CN1977907A

CN1977907A - 一种枇杷花提取物、含有该提取物的组合物及用途

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Publication number: CN1977907A
Application number: CNA200610022453XA
Authority: CN
Inventors: 张宏; 张晓喻; 陶宗娅; 许禄昙
Original assignee: Individual
Current assignee: Chengdu Qingshan Likang Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2006-12-08
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2007-06-13
Anticipated expiration: 2026-12-08
Also published as: CN1977907B

Abstract

本发明涉及枇杷花提取物，它是由枇杷Eriobotrya japonica Lindl的花、花蕾、花托为原料，加入水或有机溶剂提取制备而成，其中，含有总黄酮50－350mg/g。本发明还提供了该枇杷花提取物的制备方法和用途。本发明提取物用于镇咳、抑菌，药效明确。本发明提取物中首次发现含有黄酮类成分，并以该成分为主要质量控制指标，通过测定总黄酮的含量，可达到控制药物质量的目的。同时采用齐墩果酸、熊果酸进行测定，提高药物的可控性。在对本发明提取物进行量化控制的同时，采用指纹图谱，进一步保证了提取物的质量。且质量控制方法简便易行、准确灵敏、重现性好、使用范围广，可用于检验、评价枇杷花及其产品质量控制。

Description

一种枇杷花提取物、含有该提取物的组合物及用途

技术领域

本发明涉及一种枇杷花提取物，具体地，是枇杷花为原料药制备的提取物，属药物领域。

背景技术

枇杷(Eriobotrya japonica Lindl)又名卢桔、金丸、芦橘、芦枝等，属蔷薇科(Rosaceae)枇杷属Eriobotrya，原产我国，已有2200多年的栽培历史，我国还是世界上最主要的枇杷生产国，栽培面积和产量占世界的2/3以上。主要分布在长江以南的各省。其中三大产区为福建莆田、浙江塘栖、江苏洞庭山，其它省份如四川、安徽、贵州、湖南、湖北、广东、广西、云南、海南、台湾等均有栽培。其叶、花、根、果实均可药用。

枇杷最重要的药用部位即是叶，枇杷叶入药始载于《名医别录》，列为中品，为传统中药材，性微寒，味苦辛，枇杷叶归肺、胃经，具清肺、止咳、降逆止呕作用，用于治疗肺热咳嗽、气逆喘气、胃热呕逆、烦热口渴之症状。现代研究表明：枇杷叶含挥发油，其主要成分中的熊果酸是一种五环三萜类化合物，具有抗肝炎、抗肿瘤、抗炎抑菌、降血脂、抗艾滋病、抗疟疾、抗糖尿病等多种生物活性，具有广泛的开发前景。此外，祖国医学认为，枇杷果味甘酸、性凉，具有清肺、润肺、宁嗽、止咳、和胃、止渴、下气、止吐逆、主上焦热、润五脏之功效。可治咳嗽、吐血、燥热等症。枇杷根治虚劳久嗽、关节疼痛，1996年日本自然医学及医学动态与消息报导，枇杷核含扁桃甙成分，此成分具有抗炎、抗肿瘤及免疫赋活作用。

枇杷花系蔷薇科枇杷属植物枇杷Eriobotrya japonica(Thunb)Lindl的花，分布于我国浙江、江苏、四川、广西等省区。据记载其味淡，性温，入肺经。近年来的研究分析表明，枇杷花营养丰富，尤其是含有较高的营养元素钙、铁、锌等。此外，枇杷花富含蛋白质，18种氨基酸，尤其是人体必需的8种氨基酸、脂肪、维生素、粗纤维、碳水化合物、矿质成分含量均较高，具有较高的营养价值。枇杷花含有三萜皂苷等药用成分，具有化痰、止咳，防治头痛、伤风等功效，三萜类化合物具有多种生物活性，近年来还发现一些化合物具有抗HIV和抗肿瘤活性，因而受到研究人员的重视，此外，枇杷花还是制作天然保健饮料的优良原料。(董世份主编.中华医药全典[M].重庆：重庆大学出版社，1997.235.；冉先德主编.中华药海(下卷)[M].哈尔滨：哈尔滨出版社，1998.989.；施木田.《枇杷花茶的开发》通过专家鉴定[J].福建农业，2006：33.；郭启雷，杨峻山.蔷薇科植物中的三萜类化合成分[J].国外医学中医中药分册，2004，26(5)：271.)，成丽等对四川成都枇杷花的化学成分进行了研究。从乙醇提取物中分离得到4个三萜皂甙元类成分I～IV，经过理化常数测定和光谱(IR，MS，¹HNMR，¹³CNMR)解析，确定了它们的化学结构分别为：I齐墩果酸(oleanolic acid)，II熊果酸(ursolic acid)，III 2α，3α，19α-三羟基熊果-5，12-二烯-28-酸(2α，3α，19α-trihydroxyurs-5，12-dien-28-acid)，IV 2β，3β，23α-三羟基齐墩果酸-12烯-28-酸(2β，3β，23α-trihydroxyolean-12-en-28-acid)(成丽，刘燕，陈凌亚等.枇杷花三萜皂甙成分的研究[J].华西医大学报，2001：32(2)：283～285.成丽，高朝霞，陈凌亚等.枇杷花三萜皂甙的分离与鉴定[J].中国野生植物资源，2001：18(2)：50～51.)。上述仅仅针对枇杷的成分及理化性质进行相关的报道。由于药材中成分复杂，虽然公开了其中的成分，但并没有进行限量分析，不能有效的控制药材及最终产品的质量。

申请号：200510006030，发明名称：枇杷花茶饮品的制备方法及产品，公开了一种枇杷花茶饮品的制备方法及产品，其以枇杷花和清凉的中草药或茶为原料，在沸水中浸提，把浸提的滤液与甜料、纯水配比，经过精滤、UHT灭菌、无菌热灌装即为成品；采用本制备方法所获得的枇杷花饮品，含有三萜皂甙等药用成分，同时含有人体必需氨基酸、核酸、维生素、Ca、Zn和Fe等各种矿质成分，具有较高的营养价值，从药理上推测具有化痰、止咳、降逆止呕、清胃止渴、减轻热病口渴和糖尿病口渴等症状以及抗衰老的功效。申请号：200310106300，发明名称：气喘灵及其生产方法，公开了主要由柿子露、冰糖、枇杷花、桔子皮、罗汉果、洋参、纯高粱酒重量成分的原料制成的大组方制剂。申请号：03117279，发明名称：治疗哮喘中草药复方制剂，公开了一种治疗哮喘中草药复方制剂，它由苏叶、百合、五味子、枇杷花、五匹风、麻黄、重楼七味中草药配方。由于中药成分复杂，现有报道的枇杷花多用于复方制剂，单独可作食品使用，且由于枇杷花的功效复杂，目前尚无有效控制其质量，充分反映其药效质量的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供了一种质量稳定、药效明确可控的枇杷花提取物。本发明还提供了该提取物的制备方法和用途。

本发明提供了一种枇杷花提取物，它是由枇杷Eriobotrya japonica Lindl的花、花蕾、花托为原料，加入水或有机溶剂提取制备而成，其中，含有总黄酮50-350mg/g。

