CN101744883B - 一种中药组合物制剂及制备方法和质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药组合物制剂及制备方法和质量控制方法，特别公开了一种清热解毒、消炎的中药组合物制剂及制备方法和质量控制方法。本发明中药组合物制剂原料组成为：金银花提取物10-50重量份、黄芩提取物5-30重量份、糊精60-180重量份、甜菊素0.5-2.0重量份。本发明中药组合物无糖型颗粒剂将传统工艺中原有的蔗糖、淀粉改为糊精、甜菊素，使得其除了具有一般颗粒剂的特点外，还具有药物的稳定性好、减少了药物赋形剂用量和改善了中药制剂形象、疗效增强等优势。本发明还还公开了绿原酸含量测定和黄芩苷含量测定以及微生物限度检查法。经实验证明检测专属性好、稳定性高、重现性好、精密度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物制剂及制备方法和质量控制方法，特别涉及一种清热解毒、消炎的中药组合物制剂及制备方法和质量控制方法。
背景技术
炎症是指具有血管系统的活体组织对各种损伤因子的刺激所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。局部的血管反应是炎症过程的主要特征和防御反应的中心环节。炎症的局部表现为红、肿、热、痛和功能障碍，也伴有发热、末梢血白细胞计数改变等全身反应。
金银花、黄芩作为清热解毒、消炎的中药，经常被组合运用，效果甚佳。但是现有技术在对该组合物的工艺及质量进行有效控制时，仍存在很多缺陷，有待进一步提高。
发明内容
本发明目的在于提供一种中药组合物制剂；本发明第二个目的在于提供一种清热解毒、消炎的中药组合物制剂；本发明的第三个目的在于提供该中药组合物制剂的制备方法；本发明的第四个目的在于提供该中药组合物制剂的质量控制方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
本发明一种清热解毒、消炎的中药组合物制剂的原料组成为：金银花提取物10-50重量份、黄芩提取物5-30重量份、糊精60-180重量份、甜菊素0.5-2.0重量份。
本发明一种清热解毒、消炎的中药组合物制剂的原料组成优选为：金银花提取物30重量份、黄芩提取物12重量份、糊精126.8重量份、甜菊素1.18重量份。
本发明一种清热解毒、消炎的中药组合物制剂的制备方法为：取金银花，加水煎煮1-3次，第一次加水6-10倍量煎煮1-3小时，第二次加水4-8倍量煎煮1-3小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮1-3次，每次0.5-1.5小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至1-3，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按比例混合，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或药学上可接受的剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、散剂、软胶囊剂、滴丸、蜜丸、丸剂、颗粒剂、蜜炼膏剂、缓释制剂、速释制剂、控释制剂、口服液体制剂、注射制剂或外用制剂。
本发明一种清热解毒、消炎的中药组合物无糖型颗粒剂的制备方法优选为：取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按比例混合，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000重量份，即得。
一种原料包含金银花提取物、黄芩提取物的清热解毒、消炎的中药组合物制剂的质量控制方法，该方法包括如下含量测定和/或微生物限度检查法中的一种或两种或三种：
A、含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以5-15∶50-150比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加40％-60％甲醇制成每1ml含10-30μg的溶液，作为对照品溶液，5℃-15℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物制剂0.5-1.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加40％-60％甲醇40-60ml，称定重量，超声处理20-40分钟，放冷，再称定重量，用40％-60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液4-6ml，置15-35ml棕色容量瓶中，加40％-60％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-15μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
B、含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以45-65∶35-55比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为260-300nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加60-80％乙醇制成每1ml含40-60μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物制剂0.5-1.5g，研细，精密称定，置80-120ml量瓶中，加60-80％乙醇至刻度，功率240-260W，频率40-60Hz条件下超声处理20-40分钟，放冷，用60-80％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-15μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
C、微微生物限度检查法：取供试品5-15g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至80-120ml，振摇，使呈0.5-1.5∶5-15的供试品储备液，取0.5-1.5∶5-15的供试品储备液5-15ml，400-600转/分离心3-8分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至5-15ml，2800-3200转/分离心10-30分钟，取底部集菌液1-3ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至5-15ml，即为0.5-1.5∶5-15的供试液；细菌检查采用离心加稀释法，取0.5-1.5∶5-15的供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查，霉菌、酵母菌检查取0.5-1.5∶5-15的供试品储备液，依常规中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查；大肠杆菌检查取0.5-1.5∶5-15的供试品液，依中国药典2005年版一部附录XIIIC离心加稀释法检查；1g供试品中，细菌数不得过800-1200个，霉菌和酵母菌数不得过80-120个，大肠杆菌不得检出。
上述质量控制方法优选包括如下含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物中药组合物制剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述质量控制方法中优选包括如下微生物限度检查法：
