CN102277325B - 一株饲用粪肠球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848，是革兰氏阳性菌，显微镜下观察呈球形，不形成芽孢；在MRS琼脂平板上生长良好，48h形成圆整、光滑、隆起、灰白色露滴样、直径0.5-1mm大小、菌落；兼性厌氧生长，生长温度范围：10℃-50℃，最适生长温度：30℃-40℃；生长酸碱度范围：pH4-10，最适pH值为6.5。由该菌株制成的菌剂无毒无害，耐胃液，耐胆盐，对多种有害菌有很强的抑制作用，可广泛应用到禽、畜养殖业(直接添加到动物日粮或饮用水中即可)中，可增强动物抗病能力，有望成为饲用抗生素的替代物，并且能够明显提高断奶仔猪的平均增重，降低料肉比，还能改善禽、畜生存环境，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于微生物菌株，特别是涉及一株粪肠球菌菌株及其取代抗生素在禽、畜养殖中的应用。
背景技术
乳酸菌是肠道常居菌群。动物服用乳酸菌后，可以改变肠道内菌群环境，产生多种抑菌因子，抑制有害菌繁殖，提高动物机体免疫力。乳酸菌通过粘附素与肠粘膜细胞紧密结合，在肠粘膜表面定植占位，成为生理屏障的主要组成部分，从而达到恢复宿主抵抗力，修复肠道菌群屏障、治愈肠道疾病的作用。
国内外对乳酸菌作用效果的实验报道不计其数，乳酸菌是动物机体有益菌的观点受到广泛赞同。Barrow(Barrow PA，Brooker BE，Fuller R，Newport MJ.Theattachment of bacteria to the gastric epithelium of pig and its importancein the microecology of the intestine.J Appl Bacterio，1980，48：147-154)给仔猪饲喂乳杆菌可显著降低肠道中大肠杆菌的数量。Rada(Behling RG.Competitive Exclusion of salmonella enteritidis in chicks by treatment witha single culture plus dietary lactose.Int J food Microbiol，1994，22：1-9)和Behling(Pollman DS，Danielson DM，Wren WB，Peo ER，Shahani KM.Influenceof Lactobacillus acidophilus inoculum on gnotobiotic and conventional pigs.J Anim Sci，1980，51：629-637)报道用乳杆菌可减少禽类消化道内大肠杆菌和沙门氏菌的定植。Simon(2001)对国外已有报道进行了统计分析，结果表明益生素在减少仔猪和犊牛的腹泻发病率方面效果显著。Pergidon等(Simon O，Jadamus A，Vahjen W.Probiotic Feed Additives-Effectiveness and Expected Modes of Action.J AnimFeed Sci，2001，10(Suppl)，1：51-67)报道，口服乳酸菌后，对巨噬细胞的β-半乳糖甙酶活性、巨噬细胞的吞噬活性等具有显著的激活和促进作用。当异物侵入机体时，免疫细胞被乳酸菌激活，增强了机体对异物产生抗体的作用。Pollman(Sorrels KM，Speck ML.Inhibition of Salmonella gallinarum by Culture Filtrates ofLeuconostoc citrovorum.J Dairy Sci，1970，53：237-243)给无菌仔猪口服嗜酸乳杆菌后引起白细胞数和血清总蛋白数(主要是球蛋白)浓度提高。Herich(Pergidon G，Nader de Macias ME，Alvarez S，Oliver G，Pesce De Ruiz Holgado AA.Systemicaugmentation of the immune response in mice by feeding fermented milks withLactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus.Immunol，1988，63：17-23)报道，饲喂干酪乳杆菌后仔猪白细胞总数和嗜中性细胞数显著增加。Sorrels(Juven BJ，Meinersman RJ，Stern NT.Antagonidtic effect of Lactobacijli and prdiococcito control intestinal colonization by human enteropathogons in live poultry.J Appli Bacteri，1991，70：95-103)报道，明串珠菌(Leuconostocci trovorum)代谢产生的乙酸和乳酸对沙门氏菌有抑菌效果，其中乙酸起了主要作用。Juven(HerichR，Revajova V，Levkut M.The effect of Lactobacillus paracasei and raftiloseP95Upon the non-specific immune response of piglets.Food agric immunol，2002，14：171-179)报道乳酸菌产生过氧化氢或细菌素类物质，对有害菌有杀菌作用。
