CN103664807A

CN103664807A - 3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103664807A
Application number: CN201310636902.XA
Authority: CN
Inventors: 孟凡桥; 梁剑平; 陶蕾; 贾忠; 张铎; 郝宝成; 赵凤舞
Original assignee: HEBEI MEIHE PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: HEBEI MEIHE PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2013-12-02
Filing date: 2013-12-02
Publication date: 2014-03-26

Abstract

本发明公开了3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物，其制备方法，采用一步法将乙酰甲喹与甲氧基苯甲醛通过羟醛缩合生成3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物。其活性实验表明，对大肠杆菌、金色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌等具有良好的抑菌活性。通过促生长及药物残留的研究，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）有较好的促生长作用，并且使用安全。本发明制备的3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）可作为一种畜禽的抗菌促生长兽药饲料添加剂可以得到广泛应用。

Description

3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种喹喔啉类化合物、其制备方法，以及在药物中应用。

背景技术

随着我国畜牧业生产规模化程度的不断提高，对高效、低毒、低残留的非营养性药物饲料添加剂的需求日益剧增。据不完全统计我国的畜禽饲养总量占世界总饲养量的1/4，而同年我国的兽药生产总值仅占世界兽药总产值的1/10，与我国饲养业大国的地位极不相称。每年经农业部进口的兽药(不含疫苗)68种以上，标志着我国兽用药品开发研究严重滞后。另一方面，因兽药品种单一、疗效差，使畜牧业生产中抗菌药物的滥用现象十分严重，细菌的耐药性大为增强，导致许多细菌性疾病难以控制，畜产品中药物残留严重超标。因此为迎应我国面临的严峻的国内外市场竞争，解决我国新兽药及饲料添加剂研究开发中品种单一、自主独立知识产权产品缺乏等问题，研究开发有良好应用前景和国内外市场竞争力的新型兽药及饲料添加剂迫在眉睫。

喹烯酮(MBQO)是我国首创的国家级一类新兽药，具有抗菌、促生长作用。经国家兽药审评办认定是一种安全、环保健康、高效新型的饲料添加剂。实验证明喹烯酮对提升动物疾病防控能力，提高饲料转化率，改善畜禽肉类品质，促进生长，增加养殖效益，具有重要意义。其结构为3-甲基-2-肉桂酰基-喹喔啉-1,4-二氧化物，由于其水溶性差，影响其生物利用度，故通过改变结构，引入助溶性基团-OH，提高了药物的极性，进而增大其溶解度，从而提高其生物利用度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种新的具有药用价值的喹喔啉类化合物，以及它的制备方法和用途。

本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：

3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物，结构式如Ⅰ，

R为甲氧基，

当R处于邻位时，该化合物为3-甲基-2-（o-甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物（a）；

当R处于间位时，该化合物为3-甲基-2-（m-甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物（b）；

当R处于对位时，该化合物为3-甲基-2-（p-甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物（c）。

3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物制备方法，采用一步法将乙酰甲喹与甲氧基苯甲醛通过羟醛缩合生成3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物。

可以先采用邻销基苯胺作为原料，通过氧化环化得到苯并呋咱后，与乙酰丙酮通过Beirut反应得到乙酰甲喹，再与甲氧基苯甲醛通过羟醛缩合反应一步缩合生成3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物。

进一步的，所述乙酰甲喹与甲氧基苯甲醛缩合反应，采用二乙胺作为催化碱，乙醇作为反应溶剂。所述乙酰甲喹：甲氧基苯甲醛：二乙胺：乙醇（W∶V∶V∶V）为（1.5～3）g：2mL：2mL：50mL。

所述乙酰甲喹与甲氧基苯甲醛缩合反应的温度控制在10～15℃，反应时间控制在4～8h。

作为优选方案，上述方法的具体操作步骤如下：

1）苯并呋咱的合成

将邻硝基苯胺溶于甲醇中，加入NaOH，搅拌至完全溶解，冰水浴下缓慢滴加浓度为1mol/L的NaClO溶液，约半小时加完，室温下继续搅2h，TLC跟踪检测，不断有浅黄色固体析出，加水，抽滤出固体，水洗干燥，得到橙黄色粗品，70%乙醇重结晶，得黄色片状结晶，即苯并呋咱；

