤2的培养和步骤3的发酵采用相同的pH值。

分别设置三种pH值：pH5.5或pH6.0或pH6.5。

4、完成步骤3后，取整个发酵体系，进行低温真空干燥(42℃，12h，极限真空度600pa)，得到粉状干物质，即为菌粉。

5、取步骤4得到的菌粉，转移至37℃、RH＝75％环境中放置，分别于第1天、第3天、第6天、第9天、第12天和第15天，检测活菌浓度(cfu/g)。

采用pH5.5时的结果见表2。采用pH6.0时的结果见表3。采用pH6.5时的结果见表4。采用pH6.5进行培养和发酵，发酵产物的稳定性最好。

表2 37℃，RH＝75％加速实验结果(pH＝5.5)

表3 37℃，RH＝75％加速实验结果(pH＝6.0)

表4 37℃，RH＝75％加速实验结果(pH＝6.5)

二、发酵方法的建立

1、挑取植物乳杆菌E-1单菌落，接种至200mL发酵培养基，37℃静置培养14-16h。

2、取步骤1得到的菌液，以1％接种量接种至装有1.5L发酵培养基的3L容量种子罐，培养12小时。

培养条件：温度控制为36℃-37℃，pH控制为6.4-6.6，通气量为0.5m³/h(微通气，目的是维持罐压)，搅拌速度为80r/min。

3、取步骤2得到的菌液，以1％接种量接种至装有15L发酵培养基的20L容量发酵罐，发酵10-14小时。

发酵条件：温度控制为36℃-37℃，pH控制为6.4-6.6，通气量为0.5m³/h(微通气，目的是维持罐压)，搅拌速度为80r/min。

实施例3、后处理工艺

一、菌粉制剂的后处理工艺

1、不同干燥方法对稳定性的影响

(1)按照实施例2的步骤二的方法进行发酵(发酵时间为14小时)。

(2)加入保护剂。

完成步骤(1)的发酵后，在体系中加入脱脂奶粉(使其在体系中的浓度为10g/100mL)、海藻糖(使其在体系中的浓度为1.5g/100mL)、甘油(使其在体系中的浓度为0.5g/100mL)和山梨醇(使其在体系中的浓度为2g/100mL)。

(3)完成步骤(2)后，取整个体系，进行干燥，得到粉状干物质，即为菌粉。

分别采用三种干燥方法：冷冻干燥、低温真空干燥、喷雾干燥。

每种干燥方法设置5个重复处理，结果取平均值。

冷冻真空干燥：预冻温度70℃，预冻时间2h。

低温真空干燥：42℃，12h，极限真空度600pa。

喷雾干燥：进风110℃，排风60℃。

冷冻真空干燥后得到的菌粉的水分含量为5％。

低温真空干燥后得到的菌粉的水分含量为5％。

喷雾干燥后得到的菌粉的水分含量为5.5％。

(4)将步骤(3)得到的菌粉转移至37℃、RH＝75％环境中放置，分别于第1天、第3天、第6天、第12天和第15天，检测活菌浓度(cfu/g)。

结果见表5、表6和表7。喷雾干燥效果最差，不考虑。冷冻真空干燥和低温真空干燥效果相差不大，综合考虑稳定性和成本，选择低温真空干燥。

表5 冷冻真空干燥后得到的菌粉(37℃RH＝75％加速实验)

表6 低温真空干燥后得到的菌粉(37℃RH＝75％加速实验)

表7 喷雾干燥后得到的菌粉(37℃RH＝75％加速实验)

2、保护剂的筛选

(1)第一个批次的试验

①按照实施例2的步骤二的方法进行发酵(发酵时间为14小时)。

②加入保护剂(见表8的第一列，％均代表在体系中的浓度、含义为g/100ml)。

③完成步骤②后，取整个体系，进行低温真空干燥。

低温真空干燥：42℃，12h，极限真空度600pa。

④将进行干燥后得到的菌粉转移至37℃、RH＝75％环境中放置，分别于第1天、第8天、第12天、第15天，检测活菌浓度(cfu/g)。

结果见表8。

表8 不同保护剂配方对稳定性的影响(37℃，RH＝75％加速实验结果)

