CN111019010B

CN111019010B - Nigella sativa种籽多糖、提取方法和制备治疗2型糖尿病药物的应用

Info

Publication number: CN111019010B
Application number: CN201911402420.1A
Authority: CN
Inventors: 康文艺; 马常阳; 王金梅; 刘振花; 董靖; 蒋圣军; 梁琼心
Original assignee: Henan University
Current assignee: Henan University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2039-12-31
Also published as: CN111019010A

Abstract

本发明公开了一种Nigella sativa种籽多糖的提取方法：Nigella sativa种籽用水煎煮，过滤，滤液加无水乙醇至终浓度为70±5 V%，静置，收集沉淀，水溶后Sevage法除蛋白，取上清液加无水乙醇至终浓度为70±5 V%，静置，沉淀经洗涤、冻干即为Nigella sativa种籽多糖。本发明经实验发现：Nigella sativa种籽多糖可以显著降低小鼠的FBG、糖化血清蛋白GSP、甘油三酯TG、总胆固醇TC、低密度脂蛋白胆固醇LDL‑C、TNF‑α、IL‑6和IL‑1β水平，显著增加胰岛素INS）、高密度脂蛋白胆固醇HDL‑C和总抗氧化能力T‑AOC表达水平。

Description

Nigella sativa种籽多糖、提取方法和制备治疗2型糖尿病药物的应用

技术领域

本发明属于多糖药物技术领域，具体涉及一种Nigella sativa种籽多糖、提取方法及其在制备治疗2型糖尿病药物方面的应用。

背景技术

2型糖尿病（T2DM）是一种复杂的慢性代谢紊乱性疾病，主要是胰岛素抵抗和胰岛素缺乏引起的胰腺β-cell功能障碍；其特点是糖、脂类和蛋白质代谢紊乱，同时胰岛素抵抗伴有低度慢性炎症的产生。T2DM可引起多种脏器损伤，从而产生多种并发症。例如：糖尿病肾病、糖尿病足、糖尿病神经病变及心脑血管病变等，已成为全球主要的健康问题。

2型糖尿病的日益流行已成为21世纪全球公共卫生关注的问题，环境因素和遗传因素等导致了糖尿病的流行加速。目前，饮食和运动与药物治疗相结合是治疗糖尿病的常用策略，临床上T2DM的药物治疗主要是口服降糖药和胰岛素注射。然而，低血糖是这些药物的常见副作用，长期注射胰岛素也可增强胰岛素抵抗，因此对2型糖尿病的控制刻不容缓。

肠道菌群及其代谢产物与宿主处于相对稳定的生态平衡，对维持人体健康和预防疾病发挥着重要作用。肠道菌群的组成或其功能的异常可能导致机体能量失衡和代谢紊乱，包括对脂肪组织、肌肉和肝脏代谢的影响。近年来，对肠道菌群研究的热度日益上升，越来越多的研究人员希望通过调节肠道菌群平衡来预防和治疗疾病。

Nigella sativa为毛莨科Nigella属一年生草本植物，原产于西南亚，其种籽油作为食用油在中东和北非国家被广泛使用，同时，也用于保健食品对抗疾病，在食品中应用广泛。Nigella sativa种籽提取物及其种籽油具有抗菌、抗氧化、增强免疫等作用。多糖是Nigella sativa种籽中重要的活性物质之一。中国专利申请CN201811415332.0公开了一种测定黑种草Nigella sativa籽油中亚油酸含量的方法，主要用于批量Nigella sativa籽油中亚油酸的含量测定，简单高效。目前，尚无Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠治疗的相关报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种可用于治疗2型糖尿病的Nigella sativa种籽多糖，其治疗效果显著，且无毒副作用，不会引起耐药性。

本发明还提供了上述Nigella sativa种籽多糖的提取方法及其在制备治疗2型糖尿病药物方面的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种Nigella sativa种籽多糖的提取方法，其具体为：将Nigella sativa种籽用水煎煮，过滤，滤液加无水乙醇至终浓度为70±5V %，静置，收集沉淀，水溶后Sevage法除蛋白，取上清液加无水乙醇至终浓度为70±5V %，静置，沉淀经洗涤、冻干即为Nigella sativa种籽多糖。

进一步优选的，可以将Nigella sativa种籽用水煎煮2-4次，煎煮水温80-85℃，合并滤液，减压浓缩，浓缩液加无水乙醇至终浓度为70V %，冰箱中静置过夜，离心分离，收集沉淀。

进一步优选的，取上清液加无水乙醇至终浓度为70V %，冰箱中静置过夜，沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗，冻干即为Nigella sativa种籽多糖。

上述Nigella sativa种籽多糖的提取方法，进一步优选，将Nigella sativa种籽用水煎煮3次，第一次煎煮2 h，第二次煎煮1 h，第三次煎煮0.5 h。

本发明提供了采用上述提取方法提取得到的Nigella sativa种籽多糖。

本发明还提供了上述Nigella sativa种籽多糖在制备治疗2型糖尿病药物方面的应用。进一步的，Nigella sativa种籽多糖具体用量可以是140 mg/kg、70 mg/kg等。