2）乙酰甲喹的合成

向苯并呋咱中加过量乙酰丙酮18g，水浴温热至溶，振摇下加入三乙胺，再温热数分钟，室温下冷却，放置，逐渐析出结晶，10小时后析出大量的黄色结晶，抽滤，收集结晶，少量水洗涤，干燥，经无水乙醇重结晶，得鲜黄色针状结晶，即乙酰甲喹；

3）终产物的合成

将乙酰甲喹沉溶解于无水乙醇中，加入甲氧基苯甲醛，加热溶解，保持在50℃下滴加二乙胺，10-15℃下搅拌4～8h，在冰水浴中继续搅拌1h后，将反应物倒入带有冰的烧杯中，有大量沉淀析出，抽滤，用乙醇反复洗涤，得黄色产品，即3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物。

上述制备方法的各反应物或溶剂间的最佳比例关系及最佳的相关参数如下：

所述步骤1）中，所述邻硝基苯胺∶NaOH∶NaClO溶液∶水为40g∶21g∶250mL∶300mL；

所述步骤2）中，所述苯并呋咱∶乙酰丙酮∶三乙胺为10g∶18g∶40ml；

所述步骤3）中，所述乙酰甲喹：甲氧基苯甲醛：二乙胺：乙醇（W∶V∶V∶V）为2g：2mL：2mL：50mL，10-15℃下搅拌4h。

3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物作为制备抗菌促生长药物中的应用。

优选的，所述药物为兽药，将所述3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物的添加于饲料中，添加剂量为50mg/kg。

3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）是由本申请人在喹乙醇的基础上合成的一种新型药物饲料添加剂,不溶于水,可溶于二氧六环和二甲亚砜,其结构母环和喹乙醇结构母环(喹叨嗪)相同。

本发明3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物的相关药效试验：

一、3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）体外抑菌试验

1材料与方法

1.1试验药品喹喔啉（a）为美荷药业研制；喹烯酮由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所提供,纯度在98%以上。

1.2试验菌种试验菌种包括绿脓杆菌(1024)、大肠埃希氏菌(C83-1)、金黄色葡萄球菌(84184)、枯草芽孢杆菌,均由中国兽药监察所提供。

1.3试验方法

1.3.1试验药液配制准确称取3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）各75mg，分别加5mL二氧六环和二甲亚砜，加热溶解，再各加25mL肉汤，使两种药液的含量均为2.5mg/mL。

1.3.2菌液配制从标准菌试管斜面上挑选单个菌落,接种于2mL肉汤培养基中，370C培养24h，用肉汤作10-3稀释。

1.3.3最小抑菌浓度测定取不同浓度的3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）和喹烯酮药液培养基各2mL于试管中(每一菌株需一套以上药液试管)，每管加入相应菌液0.02mL，37℃培养24h后观察结果。

2结果与讨论

3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）、喹烯酮的溶解性试验与体外抑菌试验结果见表1、表2。

表1目标化合物在水中溶解度（μg/mL）

表2目标化合物的最小抑菌浓度MIC（μg/mL）

由表1可以看出目标化合物的溶解度：

3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）（b）(c)由表1得出其溶解性，化合物a比喹烯酮的溶解度提高了约8倍，b和c相当，比喹烯酮的溶解度提高约3倍。

由表2可以看出目标化合物的抑菌活性：

初步抑菌活性测试结果（表2）表明，经结构修饰后的喹烯酮衍生物a、b、c对受试菌株均表现出良好抑菌活性，其中化合物a、b最为突出，c略优于喹烯酮。

二、新型饲料添加剂3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）促生长及药物残留的研究

自1965年黎巴嫩贝鲁特（Beirut）的Haddalin和Issidorides发表Beirut反应第一篇文章以来，已有上百种应用该反应合成的专利问世和合成不下一千种新的N，N-二氮杂奈-1，4二氧化物（喹喔啉）类化合物。事实上，根据Beirut反应合成的多种喹喔啉化合物的取代衍生物如：痢立清（Catbadox）、喹乙醇（Olaquindox）、乙酰甲喹等作为抗菌及促生长剂应用于畜牧兽医及养殖业中，已取得了巨大的经济与社会效益。本文对我国研制的国家一类新兽药喹烯酮进行结构改造，基于已获得的这方面实验结果，已经发现喹烯酮分子结构发生了变化，且毒性不发生变化，抗菌活性明显增强，并通过化学分离、结构鉴定及化学合成，制备了3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）。为了在实践中安全应用，同时也为食品卫生安全方面提供一个可靠的依据，在对其进行一般毒理学研究的基础上，药物残留分析非常重要。

