CN103316096A - 一种黑种草子总黄酮提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黑种草子总黄酮提取物及其制备方法和用途。所述提取物是以黑种草子为原料提取得到，且总黄酮在提取物中所占的质量百分比为50％～90％。该提取物的制备是通过水、醇或醇-水溶液对黑种草子进行提取，然后用醚溶剂脱脂，再用有机溶剂萃取，上大孔树脂柱吸附和脱附，浓缩，干燥而得。本发明所述提取物具有抗恶性肿瘤、抗血小板聚集和抗炎活性，有望开发成抗恶性肿瘤药物或抗血小板聚集的药物或抗炎药物，具有显著药用效果；另外，本发明的黑种草子总黄酮提取物的制备方法简单，可操作性强，适合工业化生产要求。

Description

一种黑种草子总黄酮提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种黑种草子总黄酮提取物及其制备方法和用途，属于中药技术领域。

背景技术

黑种草子为毛茛科黑种草属一年生草本植物黑种草Nigella damascena L.或家黑种草即果种草Nigella sativa L.或瘤果黑种草即腺毛黑种草Nigellaglandulifera Freyn et Sint.的种子。夏、秋二季果实成熟时采割植株，晒干，打下种子，除去杂质，晒干。黑种草子具有利尿、补肾脑、活血、解毒、下乳通经、止咳和乌发抗衰老等功效，其性味甘、辛、温，作为维吾尔族习用药收入各版《中国药典》，用于胸闷气促、乳肿、耳鸣和乳汁减少等病症的治疗。近年来药理研究表明黑种草子具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、降血糖、保肝等生物活性。化学成分的研究表明，黑种草子含有大量具有显著生物活性的不饱和脂肪酸和挥发油、黄酮、皂苷和生物碱等化合物。目前未见对其总黄酮的制备工艺及抗癌、抗血小板聚集、抗炎药效进行研究的文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种黑种草子总黄酮提取物及其制备方法和用途。

本发明所述的一种黑种草子总黄酮提取物，是以黑种草子为原料提取得到，呈棕黄色至棕褐色，且总黄酮在提取物中所占的质量百分比为50％～90％。

一种所述的黑种草子总黄酮提取物的制备方法，包括如下步骤：将黑种草子粉碎后，用水、醇或醇-水溶液提取，浓缩提取液至浸膏；用醚溶剂脱脂，用有机溶剂萃取至萃取层无色，收集萃取相；上大孔树脂柱吸附，先用水洗脱，再用醇-水溶液洗脱，收集醇-水洗脱液，浓缩、干燥，即得所述的黑种草子总黄酮提取物。

作为进一步优选方案，所述的醇为无水乙醇或无水甲醇；所述的醇-水溶液是体积百分比为10～95％的乙醇-水溶液。

作为进一步优选方案，提取温度为60～100℃，每次提取所用水、醇或醇-水溶液的质量是黑种草子质量的8～10倍；每次提取时间为1～3小时；共提取2～5次。

作为进一步优选方案，用于脱脂的醚溶剂为石油醚或乙醚。

作为进一步优选方案，用于萃取的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿。

作为进一步优选方案，所述的大孔树脂柱选用弱极性大孔树脂，例如：AB-8大孔树脂、D101大孔树脂、HPD-600大孔树脂等。

作为进一步优选方案，用于洗脱的醇-水溶液是体积百分比为10～95％的乙醇-水溶液；收集的醇-水洗脱液是体积百分比为60～95％的乙醇-水洗脱液。

本发明所述的黑种草子总黄酮提取物的一种用途是用于制备抗恶性肿瘤药物，所述的恶性肿瘤尤其包括脑胶质瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤及肝癌。