和现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明从Nigella sativa种籽中提取获得Nigella sativa种籽多糖，并通过测定Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠各项生化指标，考察其调节肠道菌群，治疗2型糖尿病的效果，实验结果证明：Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠疗效显著，且无毒副作用。

附图说明

图1为alpha diversity分析绘制的rank-abundance曲线(A)和rarefactioncurve曲线(B)；

图2为Top30的优势菌群在属水平上的相对丰度。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

本发明中，如无特殊说明，乙醇均指体积浓度。

实施例1

一种Nigella sativa种籽多糖的提取方法，具体为：取Nigella sativa种籽3.7kg，加水至淹没Nigella sativa种籽，用水煎煮三次（煎煮水温80-85℃，第一次煎煮2 h，第二次煎煮1 h，第三次煎煮0.5 h）。合并滤液，减压浓缩，浓缩液加无水乙醇至乙醇终浓度为75 %，冰箱中静置过夜（12 h），离心分离，收集沉淀，沉淀用水溶后采用Sevage法除蛋白（选用体积比为4∶1的氯仿—正丁醇混合液，采用本领域常规技术即可）。取上清液加无水乙醇至终浓度为70 %，冰箱中静置过夜（12 h），沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗，冷冻干燥（- 50 ± 5℃，12 h）即为Nigella sativa种籽多糖，约37 g。

小鼠2型糖尿病应用实验

1）试验动物

SPF级的昆明雄性小鼠，体重18-22 g，动物购买于河南省实验动物中心。许可证号：SCXK（豫）2017-0001。

2）实验试剂

链脲佐菌素（STZ）：Sigma-Aldrich公司（批号：S0130）。高脂饲料：北京博爱港生物技术有限公司。达乐自动码血糖仪：韩国I-SENS, INS.。糖化血清蛋白（GSP）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和总抗氧化能力（T-AOC）由南京建成生物工程研究所提供，胰岛素（INS）、白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）由上海华蓝化学科技有限公司提供。

3）实验方法：小鼠2型糖尿病模型的建立

60只SPF级的昆明雄性小鼠适应性饲养一周（温度25 ± 2 ℃，光照12 h/d，湿度40-45 %），喂养标准饲料，自由饮水。一周后，除正常空白对照（BC）组 (n = 10)喂养标准饲料外，其他小鼠均喂养高脂饲料。喂养4周后，高脂小鼠腹腔注射剂量为100 mg/kg的STZ溶液，两周后筛选空腹血糖值＞16.7 mmol/L的糖尿病小鼠。

4）实验方法：Nigella sativa种籽多糖的给药治疗

将糖尿病小鼠随机分为5组（n = 10）：模型对照（MC）组、阳性对照（PC）组、Nigella sativa种籽多糖高剂量（HD）组、Nigella sativa种籽多糖中剂量（MD）组、Nigella sativa种籽多糖低剂量（LD）组。空白对照组和模型对照组按0.1 mL/10 g灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃二甲双胍（350 mg/kg，0.1 mL/10 g），Nigella sativa种籽多糖高、中、低剂量组分别以140 mg/kg、70 mg/kg和35 mg/kg，0.1 mL/10 g灌胃给药。

灌胃给药4周，禁食不禁水12-14 h，摘眼球取血，于4 ℃，3500 rpm/min离心10min取血清，检测小鼠INS、GSP、TG、TC、LDL-C、HDL-C、IL-6、IL-1β、TNF-α和T-AOC水平。

5）粪便DNA提取和高通量测序

每组取3只小鼠的盲肠内容汇集物约0.2 g，使用TIANamp Stool DNA试剂盒进行总基因组DNA的提取，扩增16S rRNA的V3和V4高变区。另外，通过PCR向16S rRNA的PCR产物末端加上带有Index的接头，以便进行下一代测序（NGS）。通过酶标仪检测DNA文库浓度，将文库定量到10 nM，在Illumina MiSeq平台上进行双端测序。本次研究16S rRNA扩增测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

双端测序得到的正反向reads首先进行两两拼接，过滤拼接结果中含有N 的序列，保留序列长度大于200 bp的序列。经过质量过滤，去除嵌合体序列，最终得到的序列用于OTU聚类，使用Vsearch (1.9.6) 进行序列聚类（序列相似性设为97%），参考数据Silva 132进行序列比对比分析。对OTU的代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成。基于OTU得到分析结果，采用对样本序列进行随机抽平的方法，作Rarefaction曲线和 Rank-Abundance曲线图反映物种丰富度和均匀度，用于alphadiversity分析。

6）数据处理：结果采用均值±SD值表示，数据统计采用SPSS19.0软件单因素方差分析法（One-Way ANOVA）比较其显著性差异。

7）试验结果：

表1：Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠空腹血糖的影响

注: 所有数据采用

± SD表示。与空白组相比：# P＜0.05, ## P＜0.01, ### P＜0.001; 与模型组相比：* P＜0.05, ** P＜0.01, *** P＜0.001。