(2)第二个批次的试验

①按照实施例2的步骤二的方法进行发酵(发酵时间为14小时)。

②加入保护剂(见表9的第一列，％均代表在体系中的浓度、含义为g/100ml)。

③完成步骤②后，取整个体系，进行低温真空干燥。

低温真空干燥：42℃，12h，极限真空度600pa。

④将进行干燥后得到的菌粉转移至37℃、RH＝75％环境中放置，分别于第1天、第5天、第15天，检测活菌浓度(cfu/g)。

结果见表9。

表9 不同保护剂配方对稳定性的影响(37℃，RH＝75％加速实验结果)

表8和表9的结果表明，“10％大豆分离蛋白、5％海藻糖、5％山梨醇”为最佳保护剂组合。

3、含水量对稳定性的影响

(1)按照实施例2的步骤二的方法进行发酵(发酵时间为12小时)。

(2)加入保护剂(步骤2确定的最佳保护剂组合)。

(3)完成步骤(2)后，取整个体系，进行低温真空干燥。

低温真空干燥：42℃，极限真空度600pa。

设置不同的低温真空干燥时间。时间分别为：6小时、8小时、10小时或12小时。

时间为6小时后得到的菌粉的水分含量为10.1％。

时间为8小时后得到的菌粉的水分含量为8.6％。

时间为10小时后得到的菌粉的水分含量为5.1％。

时间为12小时后得到的菌粉的水分含量为4.5％。

(4)将进行干燥后得到的菌粉转移至37℃、RH＝75％环境中放置，分别于第1天、第7天、第14天和第21天，检测活菌浓度(cfu/g)。

结果见表10。干燥时间越长，含水量越低，稳定性越好。即样品含水率在4.5％-5.1％范围内样品的储存稳定性最好。

表10 不同样品含水量对稳定性的影响(37℃RH＝75％加速实验)

4、包装方式对温度的影响

(1)按照实施例2的步骤二的方法进行发酵(设置两种发酵时间，分别为8小时和12小时)。

(2)完成步骤(1)后，取整个体系，进行低温真空干燥。

低温真空干燥：42℃，12h，极限真空度600pa。

(3)将进行干燥后得到的菌粉分成两组，一组装入自封袋中，一组采用真空包装。

(4)完成步骤(3)后，转移至37℃、RH＝75％环境中放置，分别于第0天、第7天、第12天、第20天和第25天，检测活菌浓度(cfu/g)。

结果见表11和表12。不管菌粉的活菌数为20亿还是100亿，在自封袋方式下菌粉很快失活，在37℃RH＝75％加速实验条件下储存7天时存活率已不足10％。不管菌粉的活菌数为20亿还是100亿，在真空包装方式下，在37℃RH＝75％加速实验条件下储存12天存活率仍有70％以上。

表11 包装方式对稳定性的影响(发酵8小时，活菌数约20亿，37℃RH＝75％加速实验)

表12 包装方式对稳定性的影响(发酵12小时，活菌数约100亿，37℃RH＝75％加速实验)

5、后处理方法的建立

(1)按照实施例2的步骤二的方法进行发酵(发酵时间为14小时)。

(2)加入保护剂(步骤2确定的最佳保护剂组合)。

(3)完成步骤(2)后，取整个体系，进行低温真空干燥。

低温真空干燥：42℃，12h，极限真空度600pa。

(4)将进行干燥后得到的菌粉采用真空包装。

(5)完成步骤(4)后，分为两组，一组置于4℃储存，一组室温储存。

分别于储存的不同时间取样，检测活菌浓度(cfu/g)。

4℃储存1年存活率在90％以上，室温储存6个月存活率在30％以上。

室温储存6个月过程中活菌数和存活率的结果见表13。

表13 常温试验稳定性结果

二、颗粒菌剂的后处理工艺

1、按照实施例2的步骤二的方法进行发酵(发酵时间为14小时)。

2、加入包埋剂。

完成步骤1的发酵后，在体系中加入海藻酸钠(使其在体系中的浓度为10g/100mL)。

3、完成步骤2后，取整个体系，进行低温真空干燥，得到颗粒状干物质，即为颗粒菌剂。

低温真空干燥参数：42℃，12h，极限真空度600pa。

4、完成步骤1的发酵后，取整个体系，进行低温真空干燥，得到粉末状干物质，即为菌粉。

低温真空干燥参数：42℃，12h，极限真空度600pa。

5、将步骤3得到的颗粒菌剂或步骤4得到的菌粉转移至37℃、RH＝75％环境中放置，分别于第1天、第5天、第10天、第15天和第20天，检测活菌浓度(cfu/g)。