1 材料与方法

1.1 材料

3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）含量98%，美荷药业合成。喹乙醇，含量98%，购自山西芮城药业有限公司。喹烯酮，含量99%，中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所合成。雏鸡，1日龄安卡红羽，购自河北赵县华陇种鸡场。乙腈和甲醇，色谱纯，天津化学试剂厂生产。其余化学试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）与其它饲料添加剂的作用比较（试验鸡分组与饲养）

雏鸡400只，根据随机分组，雌雄各半的原则分为5组，组间初始体重差异不显著，组内又分为4个重复，分别接受空白对照，喹乙醇（50mg/kg）,3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）（50mg/kg），3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）（100mg/kg），喹烯酮（50mg/kg）五个处理。从1日龄开始饲喂自行配制的全价饲料和实验用药物添加剂，自由采食，自由饮水。每天记录采食量，每周称体重和剩余料量，并按饲养手册进行免疫。

1.2.2 3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）不同浓度梯度之间增重效果比较（试验鸡分组及饲养）雏鸡200只，饲喂一周后，根据随机分组，雌雄各半的原则分为4组，分组后经检验体重差异不显著，且每组又分为4个重复。4组分别接受空白对照，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）（50mg/kg），3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）（75mg/kg），3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）（100mg/kg），4个处理。饲养全程未加其他抗生素，饲养方法和第一批实验相同。每天记录投料量，每周称试鸡体重和余料量。饲养实验共56d。

1.2.3 3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）在鸡体内的药物残留分析

1.2.3.1 检测波长3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）有紫外吸收值，在紫外-可见分光光度计上检测到3个最高吸收峰的波长334 nm,254nm,228nm，经高效液相检测334nm波长比较理想。

1.2.3.2 流动相流动相选择范围比较大，改变流动相的种类和比例时，都会对柱效，分离效果产生大的影响。因此，我们在选择流动相时做了大量工作，根据极性和溶解性选择了乙腈，甲醇和水做流动相，乙腈和甲醇保留时间为3.16min，乙腈和水为7.32min，于是流动相定为水和乙腈。经检测3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）在该流动相中100ng–800ng在线性范围内。

1.2.3.3 制样准确称取2g组织，加入4mL乙腈在FSH-2上匀浆5分钟，准确匀取相当于1g组织的匀浆于10mL具塞离心管内，加入1mL饱和硫酸铵振荡20分，离心15分钟。吸出上清液加磷酸二氢钾溶液，加提取液3mL震荡20分钟，离心15分钟，吸出有机相，余液重复抽提一次，合并有机相，静置过夜，第二天吸出上层有机相，在40℃-50℃水浴上氮气缓慢吹干，-20℃保存待测。测定时用1mL流动相溶解，吸取100μL注入高效液相进行测定。

1.2.3.4 标准曲线的制作配制标准液时，准确称取10mg3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）纯品，用流动相溶解于100mL容量瓶内，作为第一贮备液。吸取第一贮备液1mL，用流动相定容于25mL棕色容量瓶内，浓度为4000ng/mL，作为第二贮备液。吸取第二贮备液0.625mL，1mL，1.5mL，2mL，2.5mL，3mL，4mL，5mL，浓度分别为100ng/mL，160ng/mL，240ng/mL，320ng/mL，400ng/mL，480ng/mL，640ng/mL，800ng/mL。称取空白组织2g，按制样方法处理，测定时加入配好的各浓度标准液1mLHPLC测定，由峰面积和浓度作标准曲线。

1.2.3.5 回收率的测定药品的配制时，准确称取10mg3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）纯品，用乙腈溶解于100mL容量瓶内，作为第一贮备液。吸取第一贮备液1mL，用乙腈定容于25mL棕色容量瓶内，浓度为4000ng/mL，作为第二贮备液。吸取第二贮备液0.625mL，2mL，4mL，5mL，浓度分别为100ng/mL，320ng/mL，640ng/mL，800ng/mL。称取空白组织2g，加入2mL配好的各浓度的标准液，匀浆5分钟，再加2mL乙腈混合均匀，准确匀取相当于1g组织的匀浆，以下同制样方法。上机测定后，由标准曲线计算出浓度，再计算回收率。