本发明所述的黑种草子总黄酮提取物的另一种用途是用于制备抗血小板聚集的药物。

本发明所述的黑种草子总黄酮提取物的又一种用途是用于制备抗炎药物。

本发明提供的黑种草子总黄酮提取物中所含的总黄酮的质量百分比可达50％～90％；体外药效学试验证明：所制备的黑种草子总黄酮提取物具有抗恶性肿瘤、抗血小板聚集及抗炎活性，所述的恶性肿瘤尤其包括脑胶质瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤和肝癌，有望开发成抗恶性肿瘤药物、抗血小板聚集的药物及抗炎药物，具有显著药用效果；另外，本发明的黑种草子总黄酮提取物的制备方法简单，可操作性强，适合工业化生产要求。

附图说明

图1-1为不同实验组对U87人脑胶质瘤细胞株增殖能力的影响图；

图1-2为不同实验组对U87人脑胶质瘤细胞克隆形成的影响图；

图2为不同实验组对PANC-1人胰腺癌细胞株增殖能力的影响图；

图3为不同实验组对BXPC-3人胰腺癌细胞株增殖能力的影响图；

图4-1为不同实验组在给药处理24h后对A549人非小细胞肺癌细胞株增殖能力的影响图；

图4-2为不同实验组在给药处理72h后对A549人非小细胞肺癌细胞株增殖能力的影响图；

图5为不同实验组对NCI-H2126人肺癌细胞株增殖能力的影响图；

图6-1为不同实验组在给药处理24h后对AGs人胃癌细胞株增殖能力的影响图；

图6-2为不同实验组在给药处理72h后对AGs人胃癌细胞株增殖能力的影响图；

图7为不同实验组对MCF-7人乳腺癌细胞株增殖能力的影响图；

图8为不同实验组对MDA-MB-231人乳腺癌细胞株增殖能力的影响图；

图9-1为不同实验组对4T1小鼠乳腺癌细胞株增殖能力的影响图；

图9-2为不同实验组对4T1小鼠乳腺癌细胞克隆形成的影响图；

图10-1为不同实验组在给药处理24h后对A375人黑色素瘤细胞株增殖能力的影响图；

图10-2为不同实验组在给药处理72h后对A375人黑色素瘤细胞株增殖能力的影响图；

图11为不同实验组对SMMC-7721人肝癌细胞株增殖能力的影响图；

图12为不同实验组对ADP诱导的血小板聚集的影响图。

图13为不同实验组对脂多糖诱导的巨噬细胞中亚硝酸盐产量的影响图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

以下实施例中采用分光光度计法测定总黄酮的含量，具体步骤如下：

应用芦丁做对照，1％AlCl₃显色，采用分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA)，在271nm测定不同浓度对照品的吸光度。根据对照品溶液的浓度与吸光度的关系，绘制出标准曲线；以甲醇溶解本发明的黑种草子总黄酮提取物，定容，氯化铝比色法测定吸光值。根据所测吸光度值便可由标准曲线查出对照品的含量，从而计算出提取物中所含总黄酮的标示含量。

本测定方法具有优异的准确性、稳定性和重现性，能精确测定黑种草子总黄酮提取物中的总黄酮含量。

实施例1

称取瘤果黑种草子药材5kg，粉碎，置于提取罐中，加入40Kg体积百分比为70％的乙醇-水溶液，80℃提取3次，每次2小时；合并提取液，减压浓缩至浸膏；用石油醚回流脱脂，每次2小时，重复3次；挥干石油醚，用乙酸乙酯萃取至萃取层无色；对收集的乙酸乙酯进行减压浓缩；浓缩液用D101型大孔树脂柱吸附后，先以10倍量树脂体积的去离子水洗脱，再用6倍量树脂体积的体积百分比为10％、30％、50％、70％的乙醇-水溶液依次洗脱；收集体积百分比为70％的乙醇-水洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，所得棕黄色粉末即为所述的黑种草子总黄酮提取物；经检测，其中所含的总黄酮的质量百分比为60.19％。