微生物限度：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1∶10的供试品储备液，取1∶10的供试品储备液10ml，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，即为1∶10的供试液；细菌检查采用离心加稀释法，取1∶10的供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查，霉菌、酵母菌检查取1∶10的供试品储备液，依常规中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查；大肠杆菌检查取1∶10的供试品液，依中国药典2005年版一部附录XIIIC离心加稀释法检查；1g供试品中，细菌数不得过1000个，霉菌和酵母菌数不得过100个，大肠杆菌不得检出。
上述质量控制方法中优选包括如下含量测定：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以55∶45比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物中药组合物制剂1.0g，研细，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，功率250W，频率50Hz条件下超声处理30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述质量控制方法中药组合物制剂优选原料组成为金银花提取物30重量份、黄芩提取物12重量份、糊精126.8重量份、甜菊素1.18重量份的无糖型颗粒剂，并通过如下方法制备：取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按比例混合，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000重量份，即得无糖型颗粒剂。
上述质量控制方法中药组合物制剂优选原料包含金银花提取物100重量份、黄芩提取物40重量份的颗粒剂，并通过如下方法制备：取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮1小时，第二次加水6倍量煎煮1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；取金银花提取物100重量份、黄芩提取物40重量份，加庶糖粉800重量份与淀粉适量，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000重量份，即得颗粒剂。
上述质量控制方法中药组合物制剂优选原料包含金银花提取物100重量份、黄芩提取物40重量份的胶囊剂，并通过如下方法制备：取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮1小时，第二次加水6倍量煎煮1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；取金银花提取物100重量份、黄芩提取物40重量份，加淀粉适量，均匀，60℃以下干燥，分装入胶囊，制成1000重量份，即得胶囊剂。
附图说明
附图1无糖型和含糖型颗粒吸湿性对比图(A为含糖颗粒、B为无糖颗粒)
附图2绿原酸的紫外全波长扫描图
附图3绿原酸含量测定流动相选择图(A绿原酸对照品、B银黄颗粒、C缺金银花阴性对照1绿原酸)
附图4不同提取溶剂提取绿原酸提取率的比较图
附图5不同方法提取绿原酸提取率的比较图
附图6不同溶剂量提取绿原酸提取率的比较图
附图7不同提取时间提取绿原酸提取率的比较图
附图8透明容量瓶和棕色容量瓶对保存样品溶液稳定性的比较图
附图9保存温度对样品稳定性影响图
附图10绿原酸标准曲线图
本发明一种清热解毒、消炎的中药组合物制剂由于其原料的特定配比选择，实验证明具有成型良好等优势。
本发明一种清热解毒、消炎的中药组合物无糖型颗粒剂将传统工艺中原有的蔗糖、淀粉改为糊精、甜菊素，使得其除了具有一般颗粒剂的特点外，还具有以下优势：(1)药物的稳定性好：它避免了含糖颗粒剂的易潮解、软化变质、不宜久存的不足，从而提高了药物稳定性，又保证了药物的临床疗效。(2)减少了药物赋形剂用量和改善了中药制剂形象：由于减少了大量使用的蔗糖等赋形剂的用量，故药物的单剂包装质量大为减少，使药物服用、携带均较为方便。(3)扩大了应用范围：因为蔗糖具有较强的生物活性，能引发胃炎、导致肥胖、诱发糖尿病和儿童龋齿，使得颗粒剂不宜用于糖尿病等禁糖患者。中药无糖颗粒剂的问世，使许多儿童、老年和禁糖患者的用药限制得以解除。本发明无糖型颗粒剂同时改善了原有剂型的吸湿性问题。通过对比无糖型颗粒及含糖颗粒的吸湿百分率可以看出，无糖型颗粒的抗湿性强于含糖颗粒。通过临床对比实验也发现：本发明无糖型颗粒剂与原传统工艺含糖型颗粒剂对二甲苯所致小鼠耳肿胀以及蛋清性大鼠足跖肿胀均有非常显著的抑制作用、且无糖型颗粒剂疗效优于含糖型颗粒剂。
本发明一种清热解毒、消炎的中药组合物制剂按照中国药典2005年版微生物限度检查法首次进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证试验及菌落计数实验。试验结果表明对于细菌、霉菌及酵母菌检查采用离心加稀释法进行细菌检查可消除本品的抑菌作用，采用常规法进行本品霉菌和酵母菌检查，方法可行；对于控制菌检查，实验组控制菌生长良好，本品对大肠杆菌没有抑菌作用。阴性菌均未检出，表明该控制菌检查方法的专属性好。阳性对照试验检出相应控制菌，阴性对照无菌生长，可采用离心加稀释法进行本品的大肠杆菌检查。本发明中药组合物制剂还增加了绿原酸含量测定和黄芩苷含量测定，经实验证明：本发明含量测定方法检测专属性好、稳定性高、重现性好、精密度高，更加适合工业化的生产，真正确保了临床用药的安全、有效、可靠。
下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
本发明所有实验例所选用的制剂均为根据本发明实施例1制得的本发明颗粒剂，但是本发明实验结果并不仅限于该颗粒剂。
实验例1：生产工艺筛选实验
1.药材的鉴定与前处理
本方制剂及生产用药材均依照中国药典2005年版一部各项下中药饮片所载相关品种标准鉴定和前处理。
黄芩：本品为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。春、秋二季采挖，除去须根及泥沙，晒后撞去粗皮，晒干。应符合《中国药典》2005年版一部211页黄芩项下规定。
金银花：本品为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thuna.的干燥花蕾或带初开的花。夏初花开前采收，干燥。检验依据：应符合《中国药典》2005年版一部152页金银花项下规定。
2.提取工艺
参照传统银黄颗粒提取工艺确定了无蔗糖颗粒的提取工艺参数。
2.1金银花提取工艺
表1水提取工艺
表2石硫法提取工艺
2.2黄芩提取工艺
表3水提取工艺
表4酸沉工艺
3.制剂成型工艺研究
参考生产中的提取和制粒数据，改变制成量为原来的一半量，变更包装规格为2g/袋，服用量和服用方法保持不变。采用无蔗糖颗粒常用辅料糊精和甜菊素，实验考察了制粒的工艺条件，初步确定了银黄颗粒(无蔗糖)的制剂成型工艺，见表5。
表5银黄颗粒(无蔗糖)制粒工艺考察
由实验结果可知，实验组4的试验参数符合工艺的要求，在已有生产工艺下，银黄无蔗糖颗粒成型良好，可进行试制生产。
5、中试生产工艺研究
依照上述试验所确定的工艺，共进行了3批批量分别为10000袋的中试规模生产，以考察工艺的稳定性。生产数据见表5。
表5中试生产工艺数据
结果表明：三批生产工艺均达到设计要求。说明大生产工艺稳定。以上述中试样品分别作为质量研究及稳定性考察使用。
