CN104263683B - 具有益生作用的短小芽孢杆菌315及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)315，保藏编号为CGMCC NO.8878。短小芽孢杆菌315具有提高饲料利用率，促进饲料中营养物质的消化吸收；增强动物的免疫功能，提高日增重，降低料肉比；无污染，无残留，生物环保等特点。本发明的短小芽孢杆菌可作为一种新型的益生菌添加剂，广泛应用于饲料中。

Description

具有益生作用的短小芽孢杆菌315及其应用
技术领域
本发明属于微生物学领域，具体地说，涉及一种具有益生作用的短小芽孢杆菌315及其应用。
背景技术
随着我国畜牧业的快速发展，其数量与质量、生产与环境以及效益与资源之间的矛盾越来越突出。尤其是畜禽排泄物对环境造成的污染日趋严重，大量的有害物排放使得畜禽场污染物中的BOD(生化需氧量)和COD(化学需氧量)值急剧上升，同时也成为一些疾病发生和传播的潜在诱因。
另一方面，食品安全问题正引起越来越多的关注，在造成食品安全问题的诸多原因中，重要原因之一是饲料中使用抗生素作为促生长剂。客观上，抗生素自20世纪50年代以来广泛应用于畜禽养殖业，在促进动物生长，保证动物健康，节约饲料成本，提高经济效益等方面做出了巨大贡献。但由于抗生素在动物养殖业中的长期使用，近些年来，由其所致的毒副作用和药物残留问题已引起人们的关注。2006年，欧盟已经全面禁止了饲料中抗生素的使用，美国和日本等国家也对其做出了严格的限制。2011年，韩国全国禁止在动物饲料中添加抗生素。
随着人们对畜产品安全和环境保护意识的不断加强，作为抗生素的替代品，益生菌越来越多的应用于动物营养和饲料中。益生菌是一类能改善动物胃肠道微生态平衡，有益于动物健康和生产性能发挥的微生物添加剂。其主要作用效果体现在改善动物新陈代谢，提高营养物质吸收和利用，提高免疫力，减少环境污染等方面发挥重要作用。
由于芽孢杆菌对干燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，这种稳定性增加了它作为益生菌的潜力。因此，获得新型具有益生特性的芽孢杆菌的研究具有重大意义。分离和筛选抗病原菌且具有益生效果的短小芽孢杆菌，可以更好的应用于饲料添加剂，以代替抗生素。但短小芽孢杆菌作为益生菌制剂或饲料添加剂的研究与应用较少，尤其是在替代饲养抗生素和减少环境污染等方面。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有益生作用的短小芽孢杆菌315及其在动物饲料中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明的短小芽孢杆菌315(Bacillus pumilus)是从养猪场附近土壤中筛选到的一株芽孢杆菌。经16S rRNA基因序列分析和体外益生效果评价，该菌株为能够抑制病原菌且具有益生和减少畜禽养殖环境污染效果的短小芽孢杆菌，其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示。该菌株已于2014年3月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏号为CGMCC No.8878。
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)315的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，无鞭毛和荚膜；菌体表面干燥，有褶皱，不透明，灰白色；需氧菌；可利用蛋白质、多种糖及淀粉。
本发明提供含有该短小芽孢杆菌315的菌剂。
本发明还提供短小芽孢杆菌315或上述菌剂在广谱抗菌中的应用。其中，短小芽孢杆菌315的抑菌谱包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌，如Staphylococcus aureus IVDC C56005(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)；所述革兰氏阴性菌为致病性大肠杆菌，如K88(Escherichia coli IVDC C83901)，鼠伤寒沙门氏菌，如Salmonella typhimurium IVDC C79-13(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。
本发明还提供一种含有该短小芽孢杆菌315的动物饲料添加剂。该饲料添加剂含有短小芽孢杆菌315的活菌数为1×109CFU/g～1×1010CFU/g；优选地，含有短小芽孢杆菌315的添加剂的活菌数为5×109CFU/g。
本发明还提供一种含有该具有益生作用的短小芽孢杆菌315饲料添加剂的动物饲料。其中，所述动物饲料中短小芽孢杆菌315饲料添加剂的添加量为质量百分比的1‰。因此，动物饲料中短小芽孢杆菌315的活菌数为1×109CFU/kg～5×109CFU/kg，优选5×109CFU/kg。
本发明通过体外法鉴定了短小芽孢杆菌315的益生效果，结果表明，短小芽孢杆菌315能够耐酸、酸胆盐，能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。