另还含有齐墩果酸4-10mg/g、熊果酸15-40mg/g。

其中，所述的有机溶剂为75％乙醇、50％乙醇、30％乙醇、乙酸乙酯、丙酮中一种或几种混合。上述有机溶剂的选择不仅仅限于所述的有机溶剂。

进一步优选地，所述的有机溶剂为75％乙醇。

本发明药物组合物是具有如图1所示的HPLC指纹图谱，含有11个特征峰。

其中，色谱条件为：以RP-C₁₈色谱柱为固定相，甲醇-缓冲液为流动相进行线性梯度洗脱，缓冲液用乙酸调pH值为3.4；梯度洗脱程序：甲醇-缓冲液的比率为：0～55min为30∶70；5～6min变为50∶50；6～16min为50∶50；16～26变为94∶6；26～46min变为100∶0；46～70min为100∶0，流速为0.5mL/min，紫外检测波长为210nm。

所述的11个特征峰的相对保留时间分别为：

1号峰：0.10±0.015、2号峰：0.48±0.021、3号峰：0.54±0.024、4号峰：0.57±0.018、5号峰：0.63±0.031、6号峰：0.76±0.029、7号峰：0.78±0.016、8号峰：0.88±0.054、9号峰：0.93±0.034、10号峰：0.99±0.029、11号峰1。

本发明还提供了该枇杷花提取物的提取方法，它包括如下步骤：

取枇杷花，加入水或有机溶剂，回流提取，收集回流液，干燥，即得。

本发明还提供了该枇杷花提取物的质量控制方法，它是采用HPLC进行质量控制，所述的色谱条件为：

以RP-C₁₈色谱柱为固定相，甲醇-缓冲液为流动相进行线性梯度洗脱，缓冲液用乙酸调pH值为3.4；梯度洗脱程序：甲醇-缓冲液的比率为：0～5min为30∶70；5～6min变为50∶50；6～16min为50∶50；16～26变为94∶6；26～46min变为100∶0；46～70min为100∶0，流速为0.5mL/min，紫外检测波长为210nm。

一种控制枇杷花药材质量的方法，它是采用HPLC进行质量控制，所述的色谱条件为：以RP-C₁₈色谱柱为固定相，甲醇-缓冲液为流动相进行线性梯度洗脱，缓冲液用乙酸调pH值为3.4；梯度洗脱程序：甲醇-缓冲液的比率为：0～5min为30∶70；5～6min变为50∶50；6～16min为50∶50；16～26变为94∶6；26～46min变为100∶0；46～70min为100∶0，流速为0.5mL/min，紫外检测波长为210nm。

本发明还提供了一种药物组合物，它是由所述的枇杷花提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。

其中，所述的药剂是口服制剂。

本发明还提供了该药物组合物在制备镇咳、抑菌的药物中的用途。

本发明提取物用于镇咳、抑菌，药效明确。本发明提取物中首次发现含有黄酮类成分，并以该成分为主要质量控制指标，通过测定总黄酮的含量，可达到控制药物质量的目的。同时采用齐墩果酸、熊果酸进行测定，提高药物的可控性。在对本发明提取物进行量化控制的同时，采用指纹图谱，进一步保证了提取物的质量。且质量控制方法简便易行、准确灵敏、重现性好、使用范围广，可用于检验、评价枇杷花及其产品质量控制。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本发明药物组合物的HPLC指纹图谱

图2平行制备7份本发明药物组合物的HPLC指纹图谱

具体实施方式

实施例1本发明枇杷花提取物的制备

称取500g枇杷花样品，装于5000ml圆底烧瓶中，加十倍量75％乙醇，70℃冷凝回流2h，收集回流液。残渣再用五倍体积的75％乙醇冷凝回流2h，合并两次提取液。将提取液装入烧瓶，在旋转蒸发器上，水浴温度为50℃，速度为95rpm，将其旋干成枇杷花提取物浸膏。

实施例2本发明提取溶剂的确定试验

(1)溶剂的确定

准确称取一定量的枇杷花，分别加入甲醇、乙酸乙酯、95％、75％、50％乙醇和水100ml作溶剂，回流2.5h，旋蒸，定容于100ml容量瓶中，测定总黄酮和齐墩果酸和熊果酸的含量，得到最佳提取溶剂。

溶剂	总黄酮(mg/g)	熊果酸(mg/g)	齐墩果酸(mg/g)
溶剂	总黄酮(mg/g)	熊果酸(mg/g)	齐墩果酸(mg/g)	甲醇	6.33	34.9	6.6
乙酸乙酯	4.07	35.6	5.9	甲醇	6.33	34.9	6.6
乙酸乙酯	4.07	35.6	5.9	95％乙醇	6.68	36.6	6.8
75％乙醇	19.76	35.8	6.1	95％乙醇	6.68	36.6	6.8
75％乙醇	19.76	35.8	6.1	50％乙醇	28.89	10.7	2.1
水	20.45	无	无	50％乙醇	28.89	10.7	2.1

综上所述，水提取物中总黄酮的含量最高。综合总黄酮、熊果酸和齐墩果酸的总含量，在75％乙醇提取的含量最高，因此，本发明提取物提取选择的溶剂优选75％乙醇。

(2)称取一定量枇杷花样品，按下列正交表加入溶剂75％乙醇，回流提取，得到浸膏，准确称取一定量的浸膏，按照总黄酮和齐墩果酸和熊果酸的测定方法测定各自的含量。实验数据见下表。

相关实验因素
相关实验因素					样品(重量)	温度	时间	固液比	提取次数
1	50℃	1	1∶5	1	样品(重量)	温度	时间	固液比	提取次数
1	50℃	1	1∶5	1	2	70℃	2	1∶10	2
3	90℃	3	1∶15	3	2	70℃	2	1∶10	2
3	90℃	3	1∶15	3	提取工艺正交表
样品	温度	时间	固液比	提取次数	提取工艺正交表
样品	温度	时间	固液比	提取次数	1	1	1	1	1
2	1	2	2	2	1	1	1	1	1
2	1	2	2	2	3	1	3	3	3
4	2	1	2	3	3	1	3	3	3
4	2	1	2	3	5	2	2	3	1
6	2	3	1	2	5	2	2	3	1
6	2	3	1	2	7	3	1	3	2
8	3	2	1	3	7	3	1	3	2
8	3	2	1	3	9	3	3	2	1

样品号	总黄酮(mg/g)	熊果酸(mg/g)	齐墩果酸(mg/g)
样品号	总黄酮(mg/g)	熊果酸(mg/g)	齐墩果酸(mg/g)	123456789	63.257.722065.6106.7255.4229.2259.2121.8	37.815.521.516.723.517.018.314.925.9	7.945.14.26.96.07.15.57.4

实施例3本发明枇杷花提取物HPLC指纹图谱测定方法

运用HPLC测定枇杷花的指纹图谱。实验以RP-C₁₈色谱柱为固定相，甲醇-缓冲液为流动相进行线性梯度洗脱，缓冲液用乙酸调pH值为3.4。梯度洗脱程序：0～5min甲醇和缓冲液(pH＝3.4)溶液的比率为0～5min为30∶70；5～6min变为50∶50；6～16min为50∶50；16～26变为94∶6；26～46min变为100∶0；46～70min为100∶0，流速为0.5mL/min，紫外检测波长为210nm。