实验例2：生产工艺对比实验
无糖型颗粒剂的优点除了扩大制剂的使用人群以外，同时改善了原有剂型的吸湿性问题。通过对比无糖型颗粒及含糖颗粒的吸湿百分率可以看出，无糖型颗粒的抗湿性强于含糖颗粒。
吸湿百分率的测定：将称量瓶烘至恒重，冷却后准确称重，分别加入无糖型颗粒及含糖颗粒，在底部均匀摊成厚约2mm，打开瓶盖105℃烘约5h至恒重，取出，干燥器中冷却，准确称重。另将底部盛有NaCl过饱和溶液的干燥器放入25℃恒温培养箱内24h，此时恒温培养箱内的相对湿度为75％，将烘至恒重的药粉瓶放入干燥器内，打开瓶盖，放入干燥器上部，于25℃恒温培养箱内保存，每隔一定时间称量一次，按下式计算各时间的吸湿百分率。结果见附图1。
吸湿率(％)＝[(吸湿后药粉重量-吸湿前药粉重量)/吸湿前药粉重]×100％
通过无糖型和含糖型颗粒吸湿性的对比可以看出无糖型颗粒的抗湿性明显优于含糖颗粒，无糖处方所制颗粒不易吸湿软化，而含糖型颗粒粒易吸湿软化粘连。
实验例3：药效学实验
1、银黄颗粒对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响
试验方法：小鼠30只，体重18~22g，雌雄各半，按体重随机分为3组，即银黄颗粒大、小剂量组、空白对照组，用药组灌胃给药，空白对照组给等量生理盐水，连续3d，末次给药30min后，在小鼠右耳廓涂二甲苯0.05mL，0.5h后处死动物，用6mm打孔器沿左右耳廓相同部位打孔取材，用扭力天平称重，以耳片重差值作为肿胀度，并求出抑肿率。结果见表6。
抑肿率(％)＝[(空白组白组平均肿-给药组平均肿胀率)/空白组白组平均肿]×100％
表6银黄颗粒对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响
**P＜0.01
从表6可知银黄颗粒对二甲苯所致小鼠耳肿胀有非常显著的抑制作用。
2、银黄颗粒对大鼠蛋清性足跖肿胀的影响
试验方法：大鼠30只，体重180~200g，雌雄各半，按体重随机分为3组，即银黄颗粒大、小剂量组，、空白对照组。用毛细管放大法测量各组大鼠右后踝关节下相同位置的足跖体积。用药组灌胃给药3d，末次给药后60min，在各组动物右后足跖皮下注射100％新鲜蛋清0.05mL，从末次给药时计时，每隔2h测致炎后的大鼠足跖体积，致炎前后足跖体积差为肿胀率，结果见表7。
表7银黄颗粒对蛋清性大鼠足跖肿胀的影响
＊＊P＜0.01
从表7可知银黄颗粒对蛋清性大鼠足跖肿胀有非常显著的抑制作用。
3、抗炎机制的研究
3.1炎性组织中组胺含量测定
试验的基本原理是将组织中所含组胺用酸化正丁醇提取，经正庚烷处理除去干扰物质，提高检测结果的特异性萃取液在碱性条件下，与邻苯二甲醛(OPT)缩合产生一强而稳定的荧光物质，于荧光分光光度计测定荧光强度以作组胺定量。取健康SD♂大鼠40只，体重120~150g，按体重随机分为5组，灌胃。连续3d，末次给药后1h，每只大鼠右后足跖部皮下注射10％的新鲜蛋清生理盐水溶液0.1mL同时灌胃生理盐水[4mL·(100g)-1]行水负荷。致炎后40min沿踝关节上0.5mm处剪下致炎足，剔除骨后称重，划破皮肤组织后浸泡于酸化正丁醇4.mL中4h，再用超声波处理20min，去除组织，离心。取上清液2.5mL加正庚烷3.0mL及0.1mol·5min-1，得0.5mL水相2份，1份分别依次加入如下试剂：注射用水1.5mL及0.4mol·L-1氢氧化钠0.5mL混匀后再加0.1％的邻苯二甲醛甲醇溶液0.1mL于22℃水浴中反应10min，加0.5mol·L-1的盐酸0.5mL终止反应，于360nm激发，在450nm处测定荧光强度为组胺含量。另以0.1mol·L-1盐酸0.5mL代替水相作为空白管，以2.5mL酸化正丁醇加0.05mL浓度为5mg·L-1的组胺盐酸溶液代替样品上清液为标准管，进行试验，试验所测荧光强度按下列公式计算组胺含量，并计算回收率为93％~100％，结果见表8。
表8 VOCM对蛋清致大鼠足肿胀炎性足组织中组胺和5-羟色胺含量的影响(X±s，n＝9)
3.2炎性组织中5-HT含量测定
该原理是用稀盐酸提取的5-HT在酸性条件下可与OPT缩合，生成荧光化合物。上述荧光化合物的荧光强度与深度在一定范围内呈线性关系，因而可通过测定其荧光强度来进行定量。取上述未处理过的水相分别依次加入如下试剂：0.5％半胱氨酸0.1mL及6％的邻苯二甲醛盐酸溶液3mL，混匀后再加0.1mL0.02％碘酸钠溶液，沸水浴10min，取出置水中冷却，于365nm激发，在480nm处测定荧光强度为5-HT含量，计算方法同上。结果见表8。
本药理研究证明，二甲苯所致小鼠耳肿胀及蛋清所致大鼠足跖肿胀是一种非特异性急性炎症模型，主要表现为局部的充血、水肿及渗出。本实验显示银黄颗粒对二种肿胀均有明显的抑制作用，抗炎机制与抑制传统炎症介质组织胺、5-羟色胺的释放有关。
实验例4：药效学对比实验
1、对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响
试验方法：小鼠30只，体重18~22g，雌雄各半，按体重随机分为3组，即无糖型及含糖型组和空白对照组，用药组灌胃给药，空白对照组给等量生理盐水，连续3d，末次给药30min后，在小鼠右耳廓涂二甲苯0.05mL，0.5h后处死动物，用6mm打孔器沿左右耳廓相同部位打孔取材，用扭力天平称重，以耳片重差值作为肿胀度，并求出抑肿率。结果见表9。
表9含糖及无糖银黄颗粒对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响对比试验
＊＊与空白对照组比较P＜0.01 △与含糖银黄颗粒组比较P＜0.05
从表9可知银黄颗粒对二甲苯所致小鼠耳肿胀有非常显著的抑制作用。且无糖型优于含糖型颗粒疗效。(含糖银黄颗粒为实施例16的方法制备)
2、银黄颗粒对大鼠蛋清性足跖肿胀的影响
试验方法：大鼠30只，体重180~200g，雌雄各半，按体重随机分为3组，即无糖型及含糖型组和空白对照组。用毛细管放大法测量各组大鼠右后踝关节下相同位置的足跖体积。用药组灌胃给药3d，末次给药后60min，在各组动物右后足跖皮下注射100％新鲜蛋清0.05mL，从末次给药时计时，每隔2h测致炎后的大鼠足跖体积，致炎前后足跖体积差为肿胀率，结果见表10。
表10含糖及无糖银黄颗粒对蛋清性大鼠足跖肿胀的影响对比试验
＊＊与空白对照组比较P＜0.01 △与含糖银黄颗粒组比较P＜0.05
从表10可知银黄颗粒对蛋清性大鼠足跖肿胀有非常显著的抑制作用。且无糖型优于含糖型颗粒疗效。
实验例5：绿原酸含量测定方法实验
银黄颗粒由金银花提取物和黄芩提取物组方而成，可清热，解毒，消炎。用于急慢性扁桃体炎，急慢性咽喉炎，上呼吸道感染。方中金银花为君药，具有清热解毒，疏散风热的功效。金银花中绿原酸可抗炎、抗病毒，为中金银花有效成分。所以选择测定绿原酸含量作为控制银黄颗粒质量的方法。
1、绿原酸的性质：
绿原酸(Chlorogenic acid)是由咖啡酸(Caffeic acid)与奎尼酸(Quinic acid)生成的苯丙素类化合物，异名咖啡鞣酸，系统名1，3，4，5-四羟基环己烷羧酸-(3，4-二羟基肉桂酸酯)。分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分，因此易溶于乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂，微溶于乙酸乙酯，难溶于三氯甲烷、乙醚、苯等亲脂性有机溶剂，通常利用乙醇、丙酮、甲醇等溶剂在低温条件下将其从植物中提取出来，且应避免高温和长时间加热。
2、测定方法的选择
有关金银花中绿原酸含量测定方法文献报道有比色法、紫外分光光度法、薄层扫描法、纸色谱-紫外分光光度法、薄层色谱-紫外分光光度法、毛细管区带电泳法、导数光谱法、高效液相色谱法等，为了减少不同试验过程造成的误差，选择高效液相色谱法测定绿原酸含量，高效液相色谱法具有快速简便、灵敏准确、专属性强、重现性好等特点。