结果见表14。经海藻酸钠包被后，颗粒菌剂的稳定性明显提高，在37℃RH＝75％加速实验条件下，放置10天存活率超过65％(菌粉的存活率仅为10％左右)，放置20天存活率为25.34％(菌粉的存活率低于2％)。

表14 稳定性比较(37℃RH＝75％加速实验)

实施例4、植物乳杆菌E-1的益生特性

供试菌株：植物乳杆菌E-1。

平板稀释法检测菌浓度：采用MRS固体培养基，37℃静置培养24h。

一、耐受性

1、耐热试验

菌株活化：供试菌株从-70℃冰箱取出，划线接种至MRS固体培养基并静置培养1天，然后挑取单菌落接种至5mL MRS液体培养基并培养过夜。

菌株活化后，取菌液，按照2％的接种量接种至50mL pH6.5的MRS液体培养基，然后取样多个样本(每个样本1mL)，分别至2mL EP管中，将装有样本的EP管置于水浴锅内放置10min(水浴锅温度分别为：60℃、70℃或80℃)，然后采用平板稀释法检测各个处理后样本的菌浓度以及处理前样本的菌浓度。

结果见表15。

表15 耐热试验结果

	活菌数(cfu/mL)
		处理前样本	3.30×10<sup>7</sup>
60℃处理10min后样本	4.40×10<sup>5</sup>
		70℃处理10min后样本	6.20×10<sup>4</sup>
80℃处理10min后样本	4.00×10<sup>4</sup>

2、耐酸试验

菌株活化：供试菌株从-70℃冰箱取出，划线接种至MRS固体培养基并静置培养1天，然后挑取单菌落接种至5mL MRS液体培养基并培养过夜。

菌株活化后，取菌液，按照2％的接种量接种至50mL pH3.0的MRS液体培养基，37℃静置培养，分别于0h、1h、2h、3h后，采用平板稀释法检测菌浓度。

结果见表16。

表16 耐酸试验结果

处理时间	活菌数(cfu/mL)
		0h	5.00×10<sup>6</sup>
1h	4.10×10<sup>6</sup>
		2h	4.50×10<sup>6</sup>
3h	4.60×10<sup>6</sup>

3、耐胆盐试验

菌株活化：供试菌株从-70℃冰箱取出，划线接种至MRS固体培养基并静置培养1天，然后挑取单菌落接种至5mL MRS液体培养基并培养过夜。

菌株活化后，取菌液，按照2％的接种量接种至50mL含胆盐的pH 6.5的MRS液体培养基，37℃静置培养，分别于0h、1h、2h、3h后，采用平板稀释法检测菌浓度。胆盐浓度分别设置为0.2g/100ml或0.3g/100ml。设置不含有胆盐的对照。

结果见表17。

表17 耐胆盐试验结果

表15至表17的结果表明：植物乳杆菌E-1不耐热，耐酸、耐胆盐能力强。

二、生长曲线的测定

菌株活化：供试菌株从-70℃冰箱取出，划线接种至MRS固体培养基并静置培养1天，然后挑取单菌落接种至5mL MRS液体培养基并培养过夜。

菌株活化后，取菌液，按照2％的接种量接种至3mL pH 6.5的MRS液体培养基，37℃静置培养。每隔1小时取样测定OD_600nm值，共18个取样点，每个点3个平行，取平均值，绘制生长曲线。

生长曲线见图1(纵坐标为OD_600nm值)。植物乳杆菌E-1生长较快，繁殖量大，在37℃培养时能迅速(接种后5h)进入对数生长期。

三、对病原菌的抑制作用

指示菌：大肠杆菌K88和鸡白痢沙门氏菌CVCC1791。指示菌分别配成0.5麦氏浊度菌液，然后采用无菌水进行稀释，得到菌浓度为5×10⁸CFU/mL的指示菌菌液。CVCC：中国兽医微生物菌种保藏管理中心(http://cvcc.ivdc.org.cn/)。。

菌株活化：供试菌株从-70℃冰箱取出，划线接种至MRS固体培养基并静置培养1天，然后挑取单菌落接种至5mL MRS液体培养基并培养过夜。

取活化后菌株的菌液，按照2％的接种量接种至50mL pH6.8的MRS液体培养基，37℃静置培养24h，然后离心，收集上清液，即为发酵上清。

吸取1mL指示菌菌液于平板内，并倾注经融化后的营养琼脂。待营养琼脂凝固后，用移液枪点样150μL发酵上清，37℃静置培养24h后取出，根据抑菌圈直径大小来评价抑菌效果。

