CN111996139B

CN111996139B - 一种提高肉犊牛生产效益的复合微生态制剂及应用

Info

Publication number: CN111996139B
Application number: CN202010823853.0A
Authority: CN
Inventors: 石德时; 杨书敏; 肖运才; 罗吉; 周进; 郭爱珍; 王喜亮; 周祖涛; 李筱雯
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-08-17
Filing date: 2020-08-17
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2040-08-17
Also published as: CN111996139A

Abstract

本发明属于农业微生物应用技术领域。具体涉及一种提高肉犊牛生产效益的复合微生态制剂及应用。本发明与兽用微生物添加剂领域相关。分离得到一株可降解反刍动物粗饲料中纤维素和木质素活性强的副地衣芽胞杆菌SN‑6菌株(保藏号为CCTCC NO：M2020136)和另一株降解纤维素、淀粉、蛋白质活性强的解淀粉芽胞杆菌SN‑C(保藏号为CCTCC NO：M2020137)菌株。这两株菌株具有生长速度快、抗逆性强和安全性高的特点，将两株菌复合制成的微生态制剂能极显著促进肉牛生长，可作为畜禽饲用微生态添加剂。

Description

一种提高肉犊牛生产效益的复合微生态制剂及应用

技术领域

本发明属于农业微生物应用技术领域，具体涉及一种提高肉犊牛生产效益的复合微生态制剂及应用。本发明与兽用微生态制剂制备技术领域相关，与益生素添加剂领域有关，对肉牛有显著促生长效用的芽胞杆菌(Bacillus)菌株的分离鉴定，产酶(纤维素酶、木质素酶、淀粉酶、蛋白酶)活性评估，安全性评价，益生性能鉴定，微生态制剂制备及作为肉犊牛饲料添加剂促生长的效果的验证。本发明的制剂由副地衣芽胞杆菌(Bacillusparalicheniformis) 菌株与解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株复合而成。

背景技术

全球碳循环的一个关键步骤是水解植物细胞壁中的纤维素，纤维素是陆地上最丰富的碳源(Malhi 2003，David 2011)，但是目前其开发利用率很低，且主要用于燃料、畜牧积肥，对环境造成一定的污染。微生物能够水解纤维素生成还原糖(纤维二糖、葡萄糖等)(Vu 2012)，可提高饲料利用率，降低饲料成本，提高畜禽生产力，具有广阔的开发前景。

瘤胃是反刍动物特有的消化器官，Hungate第一个发起了对瘤胃微生物系统的系统性研究，被誉为瘤胃微生物学之父(Hungate 1966)。牛瘤胃的主要细菌包括纤维素分解菌、半纤维素分解菌及淀粉分解菌等(焦万洪2016)。反刍动物日粮以含纤维素、木质素高的粗饲料为主，同时采食富含蛋白、淀粉的精饲料。反刍动物瘤胃微生物能分解植物细胞壁中的部分纤维素供自身繁殖，同时产生大量短链脂肪酸供宿主利用，当其到达宿主消化道后段时，又成为宿主主要的蛋白质营养来源。McBee等研究显示反刍动物80％以上的纤维素消化依靠瘤胃内的微生物，且饲用微生物能够提高纤维利用率(McBee 1971)。

有益微生物可在动物体内分泌产生多种消化酶，例如，芽胞杆菌能产生分解淀粉、蛋白质、脂肪、糖类等的消化酶，促进动物营养物质的消化吸收，进而提高养分表观消化率(Paul 1996)。Sun等报道，饲喂枯草芽胞杆菌后，荷斯坦奶牛瘤胃中饲料的消化作用提高，显著提高了犊牛断奶前的日增重(Sun 2010)。符运勤等研究发现，将地衣芽胞杆菌及其复合制剂添加到后备牛日粮中，饲料利用率提高，显著提高了肉牛的生长性能(符运勤2012)。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，针对粗饲料中木质素、纤维素不易被降解的技术壁垒，以及肉牛日粮中能量饲料利用不充分的现状，分离筛选出两株安全的益生菌株，其中一株为降解木质素、纤维素能力强的菌株副地衣芽胞杆菌；另一株为降解纤维素能力强且能显著降解蛋白质的菌株解淀粉芽胞杆菌。本发明将降解纤维素/木质素能力强的菌株副地衣芽胞杆菌与降解纤维素/蛋白质能力强的菌株解淀粉芽胞杆菌以合适比例复合，以不同菌株优势的叠加和互补，提高了肉牛对饲料的利用率。