因此，利用益生菌抑制动物体内的有害菌繁殖，提高动物机体免疫力已在禽、畜养殖中发挥重要作用。
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)又称粪链球菌，根据最新的分类规则，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)属肠球菌属。与屎肠球菌一样，粪肠球菌同属人和动物肠道中正常的有益菌群，早在1994年就是我国农业部批准使用的微生物品种之一，也是1989年美国食品及药品管理局(FDA)公布了可以用作饲料添加剂的42种微生物之一。
专利文献CN 101067120A公开了一株添加到食品中用于治疗人类胃病的粪肠球菌，CN 1948464A公开了一种利用粪肠球菌生产L-瓜氨酸的方法，CN 101352198A公开了一种禽类粪肠球菌发酵混合饲料的制备方法、CN 101701201A公开了一株用于生产酪胺(对羟基-β-苯乙胺)的粪肠球菌，CN 101792726A公开了一株能够吸附霉菌毒素的粪肠球菌。上述专利文献中公开的粪肠球菌均为研究粪肠球菌抗胆盐和胃酸的性质及其在仔猪饲料中的应用方法，没有涉及其抑菌效果的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一株对致病菌具有抑制作用的可用于制备饲料和饲料添加剂的粪肠球菌。
本发明所提供的粪肠球菌菌株(Enterococcus faecalis)的名称为SBD，该菌株已于2011年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4848。
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848是革兰氏阳性菌，显微镜下观察呈球形，不形成芽孢；在MRS琼脂平板上生长良好，48h形成圆整、光滑、隆起、灰白色露滴样、直径0.5-1mm大小、菌落；兼性厌氧生长，生长温度范围：10℃-50℃，最适生长温度：30℃-40℃；生长酸碱度范围：pH 4-10，最适pH值为6.5；部分生化特性如表1所示：
表1粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848的部分生化特性
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。
体外拮抗试验结果表明：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848对金黄色葡萄球菌(SA)、伤寒沙门氏菌(ST O4Hi)、猪源产肠毒素型大肠杆菌E.coliO139和猪源致病大肠杆菌(E.coliC83524、E.coliC83529、E.coliC83905)均有较强的抑制作用。
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848可耐受pH 2.5合成胃液60min；最高耐受胆盐浓度为2.0％(质量百分比浓度)。
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848对复达欣、美满霉片、苯唑青霉素、四环素、卡那霉素、庆大霉素、强力霉素和丁胺卡那霉素不敏感(对这些抗生素的耐受能力较强)。
粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848对E.coliC83905感染有良好的免疫预防效果，饲喂粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848能有效降低小鼠受大肠杆菌攻毒时的发病率和死亡率。
本发明的第二个目的是提供一种粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCCNo.4848微生态菌剂。
本发明所提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848微生态菌剂，其活性成分为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848。
本发明还提供了一种制备粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848微生态菌剂的方法。
本发明所提供的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848微生态菌剂的制备方法，可包括以下步骤：
1)配制YPD液体培养基：酵母浸粉10g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L，调节pH 6.5，115℃灭菌20min；
2)从斜面中接一环粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848到YPD液体培养基中，37℃静置培养10-24h，再按1％-10％(体积/体积百分比)的接种量进行两级培养，每级培养时间为10-24h，37℃静置培养，培养结束后，得到粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848微生态菌剂。
本发明还提供了粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848在制备饲料添加剂或兽药中的应用。