1.2.3.6 试验动物分组及采样用第一批实验中的空白对照鸡32只，随机分为8组，每组4只，观察一周，鸡只健康。于10月3日晚上20时用胶囊给药法，给药50mg/kg，每隔12h给药一次，共给药6次。采样时间依次为2，6，12，18，24，36，48，72h，在最后一次给药后2h，剖杀，取肌肉，肝脏，肾脏装于白色自封袋内，-200C冰箱中待测。

1.2.3.7 紫外检测器波长的确定用甲醇溶解微量3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a），浓度大约为0.02mg/ml，用紫外-可见光分光光度仪扫描，从扫描图（参见附图1）可以看到，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）在254nm和334nm处均有比较好的最高吸收峰。初步认为，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的紫外最好吸收波长为254nm和334nm，将3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）用乙腈配成低浓度溶液，然后经高效液相色谱仪测定，同样浓度时波长为334nm时，柱效好，检测到的峰面积相对大，由此推断，334nm作为紫外检测波长检测灵敏度高。

1.2.3.8 流动相的选择

首先根据3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的溶解性、极性以及一些溶剂的极性强度，配了几种流动相，分别为甲醇：乙腈(V:V=1:1)，甲醇：乙腈(V:V=3:2)，甲醇：乙腈(V:V=3:1)，经高效液相仪测定，保留时间均为3min左右。3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的出峰时间太早，对于作药物残留实验是不理想的，因为组织中存在大量干扰物质，如脂肪、蛋白质、脂肪酸、氨基酸等，这些物质的保留时间均在2-5min，所以3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的出峰时间最理想应该在5min以后，因此调整流动相成分，用双蒸水替代甲醇，重新配制流动相溶液，分别为乙腈：水(V:V=1:3)，乙腈：水(V:V=2:1)，乙腈：水(V:V=2:3)，测得保留时间分别为4.28、10.79、7.31，考虑组织中在6min以后杂质峰少，而且测定时相对节约时间和实验经费，将流动相定为乙腈：水(V:V=2:3)，保留时间为7.31min。

1.2.4 回收率的测定

1.2.4.1 溶于流动相的药物浓度测定

称取10mg3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）用流动相溶解于100ml容量瓶中，吸取1ml再容于25ml容量瓶中，流动相定容，然后分别吸0.625、2、4、5ml，定容于25ml容量瓶中，浓度分别为0.1、0.32、0.64、0.8μg/ml，进样100μl作HPLC分析。

1.2.4.2 贮备液配制

准确称取10mg3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）用乙腈溶解于100ml容量瓶内，作为第一工作贮备液，吸取第一工作贮备液1ml溶于25ml容量瓶内，用乙腈定容，作为第二工作贮备液，浓度为4μg/ml。

1.2.4.3制样及测定过程

分别吸取第二工作贮备液0.625、2、4、5ml，用乙腈定容于25ml容量瓶内，浓度分别为0.1、0.32、0.64、0.8μg/ml。然后准确称取2g空白组织（肝、肾和肌肉）加入2ml配制好的各浓度溶液，匀浆机上匀浆之后，再加入2ml乙腈，然后匀取相当于1g组织的匀浆，置于具塞的离心管内，加1ml饱和硫酸铵溶液，旋涡振荡器上振荡20min，（4000r/min）离心15min后，将上清液吸至另一10ml试管中，加入1.0ml,1mol/L的磷酸二氢钾溶液，加入提取液(乙腈：乙酸乙酯=3：2，V/V)3ml，振荡20min，（4000r/min）离心15min,吸出有机相于另一试管中，余液重复抽提一次。合并有机相，于-200C冰箱静置过夜，吸出有机相，在40～500C水浴上氮气吹干，-20℃保持至测定。测定前用1ml流动相溶解样品，0.45μm尼龙针筒式过滤器过滤，然后以100μl注入HPLC进行测定。共做4次重复。

1.2.4.4 计算回收率

结果见表3：

表3组织中不同浓度3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的回收率(%)