本发明还采用体外法鉴定短小芽孢杆菌315耐酸、耐胆盐和模拟胃肠道环境中生长的益生潜力，包括以下步骤：
1)配制不同pH值的培养基，检测短小芽孢杆菌315的生长情况；
2)配制不同胆盐浓度的培养基，检测短小芽孢杆菌315的生长情况；
3)模拟人工胃肠液，检测短小芽孢杆菌315的生长情况。
本发明进一步验证了短小芽孢杆菌315在断奶仔猪饲料添加中的应用效果。
本发明的短小芽孢杆菌315(Bacillus pumilus)，最适pH 7.2～7.4，最适温度37℃，能够耐受体内环境，具有良好的益生效果。它是一株能够抑制肠道内病原菌的益生菌，它能够耐酸、耐盐、耐人工胃肠液的环境，表明其具备益生菌的潜质。通过在猪、奶牛、蛋鸡饲料添加中应用效果的研究，表明短小芽孢杆菌315可作为一种新型的益生菌添加剂，广泛应用于饲料中。
本发明筛选得到的短小芽孢杆菌315具有提高饲料利用率，促进饲料中营养物质的消化吸收；增强动物的免疫功能，提高日增重，降低料肉比；无污染，无残留，生物环保等特点。比枯草芽孢杆菌具有更好的益生特性和用作饲料添加剂的潜力。
附图说明
图1短小芽孢杆菌315在不同pH值下的生长情况
图2短小芽孢杆菌315对猪舍氨气浓度的影响
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中涉及的试验材料和试剂：
1.菌株：病原菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus IVDC C56005)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium IVDC C79-13)、大肠杆菌K88(Escherichia coliIVDC C83901)由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提供。
2.生化试剂：DNA提取试剂盒购自天根公司，胆盐、胃蛋白酶、胰蛋白酶购自Sigma公司，其它均为国产试剂。
3.培养基：
⑴肉汤培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水1000mL，pH值7.2～7.4，121℃灭菌20min。
⑵肉汤固体培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，去离子水1000mL，琼脂20g，pH值7.2～7.4，121℃灭菌20min。
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中描述的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1 短小芽孢杆菌的315的(CGMCC NO.8878)分离和鉴定
采集养猪场附近的土壤，按1:10倍比稀释于生理盐水中。取100μL稀释液涂布于营养肉汤固体培养基上，37℃培养24h。挑起菌落表面形成皱醭的单菌落在营养肉汤固体培养基上划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法分离到34株菌种，分别命名为301-334。
应用琼脂扩散的牛津杯法筛选具有抑菌活力的短小芽孢杆菌。向肉汤培养基中加入琼脂后，溶解均匀，高压灭菌，冷却到50℃左右，每20mL培养基加入20μL新鲜培养的指示菌(108CFU/mL)，混匀倒入培养皿冷却。用灭菌的镊子将无菌的牛津杯轻轻的放入培养皿中，在牛津杯中分别加入301-334各80μL单株菌液，向另一个牛津杯中加入80μL无菌营养肉汤培养基作对照，37℃培养24h。筛选出能形成抑菌圈的菌液，其菌株编号为315。
以上使用的指示菌分别为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus IVDCC56005)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium IVDC C79-13)、大肠杆菌K88(Escherichia coli IVDC C83901)。
取10mL 315培养液，低速离心获得菌体。用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，DP302)提取细菌总DNA。
以10ng纯化的细菌总DNA作为模板，扩增16S rRNA基因。所用引物为原核生物16SrRNA基因的通用引物：27F：5'-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。引物由北京博迈德生物有限公司合成。
PCR扩增体系为50μL，包括0.5μL Taq酶(0.5U/mL)、5.0μL10×PCR反应缓冲液、4.0μL dNTP Mixture、1.0μL模板DNA、1.0μL正向引物27F(25μmol/L)、1.0μL反向引物1492R(25μmol/L)和37.5μL ddH2O。
扩增条件：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；72℃7min，4℃终止反应。PCR产物序列测定由北京博迈德生物有限公司完成。