结果见表18。植物乳杆菌E-1的发酵上清液对大肠杆菌和沙门氏菌均产生了明显抑菌效果。

表18 植物乳杆菌E-1发酵上清液对致病菌的抑菌效果

指示菌	抑菌圈直径(mm)
		大肠杆菌	13.14
鸡白痢沙门氏菌	11.76

综上所述，本发明的植物乳杆菌E-1具有耐酸、耐胆盐、生长快速等特性，同时还能明显抑制致病菌大肠杆菌和沙门氏菌的生长，其发酵菌剂可作为微生态制剂添加于畜禽饲料中，有效减少甚至替代饲用抗生素的使用。

实施例5、植物乳杆菌E-1在表达抗菌肽Microcin V上的应用

抗菌肽Microcin V具有显著的抑制/杀灭革兰氏阴性菌能力，是优良的抗生素替代品。

一、制备重组菌

以植物乳杆菌E-1为表达菌株，以Cre-LoxP+天然质粒的复制序列作为表达系统，在2.5％(m/v)甘氨酸+5μg/ml氨苄青霉素条件下将重组质粒转化进植物乳杆菌E-1中。

二、制备发酵液

将重组菌按照1％的接种量接种至50mL pH 6.8的MRS液体培养基，37℃培养24h，然后离心，收集上清液，即为发酵上清。

以大肠杆菌K88为指示菌，进行抑菌圈试验。根据抑菌圈直径大小评价抑菌效果。结果见图2。图2中，Control为抗生素对照组；1-5为5个不同发酵瓶得到的发酵上清液，即5个重复。植物乳杆菌E-1成功表达出了抗菌肽Microcin V，其发酵上清对大肠杆菌具有明显的抑制效果，其抑菌圈比抗生素对照组还大。抑菌圈直径为16.5-17mm。

三、制备抗菌肽Microcin V产品

将发酵上清进行提纯干燥，得到抗菌肽Microcin V产品。

提纯干燥步骤如下：完成发酵后，将发酵体系在12000rpm下连续离心2次，收集上清液，经冷冻干燥得到抗菌肽Microcin V粗品，然后采用高效液相色谱法(HPLC)测定粗品中抗菌肽Microcin V的含量，后续以抗菌肽粗品进行最小抑菌浓度测定，抗菌谱结果换算为纯品的数据。

以常见革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌菌株为指示菌。其中，4株革兰氏阴性菌标准菌株，分别为：大肠杆菌K99、鸡白痢沙门氏菌CVCC1791、鼠伤寒沙门氏菌2018，志贺氏菌CMCC51571。其中，2株革兰氏阳性菌，分别为：金黄色葡萄球菌ATCC25923、产芽胞梭状芽胞杆菌64941。此外，还有2株益生菌的标准菌株，分别为：枯草芽孢杆菌MA139和蜡状芽孢杆菌。

按微量肉汤稀释法进行最小抑菌浓度测定，测定其抗菌谱。

测定方法步骤如下：首先将抗菌肽Microncin V用无菌Mill-Q水等倍稀释，然后将灭菌的MH肉汤培养基吸取180μL放入无菌96孔板中，再将20μL各浓度抗菌肽Microncin V打入96孔板中。将标准菌株和临床菌株分别培养至对数期、离心、洗涤、稀释和重悬，然后用微量移液枪将细菌转移至96孔板中，细菌终浓度为5×10⁶CFU/mL，并设单有菌悬液和PBS的孔作为对照。将96孔板在37℃水浴摇床中以200rpm/min隔夜培养，次日进行观察，96孔板中无肉眼可见细菌沉淀的最小浓度即为Microncin V的MIC。

结果见表19(表中数据为换算为纯品的MIC)。由表19可知，重组菌表达的抗菌肽Microcin V对革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌具有很低的MIC(0.03-0.25μg/mL)，表明其对大肠杆菌和沙门氏菌等革兰氏阴性菌具有很强的抑菌抑杀能力。此外，根据结果可知，重组菌表达的抗菌肽Microcin V对革兰氏阳性菌和益生菌无杀伤作用。