1.2.5最低检测限的测定

空白样品经处理后，上机测定。另取多份空白样品分别加入不同的较低浓度0.1μg/ml，0.05μg/ml，0.01μg/ml,的标准液，同样按同样处理程序后上机测定，对比二者即可得出最低检测限为0.01μg。

1.2.6标准曲线的制备

1.2.6.1标准溶液配制

分别吸取配好的第二工作贮备液0.625、1、1.5、2、2.5、3、4、5ml，用乙腈定容于25ml容量瓶内，浓度分别为0.1、0.16、0.24、0.32、0.4、0.48、0.64、0.8μg/ml。

1.2.6.2制样及测定过程

准确称取2g空白组织（肝、肾和肌肉）加入2ml配制好的各浓度标准液，匀浆机上匀浆之后，再加入2ml乙腈，然后匀取相当于1g组织的匀浆，置于具塞的离心管内，加1ml饱和硫酸铵溶液，旋涡振荡器上振荡20min，（4000r/min）离心15min后，将上清液吸至另一10ml试管中，加入1.0ml、1mol/L的磷酸二氢钾溶液，加入提取液(乙腈：乙酸乙酯=3：2，V/V)3ml，振荡20min，（4000r/min）离心15min，吸出有机相于另一试管中，余液重复抽提一次。合并有机相，于-20℃冰箱静置过夜，吸出有机相，在40～50℃水浴上氮气吹干，-20℃保持至测定。测定前用1ml流动相溶解样品，0.45μm尼龙针筒式过滤器过滤，然后以100μl注入HPLC进行测定。共做4次重复。

1.2.6.3制备标准曲线

将3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的色谱峰面积（S）与浓度（C）作直线回归，制备标准曲线。肌肉、肝脏、肾脏的标准曲线见表4。

表4组织中3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）高效液相标准曲线回归方程

1.2.6.4变异系数测定

分别吸取将配好的标准溶液中的0.1、0.32、0.64、0.8μg/ml各2ml加入2g空白组织中，按制样及测定过程进行测定，得出3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的色谱峰面积。每批内（日内）作六个重复，共作4个批次（日间），分别计算批内和批间峰面积平均值和标准误，结果见表5。

表5组织样品不同浓度的批内及批间的变异系数

2.给药后样品中3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的测定

2.1试验动物

由本实验室饲养52日龄健康安卡红羽肉鸡32只，公母各半，在饲养全程未添加任何药物，体重为2.11±0.14kg，随机分为8组，每组4只。

2.2试验方法

2.2.1给药

32只试鸡全部以50mg/kg的3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）剂量(每隔12h1次，连续使用6次)内服。给药方法是将3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）装入胶囊中,塞至舌根处，让其自然咽下。

2.2.2组织样品采集及处理

试鸡分别于最后一次内服3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）后2、6、12、18、24、36、48、72h剖杀，迅速取出肝、肾、胸肌，装于白色自封袋中，-20℃冰箱保存。

2.2.3组织中残留药物的萃取

准确称取2g组织，加4ml乙腈，在组织匀浆器上匀浆2min，取相当1g组织（肝、肾和肌肉）的匀浆置于10ml具塞离心管内，加1ml饱和硫酸铵溶液，旋涡振荡器上振荡20分钟，离心15min（4000r/min）后，将上清液吸至另一10ml试管中，加入1.0ml、1mol/L的磷酸二氢钾溶液，加入提取液(乙腈：乙酸乙酯=3：2，V/V)3ml，振荡20min，离心15min吸出有机相于另一试管中，余液重复抽提一次。合并有机相，于-20℃冰箱静置过夜，吸出有机相，在40～50℃水浴上氮气吹干，-20℃保持至测定。

2.2.4HPLC条件

色谱柱长25㎝，内径4.6㎜，固定相为Kromasil5u C18，流动相为水-乙腈(3：2，V/V)；流速1.0ml/min，柱温300C；紫外检测波长334nm。

2.2.5样品中3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的测定

测定前加入1ml流动相，在旋涡振荡器上震荡直到样品溶解，然后用0.45μm针筒式尼龙过滤器过滤，以100μl注入HPLC进行测定。所得空白肌肉组织图谱参见附图2，给药后肌肉组织图谱参见附图3，空白肾脏组织图谱参见附图4，给药后肾脏组织图谱参见附图5。