实施例2

称取瘤果黑种草子药材5kg，粉碎，置于提取罐中，加入50Kg体积百分比为70％的乙醇-水溶液，80℃提取3次，每次2小时；合并提取液，减压浓缩至浸膏；用石油醚回流脱脂，每次2小时，重复3次；挥干石油醚，用乙酸乙酯萃取至萃取层无色；对收集的乙酸乙酯减压浓缩至浸膏状；取适量纯水超声溶解；用AB-8型大孔树脂柱吸附后，先以10倍量树脂体积的去离子水洗脱，再用6倍量树脂体积的体积百分比为10％、30％、50％、70％的乙醇-水溶液依次洗脱；收集体积百分比为70％的乙醇-水洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，所得棕褐色粉末即为所述的黑种草子总黄酮提取物；经检测，其中所含的总黄酮的质量百分比为87.21％。

实施例3

称取瘤果黑种草子药材1kg，粉碎，置于提取罐中，加入10Kg体积百分比为95％的乙醇-水溶液，80℃提取3次，每次2小时；合并提取液，减压浓缩至浸膏；用乙醚回流脱脂，每次2小时，重复3次；挥干乙醚，用乙酸乙酯萃取至萃取层无色；对收集的乙酸乙酯减压浓缩至浸膏状；取适量纯水超声溶解；用HPD-600型大孔树脂柱吸附后，先以10倍量树脂体积的去离子水洗脱，再用6倍量树脂体积的体积百分比为20％、40％、60％、95％的乙醇-水溶液依次洗脱；收集体积百分比为95％的乙醇-水洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，所得棕黄色粉末即为所述的黑种草子总黄酮提取物；经检测，其中所含的总黄酮的质量百分比为60.07％。

实施例4

称取瘤果黑种草子药材1kg，粉碎，置于提取罐中，加入10Kg去离子水，沸水煎煮3次，每次2小时；合并煎煮液，待冷却到室温后加入乙醇至乙醇体积百分比约为80％；4℃冷藏过夜，除去析出的絮状沉淀，减压浓缩至浸膏；用石油醚回流脱脂，每次2小时，重复3次；挥干石油醚，用乙酸乙酯萃取至萃取层无色；对收集的乙酸乙酯减压浓缩至浸膏状；取适量纯水超声溶解；用上D101型大孔树脂柱吸附后，先以20倍量树脂体积的去离子水洗脱，再用10倍量树脂体积的体积百分比为10％，30％，50％，60％的乙醇-水溶液依次洗脱；收集体积百分比为60％的乙醇-水洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，所得棕黄色粉末即为所述的黑种草子总黄酮提取物；经检测，其中所含的总黄酮的质量百分比为53.48％。

实施例5

称取瘤果黑种草子药材1kg，粉碎，置于提取罐中，加入10Kg体积百分比为10％的乙醇-水溶液，80℃提取3次，每次2小时；合并提取液，减压浓缩至浸膏；用石油醚回流脱脂，每次2小时，重复3次；挥干石油醚，用氯仿萃取至萃取层无色；对收集的氯仿减压浓缩至浸膏状；取适量纯水超声溶解；用上D101型大孔树脂柱吸附后，先以15倍量树脂体积的去离子水洗脱，再用6倍量树脂体积的体积百分比为20％，40％，60％，80％的乙醇-水溶液依次洗脱；收集体积百分比为80％的乙醇-水洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，所得棕黄色粉末即为所述的黑种草子总黄酮提取物；经检测，其中所含的总黄酮的质量百分比为50.07％。

实施例6

称取瘤果黑种草子药材1kg，粉碎，置于提取罐中，加入8Kg甲醇，60℃提取3次，每次2小时；合并提取液，减压浓缩至浸膏；用石油醚回流脱脂，每次2小时，重复3次；挥干石油醚，用氯仿萃取至萃取层无色；对收集的氯仿减压浓缩至浸膏状；取适量纯水超声溶解；用上D101型大孔树脂柱吸附后，先以15倍量树脂体积的去离子水洗脱，再用8倍量树脂体积的体积百分比为20％，40％，60％，80％的乙醇-水溶液依次洗脱；收集体积百分比为80％的乙醇-水洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，所得棕黄色粉末即为所述的黑种草子总黄酮提取物；经检测，其中所含的总黄酮的质量百分比为50.13％。