3、检测波长的选择：
将绿原酸对照品溶液利用紫外分光光度计进行全波长扫面，得到绿原酸的紫外全波长扫描图见附图2：
试验结果表明：绿原酸最大吸收峰为327、246、220。通过选用三个不同检测波长检测银黄颗粒中的绿原酸优选检测波长：327nm杂质较少，吸收背景小，绿原酸的得到较好分离，峰对称性好，峰面积较246、220nm最大，灵敏度高，检测时误差小，能够满足质量控制的要求；246、220nm下杂质较多，绿原酸较难分离，定量准确度下降。所以选择327nm作为检测波长。
4、流动相的优选：
本试验曾以甲醇-1.15％冰醋酸(11∶89)、甲醇-乙腈-水(10∶2.5∶87)、乙腈-0.4％磷酸溶液(13∶87)等系统作为流动相作了系列比较。结果表明，利用绿原酸为含羧基和邻二酚羟基的强极性有机酸的性质，调节乙腈与0.4％磷酸溶液的比例，排除其他成分的干扰，使绿原酸保留时间和峰形都适宜，最后选定乙腈-0.4％磷酸溶液(10∶90)为流动相，对本品分离效果好，峰形对称，杂质峰达到基线分离，阴性无干扰。见附图3。
5、银黄颗粒中绿原酸提取条件的考察：
5.1提取溶剂的选择：
选择乙醇、甲醇、20％甲醇、50％甲醇、80％甲醇为提取溶剂提取银黄颗粒中绿原酸。
取银黄颗粒约1.0g五份，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入乙醇、甲醇、20％甲醇、50％甲醇、80％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用相应提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加相应提取溶剂至刻度，摇匀，即得。精密吸取上述5个供试品溶液10μL注入液相色谱仪，结果如表11及附图4：
表11：不同提取溶剂提取绿原酸提取率的比较
通过选用不同溶剂提取绿原酸，试验结果表明50％甲醇较其他溶剂提取率最高，20％甲醇提取水溶性杂质较多，由于本剂型为颗粒剂，甲醇及乙醇浸润性不好，较难渗入颗粒内部造成提取率不高。所以最终选择50％甲醇进行提取。
5.2提取方法的选择：
由于绿原酸对热不稳定，故比较不同提取方法选择合适的提取方法：
方法一：回流
取银黄颗粒约1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇50ml，称定重量，回流处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
方法二：超声
取银黄颗粒约1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
方法三：冷浸
取银黄颗粒约1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇50ml，称定重量，冷浸过夜，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
精密吸取上述3个供试品溶液10μL注入液相色谱仪，结果如表12及附图5：
表12：不同方法提取绿原酸提取率的比较
通过三种不同提取方法的比较发现超声法提取绿原酸的效率最高。究其原因是因为回流温度较高，造成绿原酸的分解；冷浸法虽然提取温度低，但是耗时长、提取效率低。
5.3提取溶剂量影响
溶剂量是影响提取效率的一个很重要的影响因素，溶剂量越大，提取效率越高，但是溶剂量增加到一定量以后，提取效率增加不大。所以对提取的溶剂量加以考察：
取银黄颗粒约1.0g三份，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇25、50、100ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液2.5、5、10ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
精密吸取上述3个供试品溶液10μL注入液相色谱仪，结果如表13及附图6：
表13：不同溶剂量提取绿原酸提取率的比较
5.4提取时间影响
提取时间对提取效率影响较大，提取时间短，提取效率不高，延长提取时间可以增加提取效率，但过长时间的提取耗时，而且对提高提取效率增加作用不大。所以对提取的溶剂量加以考察：
取银黄颗粒约1.0g三份，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50％甲醇50mL，称定重量，超声处理15、30、45分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
精密吸取上述3个供试品溶液10μL注入液相色谱仪，结果如表14及附图7：
表14：不同提取时间提取绿原酸提取率的比较
由试验结果可以看出，30min提取效率最高，15min提取时间较短所以提取不完全，而45min提取时间较长，可能造成绿原酸分解。所以选择30min为提取时间。
5.5样品保存条件的选择：
绿原酸的结构特点造成其性质不稳定，在光照条件下容易造成分解，含量下降。所以对其保存条件进行摸索。
5.5.1比较透明容量瓶和棕色容量瓶对保存样品溶液稳定性的影响。
精密称取绿原酸对照品适量两份，分别于透明容量瓶和棕色容量瓶中加50％甲醇配制成每1ml含20μg的溶液在常温下放置，于0、2、4、6、8h精密吸取10μL注入液相色谱仪，结果如下表15及附图8：
表15：透明容量瓶和棕色容量瓶对保存样品溶液稳定性的比较
由试验结果可以看出，样品保存在棕色瓶中稳定性较透明容量瓶中稳定性好，所以选择重色容量瓶保存样品溶液。
5.5.2保存温度对样品稳定性影响：
温度对绿原酸稳定性有很大影响。分别考察25℃与4℃下绿原酸的稳定性。
精密称取绿原酸对照品适量，分别于棕色容量瓶中加50％甲醇配制两份成每1ml含20μg的溶液分别放置于25℃与4℃下，于0、4、8、12、24、36、48、96小时精密吸取10μL注入液相色谱仪，结果如下表16及附图9：
表16：保存温度对样品稳定性影响
样品保存在4℃及25℃条件下24小时内绿原酸峰面积RSD均小于5％，而25℃保存条件下96小时内绿原酸峰面积RSD为6.2％，4℃保存条件下96小时内绿原酸峰面积RSD为1.8％。试验结果表明绿原酸在4℃下保存更稳定，保存时间更长。所以对照品应保存在4℃环境中。
综上试验最后确定银黄颗粒中绿原酸含量测定的色谱条件及对照品和供试品制备方法为：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.4％磷酸溶液(10∶90)为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液。(10℃以下保存)
供试品溶液的制备：取本品约1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
实验例6：绿原酸含量测定方法验证实验
检测仪器：岛津公司SPD-10ATvp型高效液相色谱仪
进样器：自动进样器
色谱柱：安捷伦(C18 4.6×150mm，5μm)
流动相：乙腈-0.4％磷酸溶液(10∶90)(乙腈色谱级，磷酸分析级)
流速：1.0ml/min
检测波长：327nm
柱温：室温
对照品来源：绿原酸购于中国药品生物制品检定所批号：110753-200413
对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品5mg，置50ml量瓶中，加50％甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，每1ml含绿原酸20μg的对照品溶液。(10℃以下保存)
样品批号：07110501、07110902、07111303