2.3数据分析处理

计算给药后每个时间点4只鸡的肌肉、肝、肾组织中的残留3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）浓度的平均值和标准误，再将各组织药物浓度的平均值-时间数据用计算机进行非线性最小二乘法回归处理。

3结果

3.13-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）与其它饲料添加剂的作用比较：饲喂42日龄后，经统计得出喹乙醇组比对照组日增重提高3.5%，采食量提高5.4%；3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）（50mg/kg）组比对照组日增重提高8.3%，采食量提高7.2%；喹烯酮（50mg/kg）组比对照组日增重提高8.18%，采食量提高7.29%。3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）（50mg/kg）和喹烯酮（50mg/kg）组相比增重效果和采食量差异不显著，参见表6.

表63-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）与其它饲料添加剂的作用比较（50mg/kg/d，总量到42天）

3.23-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）不同浓度梯度之间增重效果统计：添加50mg/kg3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）采食量和日增重分别比对照组提高7.28%和8.93%；75mg/kg3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）组比对照组采食量和日增重提高4.4%和4.97%；而100mg/kg3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）组和对照组比稍有提高，但差异不显著。因此，在鸡的日粮中添加50mg/kg3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）增重效果比较理想，参见表7。

表73-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）不同浓度梯度之间增重效果比较（50mg/kg/d，总量到42天）

3.3各时间点的组织药物浓度

以50mg/kg剂量给鸡内服3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a），每12h一次，连用6次，第6次给药后，各时间点宰杀鸡的组织药物浓度见表8、9、10。

表83-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）停药后肝脏组织中的药物浓度(ng/g)(n=4)

ND：不可测得(Not Detectable)

表93-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）停药后肾脏组织中的药物浓度(ng/g)(n=4)

ND：不可测得(Not Detectable)

表103-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）停药后肌肉组织中的药物浓度(ng/g)(n=4)

ND：不可测得(Not Detectable)

3.4鸡多次内服3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）后的组织残留及消除经计算机回归处理，肌肉、肝、肾组织药物浓度（Cμg/ml）与时间（t h）关系的消除曲线方程可用下述数学表达式描述：

C肌=6.642e-0.1145t

C肝=6.568e-0.1099t

C肾=6.501e-0.1001t

3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）在鸡的各组织中的消除速率常数、消除半衰期及达到0.001μg/g的理论残留时间见表11。

表11鸡多次内服3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）后药物在组织中的消除

4.讨论

给药2h后的组织中药物浓度以肾脏最高为802.29(ng/g)，之后随着各采样时间逐渐降低。经测定，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）在鸡肌肉，肝脏和肾脏中浓度较低，给药18h后，肌肉中所测到的残留浓度为104.90±3.22(ng/g)，肝脏中为112.00±14.2(ng/g)，肾脏中为123.18±5.49(ng/g)。到给药后24h，组织中3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）浓度已低于检测限（0.1μg/g）。根据3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）在鸡体内组织消除半衰期以及组织浓度测定结果可以推测，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）在鸡体内可能在2h内达到最大药物浓度，以后逐渐降低。3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）和喹乙醇都属于喹喔啉-1，4-二氧化物类合成抗生素，经高效液相色谱仪进行药物残留分析，可以看到3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）在鸡组织中残留达到1(ng/g)的时间与喹乙醇达到同样浓度时的时间几乎相同，即若喹乙醇按30mg剂量多次给药后，达到同样浓度1(ng/g)也需要3d。在家禽饲养中，喹乙醇的添加剂量和中毒剂量比较接近，而且家禽对其敏感性高，很容易发生中毒现象，因此一些国家（包括我国）已明确禁止在鸡饲料中添加喹乙醇。3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）残留低，毒副作用小，停药期短，是喹乙醇最理想的替代品。

5.小结

按50mg的剂量多次内服给药，若规定组织中3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的最高残留限量为0.001mg/kg，则肌肉需要2.42d，肝脏需要2.49d，肾脏需要2.71d，最终的休药期则可定为3d。实践证明，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）在试鸡体内残留低，毒性小，停药期短。是一种高效低毒、有良好抗菌促生长作用和比较安全的药物饲料添加剂。