具体实验方法为：

1、仪器、试剂及材料

1.1仪器

1)美国戴安(DIONEX)高效液相色谱仪[SOR-100 Solvent Rack、P680 HPLCPump、ASI-100 Automated Sample Injector、PDA-100 Photodiode Array Detector、TCC-100 Thermostatted Column Compartment、固定相为Alltech Apollo C₈(250mm×4.6mm，5um)]

2)Milli-Q(licel)型超纯水器，滤膜为SERIAL NO.0952，

3)KQ3200B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司

4)R501B型旋转蒸发器无锡市星海王生化设备有限公司

5)SHZ-D(III)型循环水式真空泵巩义市英峪予华仪器厂

6)PHS-3C⁺型酸度计成都市方舟科技开发公司

7)BP211D型十万分之一天平 SARTORIUS

8)微型植物样品粉碎机黄骅市中兴仪器有限公司

1.2试剂

甲醇为色谱纯，美国Fedia公司。

冰醋酸(AR)，成都科龙化工试剂厂

乙醇(95％)，成都科龙化工试剂厂

1.3实验材料

各样品分别产自四川浦江、双流、龙泉、宋家、归德、太平、仁寿、雅安、夹江、甘露、南充。

2、实验方法

2.1色谱条件

色谱柱：Alltech Apollo C₁₈(250mm×4.6mm，5um)

流动相：甲醇-缓冲液(缓冲液用冰醋酸调pH值为3.4)，洗脱程序见表1。

流速：：0.5mL/min

柱温：20℃

检测波长：210nm。结果见表1。

2.2实验材料的处理

取枇杷花于50℃左右烘干，粉碎，过50目筛备用。

2.3供试品溶液的制备

精密称取样品1.00g置25ml容量瓶中，加入适量乙醇浸润，50℃超声提取15min，定容至25ml，用砂心漏斗抽滤。滤液于50℃旋转挥发，挥干的提取物用乙醇溶解并定容于5ml的容量瓶中。即得供试品溶液。

2.4空白实验

量取25ml95％乙醇，旋干，再用乙醇溶解并定容于5ml的容量瓶中。过滤至进样瓶，进样检测。

2.5相对保留时间、峰面积比值计算

相对保留时间R_RT(i)＝R_RT(i)/R_RT(s)

积分相对比值R_A＝A_(i)/A_(s)

3结果与分析

3.1检测波长的选择

在实验中分别测试样品在波长为210nm、220nm、230nm、240nm下的指纹图谱，比较发现210nm检测到的指纹图谱峰数较多、特征峰的相对面积更大、基线平稳。因此，210nm作为最佳检测波长。

3.2流动相的确定

采用醇-水系统峰的分离效果差，为了改善峰的分离效果，通常在实验过程中需要加入一定酸或碱。在反相高效液相中，由于醇-水系统热力学和可压缩性因素，在梯度洗脱时，易导致基线漂移，为防止分离过程出现拖尾现象，在流动相中加入冰醋酸以达到改善色谱峰形和提高分离度的目的。指纹图谱要求含有流动相甲醇为100％时的洗脱物质，为避免基线漂移，使峰的分离度最好，出峰数量最多，故采用梯度洗脱(isocratic elution)。

3.3柱温的选择

实验考察了柱温为20℃、25℃时的分离效果，发现当温度为20℃时，获得了较好的分离度和峰形。故本实验将柱温确定为20℃。

在实验中最终确定了最佳色谱条件，色谱图见图1。

3.4重复性试验

取蒲江枇杷花样品7份，按供试品溶液制备方法平行制备7份供试品溶液，检测其指纹图谱，见图2。齐墩果酸的相对峰面积大于10％，故选用齐墩果酸的峰为参考峰。其共有峰的相对保留时间的RSD＜30％(见表2、表3)，符合指纹图谱要求。

3.5不同地区的枇杷花指纹图谱

分别测定了四川省内浦江、双流、龙泉、宋家、归德、太平、仁寿、雅安、夹江、甘露、南充(S2～S12)的枇杷花的指纹图谱，其十一个共有峰的相对峰面积见表4，用指纹图谱相似度软件计算出它们的相似度，见表5。

4、总结：

本实验的方法可用于枇杷花指纹图谱的测定，并为其全面质量控制提供参考。实验中对四川省内不同产地的枇杷花指纹图谱测定，出现了二十个共有峰，可作为四川省内枇杷花的特征峰。实验结果发现不同地区的样品相似性很高，其中双流、龙泉、宋家、归德、太平、仁寿、甘露、南充之间的相似度高于90％。说明采集枇杷花药材在四川省内任何地区均可。

实施例4RP-HPLC-PDA测定枇杷花提取物中齐墩果酸和熊果酸的含量

1、仪器、试剂与样品

美国DIONEX高效液相色谱仪[ASI-100 Auto Sampler Injector，P680A HPLCPump，PDA-100 Photodiode Array Deteetor，TCC-100 Column Thermostat]。KQ3200B型超声波清洗器，Millipore超纯水器，滤膜为SERIAL NO.0952，SARTORIUS(BP211D型)十万分之一天平，微型植物样品粉碎机。

对照品熊果酸(批号：110742-200516)、齐墩果酸(批号：110709-200304)购自中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，美国Fedia公司产品，其他试剂为国产分析纯。

枇杷花提取物的制备：称取一定量枇杷花样品，装于5000ml圆底烧瓶中，按实施例2的正交表的各工艺加入溶剂75％乙醇，回流提取，得到枇杷花提取物。

2、色谱条件

色谱柱：Alltech Apollo C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-0.1％醋酸水溶液(pH3.4)(94∶6)，流速：0.5mL·min^-1；检测波长：210nm；柱温：20℃；进样量：10μL。

3、线性关系考察

精密称取齐墩果酸25.34mg、熊果酸9.11mg，置于50mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，配制成507mg·L^-1齐墩果酸和182mg·L^-1熊果酸的混合溶液，摇匀，作为对照品储备液。

精密量取上述对照品储备液0.5，1，2，4，6，8mL于10mL量瓶中，用流动相稀释定容，即得不同浓度对照品混合溶液。

精密量取上述不同浓度对照品混合溶液和对照品储备液在上述色谱条件下，进行测定。以峰面积Y为纵坐标，进样浓度X(mg·L^-1)为横坐标，绘制标准曲线，齐墩果酸和熊果酸的回归方程分别为：

Y＝0.1588X+0.0055 r＝0.9996

Y＝0.1717X-0.0816 r＝0.9997

线性范围分别为25.3～507及9.11～182mg·L^-1。

4、精密度和检测限的测定

精密量取对照品储备液，按照上述色谱条件连续进样6次，测定日内精密度，齐墩果酸和熊果酸RSD分别为0.48％和0.91％；连续进样6d(每天1次)测定日间精密度，齐墩果酸和熊果酸RSD分别为0.83％和1.1％。

精密量取对照品混合溶液(齐墩果酸25.34mg·L^-1，熊果酸9.11mg·L^-1)，加流动相分别稀释10，20，30，40，50，60，70，80倍后，进样10μL，直到齐墩果酸和熊果酸不能检出，分别得出齐墩果酸和熊果酸的最低检测限分别为0.63mg·L^-1和0.46mg·L^-1。

5、样品溶液制备

精密称取枇杷花提取物0.5g，置于25mL量瓶中，加乙醇20mL超声处理使样品溶解，冷却，用乙醇定容至刻度线，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