实验例7：本发明的黑种草子总黄酮提取物的体外药效学研究

一、对U87人脑胶质瘤细胞株增殖能力的影响

1.1实验材料

黑种草子，购自新疆，由上海市食品药品检验所检验(报告书编号20080350)为黑种草子。U87人脑胶质瘤细胞株，购自美国ATCC公司，培养于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基(GIBCO)。

1.2MTT法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的U87细胞，细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h。细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮提取物给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL；③阳性对照组(姜黄素)：60μM、40μM、20μM。各组细胞给药处理后24h，加入MTT溶液20μL，继续于细胞培养箱中孵育4h，弃上清液，加入150μLDMSO，震荡溶解结晶，10min后于酶标仪检测490nm吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：

抑制率(％)＝(正常对照组OD值-给药组OD值)/正常对照组OD值×100。

图1-1为不同实验组对U87人脑胶质瘤细胞株增殖能力的影响图，由图1-1可见：本发明的黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制U87细胞增殖，其IC₅₀为75.09μg/mL，而姜黄素IC₅₀为17.16μM。

1.33D克隆形成实验

琼脂层与血清、培养液按比例配制吸取100μL铺于96孔板，形成底层琼脂；取处于对数生长期的U87细胞，调整细胞密度为1000个/孔，与琼脂糖、血清、培养液按比例配制，吸取100μL于凝固的琼脂层之上，形成上层琼脂；细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL；③阳性对照组(姜黄素)：60μM、40μM、20μM。每组设6个平行对照。培养10～28天更新黑种草子总黄酮提取物各剂量组液体，对照组更新同体积的无血清培养液加0.1％DMSO。倒置相差显微镜下观察细胞克隆形成情况，以单位面积中克隆面积(mm²)计算细胞克隆平均形成率。

图1-2为不同实验组对U87人脑胶质瘤细胞克隆形成的影响图，由图1-2可见：黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制U87细胞克隆形成(P＜0.01)。

二、对PANC-1人胰腺癌细胞株增殖能力的影响

2.1实验材料

黑种草子，购自新疆，由上海市食品药品检验所检验(报告书编号20080350)为黑种草子。PANC-1人胰腺癌细胞株购自美国ATCC公司，培养于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基(GIBCO)。

2.2MTT法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的PANC-1细胞，细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h。细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮提取物给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL；各组细胞给药处理后24h，加入MTT溶液20μL，继续于细胞培养箱中孵育4h，弃上清液，加入150μL DMSO，震荡溶解结晶，10min后于酶标仪检测490nm吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：

抑制率(％)＝(正常对照组OD值-给药组OD值)/正常对照组OD值×100。

图2为不同实验组对PANC-1人胰腺癌细胞株增殖能力的影响图，由图2可见：黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制PANC-1细胞增殖，其IC₅₀为169.85μg/mL。

三、对BXPC-3人胰腺癌细胞株增殖能力的影响

3.1实验材料

黑种草子，购自新疆，由上海市食品药品检验所检验(报告书编号20080350)为黑种草子。BXPC-3人胰腺癌细胞株购自美国ATCC公司，培养于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素的1640培养基(GIBCO)。

3.2MTT法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的BXPC-3细胞，细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h。细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL。各组细胞给药处理后24h，加入MTT溶液20μL，继续于细胞培养箱中孵育4h，弃上清，加入150μL DMSO，震荡溶解结晶，10min后于酶标仪检测490nm吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：

抑制率(％)＝(正常对照组OD值-给药组OD值)/正常对照组OD值×100。

图3为不同实验组对BXPC-3人胰腺癌细胞株增殖能力的影响图，由图3可见：黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制BXPC-3细胞增殖，其IC₅₀为160.08μg/mL。