通过上述试验可以的得出以下结论：与其它喹喔啉饲料添加剂比，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）促生长效果显著，日增重、采食量和饲料转化率等显著高于喹乙醇组，毒副作用小。与喹烯酮比，各项指标都优于与喹烯酮。由本试验可看出，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）50mg/kg、75mg/kg组试鸡日增重、采食量和饲料转化率都提高，但100mg/kg组的各项指标有下降趋势。因此，50mg/kg的添加剂量最理想，既发挥其促生长作用，又使组织残留量最小。通过本次试验，筛选出3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的高效液相测定条件，为测定3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的药物残留奠定了基础。3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）在肉鸡组织中的消除及残留表明，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）在鸡组织中消除迅速，残留少，停药期短。因此，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）是高效低毒，具有良好促生长作用和比较安全的新型饲料添加剂，可望成为喹乙醇的更新换代产品，解决了养禽业中添加剂缺乏的现状。

本发明通过首先采用邻硝基苯胺作为原料，通过氧化环化得苯并呋咱后，与乙酰丙酮通过Beirut反应生成乙酰甲喹，再与2-甲氧基苯甲醛（或3-甲氧基苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛）通过Claisen-Schumidt缩合，得到喹烯酮（MBQO）衍生物a～c缩合生成3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物。通过药效学试验，目标化合物与喹烯酮对比，药物溶解性有所提高。初步的活性实验表明，对大肠杆菌、金色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌等具有良好的的抑菌活性。通过促生长及药物残留的研究，3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）有较好的促生长作用，并且使用安全。本发明制备的3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）可作为一种畜禽的抗菌促生长兽药饲料添加剂可以得到广泛应用。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明13-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）紫外扫描图；

图2是给药后样品中3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的测定中的空白肌肉组织高效液相图谱；

图3是给药后样品中3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的测定中的给药后肌肉组织图谱；

图4是给药后样品中3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的测定中的空白肾脏组织高效液相图谱；

图5是给药后样品中3-甲基-2-(甲氧基苯乙烯酮基)-喹喔啉-1,4-二氧化物（a）的测定中的给药后肾脏组织高效液相图谱；

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

3-甲基-2-（o-甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物的制备

结构式如下：

R为甲氧基。

其制备方法为：

1）苯并呋咱的合成

邻硝基苯胺（40g，0.29mol）溶解于225ml甲醇溶液，加入21gNaOH，搅拌至完全溶解，冰水浴下缓慢滴加1mol/L浓度为的NaClO250ml，约半小时加完，室温继续搅拌2h，TLC跟踪检测，不断有浅黄色固体析出，加入300ml水，抽滤出固体，水洗干燥，得到橙黄色粗品，70％乙醇重结晶，得黄色片状结晶。产量33g，产率83％。

1HNMR(CDCl3)δppm:7.81-7.90(m,2H),8.55-8,58(d,1H),8.62-8.64(d,1H);13CNMR(CDCl3)δppm:113.3,114.7,118.2,132.4,133.8,153.4.

2）乙酰甲喹的合成

苯并呋咱（10g，73.5mmol），加过量乙酰丙酮18g，水浴温热至溶，振摇下加入三乙胺40ml，再温热数分钟，室温下冷却，放置，逐渐析出结晶，10小时后析出大量的黄色结晶。抽滤，收集结晶，少量水洗涤，干燥，产量11g，无水乙醇重结晶，得鲜黄色针状结晶，产率68％。mp153-154℃。1HNMR(CDCl3) δppm:2.52(s,3H),2.71(s,3H),7.81-7.89(m,2H),8.53-8.55(d,1H),8.60-.62(d,1H);13CNMR(CDCl3)δppm:13.8,29.9,78.6,77.0,77.3,120.0,120.2,131.5,132.6。

3）终产物的合成

R为甲氧基。

称取2g乙酰甲喹加入50ml无水乙醇，搅拌加入2ml，2-甲氧基苯甲醛，加热溶解，保持50℃下滴加2ml二乙胺，颜色逐渐变为褐色，10-15℃搅拌反应4h，在冰水浴中继续搅拌1h，后将反应物倒入带有冰的烧杯中，有大量沉淀析出，抽滤，乙醇反复洗涤，得化合物a。淡黄色粉末1.783g，产率55%。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ:10.25(s，1H)，8.52(d，J=8Hz，1H)，8.44(d，J=8Hz，1H)，7.98(m，2H)，7.85(d，J=16.4Hz，1H)，7.57(d，J=7.2Hz，1H)，7.36～7.27(m，2H)，6.93(d，J=8Hz，3H)，6.83(t，J=8Hz，1H)，2.37(s，3H)。