本发明从水牛瘤胃分离筛选得到一株降解纤维素/木质素能力强的副地衣芽胞杆菌 (Bacillus paralicheniformis)SN-6，将所述的菌株命名为副地衣芽胞杆菌SN-6，Bacillus paralicheniformis SN-6，于2020年5月21日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2020136。本发明同时筛选得到另一株降解纤维素/蛋白能力强的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SN-C，申请人将所述的菌株命名为解淀粉芽胞杆菌SN-C，Bacillus amyloliquefaciens SN-C，于2020年5月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO： M2020137。本发明以提高粗饲料利用率为出发点，将上述筛选的副地衣芽胞杆菌SN-6菌株和解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株复配，研制成能提高肉犊牛生产效益的复合型微生态制剂。

本发明对筛选得到的副地衣芽胞杆菌SN-6菌株和解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株及其制剂的相关产酶特性(例如纤维素酶、木质素酶、淀粉酶和蛋白酶活性)、安全性、益生特性以及作为肉牛饲料添加剂促生长的效果进行了相关研究。

本发明的技术方案如下：

根据筛选目标和益生菌产酶性能为筛选标准，从抗粗饲强的水牛的瘤胃中，分离筛选得到一株副地衣芽胞杆菌(Bacillus paralicheniformis)，发明人将该菌株命名为SN-6；和另一株解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SN-C。复配了一种提高肉牛生产效益的复合微生态制剂，所述的复合微生态制剂包含有副地衣芽胞杆菌SN-6菌剂和解淀粉芽胞杆菌SN-C 菌剂。

副地衣芽胞杆菌(Bacillus paralicheniformis)SN-6的菌学特性：

副地衣芽胞杆菌(Bacillus paralicheniformis)SN-6菌株，为革兰氏阳性菌，呈单、双或链状排列的短杆菌，能形成芽胞。在以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源平板上长成白色、光滑、周边整齐、直径5mm左右的菌落(见图1A)，经刚果红染色，菌落周围产生淡黄色水解圈(见图1B)。在以木质素磺酸钠为唯一碳源的平板上点种，可长成直径3cm左右的白色菌苔(见图2)。在马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar，PDA)-愈创木酚上生长，菌落周围产生红棕色氧化圈(见图3)。将其16S rRNA基因进行克隆测序，结果在NCBI进行Blast比较，发现其16S rRNA基因序列与副地衣芽胞杆菌(MK517555.1)的序列同源性最高，为99.65％。

副地衣芽胞杆菌SN-6菌株繁殖能力较强，0-4h处于迟缓期，4h后进入对数生长期，持续到9h后进入稳定期。该菌株产芽胞，具有很好的稳定性；该菌株耐受人工胃液和肠液，在 pH为3的人工胃液孵育3h，存活率为36.36％；在中性的人工肠液孵育4h，存活率为54.29％。表明菌株具有良好的耐受性，这有利于该菌株制备成微生态制剂及作为饲料添加剂应用于生产实际。

副地衣芽胞杆菌SN-6菌株在以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的平板上长出的菌落经刚果红染色，菌落周围产生淡黄色水解圈(见图1B)，说明该菌株能够水解纤维素、外分泌纤维素酶、提高纤维素利用率。在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)-愈创木酚上生长，菌落周围产生红棕色氧化圈(见图3)，提示该菌株产漆酶、可分解木质素，可进一步提高纤维素利用率。在含有1％可溶性淀粉的LB平板上生长，经革兰氏碘液染色，菌落周围形成白色褪色圈，说明该菌株产淀粉酶(见图7)，可提高能量物质淀粉的消化利用率。

副地衣芽胞杆菌SN-6菌株对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌K99具有明显的抑菌活性(见图9)。对常用兽药如青霉素、头胞氨苄、诺氟沙星、四环素、万古霉素、氯霉素、呋喃唑酮、复方新诺明敏感，而对头胞呋辛表现中度敏感；对苯唑西林表现耐药。用PCR方法检测毒力基因，发现该菌株不含相关毒力基因。小鼠饲喂试验，试验组小鼠与空白组相比未见异常。表明该菌株具有良好的安全性。

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SN-C的菌学特性：

解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SN-C菌株为革兰氏阳性，两端钝圆、短杆状，能形成芽胞。在以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源平板上长成白色、不透明、表面干燥有皱褶、边缘毛刺状、直径3-4mm的菌落，经刚果红染色，菌落周围产生淡黄色水解圈(见图5)。将其16S rRNA基因进行克隆测序，结果在NCBI进行Blast比较，确定为解淀粉芽胞杆菌。