四、对A549人非细胞肺癌细胞株增殖能力的影响

4.1实验材料

黑种草子，购自新疆，由上海市食品药品检验所检验(报告书编号20080350)为黑种草子。A549人非细胞肺癌细胞株购自美国ATCC公司，培养于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基(GIBCO)。

4.2MTT法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的A549细胞，细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h。细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL；③阳性对照组(姜黄素)：60μM、40μM、20μM。各组细胞给药处理24h和72h后，分别加入MTT溶液20μL，继续于细胞培养箱中孵育4h，弃上清，加入150μL DMSO，震荡溶解结晶，10min后于酶标仪检测490nm吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：

抑制率(％)＝(正常对照组OD值-给药组OD值)/正常对照组OD值×100。

图4-1为不同实验组在给药处理24h后对A549人非小细胞肺癌细胞株增殖能力的影响图，图4-2为不同实验组在给药处理72h后对A549人非小细胞肺癌细胞株增殖能力的影响图；由图4-1及图4-2可见：黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制A549细胞增殖，其IC₅₀为104.74μg/mL(24h)，100.53μg/mL(72h)；而姜黄素IC₅₀为78.97μM(72h)。

五、对NCI-H2126人肺癌细胞株增殖能力的影响

5.1实验材料

黑种草子，购自新疆，由上海市食品药品检验所检验(报告书编号20080350)为黑种草子。NCI-H2126人肺癌细胞株购自美国ATCC公司，培养于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基(GIBCO)。

5.2MTT法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的NCI-H2126细胞，细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h。细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL；各组细胞给药处理后24h，加入MTT溶液20μL，继续于细胞培养箱中孵育4h，弃上清，加入150μL DMSO，震荡溶解结晶，10min后于酶标仪检测490nm吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：

抑制率(％)＝(正常对照组OD值-给药组OD值)/正常对照组OD值×100。

图5为不同实验组对NCI-H2126人肺癌细胞株增殖能力的影响图，由图5可见：黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制NCI-H2126细胞增殖，其IC₅₀为85.17μg/mL。

六、对AGs人胃癌细胞株增殖能力的影响

6.1实验材料

黑种草子，购自新疆，由上海市食品药品检验所检验(报告书编号20080350)为黑种草子。AGs人胃癌细胞株购自美国ATCC公司，培养于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素的HAM’S/F12培养基。

6.2MTT法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的AGs细胞，细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h。细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL；③阳性对照组(姜黄素)：60μM、40μM、20μM。各组细胞给药处理24h和72h后，分别加入MTT溶液20μL，继续于细胞培养箱中孵育4h，弃上清，加入150μL DMSO，震荡溶解结晶，10min后于酶标仪检测490nm吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：

抑制率(％)＝(正常对照组OD值-给药组OD值)/正常对照组OD值×100。

图6-1为不同实验组在给药处理24h后对AGs人胃癌细胞株增殖能力的影响图，图6-2为不同实验组在给药处理72h后对AGs人胃癌细胞株增殖能力的影响图；由图6-1和图6-2可见：黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制AGs细胞增殖，其IC₅₀为84.44μg/mL(24h)和53.40μg/mL(72h)；而姜黄素IC₅₀为50.84μM(24h)和49.16μM(72h)。

七、对MCF-7人乳腺癌细胞株增殖能力的影响

7.1实验材料

黑种草子，购自新疆，由上海市食品药品检验所检验(报告书编号20080350)为黑种草子。MCF-7人乳腺癌细胞株购自美国ATCC公司，培养于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素的1640培养基(GIBCO)。

7.2MTT法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的MCF-7细胞，细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h。细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL；③阳性对照组(姜黄素)：60μM、40μM、20μM。各组细胞给药处理后24h，加入MTT溶液20μL，继续于细胞培养箱中孵育4h，弃上清，加入150μL DMSO，震荡溶解结晶，10min后于酶标仪检测490nm吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：