6、重复性试验

准确称取枇杷花提取物0.5g 6份于10mL量瓶中，按“5”项下方法操作，根据峰面积带入回归方程计算样品中齐墩果酸和熊果酸含量的平均值分别为0.868mg·g^-1和3.270mg·g^-1，RSD分别为2.504％和1.381％。(见表6、表7)

7、稳定性试验

取供试品溶液，在12h内分别进样6次(0、2、4、6、8、12)，根据峰面积带入回归方程计算，样品中齐墩果酸和熊果酸的RSD值分别为2.684％和2.522％。试验结果显示供试品溶液在12h内稳定性良好。(见表8、表9)

8、加样回收率的测定

准确称取齐墩果酸和熊果酸的含量分别是8.981mg·g^-1、32.47mg·g^-1的枇杷花提取物0.25g各3份，分别置于25mL量瓶中，分别加入215.0mg·L^-1齐墩果酸对照品溶液10mL；准确称取枇杷花提取物0.25g各3份，分别置于100mL量瓶中，分别加入835.5mg·L^-1熊果酸对照品溶液10mL。分别按“5”项下操作，制备所需溶液，进样测定。计算齐墩果酸和熊果酸的加样回收率分别为101.47％(RSD＝3.16％)，101.20％(RSD＝3.98％)。

9、样品测定

在上述最佳色谱条件下，对实施例2不同提取工艺枇杷花提取物中齐墩果酸和熊果酸平行测定3次，根据峰面积带入回归方程计算根样品中齐墩果酸和熊果酸的含量。实验结果为齐墩果酸的含量在4-10mg/g、熊果酸15-40mg/g。(见表10、表11)

该方法的测定同样适用于枇杷花中齐墩果酸、熊果酸的含量，经试验测定，枇杷花中含有齐墩果酸0.5-0.9mg/g、熊果酸2.3-3.4mg/g。

实施例5紫外分光光度法测定枇杷花提取物中总黄酮的含量

1、仪器、试剂与样品

日本岛津UV-1700紫外分光光度仪，Q3200B型超声波清洗器，Millipore超纯水器，SARTORIUS(BP211D型)十万分之一天平，微型植物样品粉碎机。

对照品芦丁(批号：100080-200306)、购自中国药品生物制品检定所，其他试剂为国产分析纯。

2、线性关系考察

精密称取芦丁对照品9.962mg，置50ml量瓶中，加75％乙醇溶解，定容，精密吸取0.0，0.1，0.5，1.0，2.0，4.0mL，分置于10mL量瓶中，加5％亚硝酸钠0.3mL，放置6min，再加10％硝酸铝0.3mL，放置6min，加4％氢氧化钠4mL，加水至刻度，摇匀。进行全波长扫描，在510nm处均有最大吸收。以510mn处测得的吸收度A对浓度C回归，得回归方程：A＝11.6522C-0.03866，r＝0.9997，在1.99～79.69μg/mL的范围内，浓度与吸收度呈线性关系。

3、样品测定

分别准确称取一定量各个提取工艺所得浸膏，用少量的50％的乙醇在超声波清洗仪中于50℃、300W、40KHZ超声处理，待样品溶解后，定容于100mL容量瓶中，再精密吸取各溶液适量于10mL量瓶中，按“2”项下方法操作，测定吸收度，由回归方程求出稀释液中总黄酮浓度，然后计算百分含量。

4、稳定性实验

准确称取枇杷花提取物0.2g，按“3”项下方法操作，测定同一样品溶液在不同时间吸收度。结果表明，吸收度值在24h内基本不变，因此测定应控制在24h内完成。(见表12)

5、重现性实验

准确称取枇杷花0.2g 6份于100mL圆底烧瓶中，按“3”项下方法操作，测定吸收度，由回归方程求出稀释液中总黄酮浓度，然后计算百分含量。(见表13)

6、回收率试验

精密称取3份已知总黄酮含量(274.35mg.g^-1)的枇杷花提取物0.1g分别于3个100mL的圆底烧瓶中，分别加入2.109mg/mL的芦丁对照品溶液10mL，按“3”项下方法操作，测定吸收度。计算总黄酮的加样回收率为102.77％(RSD＝1.90％)。(见表14)

7、样品测定

对实施例2中不同提取工艺枇杷花提取物中总黄酮平行测定3次，根据吸光度带入回归方程计算根样品中总黄酮的含量。实验结果为总黄酮50-350mg/g。

上述总黄酮的质量控制方法同样适用于枇杷花药材的质量控制。

实施例6本发明药物的制备

取实施例1制备的枇杷花提取物100g，加入淀粉混合，制粒，加入硬脂酸镁，压片，得片剂。

实施例7本发明药物的制备

取实施例2中枇杷水提取物100g，加入糊精，制粒，整粒，直接装胶囊，得胶囊剂。

本发明药物提取物的人用剂量为止咳30-125g/d，抑菌浓度为50-250mg/ml，在该剂量范围内，均能达到较好的药效。

以下通过药效学试验证明本发明的有益效果。

试验例1本发明药物镇咳作用的实验

2.1实验材料

2.1.1药物

枇杷花提取液(每ml含1.8生药，1g浸膏相当于55.56g原生药，所以每1ml枇杷花液中含0.018g浸膏)，采用实施例1的方法制备，由四川师范大学生命科学学院配制：枇杷花于2006年3月采集于四川省成都市，提取液制备工艺为：采其花蕾阴干，备用，称取枇杷花1kg，用75％的乙醇提取回流三次，用旋转蒸发器减压浓缩合并提取液至一定体积，再将其在烘箱中完全干燥成粉末状，用0.5％的羧甲基纤维素钠混悬液作为溶剂配置。为淡绿色液体，气香，成人(以60kg体重计算)日用量为40ml，即0.667ml/kg·d(相当于1.2g(原生药)/kg·d)。实验时枇杷花提取液分为5倍、20倍、50倍、100倍四个剂量组，分别为3.335ml/kg·d(相当于6g(原生药)/kg·d)、13.34ml/kg·d(相当于24g(原生药)/kg·d)、33.35ml/kg·d(相当于60g(原生药)/kg·d)，66.70ml/kg·d(相当于120g(原生药)/kg·d)，给药体积都为20ml/kg·d。具体数值如表15所示。

注：每克浸膏相当于1000/18＝55.56g原生药。均用0.5％的羧甲基纤维素钠混悬液作为溶剂配置。

阳性对照药：联邦止咳露，又名复方磷酸可待因溶液，由深圳市制药厂生产，批号：200512119。规格为每瓶含120ml溶液，其中每1ml含磷酸可待因0.8mg，成人(以60kg体重计算)日用量为45ml，即人每日每千克体重用量为0.75ml(相当于磷酸可待因0.6mg)。实验时小鼠的给药剂量为15ml/kg·d(相当于磷酸可待因12mg/kg·d)，相当于人临床日用量的20倍。用0.5％的羧甲基纤维素钠混悬液作为溶剂配置成浓度为0.75ml(止咳露)/ml的液体。

空白对照组：千分之五的羧甲基纤维素钠：由上海三浦化工有限公司生产，批号为：20010011。

2.1.2动物及实验场地

ICR小鼠，雌雄兼有，共180只，体重25g左右，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，SCXK(川)2004-15。