供试品溶液的制备取本品装量差异项下的内容物，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得。
金银花空白溶液的制备按银黄颗粒制备工艺制备缺金银花的空白样品，并按供试品溶液的制备方法制备阴性对照液。
测定方法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液各10μL注入液相色谱仪，测定。
试验结果表明，对照品和供试品峰形良好，供试品分离良好。在对照品和供试品对应出峰处，阴性无干扰。
1.方法学实验
1.1线性关系考察
精密称取绿原酸对照品5.40mg，置50ml量瓶中，加50％甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2ml，置10ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含绿原酸21.6μg的对照品溶液。取对照品溶液(21.6μg/ml)摇匀，分别精密吸取2、4、8、12、16、20μl注入高效液相色谱仪，测定峰面积，结果见下表，并绘制标准曲线，表明绿原酸在0.0432μg～0.432μg间呈线性关系，其回归方程为：Area＝3.789E+06x-1.399E+04(r＝0.9999)，数据见表17和附图10。
表17绿原酸标准曲线
1.2稳定性试验
制备供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、12、24小时，依法测定，进样体积10μl，结果表明，其在24小时内基本稳定，结果见表18。
表18稳定性实验
1.3精密度试验
精密吸取对照品溶液10μl，重复进样5次，求得相对标准偏差＜2％，结果见表19。
表19精密度实验
1.4重现性试验
取同一批号(批号：07110501)样品5份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液5份，对每份进行测定，求得相对标准偏差＜2％，结果见表20。
表20重现性实验
1.5回收率试验
精密称取已知含量的同一批号(批号：07110501)的样品0.5g五份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入绿原酸对照品溶液5.0mL，浓度为0.654mg/mL(精密称取绿原酸对照品32.70mg，置50mL容量瓶中，加50％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得)，按供试品溶液的制备方法操作，测定其含量，并计算其回收率，测定结果见下表21。
表21回收率实验
2.含量测定
对三批样品进行了含量测定，试验结果见下表22：
表22样品的含量测定
根据以上数据，将含量限度定为：本品每袋含金银花提取物按绿原酸(C16H18O9)计，不得少于11.6mg。
实验例7：微生物限定检查方法实验
1.供试品：银黄颗粒(无蔗糖)
2.菌种：
菌落计数用菌种：枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大肠杆菌[CMCC(B)44102]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。
控制菌检查用菌种：大肠杆菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]。
3.培养基：营养肉汤培养基、改良马丁培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)。
4.预试验按照中国药典2005年版微生物限度检查法中常规法检验，本品有抑菌作用。霉菌、酵母菌计数检查可用常规法。经进一步试验，结果发现采用离心加稀释法基本可适用于细菌和控制菌的检查计数。
微生物限度检查方法草案：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1：10的供试品储备液；取1∶10的供试品储备液10ml，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液约2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，即为1∶10的供试液。细菌检查采用离心加稀释法。取供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依法检查(《中国药典》2005年版一部附录XIII C)。霉菌和酵母菌检查按常规法，依法检查(《中国药典》2005年版一部附录XIII C)。大肠杆菌检查，依离心加稀释法检查(中国药典2005年版一部附录XIIIC)。
5.细菌、霉菌及酵母菌方法学验证
按照中国药典2005年版微生物限度检查法进行细菌、霉菌及酵母菌计数的方法学验证试验及菌落计数。
5.1菌液制备：
(1)接种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18~24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，使菌数约为50~100cfu/ml。
(2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24~48小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，使菌数约为50~100cfu/ml。
(3)接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7天，加0.9％无菌氯化钠溶液3~5ml洗下霉菌孢子，吸出菌液，取1ml菌液加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，使菌数约为50~100cfu/ml。
5.2供试液的制备：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1∶10的供试品储备液；取1∶10的供试品储备液10ml，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液约2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，即为1∶10的供试液。
5.3验证方法：
(1)菌液组采用平皿计数法，取菌液分别注入2个平皿中，每皿1ml，测定上述制备好的菌液中每毫升的活菌数，测定结果见表23。
(2)供试品对照组取供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，测定供试品本底的细菌数，测定结果见表2。霉菌和酵母菌计数取1∶10的供试品储备液1ml，注入平皿中，测定供试液本底的霉菌和酵母菌数，测定结果见表24。
(3)试验组：细菌计数取供试液0.2ml和1ml上述菌液(50~100cfu试验菌)，分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养2天观察结果，测定结果见表19，回收率见表4。霉菌和酵母菌计数取1∶10的供试品储备液1ml和1ml上述菌液(50~100cfu试验菌)，分别注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养3天观察结果，测定结果见表25。计算回收率见表26。
(4)稀释剂对照组分别取10ml上述细菌菌液(500~1000cfu试验菌)，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液约2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至10ml，制备稀释剂对照液。取稀释剂对照液1ml，注入平皿中，立即倾注培养基，待凝固后，置规定温度培养2~5天观察结果，测定结果见表27，28.霉菌和酵母菌数检查未采用特殊的方法处理，故空白对照组可不进行验证。