本发明的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848微生态菌剂的使用方法可为：将菌液(107-108CFU/Kg体重/天)添加到禽、畜饮用水或饲料中即可。
本发明提供了一株粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848。由该菌株制成的菌剂无毒无害，耐胃液，耐胆盐，对多种有害菌有很强的抑制作用，可广泛应用到禽、畜养殖业(直接添加到动物日粮或饮用水中即可)中，可增强动物抗病能力，有望成为饲用抗生素的替代物，并且能够明显提高断奶仔猪的生长速度(平均增重提高)，降低料肉比，还能改善禽、畜生存环境，应用前景广阔。
生物材料说明：
本发明粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的名称为SBD，该菌株已于2011年05月16日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.4848。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施方式
本发明以粪肠球菌(Enterococcus faecalis)为研究对象，整合了现有的对益生粪肠球菌的理论和实践认识，筛选出一株具有抑菌活性、抗逆性、可增强动物抗病能力、改善禽、畜生存环境及安全性较高的益生粪肠球菌，优化该菌的发酵工艺，研究其作为微生态制剂对动物生产性能的影响，为益生菌粪肠球菌的应用和实践奠定基础。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848的分离、鉴定及保藏
一、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848的分离
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，柠檬酸二铵2g/L，醋酸钠5g/L，牛肉膏10g/L，吐温801g/L，K2HPO42g/L，MgSO4·7H2O0.058g/L，MnSO4·4H2O 0.25g/L，pH 6.8。
富集培养基：含40μg/mL放线菌酮的液体MRS培养基。
CaCO3MRS培养基：含0.5％(质量百分含量)轻质碳酸钙的MRS固体培养基。
耐酸MRS培养基：将MRS液体培养基的pH值调至3.0。
耐胆盐筛选培养基：向MRS培养基中加入0.3％(质量百分含量)的猪胆盐。
从华中农业大学种猪测定中心采集母猪新鲜粪便，用富集培养基富集培养后(培养条件为37℃，静置培养)，取1mL转接于10mL pH 3.0的耐酸MRS培养基中，37℃培养8h后，取1mL转接于10mL 0.3％(质量百分含量)耐胆盐筛选培养基中，37℃培养12h后，再取1mL稀释涂布于CaCO3MRS培养基平板上，挑选出产酸能力最强的菌株，命名为SBD。
二、SBD菌株的生理生化鉴定
对SBD菌株进行生理生化鉴定，该菌株是革兰氏阳性菌，显微镜下观察呈球形，不形成芽孢；在MRS琼脂平板上生长良好，48h形成圆整、光滑、隆起、灰白色露滴样、直径0.5-1mm大小、菌落；兼性厌氧生长，生长温度范围：10℃-50℃，最适生长温度：30℃-40℃；生长酸碱度范围：pH 4-10，最适pH值为6.5；部分生化特性如表2所示：
表2SBD菌株的部分生化特性
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。
三、SBD菌株的16S rDNA测序比对
以菌株SBD的总DNA为模板，在引物P0(5’-GGCGVACGGGTGAGTAA-3’)和PC3(5’-TACHAGGGTATCTAATCCT-3’)的引导下PCR扩增该菌株的16S rDNA序列，PCR反应体系为10×Buffer 5.0μL，dNTP(10mmol/L)1.0μL，Primer 1(20μmol/L)1.0μL，Primer 2(20μmol/L)1.0μL，模板DNA 2.5μL，Taq酶(5.0U/μL)2.5μL，超纯水34μL，总50μL。PCR反应条件为先95℃5min；然后94℃1min，50℃1min，72℃1min，共30个循环；最后72℃延伸8min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了大小约700bp的特异条带。用购自Axygen公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收并纯化该目的条带，送宝生物工程(大连)有限公司进行DNA序列测定，测序结果表明菌株SBD的16S rDNA序列具有序列表中序列1的核苷酸序列。将所测得的序列与Genbank中的16S rDNA序列进行Blastn相似性分析比较，结果菌株SBD与Enterococcusfaecalis的16S rDNA序列的同源性达到了100％。
综合生理生化鉴定和16S rDNA测序结果，可以确定菌株SBD为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，该菌株已于2011年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4848。
实施例2、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848的耐胃液性质分析