实验场地：四川省成都中医药大学药学院实验动物观察室(实验动物使用许可证号：SYXK(川)2004-058)。室内光照、湿度、温度适宜(空调控制室温20～26℃，相对湿度60～70％)，通风条件良好。

2.1.3试剂和仪器

BS600L型电子天平(上海友声衡器有限公司)、980型超声雾化器(上海医械专修厂有限公司)、氨水(四川德阳化学试剂厂)、台扇(FT-40型，佛山市南海区平洲明滔电器厂，额定功率：65W)，PC396型电子秒表(深圳市惠波工贸有限公司)。

2.2实验步骤

2.2.1造模

(1)分组

取体重相近的150只小白鼠，雌雄各半，备用。

(2)造模

在通风较好的环境中，将小白鼠放入容积为1000ml的烧杯中，烧杯口用保鲜膜密闭，依次在超声雾化器中加入50ml的高(15％)、中(13％)、低(10％)等三种浓度氨水，将超声雾化器的出口管插入保鲜膜中，并在保鲜膜上留一通风小孔，打开超声雾化器使氨水蒸气能均匀弥散在烧杯中，致使小白鼠咳嗽，咳嗽为机体保护性反射，其感受器分布为呼吸黏膜，在气管和大支气管分叉处最敏感。喷雾一定时间后，关闭超声雾化器并迅速打开保鲜膜。

(3)计时

在打开雾化器开始喷雾的同时，用秒表开始计时，记录小白鼠咳嗽潜伏期(由通入氨气开始至小鼠发生咳嗽所需要的时间为潜伏期及四分钟内的咳嗽次数。咳嗽的表现为：张大口或张小口时伴有咳嗽声，均可见腹肌收缩。

(4)找出适宜氨水浓度

在三个氨水浓度组中找出使小鼠咳嗽最明显且无死亡、便于观察的浓度。再用100只小鼠按上述方法，反复验证该氨水浓度和实验条件的可靠性。

2.2.2给药及观察

取小鼠140只，各性别按体重分层后，再随机分为6组，每组约25只，雌性动物约14只，雄性动物约11只。

第1组为空白对照组，按20ml灌胃给予羧甲基纤维素钠溶液；第2组为阳性对照组(联邦止咳露组)，按12mg(可待因)/kg·d灌胃给予联邦止咳露，相当于人临床日用量的20倍(仅在用氨水造模前给予该药物两次)；第3、4、5，6组分别为枇杷花提取液5倍剂量组、20倍剂量组、50倍剂量组和100倍剂量组，每组依次按6g(原生药)/kg·d、24g(原生药)/kg·d、60g(原生药)/kg·d、120g(原生药)/kg·d灌胃给予枇杷花提取液，分别相当于人临床用量的5、20、50、100倍。给药体积均为20ml/kg·d，第1、3、4、5、6组每天早晚各给药一次，连续给药5次，第三天实验观察。

最后一次给药，于一个小时后，在通风较好的环境中，将小白鼠放入容积为1000ml的烧杯中，烧杯口用保鲜膜密闭。在超声雾化器中加入50ml的氨水(13％)，并将其出口管插入保鲜膜中(在保鲜膜上留一通风小孔)，持续通入氨气(喷雾速度为最大)60s后，立即关闭超声雾化器并迅速打开保鲜膜，使其中氨气扩散。

在通入氨气的同时，用秒表开始计时，记录小白鼠咳嗽潜伏期(由通入氨气开始至小鼠发生咳嗽所需要的时间为潜伏期)及三分钟内的咳嗽次数。咳嗽的表现为：张大口或张小口时伴有咳嗽声，均可见腹肌收缩。

对各组的咳嗽潜伏期和三分钟内咳嗽次数进行单因素方差分析，并计算止咳率。

2.2.3实验数据的处理

通过大量重复性实验，所得结果最终通过SPSS软件(专业生物统计学处理软件)进行处理，并进行显著性检验。

3实验结果

3.1造模条件的选择

3.1.1氨水浓度的选择

用浓度为20％的氨水实验，通入氨气不足一分，小鼠死亡。

降低氨水浓度后，通过大量重复的实验，最终确定实验条件为：喷雾速度为最大，通气时间为60S，氨水浓度为13％；实验室温度为14～16℃。

3.1.2小鼠条件的选择

对上述条件又再进行验证实验：选择130只小白鼠，最终剔除40只不合格小鼠(死亡或反应极不敏感者)，实验结果为雄性小鼠的咳嗽潜伏期为40.18±13.39，4分钟内雄性小鼠咳嗽次数为26.76±19.22，雌性小鼠的咳嗽潜伏期为41.48±13.31，4分钟内雌性小鼠咳嗽次数为34.00±26.01；此外3分钟内小鼠的咳嗽次数与4分钟内小鼠的咳嗽次数之间的差异没有明显的统计学意义，故正式实验时选择观察3分钟为宜。总之，在该条件下由氨水导致小鼠咳嗽的效果较好。统计结果详见表16。

3.1.3时间的选择

①.此实验必须在通风环境中进行，因为氨水为挥发且有刺激性气体，在打开保鲜膜时，用电风扇迅速使氨气消散，操作人员须带口罩。但是值得注意的是，如果氨气被迅速吹散，几分钟内小鼠的咳嗽次数将很少，因此使氨气在烧杯中维持5～10s将使氨水导致小鼠咳嗽更加明显。

②.氨气极易挥发，因此每做十只动物后需更换一次氨水。

③.氨水浓度过大易造成小白鼠死亡，过小不致引咳或引咳不明显，只有通过大量实验才能找到最佳实验条件。

④.天气的变化对氨水的挥发性有较大的影响，引起实验条件不均一，因此本实验应尽量在温湿差异不大的条件中进行。

⑤.在咳嗽反应的观察上，主观性相对较强。建议由一人或少数几人观察咳嗽反应。

⑥.实验过程中可能出现死亡(呼吸衰竭、抽搐)，原因可能为：第一，现配置的氨水立即通入可能会引起死亡。第二，动物若放置在有氨气存在的空间内，可能引起类似青霉素首次接触时的致敏过程，当再次放入仪器中并通入氨气时，导致“过敏性休克”，但是动物首次致敏一段时间后(如几小时或几天)可不出现“过敏性休克”。

⑦.整个实验中，都离不开给小鼠进行灌胃，在灌胃时，需注意的是要把小鼠喉管竖直，使药液能准确到达小鼠胃部，同样腹腔注射也要到位，不然实验效果会受到影响。

⑧.每次做完实验，小鼠取出后，烧杯用湿抹布擦净，使余气散尽，否则会影响下一只小鼠咳嗽潜伏期。

3.2给药实验条件的选择

3.2.1给药浓度的影响

给药后的统计结果详见表17：

^*与空白对照组比较，P＜0.05；^**与空白对照组比较，P＜0.01。

3.3讨论

(1)此实验当中的氨水浓度、通入氨气的时间都是由造模过程中通过大量重复性实验所确定的，因为天气的变化对氨水的挥发性有较大的影响，且小鼠对天气的变化也会比较敏感，对实验结果必然会造成比较的影响，因此会引起实验条件不均一，所以本实验应尽量在温湿差异不大的条件中进行。但是由于实验条件有限，且在进行最后实验阶段的温度较造模阶段低，因此，对最终实验结果会造成一定的影响。