5.4测定结果
表23菌液组菌落计数(cfu)
表24供试品对照组菌落计数(cfu)
表25试验组菌落计数(cfu)
表26试验组回收率测定结果
表27空白对照组菌落计数(cfu)
表28空白对照组回收率测定结果
经上述实验验证，采用离心加稀释法进行细菌检查可消除本品的抑菌作用，采用常规法进行本品霉菌和酵母菌检查，方法可行。
6.控制菌检查
按照中国药典2005年版微生物限度检查法进行控制菌的方法学验证试验及检查。
6.1.菌液制备：
接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中，35～37℃培养18~24小时，取此培养液1ml加0.9％无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5~10-7，使细菌数约为10~100cfu/ml。
6.2.供试液的制备同5.2.项下方法制备供试液。
6.3.验证方法及检查
(1)试验组
取供试品液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，加入大肠杆菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时，取上述培养物0.2ml，加入含5ml的4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)试管中，置35～37℃培养5～24小时，观察结果，见表23。
(2)阴性菌对照组
采用革兰氏阳性球菌金黄色葡萄球菌验证方法的专属性。取供试品液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，加入金黄色葡萄球菌10～100cfu作阴性菌对照，35～37℃培养18～24小时，取上述培养物0.2ml，加入含5ml的4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)试管中，置35～37℃培养5～24小时，观察结果，见表23。
(3)供试品
取供试品液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，作为供试品。35～37℃培养18～24小时，取上述培养物0.2ml，加入含5ml的4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)试管中，置35～37℃培养5～24小时，观察结果，见表23。
(4)阳性对照
取胆盐乳糖培养基100ml，加入大肠杆菌10～100cfu，35～37℃培养18～24小时，取上述培养物0.2ml，加入含5ml的4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)试管中，置35～37℃培养5～24小时，观察结果，见表23。
(5)阴性对照
另取与供试品液等量的稀释剂加至胆盐乳糖培养基100ml中作稀释剂阴性对照，35～37℃培养18～24小时，取上述培养物0.2ml，加入含5ml的4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)试管中，置35～37℃培养5～24小时，观察结果，见表29。
表29控制菌验证及检查结果
实验结果显示，实验组控制菌生长良好，本品对大肠杆菌没有抑菌作用。阴性菌均未检出，表明该控制菌检查方法的专属性好。阳性对照试验检出相应控制菌，阴性对照无菌生长，可采用离心加稀释法进行本品的大肠杆菌检查。
7.结论
根据上述验证试验结果，制定本品的微生物限度检查法标准如下：
微生物限度取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1∶10的供试品储备液，取1∶10的供试品储备液10ml，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液约2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，即为1∶10的供试液。细菌计数采用培养基稀释法，取1∶10的供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依法检查(中国药典2005年版一部附录XIIIC)。霉菌、酵母菌检查取1∶10的供试品储备液，依常规法检查(中国药典2005年版一部附录XIIIC)。大肠杆菌检查取1∶10的供试品液，依离心加稀释法检查(中国药典2005年版一部附录XIIIC)。1g供试品中，细菌数不得过1000个，霉菌和酵母菌数不得过100个，大肠杆菌不得检出。
按照该方法检验供试品符合规定，测定结果见表30。
表24供试品检验结果
实验例8：黄芩苷含量测定方法实验
检测仪器：岛津公司SPD-10ATvp型高效液相色谱仪
色谱柱：安捷伦(C18 4.6×250mm，5μm)
流动相：甲醇-2％醋酸溶液(55∶45)
流速：1.0ml/min 进样量：10μl
检测波长：280nm
对照品来源：黄芩苷购于中国药品生物制品检定所
样品批号：07110501、07110902、07111303
供试品溶液制备方法：取本品约1.0g，研细，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，超声(功率250W，频率50Hz)处理30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得。
阴性对照样品溶液的制备：按银黄颗粒制备工艺制备缺黄芩的空白样品，并按供试品溶液的制备方法制备成阴性样品液。
1.色谱条件的建立：
本品通过实验摸索建立了本品的流动相色谱条件，以甲醇为有机相，2％醋酸溶液为水相，并调整合适的比例，经过试验确定了本品的色谱条件：
流动相：甲醇-2％醋酸溶液(55∶45)
波长：280nm
通过阴性干扰试验证明，本品的阴性不干扰黄芩苷主成分色谱峰，且黄芩苷主成分色谱峰与其他色谱峰分离度良好，可满足含量测定的要求。
2.含量测定方法的建立
2.1线性试验范围
精密称取黄芩苷对照品5.02mg，加70％乙醇制成浓度为50.2μg的对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液2、4、8、10、12、20μl，进样，测定峰面积，以进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，计算回归方程，结果见表31。
表31黄芩苷标准曲线测定数据
结论：由试验结果可知黄芩苷对照品的进样量在0.1004μg～1.004μg的范围之内呈良好的线性关系，其线性方程为：Y＝1E+0.6x-866.7；r＝0.9999。
2.2精密度试验
精密吸取对照品溶液10μl，在相同色谱条件下重复进样5次，测定色谱峰的面积，求得相对标准偏差＜2％，结果见表32。
表32精密度试验数据(n＝5)
结论：结果本品的精密度RSD为0.79％，该测定方法精密度良好，符合相关测定的要求。
2.3稳定性试验
制备供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、12、24小时，依法测定，进样体积10μl，结果表明，其在24小时内基本稳定，结果见表33。
表33供试品稳定性试验数据(n＝6)
结论：由数据结果可以看出本品在24小时内基本稳定，其RSD％结果小于2.0％。
2.4重现性试验
取同一批号(批号：07110501)样品5份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液5份，对每份进行测定，求得相对标准偏差＜2％，结果见表34.