抑制率(％)＝(正常对照组OD值-给药组OD值)/正常对照组OD值×100。

图7为不同实验组对MCF-7人乳腺癌细胞株增殖能力的影响图，由图7可见：黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制MCF-7细胞增殖，其IC₅₀为50.70μg/mL；而姜黄素对MCF-7细胞增殖无明显影响。

八、对MDA-MB-231人乳腺癌细胞株增殖能力的影响

8.1实验材料

黑种草子，购自新疆；MDA-MB-231人乳腺癌细胞株购自美国ATCC公司，培养于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素的1640培养基(GIBCO)。

8.2MTT法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的MDA-MB-231细胞，细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h。细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO。②黑种草子总黄酮给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL；③阳性对照组(姜黄素)：60μM、40μM、20μM。各组细胞给药处理后24h，加入MTT溶液20μL，继续于细胞培养箱中孵育4h，弃上清，加入150μL DMSO，震荡溶解结晶，10min后于酶标仪检测490nm吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：

抑制率(％)＝(正常对照组OD值-给药组OD值)/正常对照组OD值×100。

图8为不同实验组对MDA-MB-231人乳腺癌细胞株增殖能力的影响图，由图8可见：黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制MDA-MB-231细胞增殖，其IC₅₀为140.03μg/mL；而姜黄素IC₅₀为63.33μM。

九、对4T1小鼠乳腺癌细胞株增殖能力的影响

9.1实验材料

黑种草子，购自新疆；4T1小鼠乳腺癌细胞株购自中国科学院上海细胞库，培养于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素的1640培养基(GIBCO)。

9.2MTT法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的4T1细胞，细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h。细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL；③阳性对照组(姜黄素)：100μM、50μM、10μM、1μM。各组细胞给药处理后24h，加入MTT溶液20μL，继续于细胞培养箱中孵育4h，弃上清，加入150μLDMSO，震荡溶解结晶，10min后于酶标仪检测490nm吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：

抑制率(％)＝(正常对照组OD值-给药组OD值)/正常对照组OD值×100。

图9-1为不同实验组对4T1小鼠乳腺癌细胞株增殖能力的影响图，由图9-1可见：黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制4T1细胞增殖，其IC₅₀为24.18μg/mL；而姜黄素IC₅₀为16.43μM。

9.33D克隆形成实验

琼脂层与血清、培养液按比例配制吸取100μL铺于96孔板，形成底层琼脂。取处于对数生长期的4T1细胞，调整细胞密度为1000个/孔，与琼脂糖、血清、培养液按比例配制，吸取100μL于凝固的琼脂层之上，形成上层琼脂，细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮给药组，按以下剂量给药：25μg/mL、50μg/mL；③阳性对照组，姜黄素：60μM、40μM、20μM；紫杉醇：60μM、40μM、20μM；每组设6个平行对照。培养10～28天更新黑种草子总黄酮各剂量组液体，对照组更新同体积的无血清培养液加0.1％DMSO。倒置相差显微镜下观察细胞克隆形成情况，以单位面积中克隆面积(mm²)计算细胞克隆平均形成率。

图9-2为不同实验组对4T1小鼠乳腺癌细胞克隆形成的影响图，由图9-2可见：黑种草子总黄酮提取物可显著抑制4T1细胞克隆形成，而姜黄素和紫杉醇未呈剂量依赖性抑制4T1细胞克隆形成。

十、对A375人黑色素瘤细胞株增殖能力的影响

10.1实验材料

黑种草子，购自新疆；A375人黑色素瘤细胞株购自美国ATCC公司，培养于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基(GIBCO)。

10.2MTT法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的A375细胞，细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h。细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL；③阳性对照组：姜黄素，60μM、40μM、20μM。各组细胞给药处理24h和72h后，分别加入MTT溶液20μL，继续于细胞培养箱中孵育4h，弃上清，加入150μL DMSO，震荡溶解结晶，10min后于酶标仪检测490nm吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：