解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株在含有1％可溶性淀粉的LB平板上生长，经革兰氏碘液染色，菌落周围形成白色褪色圈(见图7)，说明该菌株产淀粉酶，可提高能量物质淀粉的消化利用率。在以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为唯一碳源的平板上长出的菌落经刚果红染色，菌落周围产生淡黄色水解圈(见图5B)，说明该菌株外分泌纤维素酶，能够水解纤维素，提高纤维素利用率。

解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株对常用兽药青霉素类、头胞类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类抗生素均敏感，不存在散布耐药基因的问题。用PCR方法检测毒力基因，解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株仅扩增出毒力基因nheA和nheC(见图12A、图12B)。小鼠饲喂试验，试验组小鼠与空白组相比未见异常，证明该菌株虽具有毒力基因，但对小鼠无毒害作用，说明解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株是安全的。

申请人将本发明的SN-6菌株与SN-C菌株通过液体发酵方式制备成微生态制剂，根据不同菌株的稳定性、菌株与饲料之间混合的均匀度，以最优比例复配用作饲料添加剂，进行了肉牛饲养试验，证明对肉犊牛有明显的促进生长的作用，达到了预期的效果，从而完成了本发明的任务。本发明复合微生态制剂的配方：按活菌数计算，将副地衣芽胞杆菌SN-6与解淀粉芽胞杆菌SN-C以活菌数1:1的比例进行复配。

本发明的复合微生态制剂具有如下优点：

(1)将从耐粗饲的水牛瘤胃中分离所得降解纤维素、木质素能力强的菌株SN-6与降解纤维素能力强和降解蛋白质能力强的菌株SN-C复合，进行不同菌株优势的叠加和互补，对于提高肉牛日粮利用率效果更显著。

(2)对复配菌株用分子生物学的方法及小鼠饲喂试验进行了安全性淘选，因此安全性更高。 (3)动物试验证明，对肉犊牛具有明显的促生长作用。

更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。

附图说明

图1：本发明筛选的副地衣芽胞杆菌菌株SN-6在CMC-Na琼脂平板上的生长状态和刚果红染色后经生理盐水脱色后的结果。附图标记说明：图1A：副地衣芽胞杆菌菌株SN-6在CMC-Na 琼脂平板上的生长状态。图1B：刚果红染色后经生理盐水脱色后的结果，显示SN-6的菌落周围出现淡黄色水解圈。

图2：副地衣芽胞杆菌SN-6在木质素唯一碳源平板上的生长情况。

图3：副地衣芽胞杆菌SN-6在PDA-愈创木酚平板上的生长情况。

图4：副地衣芽胞杆菌SN-6革兰氏染色结果(×1000)。

图5：解淀粉芽胞杆菌SN-C在CMC-Na琼脂平板上的生长状态和刚果红染色，经生理盐水脱色后的结果。附图标记说明：图5A：解淀粉芽胞杆菌SN-C在CMC-Na琼脂平板上的生长状态。图5B：是刚果红染色，经生理盐水脱色后的结果，图中显示SN-C的菌落周围出现淡黄色水解圈。

图6：是本发明分离筛选的解淀粉芽胞杆菌SN-C革兰氏染色结果(×1000)。

图7：副地衣芽胞杆菌SN-6、解淀粉芽胞杆菌SN-C产淀粉酶检测结果。

图8：副地衣芽胞杆菌SN-6、解淀粉芽胞杆菌SN-C产蛋白酶检测结果。

图9：副地衣芽胞杆菌SN-6、解淀粉芽胞杆菌SN-C发酵液上清体外抑菌结果。附图标记说明：图9中6代表SN-6菌株；C代表SN-C菌株。从上到下分别是SN-6菌株、SN-C菌株对指示菌株大肠杆菌O157、O139、K88、K99，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌的抑制结果。

图10：毒力基因阳性菌株蜡样芽胞杆菌毒力因子PCR检测结果。附图标记说明：图10中各泳道：M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：nheA；泳道2：nheB；泳道3：nheC；泳道4：entFM；泳道5：阴性对照。