短小芽孢杆菌315经16S rRNA基因测序，测得序列经Blast比对，结果该菌株与GenBank中Bacillus pumilus strain 3L-10F 16S ribosomal RNA gene(GenBankaccession number:EU379272)序列相似性为98％。初步确定315为短小芽孢杆菌，该菌株已于2014年3月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，保藏号为CGMCC No.8878。其微生物学特性为：革兰氏阳性菌，无鞭毛和荚膜；菌体表面干燥，有褶皱，不透明，灰白色；需氧菌；可利用蛋白质、多种糖及淀粉。
实施例2 短小芽孢杆菌315耐酸耐胆盐特性测定
测定短小芽孢杆菌315在低pH中的生长状态，用1mol/L盐酸调节营养肉汤培养基为不同pH值梯度，分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和6.4。短小芽孢杆菌315培养液按1％(v/v)分别接种于不同pH值营养肉汤培养基中，37℃培养24h，测OD600nm值。试验结果如图1所示，短小芽孢杆菌315在pH＝4.0的培养基中存活率为68％，说明短小芽孢杆菌315在低酸的环境能够保持一定的活菌数。
在营养肉汤培养基中加入猪胆盐，使其浓度分别为0％(对照)、0.15％、0.3％和0.6％。短小芽孢杆菌315接种于上述不同浓度的营养肉汤培养基中，37℃培养24h，通过平板计数法计算活菌数。结果见表1，短小芽孢杆菌0.3％胆盐浓度下存活率达到80％。由于动物体内胆盐浓度在0.3％左右，所以短小芽孢杆菌315能够耐受体内的胆盐环境。
表1 短小芽孢杆菌315在不同浓度胆盐中培养24h的活菌数
注：a、b表示差异极显著(P<0.01)，下同。
实施例3 短小芽孢杆菌315抗人工胃肠液的耐受性测定
人工胃液的配制：取9.5％～10.5％的盐酸16.4mL，加水稀释，使pH值达3.0。每100mL溶液中加入1.0g胃蛋白酶，混匀，用0.2μm无菌滤膜过滤。
人工肠液的配制：称取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL溶解，用0.4％的氢氧化钠溶液调pH值至6.8，加水稀释至1000mL，每100mL液体中加入1.0g胰蛋白酶，混匀，用0.2μm无菌滤膜过滤。
将短小芽孢杆菌315培养液分别接种于人工胃液和人工肠液中，37℃，140r/min摇床培养，分别在0、30min和180min进行活菌平板计数。结果见表2，短小芽孢杆菌315在人工胃液中生长0.5h时，活菌率为94％，生长3h时存活率在71.8％；短小芽孢杆菌315在人工肠液中生长0.5h，活菌率为84％，生长3h时存活率达到71％。该结果说明短小芽孢杆菌能够耐受人工胃、肠液的环境。
表2 短小芽孢杆菌315在人工胃肠液中的活菌数
实施例4 短小芽孢杆菌315制剂的制备
将短小芽孢杆菌315接种于营养肉汤培养基中，37℃培养24h。将1L培养物与0.25kg麸皮混合真空冷冻干燥。应用平板计数法计算冻干样品中的活菌数为1.5×1010CFU/g。
实施例5 短小芽孢杆菌315在猪饲料添加中应用效果的测定
试验选择70日龄生长猪600头，随机分为四组，每组150头，对照组饲喂基础日粮，日粮的营养水平参照NRC(2012)猪营养需要配制，试验组分别在基础日粮中添加实施例4制得的短小芽孢杆菌制剂，使短小芽孢杆菌315在基础日粮中的用量分别为1×109CFU/kg、5×109CFU/kg、1×1010CFU/kg。分别与试验开始和出栏时称重，计算生猪生增重、日增重，试验全程记录饲料投喂量，计算采食量，和饲料报酬。同时记录猪的健康和死亡情况。并于试验期采用氨气检测管检测猪舍中氨气浓度。在试验第150天时采用4N盐酸不溶灰分法测定饲料营养物质消化率，连续收集粪尿和饲料样品5天，将每个组的样品合并用于测定。
参见表3、表4，结果表明：在基础日粮中添加短小芽孢杆菌的三个试验组均提高了生猪育成率、增重速度及饲料报酬，并降低了猪舍的氨气含量(图2)。并且提高饲料饲料营养物质的消化率。其中以试验组2的效果最好。
表3 饲喂短小芽孢杆菌315对猪生长性能的影响
分类 试验组1 试验组2 试验组3 对照组
添加量，CFU/kg日粮 1×109 5×109 1×1010 -
开始实验数量 150 150 150 150
出栏数量 143 147 146 142
育成率 95.33％ 98.00％ 97.33％ 94.67％
平均开始体重,kg 29.95 30.25 29.65 29.24
平均出栏体重,kg 109.2 110.5 110.3 106.6
平均增重量,kg 79.25 80.25 80.65 77.36
开始日龄,天 70 70 70 70
出栏日龄，天 169 165 166 171
平均日增重量,g/d 800.51 844.74 840.10 765.94
总饲料摄取量,吨 33.55 33.5 33.9 34.95
饲料增重比 2.96 2.84 2.88 3.18
平均氨气,ppm 65 43 44 84
表4 饲料营养物质消化率
试验组1 试验组2 试验组3 对照