由表1可知，链脲佐菌素STZ造模后，通过对小鼠空腹血糖水平的测定，与空白对照组相比，模型对照组和各给药组小鼠的初始血糖水平明显高于空白对照组，说明造模成功（P＜0.001）。与模型组相比，在给药第20天后，血糖水平开始缓慢下降，其中HD组血糖水平下降最为显著（P＜0.001）。

表2：Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠TC、LDL-C、TG和GSP水平的影响

注: 所有数据采用

由表2可知，与空白对照BC组相比，模型对照MC组小鼠血清中TG、TC、LDL-C和GSP水平均极显著升高（P＜0.001）。给药治疗后，与模型对照MC组相比，HD组TG水平极显著下降（P＜0.001），PC组和LD组的TC、LDL-C水平并没有得到改善（P＞0.05），而HD组和MD组显著降低了TC、LDL-C和GSP的水平。

表3：Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠HDL-C、INS、T-AOC水平的影响

注: 所有数据采用

由表3可知，与空白对照BC组相比，模型对照MC组小鼠血清中HDL-C、INS、T-AOC水平均极显著降低（P＜0.001）。给药治疗后，与模型对照MC组相比，PC组和HD组HDL-C、INS、T-AOC水平均显著升高。

表4：Nigella sativa种籽多糖对2型糖尿病小鼠骨骼肌IL-6、IL-1β、TNF-α基因表达水平的影响

注: 所有数据采用

由表4可知，通过对细胞因子的测定，与空白对照BC组相比，模型对照MC组小鼠血清中IL-6和TNF-α水平极显著升高（P＜0.001），IL-1β水平显著升高（P＜0.01）。给药治疗后，与模型对照MC组相比，PC组和HD组的IL-6和TNF-α水平均显著降低（P＜0.01），IL-1β水平有所降低（P＜0.05）。

Rank-Abundance曲线可反映物种丰度和物种均匀度，物种丰度由曲线在横轴上的长度来反映，曲线在横轴上的范围越大，物种的丰度越高；物种均匀度由曲线的平滑度来反映，曲线越平坦，表示物种的均匀度越高。由图1A可知，物种的丰度较高，曲线光滑样品之间均匀度较高。rarefaction curve曲线用于判断样本量是否充分以及估计物种丰富度，如图1B所示，物种的积累曲线趋于平缓，表示随着抽取的数据量的加大，检测到的OTU数目不再增加，表明测序数据量合理，可进行下一步分析。

为更进一步了解肠道菌群的变化，从每组中选择出优势菌种并在属水平上进行分析。如图2所示，我们对比分析了5个相对丰度较高的菌属，且这5种优势菌属来源于丰度较高的厚壁菌门和拟杆菌门。发现经Nigella sativa种籽多糖治疗后，HD组的拟杆菌门丰度明显高于MC组，且拟杆菌门中f_Muribaculaceae_Unclassified菌属和Bacteroides菌属的丰度也明显高于MC组，与研究报道的结果一致，揭示高剂量的Nigella sativa种籽多糖可能通过增加拟杆菌的丰度来调节机体代谢异常，有助于缓解T2DM。

Nigella sativa种籽多糖NSSP高剂量组能显著降低小鼠的FBG、GSP、TG、TC、LDL-C、TNF-α、IL-6和IL-1β水平，显著增加INS、HDL-C和T-AOC的表达水平。肠道菌群组成分析显示，f_Muribaculaceae_Unclassified菌属和Bacteroides菌属在模型组丰度显著降低，而NSSP高剂量组显著增加了其丰度，说明Nigella sativa种籽多糖NSSP可以通过调节肠道微生物群改善糖尿病小鼠的异常状态。

综上说明：本发明Nigella sativa种籽多糖可以通过调节肠道微生物来改善2型糖尿病状态，是治疗2型糖尿病的理想药物。

Claims

1.Nigella sativa种籽多糖在制备治疗2型糖尿病药物方面的应用，其特征在于，所述Nigella sativa种籽多糖经下述提取步骤获得：Nigella sativa种籽用水煎煮，过滤，滤液加无水乙醇至终浓度为70±5V %，静置，收集沉淀，水溶后Sevage法除蛋白，取上清液加无水乙醇至终浓度为70±5V %，静置，沉淀经洗涤、冻干即为Nigella sativa种籽多糖。

2.根据权利要求1所述Nigella sativa种籽多糖在制备治疗2型糖尿病药物方面的应用，其特征在于，将Nigella sativa种籽用水煎煮2-4次，煎煮水温80-85℃，合并滤液，减压浓缩，浓缩液加无水乙醇至终浓度为70V %，冰箱中静置过夜，离心分离，收集沉淀。

3.根据权利要求2所述Nigella sativa种籽多糖在制备治疗2型糖尿病药物方面的应用，其特征在于，取上清液加无水乙醇至终浓度为70V %，冰箱中静置过夜，沉淀分别用丙酮、石油醚、无水乙醇淋洗，冻干即为Nigella sativa种籽多糖。

4.根据权利要求2或3所述Nigella sativa种籽多糖在制备治疗2型糖尿病药物方面的应用，其特征在于，将Nigella sativa种籽用水煎煮3次，第一次煎煮2 h，第二次煎煮1 h，第三次煎煮0.5 h。