图11：副地衣芽胞杆菌SN-6毒力基因entFM、nheA、nheB和nheC PCR检测结果。附图标记说明：图11A：副地衣芽胞杆菌SN-6毒力基因nheA PCR检测结果。图中各泳道：M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：本实验室保存SN-20菌株；泳道2：本发明菌株SN-6；泳道3：本实验室保存SN-4菌株：泳道4：本实验室保存SN-3菌株；泳道5：阳性对照菌株；泳道6：阴性对照。图11B：副地衣芽胞杆菌SN-6毒力基因nheB PCR检测结果。图中各泳道：M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：本实验室保存SN-20菌株；泳道2：本发明菌株SN-6；泳道3：本实验室保存SN-4菌株：泳道4：本实验室保存SN-3菌株；泳道5：阳性对照菌株；泳道6：阴性对照。图11C：副地衣芽胞杆菌SN-6毒力基因nheC PCR检测结果。图中各泳道：M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：本实验室保存SN-20菌株；泳道2：本发明菌株SN-6；泳道3：本实验室保存SN-4菌株：泳道4：本实验室保存SN-3菌株；泳道 5：阳性对照菌株；泳道6：阴性对照。图11D：副地衣芽胞杆菌SN-6毒力基因entFM PCR 检测结果。图中各泳道：M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：本实验室保存SN-20菌株；泳道2：本发明菌株SN-6；泳道3：本实验室保存菌株SN-4：泳道4：本实验室保存SN-3 菌株；泳道5：阳性对照菌株；泳道6：阴性对照。

图12：解淀粉芽胞杆菌SN-C毒力基因nheA PCR检测结果和解淀粉芽胞杆菌SN-C毒力基因 nheC PCR检测结果。附图标记说明：图12A：解淀粉芽胞杆菌SN-C毒力基因nheA PCR检测结果。图中各泳道：M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：阳性对照菌株；泳道2：本发明菌株；泳道3：阴性对照。图12B：解淀粉芽胞杆菌SN-C毒力基因nheC PCR检测结果。图中各泳道：M:DL2000 DNA分子量标准；泳道1：阳性对照菌株；泳道2：本发明菌株；泳道3：阴性对照。

图13：是副地衣芽胞杆菌SN-6的生长曲线。

图14：是解淀粉芽胞杆菌SN-C的生长曲线。

具体实施方式

序列表SEQ ID NO：1是本发明的副地衣芽胞杆菌SN-6菌株和解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株的 16S rRNA基因部分序列。

实施例1：复合微生态制剂中的益生菌菌株的分离和鉴定

1.副地衣芽胞杆菌SN-6菌株的分离和鉴定

样品取自湖北省荆门市沙洋县湖北劲牛牧业有限公司的装有瘤胃瘘管的健康水牛，取瘤胃内容物经纱布过滤，收集滤液于厌氧袋，置于39℃车载小型恒温箱中。取1mL采集的样品进行10^-1-10^-6梯度稀释(100μL培养液加入900μL灭菌水中进行梯度稀释)，取10^-4、10^-5、 10^-6三个稀释度培养液涂布CMC-Na唯一碳源平板，平板置于39℃厌氧箱中培养3d后挑取单菌落，点样到CMC-Na唯一碳源平板，置于39℃厌氧箱中培养3d，随后用0.1％刚果红染色液染色10-15min，再用1.0mol/L NaCl溶液洗涤2次，观察是否产生淡黄色水解圈(张超2007)，挑取产生水解圈的菌株进行纯培养。将纯培养菌株接种在木质素磺酸钠唯一碳源平板、 PDA-愈创木酚平板进行依次筛选。该发明的菌株在CMC-Na为唯一碳源平板上长成白色、光滑、周边整齐、直径5mm左右的菌落，见图1A；经刚果红染色，菌落周围产生淡黄色水解圈，见图1B；在木质素磺酸钠为唯一碳源平板上长成直径3cm左右的白色菌落，见图2。在PDA-愈创木酚上生长，菌落周围产生红棕色氧化圈，见图3；革兰氏染色特性见图4。

在上述鉴定的基础上，进一步对该发明菌株进行16S rRNA基因序列检测，对菌株所属的种进行确证鉴定，具体如下：

(1)目标菌株基因组提取：

1)取1mL培养菌液，10000rpm离心30s，尽可能的吸弃上清，收集菌体。

2)加入200μL缓冲液RB重悬，10000rpm离心30s，弃上清。

3)加入120μL溶菌酶(20mg/mL in 10mM Tris-HCl，pH 8.0)颠倒混匀，37℃温育30-60min。 12000rpm离心2min，弃上清后吹打重悬于180μL缓冲液RB中。

4)加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，充分混匀，再加入200μL结合液CB，立即涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min。

5)冷却后加入100μL异丙醇，立即涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

6)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中) 13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。

7)加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。

8)加入700μL漂洗液WB(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉废液。

9)加入500μL漂洗液WB(已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，弃掉废液。

10)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

11)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL洗脱缓冲液EB (洗脱缓冲液事先在67-70℃水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。

12)DNA贮存于-20℃贮存备用。

(2)16S rRNA基因扩增：

用细菌通用引物扩增分离株16S rRNA序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物的DNA序列如下：