配制合成胃液：胰蛋白胨8.3g、葡萄糖3.5g、氯化钠2.05g、氯化钙0.11g、氯化钾0.37g、磷酸二氢钾0.6g、猪胆盐0.05g、溶菌酶0.1g、胃蛋白酶13.3mg、加蒸馏水1000mL，用1mol/L盐酸调pH值分别为1.5和2.5，115℃灭菌20min。其中溶菌酶和胃蛋白酶过滤除菌。
菌种活化，按1％的接种量将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCCNo.4848转接到100mL液体MS培养基中，37℃、200r/min培养过夜，取1mL菌液加入9mL无菌合成胃液中，分别于0min、30min、60min、180min分别用活菌平皿计数法检测活菌数量。
胃酸的pH为3.0左右，流食在胃中存留时间为1-2h，在进食后很短的时间内，胃内pH值可以升到6.0左右。粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848在pH 2.5的模拟胃液中耐受60min存活率仍大于50％，表明本发明的菌株具有较强的耐胃酸能力。
实施例3、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848的耐胆盐性质分析
准备MRS液体培养基，其中分别添加有0.1％、0.3％、0.5％、1.0％、2.0％、3.0％、5.0％(质量百分比浓度)胆盐(购自国药集团药业股份有限公司)。取1mL 37℃培养过夜后粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848的菌体发酵培养液(109CFU/mL)，加入9mL添加有以上浓度胆盐的MRS液体培养基中，37℃静置培养12h，稀释104倍后取0.1mL涂MRS固体琼脂平板，观察菌体的生长情况，以检测其耐胆盐性质。若生长数目超过30个(菌数为3×106CFU/mL)则表明其生长良好，能耐该浓度的胆盐；若生长数目在5-30个则表明其生长较差，耐该浓度胆盐能力差；若生长数目小于5个则表明其不生长，不能耐该浓度胆盐。仔猪小肠内胆盐浓度在0.03％-0.3％范围内波动。
检测结果表明，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848的最高耐受胆盐浓度为2.0％，远高于0.03％-0.3％的范围。
实施例4、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848的耐抗生素性质分析
将MRS固体培养基融化后冷却至50℃，每30mL培养基中加入活化好的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848菌液0.1mL(109CFU/mL)倾倒平板，待平板表面稍干后，放入常用抗生素(青霉素、苯唑青霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、氧哌嗪青霉素、先锋霉素、先锋霉素IV、先锋霉素V、头孢肤肟、复达新、菌必治、先锋必素、丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、强力霉素、美满霉素、红霉素、氯霉素)药敏纸片(购自卫生部抗菌药物细菌耐药性检测中心杭州微生物试剂有限公司)37℃培养，观察其生长情况，测量抑菌圈直径。参照卫生部抗菌药物细菌耐药性检测中心杭州微生物试剂有限公司制定的抗菌药物药敏纸片及实验判断标准，得到粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848对24种抗生素的耐药性。
检测结果表明，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848对复达欣、美满霉片、苯唑青霉素、四环素、卡那霉素、庆大霉素、强力霉素和丁胺卡那霉素不敏感，对这些抗生素的耐受能力较强。
实施例5、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848的平板抑菌实验
配制LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂18g/L，121℃灭菌30min。
将指示菌金黄色葡萄球菌(SA)、伤寒沙门氏菌(ST O4Hi)、猪源产肠毒素型大肠杆菌(E.coli O139)、猪源致病大肠杆菌(E.coliC83524、E.coliC83529、E.coliC83905)分别接种于营养肉汤培养基(牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000mL、pH 7.2-7.4)中，37℃培养20h备用。
将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848接种于MRS液体培养基中，37℃培养20h备用。用乳酸调MRS液体培养基的pH值，使其与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848发酵液pH值相同，将其作为对照。用无菌棉签将0.1mL指示菌培养液均匀涂抹在固体LB培养基上，待平板干后用金属管均匀地打孔，孔径为10mm±0.1mm，再用无菌镊子将孔内琼脂块挑出，然后用热玻棒封底。在各孔中分别加入粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848发酵液和对照液，37℃培养24h，观察有无抑菌环，并测定对照与粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848发酵液的抑菌直径。