(2)由于对小鼠连续几天的灌胃，而小鼠数量较多，操作过程中难免会对个别小鼠的喉管造成的一定的影响，从而对最终实验造成一定的影响，但影响不会太大。

(3)通过大量重复性实验，发现雄性小鼠对抗氨气的能力强于雌性小鼠，但差别不大。

(4)本实验方法简便，快速，不需特殊设备，耗药量少，易于掌握，且小鼠廉价易得，适用于止咳中草药有效成分的分离提纯或合成止咳药研究的初筛，确定效果后，应再用豚鼠作进一步研究。

(5)一般规定，应用“标准动物”至少两种，足够数量，且要反复实验，取得足够数据，进行统计分析才有科学性。本来想用豚鼠作进一步研究。但由于实验条件、时间及经费等方面的限制，没能再进一步研究，但此实验仍为临床医学用药提供了一定药理学依据。

4结论

通过上述统计结果表明：与空白对照组比较，阳性药(联邦止咳露)、枇杷花20倍剂量和50倍剂量均能明显减少小鼠3分钟内的咳嗽次数(P＜0.05)；与空白对照组比较，阳性药(联邦止咳露)以及枇杷花各剂量均有延长潜伏期的趋势。

所以，枇杷花提取液能对抗氨水致小鼠咳嗽反应，具有一定的镇咳作用。

试验例2本发明药物抑菌作用的试验

2.1材料

2.1.1供试枇杷花样品及来源：干枇杷花，2005.12.10采于蒲江

2.1.2供试菌种(见表18)

2.1.3主要试剂及仪器

95％乙醇、丙三醇、无菌水

台秤：大阳衡器有限公司；电热恒温水浴锅：余姚市东方电工仪器厂；R501B型旋转蒸发仪：无锡市星海王生化设备有限公司；SHZ-D循环水式真空泵：巩义市英峪予华仪器厂；电子天平：J D 200-3，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；高压蒸气灭菌锅：XYQ.SG.41.280，上海华线医用核子仪器有限公司；振荡培养箱：HZQ-X100，中国哈尔滨市东明医疗仪器厂；微量移液器200ul，1000ul；超净工作台：苏净集团安泰公司；隔热式电热恒温培养箱：GSP-781，湖北省黄石市医疗器械厂。

2.1.4培养基

2.1.4.1细菌固体培养基(牛肉膏蛋白胨固体培养基)

蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaCl 0.5％；琼脂1.8％；pH7.0-7.5

2.1.4.2细菌液体培养基(牛肉膏蛋白胨液体培养基)

蛋白胨1％；牛肉膏0.3％；NaCl 0.5％；pH7.0-7.5

2.1.4.3真菌固体培养基(沙氏固体培养基)

蛋白胨1％；葡萄糖4％；琼脂1.8％；

2.1.4.4真菌液体培养基(沙氏液体培养基)

蛋白胨1％；葡萄糖4％；

2.2提取制备

2.2.1药品浸膏的制备

称取500g枇杷花样品，装于5000ml圆底烧瓶中，加五倍量95％乙醇，80℃冷凝回流2h，收集回流液。残渣再用三倍体积的95％乙醇冷凝回流2h，合并两次提取液。

将提取液装入烧瓶，在旋转蒸发器上，水浴温度为50℃，速度为95rpm，将其旋干成枇杷花提取物浸膏。

2.2.2抑菌实验

先制备适合菌体生长的固体培养基，活化菌种。

液体培养基(液体)+药液+菌液→培养→稀释，涂平板→计数

注：白色念珠菌用沙氏培养基培养

2.2.2.1对细菌的抑菌实验

称取2g枇杷花浸膏，5ml蒸馏水溶解，配成原始浓度为200mg/ml的药液，并将原始浓度稀释成150mg/ml和100mg/ml两个浓度。

分别取药液200mg/ml，150mg/ml，100mg/ml的三个浓度1ml于5ml细菌液体培养基中，再取1ml无菌水于5ml细菌液体培养基中作为对照组，将大肠杆菌和金色葡萄球菌分别接种到四个样品中，置于37℃的摇床振荡培养6b。

培养后分别取两种菌共八个样品的发酵液0.5ml，加入4.5ml无菌水中，稀释六次，得到10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的稀释梯度，取其中10^-4，10^-5，10^-6的浓度涂平板，每个梯度做三个重复。

涂布好的平板置于37℃电热恒温培养箱培养12h后数菌落数。

2.2.2.2对真菌的抑菌实验

2.2.2.2.1抑菌实验

称取4g枇杷花浸膏，用10ml蒸馏水溶解，配成原始浓度为400mg/ml的药液，并将原始浓度稀释成300mg/ml，200mg/ml，100mg/ml三个浓度。

分别取药液300mg/ml，200mg/ml，100mg/ml的三个浓度1ml于5ml真菌液体培养基中，再取1ml无菌水于5ml真菌液体培养基中作为对照组，将白色念珠菌接种到四个样品中，置于28℃的摇床振荡培养24h。

培养后分别取四个样品的发酵液0.5ml，加入4.5ml无菌水中，稀释六次，得到10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的稀释梯度，取其中10^-4，10^-5，10^-6的浓度涂平板，每个梯度做三个重复。

涂布好的平板置于28℃电热恒温培养箱培养12h后数菌落数。

2.2.2.2.2验证实验

分别取药液400mg/ml，300mg/ml，200mg/ml，100mg/ml的四个浓度4ml于灭菌的平板中，加入20ml沙氏液体培养基，待药物和培养基混匀，制备一个不加药的培养基作空白对照，待培养基冷却凝固。.将白色念珠菌接种到五个平板中，置于28℃电热恒温培养箱中培养一夜，观察白色念珠菌长势。

3结果与讨论

3.1提取剂和提取方法的选择

采用实施例1制备的提取物进行下述试验。

由于枇杷花提取物是绿色膏状物，应用纸片法时对观察的干扰较大，因此本实验采用稀释法做枇杷花的抑菌实验。

3.2抗大肠杆菌实验条件的选择

由表19显示，在加入相同体积而不同浓度的枇杷花浸提液后，大肠杆菌的长势有明显差别，因此可以证明浸提液对该菌有抑菌效果。药液的浓度越高，抑菌性越强。

3.3抗金黄色葡萄球菌实验条件的选择

由表20显示，在加入相同体积而不同浓度的枇杷花浸提液后，金黄色葡萄球菌的长势有明显差别，因此可以证明浸提液对该菌有抑菌效果。药液的浓度越高，抑菌性越强。

对比浸提液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种细菌的原始数据，其对金黄色葡萄球菌的抑菌效果更佳。

3.4对白色念珠菌的实验结果

由表21显示，本次实验不能说明枇杷花提取物对白色念珠菌有抑制功效，因此又对该菌作了验证实验。实验后观察生长情况，加药组和空白对照组中白色念珠菌都正常生长，长势良好，并没有明显差异，几个浓度梯度之间的长势也没有差异。

4结论

培养基部分有沉淀、杂质、气泡，干扰记数。配制的枇杷花提取物药液是悬浊液，枇杷花有效成分在其中分布不均匀可能影响到局部的抑菌效果。

在枇杷花乙醇部分提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌作用中，采用稀释法测定了枇杷花乙醇提取物对以上3种供试菌的抑制作用，结果表明提取物可能对白色念珠菌没有明显抑制效果，对两种供试细菌：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌经初步实验表明都有抑制作用，其中，抗金黄色葡萄球菌的效果较好。上述试验说明，枇杷花作为新型抑菌药物具有开发价值。