正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；

PCR扩增体系见表1。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃1min，50℃30s，72℃1.5min， 30个循环，72℃延伸10min。取PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳检测，扩增的片段大小与预期相符，约1500bp。

表1菌株PCR扩增体系

(3)构建细菌进化树确定种属：

提取的细菌基因组DNA送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在 NCBI上进行Blast，用MEGA7.0软件通过邻接法(Neighbor-Joining)构建细菌系统进化树，分析结果显示本发明分离的菌株SN-6为副地衣芽胞杆菌。

2.解淀粉芽胞杆菌SN-C菌株的分离、鉴定

样品取自湖北省荆门市沙洋县湖北劲牛牧业有限公司，装有瘤胃瘘管的健康水牛，取瘤胃内容物经纱布过滤，收集滤液于厌氧袋，置于39℃车载小型恒温箱。取1mL采集的样品进行10^-1-10^-6梯度稀释(100μL培养液加入900μL灭菌水中进行梯度稀释)，取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度培养液涂布CMC-Na唯一碳源平板，平板置于39℃厌氧箱中培养3d后挑取单菌落，点样到CMC-Na唯一碳源平板，置于39℃厌氧箱中培养3d，随后用0.1％刚果红染色液染色10-15min，再用1.0mol/L NaCl溶液洗涤2次，观察是否产生淡黄色水解圈(张超2007)，挑取产生水解圈的菌株进行纯培养。该发明的菌株在CMC-Na为唯一碳源平板上长成白色、不透明、表面干燥有皱褶、边缘毛刺状、直径3-4mm的菌落，见图5A；经刚果红染色，菌落周围产生淡黄色水解圈(见图5B)；革兰氏染色特性见图6。

在上述鉴定的基础上，进一步对该发明菌株进行16S rRNA基因序列检测，对菌株所属的种进行确证鉴定。

(1)目标菌株基因组提取：

1)分别取1mL分离株纯培养物，加入1.5mL EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mL TE(pH 8.0)中。

2)加入6μL 50mg/mL的溶菌酶，37℃作用2h。

3)再加2M NaCl 50μL，10％十二烷基硫酸钠(即SDS)110μL，20mg/mL的蛋白酶K 3μL， 50℃作用3h或37℃过夜。

4)将菌液均分到两个1.5mL EP管，加等体积的酚:氯仿:异戊醇(体积比为25:24:1)，混匀，室温放置5-10min；12000rpm离心10min；如此重复抽提两次。

5)加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10min。

6)用75％的乙醇洗涤沉淀。

7)风干后，溶于50μL ddH₂O中，加入1μL 10mg/mL RNase A，37℃消化2-3h。

8)取2-5μL电泳检测。贮存于-20℃备用，以下简称为“分离株基因组”。

(2)16S rRNA基因扩增：

正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；

PCR扩增体系见表2，扩增条件：95℃预变性5min，95℃50s，55℃35s，72℃1min， 30个循环，72℃延伸10min。取PCR扩增产物在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳检测，扩增的片段大小与预期相符，约1500bp。

表2菌株PCR扩增体系

(3)构建细菌进化树确定种属：

提取的细菌基因组DNA送去生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI上进行Blast，用MEGA7.0软件通过邻接法(Neighbor-Joining)构建细菌系统进化树，分析结果显示菌株SN-C为解淀粉芽胞杆菌。

实施例2：副地衣芽胞杆菌SN-6、解淀粉芽胞杆菌SN-C的益生特性检测

1.产酶试验

(1)产淀粉酶活性检测

将菌种点接在含有1％可溶性淀粉的LB平板上，放入37℃培养箱培养48h；向反应好的淀粉培养基中加入2mL碘液，轻旋至碘液均匀覆盖平板，静置10min，淀粉遇碘变蓝，若产生淀粉酶，菌落周围淀粉就会分解，碘液染色的蓝紫色平板上会出现褪色圈，染色结果如图 7所示，菌株产淀粉酶活性检测结果见表3。

表3菌株产淀粉酶检测结果

(2)产蛋白酶活性检测

将菌种点接在以牛奶作为唯一碳源的平板上，放入37℃培养箱培养48h。若产生蛋白酶，菌落周围蛋白就会分解，平板上会出现透明圈，结果如图8所示。菌株产蛋白酶活性检测结果见表4。

表4菌株产蛋白酶检测结果

2.抑菌活性试验

以大肠杆菌O157、O139、K88、K99，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌为指示菌，以本发明菌株的发酵液上清为抑菌剂，检测菌株的体外抑菌活性，具体操作如下：