结果表明粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848菌液对指示菌金黄色葡萄球菌(SA)、伤寒沙门氏菌(ST O4Hi)、猪源产肠毒素型大肠杆菌(E.coliO139)、猪源致病大肠杆菌(E.coliC83524、E.coliC83529、E.coliC83905)都有较强的抑制作用，尤其对伤寒沙门氏菌(ST O4Hi)抑制作用更强。
实施例6、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848的小鼠饲喂实验
实验动物选用普通级昆明系(KM)小鼠20只(购自湖北省预防医学科学院疾病控制中心实验动物中心)，雄性，体重18-20g，随机分成2组，分别为试验组和对照组，试验组饲喂小鼠基础日粮和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848(SBD饲喂量为0.5mL/只，菌液浓度为109CFU/mL)，对照组只饲喂小鼠基础日粮。每组10只，饲喂21d后进行攻毒实验。
给饲喂21d的小鼠腹腔注射致病大肠杆菌E.coliC83905菌液0.5mL/只，菌液浓度为109CFU/mL。观察两组小鼠状态，统计死亡率。
表3小鼠饲喂粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848试验结果
通过逐日观察发现，小鼠的发病症状主要表现在：呆滞，颤抖，缩成团，背毛凌乱，不食，背部明显弓起。对照组小鼠在攻毒后第1天开始出现发病症状，死亡1只，第2、3、4天各死亡3、2、1只，剩余存活的3只也不同程度的出现发病症状。试验组小鼠在攻毒后第2天死亡2只，其它小鼠在攻毒两天后不食，缩成团，之后逐步恢复正常。
小鼠攻毒前无一只死亡，攻毒后两组小鼠的死亡时间和死亡率见表3。试验结果表明粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848对大肠杆菌E.coli C83905感染有良好的免疫预防效果，饲喂粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCCNo.4848能有效降低小鼠受大肠杆菌攻毒时的发病率和死亡率。
实施例7、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848微生态菌剂的制备
用本发明的方法制备粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848微生态菌剂，具体方法包括以下步骤：
1)配制YPD液体培养基：酵母浸粉10g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L，调节pH 6.5，115℃灭菌20min；
2)从斜面中接一环粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848到YPD液体培养基中，37℃静置培养10-24h，再按1％-10％(体积/体积百分比)的接种量进行两级培养(两级培养是将一级培养结束后，将一级培养物再接种到YPD液体培养基中进行二级培养)，每级培养时间为10-24h，37℃静置培养，培养结束后，得到粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848微生态菌剂(菌液)。在洁净无菌条件下，将菌液灌装，厌氧冷藏。
使用时，取一定量(107-108CFU/Kg体重/天)的菌液加到禽、畜饮用水或饲料中即可。
实施例8、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848在断奶仔猪中的应用
(1)试验动物
试验于湖北省某规模化养猪场进行。试验选用64头健康35日龄三元杂断奶仔猪(杜×长×大)作为供试动物，随机分为五组：
I组为空白对照组，
II组为抗生素对照组(所用抗生素为新霉素120mg/kg，喹烯酮75mg/kg)，
III组为高剂量组，
IV组为中剂量组，
V组为低剂量组，
全期试验为30天。
(2)饲喂方式
基础日粮组成：玉米56％、豆粕18％、优补健8％、鱼粉3％、乳清粉3％、代乳粉5％、油脂2.4％、甜味剂0.25％、乳香剂0.25％、酸化剂0.1％、嘉禾S614型乳猪预混料4％。饲喂方式如表4所示。
表4断奶仔猪试验饲喂方式
(3)饲养管理
试验期间仔猪饲养在开放式猪舍内，舍内温度约在20-27℃。自由采食，每个栏圈安装有1个鸭嘴式饮水器供仔猪自由饮水。按猪场常规兽医传染病的免疫程序进行仔猪常见传染病的免疫，猪场管理按其日常管理方式。
(4)测定指标
在试验开始0d、15d、30d清晨逐头空腹称仔猪个体重和饲料用量，每天记录每栏仔猪的腹泻情况(临床表现)。计算断奶仔猪平均增重(kg/头)、饲料用量(kg)、料肉比、腹泻发病率、死亡率。每天记录各组粪便臭味程度。观察各组仔猪健康状况。
(5)结果一：全期增重及饲料转化率
五组仔猪体重变化、全期饲料用量、平均增重及料肉比的差异见表5。
表5全期各组仔猪增重及饲料转化率
从“平均增重”看，SBD高、中、低剂量组仔猪平均增重均高于空白对照组，表明粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848能促进仔猪生长；抗生素组与空白对照组平均增重差异不大。从“料肉比”看，抗生素组最优，SBD中剂量组仅次之。上述试验结果表明：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCC No.4848能够明显提高断奶仔猪的平均增重，降低料肉比。