表1梯度洗脱程序

时间(min)	流动相
	流动相		甲醇	缓冲液
	05616264670	3030505094100100	甲醇	缓冲液	70705050600

表27批浦江样品指纹图谱共有峰的相对保留时间

	1	2	3	4	5	6	7	RSD％
	1	2	3	4	5	6	7	RSD％	峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10峰11(S)	0.100.480.540.570.630.760.780.880.930.991	0.100.480.540.570.630.760.780.880.930.991	0.100.480.540.570.630.760.780.880.930.991	0.100.480.540.570.630.760.780.880.930.991	0.100.480.540.570.630.760.780.880.930.981	0.100.480.540.570.630.760.780.880.930.991	0.100.480.540.570.630.760.780.880.930.981	0.750.100.060.040.030.020.030.010.010.010

表3七批浦江样品指纹图谱共有峰的峰面积比值

	1	2	3	4	5	6	7	RSD％
	1	2	3	4	5	6	7	RSD％	峰1峰2峰3峰4峰5峰6峰7峰8峰9峰10峰11(S)	0.110.050.550.191.090.140.150.130.090.281	0.100.070.670.120.810.170.090.120.110.301	0.110.060.720.100.670.170.060.120.110.301	0.110.060.730.100.600.180.080.120.100.291	0.100.070.640.100.790.170.090.120.110.301	0.090.070.650.100.860.170.090.120.120.321	0.100.060.690.100.650.170.080.120.110.301	7.7412.819.1627.2521.326.6928.923.669.304.150

表4不同产地的枇杷花指纹图谱的相对峰面积

Table 4 Rel.Area of Fingerprints from different samples

峰号	蒲江	双流	龙泉	宋家	归德	太平	仁寿	雅安	夹江	甘露	南充
峰号	蒲江	双流	龙泉	宋家	归德	太平	仁寿	雅安	夹江	甘露	南充	1234567891011121314151617181920合计	1.551.33.493.520.647.542.523.535.214.851.970.991.990.560.421.790.451.183.7713.6470.91	0.20.387.713.890.2512.270.493.150.114.010.370.560.060.080.10.360.280.50.81.6747.22	0.410.968.4214.590.167.330.412.040.472.681.080.990.40.180.340.730.430.971.423.7747.77	0.810.787.669.030.373.290.372.071.63.226.074.070.410.321.11.30.651.212.436.9153.68	0.241.3210.738.340.174.460.172.980.811.643.483.790.20.20.730.950.510.981.353.5546.6	0.111.018.3411.540.115.550.182.680.1511.240.90.270.130.30.580.360.510.983.2939.24	0.251.189.5713.310.124.250.241.560.270.71.530.950.40.160.460.820.530.681.544.6543.17	0.11.479.7813.920.135.160.122.770.062.850.570.650.050.090.160.350.160.420.61.3340.73	0.131.6310.1519.830.065.530.542.310.262.050.450.310.10.070.130.230.080.490.551.2846.17	0.451.7210.8811.220.215.290.172.120.632.32.974.170.260.270.851.780.941.261.755.1654.37	0.721.7410.584.240.489.961.031.740.165.121.931.930.70.390.671.480.480.842.348.6355.15

表5不同产地枇杷花指纹图谱的相似度

	蒲江	双流	龙泉	宋家	归德	太平	仁寿	雅安	夹江	甘露	南充
	蒲江	双流	龙泉	宋家	归德	太平	仁寿	雅安	夹江	甘露	南充	蒲江双流龙泉宋家归德太平仁寿雅安夹江甘露南充	1.000.170.180.140.130.150.131.000.980.160.13	0.171.000.990.940.960.980.970.170.200.970.95	0.180.991.000.960.970.980.980.180.220.980.95	0.140.940.961.000.980.970.980.130.170.990.96	0.130.960.970.981.000.990.990.120.150.990.97	0.150.980.980.970.991.000.990.140.170.980.95	0.130.970.980.980.990.991.000.130.170.990.95	1.000.170.180.130.120.140.131.000.990.150.12	0.980.200.220.170.150.170.170.991.000.190.15	0.160.970.980.990.990.980.990.150.191.000.97	0.130.950.950.960.970.950.950.120.150.971.00

表6齐墩果酸重现性测定结果(n＝6)

样品重量(g)	峰面积	齐墩果酸的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)
样品重量(g)	峰面积	齐墩果酸的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)	0.52850.55430.54280.51590.58730.5342	27.912326.648129.140426.185229.529126.9174	9.1928.8949.0818.9838.9948.769	8.981	1.63

表7熊果酸重现性测定结果(n＝6)

样品重量(g)	峰面积	熊果酸的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)
样品重量(g)	峰面积	熊果酸的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)	0.52850.55430.54280.51590.58730.5342	112.5611108.0124113.2108109.3217112.9854110.3491	32.2631.9233.1432.0633.0932.68	32.47	1.61

表8齐墩果酸稳定性测定结果(n＝6)

样品重量(g)	峰面积	齐墩果酸的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)
样品重量(g)	峰面积	齐墩果酸的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)	0.5285	27.912326.881227.543127.195729.091527.0123	9.1929.0049.1299.0369.3159.018	9.105	1.34

表9熊果酸稳定性测定结果(n＝6)

样品重量(g)	峰面积	熊果酸的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)
样品重量(g)	峰面积	熊果酸的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)	0.5285	112.5611111.7156113.9812112.0746113.7241111.9124	32.2631.8232.8132.0432.6131.98	32.12	1.21

表10齐墩果酸加样回收率测定结果(n＝3)

样品重量(g)	样品中的含量(mg)	对照品加入量			加入量(mg)	回收率％	平均回收率％	RSD％
		对照品加入量							浓度(mg.L^-1)	体积(ml)	加入量(mg)
		0.25050.25090.2512	2.2502.2532.256	215.0					浓度(mg.L^-1)	体积(ml)	加入量(mg)	10	2.15	4.4264.5064.372	101.2104.898.4	101.47	3.16

表11熊果酸加样回收率测定结果(n＝3)

样品重量(g)	样品中的含量(mg)	对照品加入量(μg)			加入量(mg)	回收率％	平均回收率％	RSD％
		对照品加入量(μg)							浓度(mg.L^-1)	体积(ml)	加入量(mg)
		0.25120.25230.2517	8.1568.1928.173	835.5					浓度(mg.L^-1)	体积(ml)	加入量(mg)	10	8.36	16.23216.79416.876	96.6102.9104.1	101.20	3.98

表12总黄酮稳定性测定结果(n＝6)

样品重量(g)	吸光度	总黄酮的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)
样品重量(g)	吸光度	总黄酮的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)	0.2023	0.5990.6160.5890.6040.5910.621	270.51277.72266.27272.63267.12279.84	272.35	2.03

表13总黄酮重现性测定结果(n＝6)

样品重量(g)	吸光度	总黄酮的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)
样品重量(g)	吸光度	总黄酮的含量(mg.g^-1)	平均值(mg.g^-1)	RSD(％)	0.20230.20450.20750.20160.20610.2093	0.5990.6250.6340.5880.6160.643	270.51278.51278.21266.77272.60279.51	274.35	1.89