抑制率(％)＝(正常对照组OD值-给药组OD值)/正常对照组OD值×100。

图10-1为不同实验组在给药处理24h后对A375人黑色素瘤细胞株增殖能力的影响图，图10-2为不同实验组在给药处理72h后对A375人黑色素瘤细胞株增殖能力的影响图；由图10-1及图10-2可见：黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制A375细胞增殖，其IC₅₀为91.93μg/mL(24h)和110.65μg/mL(72h)；而姜黄素IC₅₀为140.25μM(24h)和153.15μM(72h)。

十一、对SMMC-7721人肝癌细胞株增殖能力的影响

11.1实验材料

黑种草子，购自新疆；SMMC-7721人肝癌细胞株购自中国科学院上海细胞库，培养于含10％胎牛血清、100U/mL的青霉素、100μg/mL链霉素的1640培养基(GIBCO)。

11.2MTT法测定细胞增殖能力

取处于对数生长期的SMMC-7721细胞，细胞密度为1×10⁵个/mL，于96孔培养板中每孔加入100μL细胞悬液，置于5％CO₂，37℃的细胞培养箱中培养24h。细胞分为以下各组：①正常对照组：完全培养液，加0.1％的DMSO；②黑种草子总黄酮给药组，按以下剂量给药：200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL；③阳性对照组，姜黄素按以下剂量给药：60μM、40μM、20μM。各组细胞给药处理后72h，加入MTT溶液20μL，继续于细胞培养箱中孵育4h，弃上清，加入150μL DMSO，震荡溶解结晶，10min后于酶标仪检测490nm吸光值。按下式计算药物对细胞增殖的抑制率：

抑制率(％)＝(正常对照组OD值-给药组OD值)/正常对照组OD值×100。

图11为不同实验组对SMMC-7721人肝癌细胞株增殖能力的影响图，由图11可见：黑种草子总黄酮提取物呈剂量依赖性抑制SMMC-7721细胞增殖，其IC₅₀为67.66μg/mL；而姜黄素IC₅₀为15.44μM。

十二、对ADP诱导的血小板聚集的影响

12.1实验材料

黑种草子，购自新疆；二磷酸腺苷(ADP)购自sigma公司；SD雄性大鼠，清洁级，220～250g，购自中国科学院上海实验动物中心。

12.2比浊法测定对血小板聚集的影响

大鼠麻醉后自腹主动脉取血，质量分数为3.8％枸橼酸钠(抗凝剂∶血液体积比为1∶9)抗凝后制备富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆(PPP)。以PPP调整PRP，使血小板数为2×10⁸个/L左右；取200μL，37℃孵育5min后加入黑种草子总黄酮，使黑种草子总黄酮的含量分别为12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL(临用前溶于无水乙醇，血浆中无水乙醇终浓度＜0.005％，对实验结果无影响)，孵育5min；阳性给药组为阿司匹林(ASA)25μg/mL；溶媒对照组为0.1％的无水乙醇。最后分别加入终浓度为5μmoL/L的二磷酸腺苷(ADP)，记录5min内最大聚集率PAG_max。

图12为不同实验组对ADP诱导的血小板聚集的影响图，由图12可见：黑种草子总黄酮提取物对ADP引起的血小板聚集在25μg/mL、50μg/mL剂量有抑制作用(P＜0.05)。