表19 抗菌肽Microncin V对标准菌株的MIC

菌株	MIC(μg/mL)
		革兰氏阴性菌
大肠杆菌K99	0.03
		鸡白痢沙门氏菌CVCC1791	0.03
鼠伤寒沙门氏菌2018	0.25
		志贺氏菌CMCC51571	0.125
革兰氏阳性菌
		金黄色葡萄球菌ATCC25923	NT
产芽胞梭状芽胞杆菌64941	NT
		益生菌
枯草芽孢杆菌MA139	NT
		蜡状芽孢杆菌	NT

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京中农创研生物科技有限公司

<120> 一株植物乳杆菌E-1及其应用

<130> GNCYX201685

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1380

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 1

gggcggtgtg tatgcaaggc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcaggattac 60

tagcgattcc gacttcatgt aggcgagttg gcctacaatc cgaactgaga atggctttaa 120

gagattagct tactctcgcg agttcgcaac tcgttgtacc atccattgta gcacgtgtgt 180

agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc cggtttgtca 240

ccggcagtct caccagagtg cccaacttaa tgctggcaac tgataataag ggttgcgctc 300

gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg caccacctgt 360

atccatgtcc ccgaagggaa cgtctaatct cttagatttg catagtatgt caagacctgg 420

taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 480

tcaattcctt tgagtttcag ccttgcggcc gtactcccca ggcggaatgc ttaatgcgtt 540

agctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc attcatcgtt tacggtatgg 600

actaccaggg tatctaatcc tgtttgctac ccatactttc gagcctcagc gtcagttaca 660

gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt tcaccgctac 720

acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc agtttccgat gcacttcttc 780

ggttgagccg aaggctttca catcagactt aaaaaaccgc ctgcgctcgc tttacgccca 840

ataaatccgg acaacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac gtagttagcc 900

gtggctttct ggttaaatac cgtcaatacc tgaacagtta ctctcagata tgttcttctt 960

taacaacaga gttttacgag ccgaaaccct tcttcactca cgcggcgttg ctccatcaga 1020

ctttcgtcca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtttg ggccgtgtct 1080

cagtcccaat gtggccgatt accctctcag gtcggctacg tatcattgcc atggtgagcc 1140

gttaccccac catctagcta atacgccgcg ggaccatcca aaagtgatag ccgaagccat 1200

ctttcaagct cggaccatgc ggtccaagtt gttatgcggt attagcatct gtttccaggt 1260

gttatccccc gcttctgggc aggtttccca cgtgttactc accagttcgc cactcagtca 1320

aatgtaaatc atgatgcaag caccaatcaa agctaccaga gttcgttcga ctgcatcgaa 1380

Claims (10)

1.植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）E-1，其保藏登记号为CGMCC No.19890。

2.权利要求1所述植物乳杆菌作为益生菌的应用。

3.一种菌剂，包括权利要求1所述植物乳杆菌。

4.一种菌剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）进行权利要求1所述植物乳杆菌的发酵；

（2）进行干燥，得到干物质，即为菌剂。

5.一种粉末菌剂的制备方法，依次包括如下步骤：

（1）进行权利要求书1所述植物乳杆菌的发酵；

（2）加入保护剂；

（3）进行干燥，得到粉末状干物质，即为粉末菌剂；

所述保护剂由大豆分离蛋白、海藻糖和山梨醇组成；保护剂中各组分的配比为：10质量份大豆分离蛋白：5质量份海藻糖：5质量份山梨醇；

或者，所述保护剂由脱脂奶粉、海藻糖、甘油和山梨醇组成；保护剂中各组分的配比为：10质量份脱脂奶粉：1.5质量份海藻糖：0.5质量份甘油：2质量份山梨醇。

6.一种颗粒菌剂的制备方法，依次包括如下步骤：

（1）进行权利要求1所述植物乳杆菌的发酵；

（2）加入包埋剂；

（3）进行干燥，得到颗粒状干物质，即为颗粒菌剂；

所述包埋剂为海藻酸钠。

7.权利要求4或5或6所述方法制备得到的菌剂。

8.权利要求1所述植物乳杆菌的发酵上清。

9.权利要求1所述植物乳杆菌或权利要求3所述菌剂或权利要求7所述菌剂或权利要求8所述发酵上清的应用，为如下（a）、（b）或（c）：

（a）在制备细菌抑制剂中的应用；

（b）在制备饲料或饲料添加剂中的应用；

（c）作为饲料添加剂的应用。

10.权利要求1所述植物乳杆菌在制备抗菌肽中的应用。

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