表34重现性试验结果
结论：由实验数据结果可知，本品的重复性含量测定结果较好，
2.5回收率试验
精密称取已知含量的同一批号(批号：07110501)的样品0.5g五份，精密称定，置100ml量瓶中，再精密量取黄芩苷对照品母溶液(0.442mg/ml)5ml，同置100ml量瓶中，加入70％乙醇定容至刻度，超声处理(功率250W，频率50Hz)30分钟，放冷，以70％乙醇补足减失量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别制备5份样品溶液，测定其回收率结果，测定结果表35。
表35回收率试验结果
结论：本品的回收率试验结果符合含量测定的要求。
3.含量测定结果：
本品三批样品的含量测定结果见表36。
表36三批样品的黄芩苷含量测定结果
根据以上数据，将含量限度定为：本品每袋含黄芩苷提取物按黄芩苷(C21H18O11)计，不得少于6.5mg。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
具体实施方式
实施例1无糖型颗粒剂
金银花提取物30g、黄芩提取物12g、糊精126.8g、甜菊素1.18g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按上述比例混合，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000g，即得无糖型颗粒剂。
实施例2散剂
金银花提取物20g、黄芩提取物25g、糊精65g、甜菊素1.8g
取金银花，加水煎煮3次，第一次加水6倍量煎煮3小时，第二次加水4倍量煎煮3小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至11，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6.5，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮1次，每次1.5小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至1，静置滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按比例混合，搅拌均匀，加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或制药上接受的散剂。
实施例3胶囊剂
金银花提取物30g、黄芩提取物12g、糊精126.8g、甜菊素1.18g
加入常规辅料，按照常规工艺，制成临床或制药上接受的胶囊剂。
实施例4无糖型颗粒剂
金银花提取物30g、黄芩提取物12g、糊精126.8g、甜菊素1.18g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按上述比例混合，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000g，即得无糖型颗粒剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物无糖型颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；中药组合物无糖型颗粒剂每袋含金银花提取物按绿原酸C16H1809计，不得少于6.0mg。
实施例5无糖型颗粒剂
金银花提取物30g、黄芩提取物12g、糊精126.8g、甜菊素1.18g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按上述比例混合，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000g，即得无糖型颗粒剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以55∶45比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物无糖型颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，功率250W，频率50Hz条件下超声处理30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；中药组合物无糖型颗粒剂每袋含黄芩提取物按黄芩苷C21H18011计，不得少于6.5mg。
实施例6无糖型颗粒剂
金银花提取物30g、黄芩提取物12g、糊精126.8g、甜菊素1.18g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按上述比例混合，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000g，即得无糖型颗粒剂；
微生物限度检查：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1∶10的供试品储备液，取1∶10的供试品储备液10ml，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，即为1∶10的供试液；细菌检查采用离心加稀释法，取1∶10的供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查，霉菌、酵母菌检查取1∶10的供试品储备液，依常规中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查；大肠埃希菌检查取1∶10的供试品液，依中国药典2005年版一部附录XIIIC离心加稀释法检查；1g供试品中，细菌数不得过1000个，霉菌和酵母菌数不得过100个，大肠埃希菌不得检出。
实施例7无糖型颗粒剂
金银花提取物30g、黄芩提取物12g、糊精126.8g、甜菊素1.18g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按上述比例混合，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000g，即得无糖型颗粒剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物无糖型颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；中药组合物无糖型颗粒剂每袋含金银花提取物按绿原酸C16H18O9计，不得少于6.0mg；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以55∶45比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物无糖型颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，功率250W，频率50Hz条件下超声处理30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；中药组合物无糖型颗粒剂每袋含黄芩提取物按黄芩苷C21H18O11计，不得少于6.5mg。
实施例8无糖型颗粒剂
金银花提取物30g、黄芩提取物12g、糊精126.8g、甜菊素1.18g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按上述比例混合，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000g，即得无糖型颗粒剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物无糖型颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；中药组合物无糖型颗粒剂每袋含金银花提取物按绿原酸C16H18O9计，不得少于6.0mg；
微生物限度检查：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1∶10的供试品储备液，取1∶10的供试品储备液10ml，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，即为1∶10的供试液；细菌检查采用离心加稀释法，取1∶10的供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查，霉菌、酵母菌检查取1∶10的供试品储备液，依常规中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查；大肠埃希菌检查取1∶10的供试品液，依中国药典2005年版一部附录XIIIC离心加稀释法检查；1g供试品中，细菌数不得过1000个，霉菌和酵母菌数不得过100个，大肠埃希菌不得检出。
实施例9无糖型颗粒剂
金银花提取物30g、黄芩提取物12g、糊精126.8g、甜菊素1.18g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按上述比例混合，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000g，即得无糖型颗粒剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以55∶45比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物无糖型颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，功率250W，频率50Hz条件下超声处理30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；中药组合物无糖型颗粒剂每袋含黄芩提取物按黄芩苷C21H18O11计，不得少于6.5mg；
微生物限度检查：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1∶10的供试品储备液，取1∶10的供试品储备液10ml，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，即为1∶10的供试液；细菌检查采用离心加稀释法，取1∶10的供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查，霉菌、酵母菌检查取1∶10的供试品储备液，依常规中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查；大肠埃希菌检查取1∶10的供试品液，依中国药典2005年版一部附录XIIIC离心加稀释法检查；1g供试品中，细菌数不得过1000个，霉菌和酵母菌数不得过100个，大肠埃希菌不得检出。
实施例10无糖型颗粒剂
金银花提取物30g、黄芩提取物12g、糊精126.8g、甜菊素1.18g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，每次1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；将金银花提取物、黄芩提取物、糊精、甜菊素按上述比例混合，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000g，即得无糖型颗粒剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物无糖型颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；中药组合物无糖型颗粒剂每袋含金银花提取物按绿原酸C16H18O9计，不得少于6.0mg；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以55∶45比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物无糖型颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，功率250W，频率50Hz条件下超声处理30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；中药组合物无糖型颗粒剂每袋含黄芩提取物按黄芩苷C21H18O11计，不得少于6.5mg；
微生物限度检查：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1∶10的供试品储备液，取1∶10的供试品储备液10ml，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，即为1∶10的供试液；细菌检查采用离心加稀释法，取1∶10的供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查，霉菌、酵母菌检查取1∶10的供试品储备液，依常规中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查；大肠埃希菌检查取1∶10的供试品液，依中国药典2005年版一部附录XIIIC离心加稀释法检查；1g供试品中，细菌数不得过1000个，霉菌和酵母菌数不得过100个，大肠埃希菌不得检出。
实施例11胶囊剂
金银花提取物100g、黄芩提取物40g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮1小时，第二次加水6倍量煎煮1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；取金银花提取物100g、黄芩提取物40g，加淀粉适量，均匀，60℃以下干燥，分装入胶囊，制成1000g，即得胶囊剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物胶囊剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例12胶囊剂