十三、对脂多糖诱导的巨噬细胞中亚硝酸盐产量的影响

13.1实验材料

黑种草子，购自新疆；脂多糖(LPS)，Griess试剂，L-NIL(一氧化氮合成抑制剂)购自sigma公司；鼠源巨噬细胞RAW264.7购买自ATCC公司。

13.2Griess法测定对激活巨噬细胞亚硝酸盐产量的影响

小鼠RAW264.7细胞株以含10％FBS的RPMI-1640培养液在含5％CO₂的37℃培养箱中培养。接种细胞至96孔板(5×10⁴cell/100μL^-1)，培养4h。模型组以LPS(1μg/mL^-1)刺激巨噬细胞，黑种草子总黄酮处理组25，50，100μg·mL^-1(临用前用DMSO溶解，DMSO终浓度＜0.1％)与刺激剂同时加入，空白对照组加入0.1％的DMSO，阳性药处理组为L-NIL(50μM)与刺激剂同时加入。培养24h后，取细胞上清100μL，加入等体积的Griess试剂，室温10min后于540nm处读取吸光值，代入亚硝酸盐标准曲线换算亚硝酸盐含量，并计算抑制率，亚硝酸盐为一氧化氮合成的稳定产物。

抑制率(％)＝(模型组吸光值-各剂量干预组吸光值)/(模型组吸光值-空白对照组吸光值)×100％

图13为不同实验组对脂多糖诱导而激活巨噬细胞中亚硝酸盐产量的影响图，由图13可见：LPS可诱导巨噬细胞RAW264.7产生大量一氧化氮，引起其稳定产物亚硝酸盐在细胞上清液中的含量剧增(P＜0.01)，而本发明的黑种草子总黄酮提取物可呈剂量依赖性抑制激活巨噬细胞中亚硝酸盐的产量(P＜0.01)，说明本发明的黑种草子总黄酮提取物具有抗炎活性。

综上所述的体外药效学试验可见：本发明所提供的黑种草子总黄酮提取物具有抗恶性肿瘤、抗血小板聚集及抗炎活性，所述的恶性肿瘤尤其包括脑胶质瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤和肝癌，有望开发成抗恶性肿瘤药物、抗血小板聚集的药物及抗炎药物，具有显著药用效果。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种黑种草子总黄酮提取物，其特征在于：是以黑种草子为原料提取得到，且总黄酮在提取物中所占的质量百分比为50％～90％。

2.一种权利要求1所述的黑种草子总黄酮提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将黑种草子粉碎后，用水、醇或醇-水溶液提取，浓缩提取液至浸膏；用醚溶剂脱脂，用有机溶剂萃取至萃取层无色，收集萃取相；上大孔树脂柱吸附，先用水洗脱，再用醇-水溶液洗脱，收集醇-水洗脱液，浓缩、干燥，即得所述的黑种草子总黄酮提取物。

3.根据权利要求2所述的黑种草子总黄酮提取物的制备方法，其特征在于：所述的醇为无水乙醇或无水甲醇；所述的醇-水溶液是体积百分比为10～95％的乙醇-水溶液。

4.根据权利要求2所述的黑种草子总黄酮提取物的制备方法，其特征在于：提取温度为60～100℃，每次提取所用水、醇或醇-水溶液的质量是黑种草子质量的8～10倍；每次提取时间为1～3小时；共提取2～5次。

5.根据权利要求2所述的黑种草子总黄酮提取物的制备方法，其特征在于：用于脱脂的醚溶剂为石油醚或乙醚；用于萃取的有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿。

6.根据权利要求2所述的黑种草子总黄酮提取物的制备方法，其特征在于：所述的大孔树脂柱选用弱极性大孔树脂。

7.根据权利要求2所述的黑种草子总黄酮提取物的制备方法，其特征在于：用于洗脱的醇-水溶液是体积百分比为10～95％的乙醇-水溶液；收集的醇-水洗脱液是体积百分比为60～95％的乙醇-水洗脱液。

8.一种权利要求1所述的黑种草子总黄酮提取物的用途，其特征在于：用于制备抗恶性肿瘤药物，所述的恶性肿瘤包括脑胶质瘤、胰腺癌、非小细胞肺癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤及肝癌。

9.一种权利要求1所述的黑种草子总黄酮提取物的用途，其特征在于：用于制备抗血小板聚集的药物。

10.一种权利要求1所述的黑种草子总黄酮提取物的用途，其特征在于：用于制备抗炎药物。

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