1)指示菌悬液的准备：指示菌菌种平板划线，36℃培养20h；挑取单菌落于LB液体培养基，置37℃振荡培养16h，复苏指示菌；将培养好的菌液调整到细菌数为1.0×10⁷CFU/mL。(注：在稀释过程中需用0.01mol/L PBS进行稀释)

2)细菌发酵液的制备和处理：将本发明菌株平板画线，37℃培养16h；挑取分离菌株于50mL 的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下培养24h后作为种子液；将种子液以1％的接种量接种到100mL的LB液体培养基中，37℃、200r/min条件下培养48h作为发酵液；将制备好的发酵液10000r/min条件下离心5min，取离心后的上清液用0.22μm无菌过滤器过滤后备用。

3)抑菌试验：取100μL指示菌菌悬液，滴于LB平板上，涂布棒涂布均匀，直至无可见水滴，再用无菌镊子取灭菌牛津杯，轻轻放于LB固体培养基表面，每个培养基上均匀放置3只牛津杯。用微量移液器吸取菌株发酵液上清各200μL，注入到放置平稳的牛津杯内(小心加入，切勿滴洒牛津杯之外的培养基上)；再用灭菌陶瓷盖换掉原来的玻璃平皿盖(以吸取培养基在后面实验过程中所蒸腾出的水分)。

4)培养：将上述加有上清液的培养基放置4℃冰箱8h，然后再将扩散处理完全后的平皿放入37℃的恒温培养箱内，培养16h～24h后，观察并记录试验结果。

试验结果表明本发明菌株对致病菌的抑制能力较弱，其中副地衣芽杆菌SN-6对K99、金黄色葡萄球菌的抑制能力较强，结果见图9和表5。

表5本发明的菌株与不同现有菌株发酵上清液体外抑菌试验

实施例3：副地衣芽胞杆菌SN-6、解淀粉芽胞杆菌SN-C的安全性评价

1.药敏试验

选取青霉素类、头胞类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类等15种药敏纸片(购自杭州微生物试剂有限公司)进行药敏试验。试验判断标准参照WHO提供的NCCLS最新版本的标准进行(2018版)。试验步骤如下：

1)菌液以1％的量接入LB液体培养基中，37℃200rpm/min摇床过夜培养；

2)以有黑字的白纸为背景，调整浊度至0.5麦氏标准比浊管浊度。若菌液浓度太浓时，可用生理盐水稀释；

3)用灭菌棉签蘸取菌液，抵在管壁上挤去多余的菌液后涂布于LB琼脂平板上，每次将平板旋转60度，最后涂布平板内侧边缘两圈，反复几次，保证涂均匀；

4)待平板上的水分被琼脂完全吸收后，用无菌镊子夹取药敏纸片贴在平板表面，纸片一旦贴上就不可再拿起。每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。

5)平板放置于37℃恒温培养箱培养12-16h观察结果。

试验结果见表6、表7。副地衣芽胞杆菌SN-6对常用兽药如青霉素、头胞氨苄、诺氟沙星、四环素、万古霉素、氯霉素、呋喃唑酮和复方新诺明敏感，对头胞呋辛表现中度敏感，对苯唑西林表现耐药。解淀粉芽胞杆菌SN-C对常用兽药如青霉素类、头胞类、喹诺酮类、氨基糖苷类和四环素类抗生素均敏感。

表6副地衣芽胞杆菌SN-6的抗生素敏感性试验结果

表7解淀粉芽胞杆菌SN-C的抗生素敏感性试验结果

注：表7中：S表示敏感，M表示中等敏感，R表示耐药。

2.毒力基因检测试验

以含非溶血性肠毒素Nhe基因(nheA、nheB、nheC)及肠毒素FM基因entFM的蜡样芽胞杆菌作为阳性对照菌株，进行目标菌株相关毒力基因的检测。

分别以前述制备的目标菌株的基因组为模板，以各毒力基因的特异引物进行PCR扩增，各引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，PCR反应条件为94℃3min；95℃30s， 58℃30s，72℃33s，35个循环；72℃10min(Rowan2003)。毒力基因引物序列和预期PCR产物大小见表8，毒力基因PCR扩增体系见表9。

表8毒力基因PCR扩增引物序列

表9毒力基因PCR扩增体系

注：阴性对照孔DNA模板用2μL ddH₂O代替。

取PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳，在凝胶成像系统中观察并拍照。电泳结果显示：阳性菌株扩增出4种毒力基因nheA、nheB、nheC和entFM，扩增出来的片段大小均与预期一致，结果见图10；菌株SN-6未检测到肠毒素相关毒力基因，结果见图11；菌株SN-C检测到毒力基因nheA和nheC，结果见图12。