表14总黄酮加样回收率测定结果(n＝3)

样品重量(g)	样品中的含量(mg)	对照品加入量			测得量(mg)	回收率％	平均回收率％	RSD％
		对照品加入量							浓度(mg.mL^-1)	体积(ml)	加入量(mg)
		0.10750.10830.1064	29.4929.7129.19	2.109					浓度(mg.mL^-1)	体积(ml)	加入量(mg)	10	21.09	51.1350.9951.29	102.6100.9104.8	102.77	1.90

表15枇杷花剂量组配制表

Table15 The table of flowers of eriobotrya japonica dosage

剂量组	剂量(g原生药/kg·d)	给药体积(ml/kg·d)	药物浓度(g原生药/ml)	药物浓度(g浸膏/ml)
剂量组	剂量(g原生药/kg·d)	给药体积(ml/kg·d)	药物浓度(g原生药/ml)	药物浓度(g浸膏/ml)	枇杷花5倍剂量组枇杷花20倍剂量组枇杷花50倍剂量组枇杷花100倍剂量组	62460120	20202020	0.301.203.006.00	0.00540.02160.05400.1080

表16氨水致小鼠咳嗽的影响(

)

Table16 The effect of mouse cough induced by NH4OH(

)

性别	动物数(只)	重量(g)	氨水浓度(％	咳嗽潜伏期(S)	咳嗽次数(次)
					咳嗽次数(次)					60S内	120S	180S内	240S内	合计
					雄性雌性	5145	25.66±2.1723.74±1.49	0.130.13	40.18±13.3941.48±13.31	60S内	120S	180S内	240S内	合计	4.12±3.594.38±2.85	19.84±14.6523.19±15.66	25.51±19.0332.24±24.57	26.76±19.2234.00±26.01	26.76±19.2234.00±26.01

表17枇杷花对氨水致小鼠咳嗽的影响(

)

Table17 Influence flowers of eriobotrya japonica on mouse cough induced by NH4OH(

)

组别	动物数(只)	剂量(mg(原生药)/kg·d)	体重(g)	潜伏期(s)	3分钟咳嗽次数(次)	止咳率(％)
组别	动物数(只)	剂量(mg(原生药)/kg·d)	体重(g)	潜伏期(s)	3分钟咳嗽次数(次)	止咳率(％)	空白对照组阳性对照组枇杷花5倍剂量组枇杷花20倍剂量组枇杷花50倍剂量组枇杷花100倍剂量组	171915161520	-15ml62460120	21.46±3.3622.52±3.0824.15±2.7623.23±2.8622.39±3.6423.46±3.09	30.35±27.0346.16±29.5835.67±19.7153.38±43.8747.53±54.4050.40±32.53	35.06±30.0210.53±12.2517.00±16.468.19±8.148.80±12.73*14.05±10.88	-152.1117.5175.9156.6166.1

表18供试菌种一览表

Tab.18 The species of bacteria

编号	菌种	学名	分类地位	备注
编号	菌种	学名	分类地位	备注	ABC	大肠杆菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌	Escherichia coliStaphylococcus aureusCandids albicans	埃希菌属葡萄球菌属念珠菌属	菌种均由四川师范大学生命科学院提供

表19大肠杆菌的菌落数

Tab.19 The quantity of Escherichia coli group

平板显示菌落数	稀释倍数
	稀释倍数			10^-4	10^-5	10^-6
	对照组100mg/ml药液组150mg/ml药液组200mg/ml药液组	＞1100＞1100＞1100681740780586632627497531524	177204144150110133767773446057	10^-4	10^-5	10^-6	30322887611124535

表20金黄色葡萄球菌的菌落数

Tab.20 The quantity of Staphylococcus aureus group

	稀释倍数
	稀释倍数			平板显示菌落数	10^-4	10^-5	10^-6
对照组100mg/ml药液组150mg/ml药液组200mg/ml药液组	约1000约1000约1000177222＜50031154713434	1461972881830171135733	29420021532241	平板显示菌落数	10^-4	10^-5	10^-6

表21白色念珠菌的菌落数

Table21 The quantity of Candids albicans group

平板显示菌落数	稀释倍数
	稀释倍数			10^-4	10^-5	10^-6
	对照组100mg/ml药液组200mg/ml药液组300mg/ml药液组400mg/ml药液组200mg/ml药液组	14517114414514412712310693246170263103197148	177284431919719623353950154255	10^-4	10^-5	10^-6	270032110264112

Claims

1、一种枇杷花提取物，其特征在于：它是由枇杷Eriobotrya japonica Lindl的花、花蕾、花托为原料，加入水或有机溶剂提取制备而成，其中，含有总黄酮50-350mg/g。

2、根据权利要求1所述的枇杷花提取物，其特征在于：其中还含有齐墩果酸4-10mg/g、熊果酸15-40mg/g。

3、根据权利要求1所述的枇杷花提取物，其特征在于：所述的有机溶剂为75％乙醇、50％乙醇、30％乙醇、乙酸乙酯、丙酮中的一种或几种混合。

4、根据权利要求1-3任一项所述的枇杷花提取物，其特征在于：它具有如图1所示的HPLC指纹图谱，含有11个特征峰，

其中，色谱条件为：以RP-C₁₈色谱柱为固定相，甲醇-缓冲液为流动相进行线性梯度洗脱，缓冲液用乙酸调pH值为3.4；梯度洗脱程序：甲醇-缓冲液的比率：

0～5min为30∶70；5～6min变为50∶50；6～16min为50∶50；16～26变为94∶6；26～46min变为100∶0；46～70min为100∶0；流速为0.5mL/min，紫外检测波长为210nm。

5、根据权利要求4所述的枇杷花提取物，其特征在于：所述的11个特征峰的相对保留时间分别为：

6、一种制备权利要求1-5任一项所述的枇杷花提取物的方法，它包括如下步骤：

7、一种控制权利要求1-5任一项所述的枇杷花提取物质量的方法，其特征在于：它是采用HPLC进行质量控制，所述的色谱条件为：

以RP-C₁₈色谱柱为固定相，甲醇-缓冲液为流动相进行线性梯度洗脱，缓冲液用乙酸调pH值为3.4；梯度洗脱程序：甲醇-缓冲液的比率为：0～5min为30∶70；5～6min变为50∶50；6～16min为50∶50；16～26变为94∶6；26～46min变为100∶0；46～70min为100∶0；流速为0.5mL/min，紫外检测波长为210nm。

8、一种控制枇杷花药材质量的方法，其特征在于：它是采用HPLC进行质量控制，所述的色谱条件为：以RP-C_i8色谱柱为固定相，甲醇-缓冲液为流动相进行线性梯度洗脱，缓冲液用乙酸调pH值为3.4；梯度洗脱程序：甲醇-缓冲液的比率为：0～5min为30∶70；5～6min变为50∶50；6～16min为50∶50；16～26变为94∶6；26～46min变为100∶0；46～70min为100∶0，流速为0.5mL/min，紫外检测波长为210nm。

9、一种药物组合物，它是由权利要求1-5任一项所述的枇杷花提取物为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。

10、权利要求9所述的药物组合物在制备镇咳或抑菌的药物中的用途。