(6)结果二：预防疾病及环境改善
全程试验中各组断奶仔猪腹泻率与腹泻程度见表6。粪肠球菌SBD试验组和抗生素对照组仔猪在全期饲养中全部成活，成活率100％；空白对照组死亡2头，成活率为89％。试验期中，空白对照组仔猪腹泻率为12.2％，抗生素组仔猪腹泻率为3.6％，SBD中剂量组腹泻率为3.5％，表明添加一定量的粪肠球菌SBD可以防治仔猪腹泻。
表6全期各组腹泻率与腹泻程度
注：腹泻率＝试验期内腹泻头数÷(试验天数×试验头数)×100％
此外，试验全期，粪肠球菌SBD组仔猪油光顺滑、粪便黑色，猪粪的臭味明显低于空白对照组和抗生素对照组。粪肠球菌SBD组猪圈内苍蝇量很少，猪皮肤表面光滑，而在空白对照组和抗生素对照组中，有很多仔猪皮肤表面有蚊虫叮咬或寄生虫感染所致的圆环状或红色小点。结果表明粪肠球菌(Enterococcus faecalis)SBD CGMCCNo.4848还能够改善猪圈的环境卫生。
Claims (10)
1.粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848。
2.根据权利要求1所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848，其特征在于：粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848是革兰氏阳性菌，显微镜下观察呈球形，不形成芽孢；在MRS琼脂平板上生长良好，48h形成圆整、光滑、隆起、灰白色露滴样、直径0.5-1mm大小、菌落；兼性厌氧生长，生长温度范围：10℃-50℃，最适生长温度：30℃-40℃；生长酸碱度范围：pH 4-10，最适pH值为6.5。
3.根据权利要求1所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848，其特征在于：粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848对金黄色葡萄球菌SA、伤寒沙门氏菌ST O4Hi、猪源产肠毒素型大肠杆菌E.coli O139和猪源致病大肠杆菌E.coli C83524、E.coli C83529、E.coli C83905均有较强的抑制作用。
4.根据权利要求1所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848，其特征在于：粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848可耐受pH 2.5合成胃液60min；最高耐受胆盐浓度为2.0％（质量百分比浓度）。
5.根据权利要求1所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848，其特征在于：粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848对复达欣、美满霉片、苯唑青霉素、四环素、卡那霉素、庆大霉素、强力霉素和丁胺卡那霉素不敏感。
6.根据权利要求1所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848，其特征在于：粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848对E.coli C83905感染有良好的免疫预防效果，饲喂粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCCNo.4848能有效降低小鼠受大肠杆菌攻毒时的发病率和死亡率。
7.一种粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848微生态菌剂，其活性成分为粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848。
8.一种制备权利要求7所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCCNo.4848微生态菌剂的方法，包括以下步骤：
1）配制YPD液体培养基：酵母浸粉10g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L，调节pH 6.5，115℃灭菌20min；
2）从斜面中接一环粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848到YPD液体培养基中，37℃静置培养10-24h，再按1％-10％（体积/体积百分比）的接种量进行两级培养，每级培养时间为10-24h，37℃静置培养，培养结束后，得到粪肠球菌（Enterococcus faecalis）SBD CGMCC No.4848微生态菌剂。
9.权利要求7所述的微生态菌剂在制备饲料添加剂或兽药中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述微生态菌剂的使用方法为：将微生态菌剂按107-108CFU/Kg体重/天的量添加到禽、畜饮用水或饲料中。
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