3.小鼠安全饲喂试验

选用三周龄昆明小鼠(雌雄各半)进行本发明菌株安全饲喂试验，试验时间为2天预饲适应期加2周的正式试验期。按照体重进行分组，每组2笼，每笼5只；试验组小鼠分别灌胃目标菌液(生理盐水重悬稀释)200μL/只/天，菌数量达2-5×10⁸，空白对照组用等体积的生理盐水灌胃，每2天进行称重，每天观察记录小鼠精神状态及健康状况。

结果分析：观察试验组小鼠毛色、精神状态，剖检观察小鼠内脏器官，结果与空白组相比。结果目标菌株饲喂的试验组小鼠与对照组均正常。

上述药敏试验、毒力基因检测、小鼠饲喂试验等结果，一起证明了副地衣芽胞杆菌SN-6、解淀粉芽胞杆菌SN-C是安全的。

实施例4：本发明的益生菌株(副地衣芽胞杆菌SN-6、解淀粉芽胞杆菌SN-C)的抗逆特性及生长特性

1.抗逆性试验

(1)耐人工胃液试验

1)制备人工胃液：参考《中国药典》2015配制人工胃液，准确量取质量浓度为100g/L的盐酸16.4mL，加蒸馏水稀释，调节pH值为3.0，然后加入胃蛋白酶(加入量按照1g/100mL的质量浓度比计算)，充分溶解后，用孔径0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制得人工胃液备用。

2)制备菌液：用无菌接种环挑取少量分离保存的菌株于LB琼脂平板上划线，37℃温箱培养24h，挑取单一菌落，接种到LB液体培养基中，37℃培养至细菌对数生长期，平板计数，菌液浓度为2.4×10⁹CFU/mL，待用。

3)菌液按体积分数1％的接种量接种到pH值为3.0的人工胃液中混匀，37℃、200r/min摇床培养，于3h后取样，计算存活率。

(2)耐人工肠液试验

1)制备人工肠液：参考《中国药典》2015配制人工肠液，称取磷酸二氢钾KH₂PO₄3.4g，加蒸馏水250mL溶解，用0.4g/100mL的NaOH溶液调节pH值至7.0，加水稀释至500mL，然后按照1g/100mL的质量浓度比加入胰蛋白酶，充分溶解后，用孔径0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制得人工肠液备用。

2)制备菌液：用无菌接种环挑取少量分离保存的菌株于LB琼脂平板上划线，37℃温箱培养 24h，挑取单一菌落，接种到LB液体培养基中，37℃培养至细菌对数生长期，平板计数，菌液浓度为2.4×10⁹CFU/mL，待用。

3)菌液按体积分数1％的接种量接种到pH值为7.0的人工肠液中混匀，37℃、200r/min摇床培养，于4h后取样，计算存活率。

菌株耐人工胃液/肠液存活率按照如下公式计算：存活率(％)＝处理后的活菌数/未处理活菌数×100；结果见表10。

表10本发明的菌株耐人工胃液/肠液检测结果

2.生长曲线的测定

1)种子液的制备：挑取单菌落接种至mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养24h，得到种子液。

2)发酵液的制备：将种子液按1％的接种量接种至100mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养24h，得到发酵液。

3)生长曲线的测定：将发酵液以1％的接种量接种至50mL的LB液体培养基中，分别于0h、 2h、4h、6h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h时将细菌悬液取出，测其在OD₆₀₀下的吸光值。10倍梯度稀释后用倾注法测各菌株的生长曲线，每组试验做三个重复。以培养时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。

试验表明，本发明分离的菌株繁殖能力较强，0-4h处于迟缓期，4h进入对数生长期持续到10h，10h后进入稳定期。该菌株繁殖能力很强，有利于工业化的大规模发酵生产，其生长曲线见图13、14。

实施例5：复合微生态菌剂(制剂)的研制

将本发明菌株SN-6、SN-C制成复合微生态菌剂，具体方法如下：

1)菌株的活化培养：取副地衣芽胞杆菌SN-6、解淀粉芽胞杆菌SN-C分别在LB琼脂平板上划线，置37℃恒温培养箱活化培养24h。

2)菌株的液体培养：挑取上述制备的单菌落，分别接种到LB液体培养基，37℃、200r/min 振荡培养48h，分别调整得到浓度为5.0×10¹⁰CFU/mL的芽胞杆菌的发酵菌液。

3)菌剂的制备：将上述步骤制备的发酵菌液经过离心，加入麦芽糊精包被干燥制成相应的菌剂(常规方法)，最后使芽胞杆菌SN-6、SN-C的活菌数均为500亿CFU/g。