13CNMR(400MHz，DMSO-d6)δ:187.23，158.12，144.61，138.93，138.87，137.53，136.63，133.06，132.43，131.49，130.88，125.28，120.58，119.64，119.41，117,10，116.55，13.98。

实施例2

3-甲基-2-（m-甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物的制备

结构式如下：

R为甲氧基。

其制备方法与实施例1参照实施例1，区别之处在于：步骤3）中采用3-甲氧基苯甲醛。

最终得化合物b。淡黄色粉末1.685g，产率52%。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ:9.70(s，1H)，8.52(d，J=5.6Hz，1H)，8.43(d，J=5.6Hz，1H)，7.98(s，2H)，7.78(d，J=16Hz，3H)，7.24～7.10(m，4H)，6.89(s，1H)，2.34(s，3H)。

13CNMR(400MHz，DMSO-d6)δ:187.28，157.76，149.19，138.93，138.57，137.66，136.71，135.31，132.40，131.43，130.05，125.30，120.15，119.64，119.64，118.82，117,10，115.40，13.99。

实施例3

3-甲基-2-（p-甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物的制备

结构式如下：

R为甲氧基。

其制备方法与实施例1基本相同，区别之处在于：步骤3）中采用4-甲氧基苯甲醛。

最终得化合物c。淡黄色粉末1.366g，产率42%。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ:10.31(s，1H)，8.52～8.43(m，2H)，7.98(s，2H)，7.74(d，J=14.4Hz，,3H)，7.61(s，2H)，7.01(d，J=14.8Hz，1H)，6.81(s，2H)，2.35(s，3H)。

13CNMR(400MHz，DMSO-d6)δ:187.35，161.65，150.38，139.32，138.00，137.18，135.51，132.74，132.00，131.83，129.81，125.55，122.58，120.11，117,10，116.41，14.49。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物，结构式如Ⅰ，

R为甲氧基。

2.根据权利要求1所述的3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物制备方法，其特征在于：采用一步法将乙酰甲喹与甲氧基苯甲醛通过羟醛缩合生成3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物。

3.根据权利要求2所述的3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物制备方法，其特征在于：先采用邻销基苯胺作为原料，通过氧化环化得到苯并呋咱后，与乙酰丙酮通过Beirut反应得到乙酰甲喹，再与甲氧基苯甲醛通过羟醛缩合反应一步缩合生成3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物。

4.根据权利要求2或3所述的3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物制备方法，其特征在于：所述乙酰甲喹与甲氧基苯甲醛缩合反应，采用二乙胺作为催化碱，乙醇作为反应溶剂。

5.根据权利要求4所述的3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物制备方法，其特征在于：所述乙酰甲喹：甲氧基苯甲醛：二乙胺：乙醇（W∶V∶V∶V）为（1.5～3）g：2mL：2mL：50mL。

6.根据权利要求4所述的3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物制备方法，其特征在于：所述乙酰甲喹与甲氧基苯甲醛缩合反应的温度控制在10～15℃，反应时间控制在4～8h。

7.根据权利要求5或6所述的3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物制备方法，其特征在于：具体操作步骤如下：

1）苯并呋咱的合成

2）乙酰甲喹的合成

3）终产物的合成

8.根据权利要求7所述的3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物制备方法，其特征在于：所述步骤1）中，所述邻硝基苯胺∶NaOH∶NaClO溶液∶水为40g∶21g∶250mL∶300mL；所述步骤2）中，所述苯并呋咱∶乙酰丙酮∶三乙胺为10g∶18g∶40ml；所述步骤3）中，所述乙酰甲喹：甲氧基苯甲醛：二乙胺：乙醇（W∶V∶V∶V）为2g：2mL：2mL：50mL，10-15℃下搅拌4h。

9.3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物作为制备抗菌促生长药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述药物为兽药，将所述3-甲基-2-（甲氧基苯乙烯酮基）-喹喔啉-1，4-二氧化物的添加于饲料中，添加剂量为50mg/kg。