金银花提取物100g、黄芩提取物40g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮1小时，第二次加水6倍量煎煮1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；取金银花提取物100g、黄芩提取物40g，加淀粉适量，均匀，60℃以下干燥，分装入胶囊，制成1000g，即得胶囊剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物胶囊剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以55∶45比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物胶囊剂1.0g，研细，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，功率250W，频率50Hz条件下超声处理30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例13胶囊剂
金银花提取物100g、黄芩提取物40g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮1小时，第二次加水6倍量煎煮1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；取金银花提取物100g、黄芩提取物40g，加淀粉适量，均匀，60℃以下干燥，分装入胶囊，制成1000g，即得胶囊剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物胶囊剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以55∶45比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物胶囊剂1.0g，研细，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，功率250W，频率50Hz条件下超声处理30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
微生物限度检查：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1∶10的供试品储备液，取1∶10的供试品储备液10ml，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，即为1∶10的供试液；细菌检查采用离心加稀释法，取1∶10的供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查，霉菌、酵母菌检查取1∶10的供试品储备液，依常规中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查；大肠埃希菌检查取1∶10的供试品液，依中国药典2005年版一部附录XIIIC离心加稀释法检查；1g供试品中，细菌数不得过1000个，霉菌和酵母菌数不得过100个，大肠埃希菌不得检出。
实施例14颗粒剂
金银花提取物100g、黄芩提取物40g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮1小时，第二次加水6倍量煎煮1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；取金银花提取物100g、黄芩提取物40g，加庶糖粉800g与淀粉适量，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000g，即得颗粒剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例15颗粒剂
金银花提取物100g、黄芩提取物40g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮1小时，第二次加水6倍量煎煮1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；取金银花提取物100g、黄芩提取物40g，加庶糖粉800g与淀粉适量，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000g，即得颗粒剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以55∶45比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，功率250W，频率50Hz条件下超声处理30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
实施例16颗粒剂
金银花提取物100g、黄芩提取物40g
取金银花，加水煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮2小时，第二次加水6倍量煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液加入石灰乳调节pH值至10～12，静置，滤取沉淀，加水适量，用硫酸调节pH值至6～7，搅匀，滤过，滤液浓缩至稠膏状，即得金银花提取物；取黄芩，加至沸水中煎煮2次，第一次加水8倍量煎煮1小时，第二次加水6倍量煎煮1小时，合并煎煮液，滤过，滤液加硫酸调节pH值至2，静置，滤取沉淀，用乙醇适量洗涤后，干燥，即得黄芩提取物；取金银花提取物100g、黄芩提取物40g，加庶糖粉800g与淀粉适量，搅拌均匀，制成颗粒，60℃以下干燥，制成1000g，即得颗粒剂；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以55∶45比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物颗粒剂1.0g，研细，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，功率250W，频率50Hz条件下超声处理30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
微生物限度检查：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1∶10的供试品储备液，取1∶10的供试品储备液10ml，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，即为1∶10的供试液；细菌检查采用离心加稀释法，取1∶10的供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查，霉菌、酵母菌检查取1∶10的供试品储备液，依常规中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查；大肠埃希菌检查取1∶10的供试品液，依中国药典2005年版一部附录XIIIC离心加稀释法检查；1g供试品中，细菌数不得过1000个，霉菌和酵母菌数不得过100个，大肠埃希菌不得检出。
Claims (4)
1.一种原料包含金银花提取物、黄芩提取物具有清热解毒、消炎作用的中药组合物制剂的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
A、含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以5-15∶50-150比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加40％-60％甲醇制成每1ml含10-30μg的溶液，作为对照品溶液，5℃-15℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物无糖型颗粒剂0.5-1.5g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加40％-60％甲醇40-60ml，称定重量，超声处理20-40分钟，放冷，再称定重量，用40％-60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液4-6ml，置15-35ml棕色容量瓶中，加40％-60％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-15μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
B、含量测定：色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以45-65∶35-55比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为260-300nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加60-80％乙醇制成每1ml含40-60μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物制剂0.5-1.5g，研细，精密称定，置80-120ml量瓶中，加60-80％乙醇至刻度，功率240-260W，频率40-60Hz条件下超声处理20-40分钟，放冷，用60-80％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-15μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
C、微生物限度检查法：取供试品5-15g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至80-120ml，振摇，使呈0.5-1.5∶5-15的供试品储备液，取0.5-1.5∶5-15的供试品储备液5-15ml，400-600转/分离心3-8分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至5-15ml，2800-3200转/分离心10-30分钟，取底部集菌液1-3ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至5-15ml，即为0.5-1.5∶5-15的供试液；细菌检查采用离心加稀释法，取0.5-1.5∶5-15的供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查，霉菌、酵母菌检查取0.5-1.5∶5-15的供试品储备液，依常规中国药典2005年版一部附录X IIIC法检查；大肠埃希菌检查取0.5-1.5∶5-15的供试品液，依中国药典2005年版一部附录XIIIC离心加稀释法检查；1g供试品中，细菌数不得过800-1200个，霉菌和酵母菌数不得过80-120个，大肠埃希菌不得检出；
所述制剂的原料组成为：金银花提取物10-50重量份、黄芩提取物5-30重量份、糊精60-180重量份、甜菊素0.5-2.0重量份。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法中含量测定A为：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10∶90比例的乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取绿原酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含20μg的溶液，作为对照品溶液，10℃以下保存；供试品溶液的制备：取中药组合物中药组合物制剂1.0g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50％甲醇50ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml棕色容量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于该中含量测定B为：
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以55∶45比例的甲醇-2％醋酸溶液为流动相；检测波长为280nm；理论板数按黄芩苷峰计算应不低于3000；对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，加70％乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作为对照品溶液；供试品溶液的制备：取中药组合物中药组合物制剂1.0g，研细，精密称定，置100ml量瓶中，加70％乙醇至刻度，功率250W，频率50Hz条件下超声处理30分钟，放冷，用70％乙醇补足减失的量，摇匀，滤过，即得；测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于该方法中微生物限度检查法为：
微生物限度：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇，使呈1∶10的供试品储备液，取1∶10的供试品储备液10ml，500转/分离心5分钟，取上清液加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，3000转/分离心20分钟，取底部集菌液2ml，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至10ml，即为1∶10的供试液；细菌检查采用离心加稀释法，取1∶10的供试液1ml，分别注入5个平皿中，每皿0.2ml，依中国药典2005年版一部附录XIIC法检查，霉菌、酵母菌检查取1∶10的供试品储备液，依常规中国药典2005年版一部附录XIIIC法检查；大肠埃希菌检查取1∶10的供试品液，依中国药典2005年版一部附录XIIC离心加稀释法检查；1g供试品中，细菌数不得过1000个，霉菌和酵母菌数不得过100个，大肠埃希菌不得检出。
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