综合考虑到不同菌株的益生特性、菌株分别在动物群体中合适的添加剂量、菌株与饲料之间混合的均匀度。最后得出：按活菌数计算，副地衣芽胞杆菌SN-6、解淀粉芽胞杆菌SN-C 的复配比例为1:1。

实施例6：本发明的复合微生态制剂在肉牛饲喂中的应用

将本发明研制的复合微生态制剂饲喂消化粗纤维较多的动物(牛)，具体是肉犊牛，目的是验证本发明的复合微生态制剂对肉牛的促生长作用。

1.试验动物与分组

选取遗传背景一致、体重相近的西门塔尔肉犊牛20头，试验开始前，对牛只按照体重进行一一配对，共计10对。每对对子之间的两头牛随机分到空白对照组和试验组。以栏为单位进行圈养，每栏10头，试验期为33天。基础日粮包括玉米秸秆青贮料、精料补充料、酒糟和麦秸，精料补充料购自于湖北省荆门市荆门龙谷饲料有限公司。

2.试验过程

肉牛饲喂试验在湖北省襄阳市襄州区石桥镇湖北良友金牛畜牧科技有限公司进行，饲喂具体时间为2020年5月22日开始到2020年6月24日结束，共33天。试验期间牛只自由饮水和采食，每天喂料2次(为上午6:30，下午16:00)，上午青贮料和精料补充料混合饲喂，下午只饲喂麦秸，饲料及菌粉饲喂量按照体重相应增减(以体重500斤的肉牛为例，每天饲喂全价料20斤，菌粉按照每头牛每天7.5g添加，总菌量为1.0×10¹¹/d/头)，菌粉溶于水中饲喂肉牛。

3.测定指标

通过体重变化检验本发明的复合微生态制剂对肉牛生长的影响，在复合添加剂饲喂前空腹进行首次称重，在试验结束时空腹称重一次，计算平均日增重。

4.结果分析

由表11结果显示，试验前平均体重，空白对照组>复合微生态制剂组；试验结束平均增重，复合微生态制剂组>空白对照组，本次试验选取处于育肥前期的架子牛，体重基数大的牛生长速度更快，但试验中较体重基数稍大的空白组，复合微生态制剂组增重更多，说明复合微生态制剂的添加能够促进肉牛生长；空白对照组平均日增重为1.34kg，复合微生态制剂组平均日增重达1.44kg，差异极显著(P<0.01)。

表11肉牛生长性能比较

在整个试验期中，空白组相对增重率为23.53％，复合微生态制剂组相对增重率为25.43％。复合微生态制剂的添加使得试验组相对日增重较空白组提高7.46％，说明在日粮中添加本发明的复合微生态制剂对于提高肉牛生长性能的作用显著。

参考文献

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15 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2015。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种提高肉犊牛生产效益的复合微生态制剂及应用

<141> 2020-08-17

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1443

<212> DNA

<213> 副地衣芽胞杆菌(Bacillus paralicheniformis)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1443)

<400> 1

agacgctgct atacatgcaa gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg 60

gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120

cggggctaat accggatgct tgattgaacc gcatggttca attataaaag gtggctttta 180

gctaccactt acagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca 240

aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc 300

ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga 360

gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaaa ctctgttgtt agggaagaac 420

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acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta 540

aagcgcgcgc aggcggtttc ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg 600

tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt 660

gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg 720

acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg 780

taaacgatga gtgctaagtg ttagagggtt tccgcccttt agtgctgcag caaacgcatt 840

aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900

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caa 1443

<210> 2

<211> 1449

<212> DNA

<213> 解淀粉芽胞杆菌( Bacillus amyloliquefaciens)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1449)

<400> 2

catgcggcgt gctatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60

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aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt 180

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ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540

taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600

ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660

gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720

tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780

cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840

ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900

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cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt 1020

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tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380

ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa 1440

gtgacagat 1449

Claims

1.一种由保藏编号为CCTCC NO：M2020136的副地衣芽胞杆菌（Bacillus paralicheniformis）SN-6菌株和保藏编号为CCTCC NO：M2020137的解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SN-C菌组成的菌株制备的食用粗饲料肉犊牛促生长的饲用复合微生态制剂。

2.如权利要求1所述的由保藏编号为CCTCC NO：M2020136的副地衣芽胞杆菌（Bacillus paralicheniformis）SN-6菌株和保藏编号为CCTCC NO：M2020137的解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）SN-C菌株组成的菌株在制备食用粗饲料肉犊牛促生长的饲用复合微生态制剂中的应用。