能量 90.07％ 92.07％ 93.32％ 87.43％
DM 90.24％ 92.42％ 92.50％ 88.00％
OM 88.08％ 91.03％ 91.88％ 85.03％
蛋白 89.11％ 92.01％ 91.13％ 86.84％
脂肪 93.42％ 95.42％ 95.55％ 92.19％
实施例6 短小芽孢杆菌(CGMCC NO.8878)与枯草芽孢杆菌B27在猪饲料添加中应用效果的测定
试验选择断奶仔猪150头，随机分为三组，每组50头，对照组饲喂基础日粮，日粮的营养水平参照NRC(2012)猪营养需要配制，试验一组在基础日粮中添加短小芽孢杆菌(CGMCC NO.8878)制剂5×109CFU/kg、试验二组在基础日总添加枯草芽孢杆菌B27制剂5×109CFU/kg基础日粮。分别与试验开始和保育期结束时称重，计算生猪生增重、日增重，试验全程记录饲料投喂量，计算采食量，和饲料报酬，结果见表5。
结果表明：在基础日粮中添加芽孢杆菌均提高了仔猪生长性能和饲料报酬，并且短小芽孢杆菌315效果优于枯草芽孢杆菌B27。
表5 饲喂芽孢杆菌对仔猪生长性能的影响
分类 枯草芽孢杆菌B27 短小芽孢杆菌315 对照组
添加量，CFU/kg日粮 5×109 5×109 -
平均开始体重,kg 7.62 7.55 7.74
平均结束体重,kg 24.25 24.55 24.02
平均增重量,kg 16.63 17.00 16.28
平均日增重量,g/d 475.14 485.71 465.14
平均饲料采食，g/d 761.00 742.00 803.00
饲料增重比 1.60 1.53 1.73
实施例7 短小芽孢杆菌315在蛋鸡饲料添加中应用效果
19周龄京粉一号蛋鸡12000只。试验蛋鸡自由采食(每天添料三次)、自由饮水(乳头式饮水器)。日粮中添加短小芽孢杆菌制剂，使短小芽孢杆菌315在蛋鸡配合饲料中的用量为5×109CUF/kg。将试验蛋鸡分成两个组，试验组6100只，对照组5900只。试验共计38天，其中预饲期15天，正试期23天。测定蛋鸡产蛋率、蛋重、畸形蛋率、死淘率、料肉比等，结果参见表6。
结果表明：添加短小芽孢杆菌于蛋鸡日粮中，提高了产蛋率6.8个百分点，蛋重提高了4.8g/枚，鸡舍氨气浓度降低了41％。
表6 蛋鸡产蛋性能
分类 对照组 试验组
平均日饲料摄取量 115.37g/只 110.67g/只
平均产蛋率 86.1％ 92.9％
平均蛋重 61.1g 65.9g
平均蛋壳厚度 0.384 0.393
平均淡黄色度 10.01 10.13
平均破蛋率 0.18％ 0.09％
平均氨气浓度 63.9ppm 37.7ppm
实施例8 短小芽孢杆菌315在奶牛饲料添加中应用效果的测定
选择产奶量高产奶牛60头。根据奶牛胎次、产奶量相近的原则将其分为两个处理组，每组30头。对照组饲喂奶牛场原有日粮，不做变动，试验组在奶牛精饲料中添加短小芽孢杆菌制剂，使短小芽孢杆菌315在精饲料中的用量为5×109CFU/kg。试验奶牛均采用敞棚、散栏饲养方式，日喂三次，挤奶三次。试验奶牛饲料采用原场饲料，不作变动。粗饲料为苜蓿草、羊草，每天6千克/头左右，精料每天9千克/头，青贮玉米每天20千克/头，另有各种辅料，如胡萝卜等。预试期7天，正式试验期90天。测定奶牛产奶量，乳成分。
参见表7，结果表明：添加短小芽孢杆菌与奶牛日粮中，提高了奶牛产奶量和乳蛋白含量，降低了奶牛体细胞数。
表7 奶牛产奶性能
综上，本发明提供的短小芽孢杆菌可提升生猪生长性能、奶牛产奶性能和蛋鸡产蛋性能，提高饲料利用效率。并且以添加短小芽孢杆菌5×109CUF/kg日粮时效果最好。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)315，其保藏编号为CGMCC NO.8878。
2.含有权利要求1所述的短小芽孢杆菌315的菌剂。
3.权利要求1所述短小芽孢杆菌315在制备饲料添加剂中的应用，其特征在于，所述饲料添加剂可广谱抗菌。
4.权利要求2所述菌剂在制备饲料添加剂中的应用，其中所述饲料添加剂可广谱抗菌。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，短小芽孢杆菌315的抑菌谱包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；
所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌；所述革兰氏阴性菌为致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌。
6.权利要求1所述的短小芽孢杆菌315在制备饲料添加剂中的应用。
7.含有权利要求1所述短小芽孢杆菌315的饲料添加剂。
8.根据权利要求7所述的饲料添加剂，其特征在于，饲料添加剂中短小芽孢杆菌315的活菌数为1.0×109～1.0×1010CFU/g。
9.根据权利要求8所述的饲料添加剂，其特征在于，饲料添加剂中短小芽孢杆菌315的活菌数为5.0×109CFU/g。
10.含有权利要求1所述短小芽孢杆菌315的动物饲料。
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