CN115040554B

CN115040554B - 乌苏里瓦韦总黄酮的应用

Info

Publication number: CN115040554B
Application number: CN202210639162.4A
Authority: CN
Inventors: 王丽红; 王超; 杜美霖; 王宇航; 彭渤; 周彤; 平洋; 赵宏
Original assignee: Jiamusi University
Current assignee: Jiamusi University
Priority date: 2022-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2042-06-08
Also published as: CN115040554A

Abstract

本发明公开了乌苏里瓦韦总黄酮的应用，属于药物领域。本发明提供一种无肝肾毒性的抗类风湿性关节炎的活性成分。乌苏里瓦韦总黄酮在制备抗类风湿性关节炎药物方面的应用。乌苏里瓦韦总黄酮制备方法包括如下步骤：(1)取乌苏里瓦韦全草，于通风、避光处阴干至恒重，研磨后过筛；(2)使用乙醇水溶液进行超声提取，抽滤，浓缩提取液，用乙醇水溶液溶解；(3)然后上样于D101型大孔树脂，用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发，冷冻干燥。本发明制备方法操作简单，适于连续、工业化生产，抗类风湿性关节炎效果显著。

Description

乌苏里瓦韦总黄酮的应用

技术领域

本发明属于药物领域，具体涉及乌苏里瓦韦总黄酮的应用，具有无肝肾毒性的优点。

背景技术

类风湿性关节炎(RA)是一种以慢性、多发性、关节滑膜炎和关节外病变为主要临床表现的自身免疫性疾病。全球患病率为0.5％～1.0％，我国RA患病率为0.2％～4％，且女性发病率是男性的3倍。目前临床上用于治疗RA的药物主要包括非甾体抗炎药、抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂及中药与中药制剂。非甾体抗炎药、糖皮质激素、生物制剂等药物虽旨在实现症状的缓解，但有研究表明，这些药物使许多患者身体功能下降、甚至早逝。

甲氨喋呤、雷公藤多苷作为临床治疗RA的常用药物，被认为是治疗RA的黄金标准，但其具有一定的毒性反应且随剂量增加而加深，易产生耐药性。

因此，如何提供一种制备方法简单、抗类风湿性关节炎效果好且无肝肾毒性的活性物质是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了乌苏里瓦韦总黄酮的应用，乌苏里瓦韦总黄酮的制备方法，其操作简单，适于连续、工业化生产，制得的抗类风湿性关节炎活性物质效果显著。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

乌苏里瓦韦总黄酮在制备抗类风湿性关节炎药物的应用，用作抗类风湿性关节炎药物的活性成分。

乌苏里瓦韦总黄酮在制备抗类风湿性关节炎药物的应用。

所述乌苏里瓦韦总黄酮的制备方法是按下述步骤制备的：

步骤一、取乌苏里瓦韦全草，于通风、避光处阴干至恒重，研磨后过筛，获得全草粉末；

步骤二、使用乙醇水溶液对步骤一获得的全草粉末进行超声提取，抽滤后浓缩得到浸膏，用乙醇水溶液溶解；

步骤三、然后上样于D101型大孔树脂，用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发，冷冻干燥，即得乌苏里瓦韦提取物。

进一步地限定，步骤一中过80目筛。

进一步地限定，步骤二中乙醇水溶液的体积分数为75％。

进一步地限定，步骤二所述的超声功率为180W～360W，超声温度为40℃～80℃，超声时间为40min～80min，料液比为(1∶10)g/mL～(1∶60)g/mL。

进一步地限定，步骤三中上样浓度为0.34g/mL，上样吸附时间为12h。

进一步地限定，步骤三中洗脱流速为4BV/h，洗脱体积为4BV。

进一步地限定，步骤三中乙醇水溶液的体积分数为50％。

有益效果：乌苏里瓦韦为水龙骨科瓦韦属植物乌苏里瓦韦Lepisorusussuriensis(Regel et Maack)Ching的全草，又称剑刀草、铁包针、人头发、石茶、骟鸡尾等。主要分布于我国黑龙江、辽宁、吉林及山东等地，其他国家如朝鲜、日本、俄罗斯也均有分布。《中国植物志》《中华本草》《东北常用药用植物》《湖南药物志》等均有记载。本发明利用超声辅助提取法提取乌苏里瓦韦中的总黄酮，并采用大孔树脂进行纯化，提高了总黄酮的制备率，具有显著的抗类风湿性关节炎效果且无肝肾毒性。

本发明无肝肾毒性的抗类风湿性关节炎活性物质的制备方法操作简单，适于连续、工业化生产，制得的抗类风湿性关节炎活性物质效果显著且无肝肾毒性，可显著降低佐剂性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量，可应用于制备抗类风湿性关节炎制品，具有极好的发展前景。

附图说明

图1芦丁标准曲线回归方程；

图2所示为超声功率对提取量的影响；

图3所示为超声温度对提取量的影响；

图4所示为超声时间对提取量的影响；

图5所示为料液比对提取量的影响；

图6所示为CG组大鼠足趾形态；

图7所示为MG组大鼠足趾形态；

图8所示为WPG组大鼠足趾形态；

图9所示为CPG组大鼠足趾形态；

图10所示为LHG组大鼠足趾形态；

图11所示为LLG组大鼠足趾形态；

图12所示为CG组大鼠踝关节形态学观察(HE，100×)；

图13所示为MG组大鼠踝关节形态学观察(HE，100×)；

图14所示为WPG组大鼠踝关节形态学观察(HE，100×)；

图15所示为CPG组大鼠踝关节形态学观察(HE，100×)；

图16所示为LHG组大鼠踝关节形态学观察(HE，100×)；

图17所示为LLG组大鼠踝关节形态学观察(HE，100×)；

图18所示为CG组大鼠踝关节形态学观察(HE，400×)；

图19所示为MG组大鼠踝关节形态学观察(HE，400×)；

图20所示为WPG组大鼠踝关节形态学观察(HE，400×)；

图21所示为CPG组大鼠踝关节形态学观察(HE，400×)；

图22所示为LHG组大鼠踝关节形态学观察(HE，400×)；

图23所示为LLG组大鼠踝关节形态学观察(HE，400×)；

图24所示为维生素C标准曲线图；

图25所示为维生素C标准品高效液相色谱图；

图26所示为维生素C供试品溶液高效液相色谱图；

图27所示为Venn分析；

图28所示为α多样性稀释曲线；

图29所示为β多样性分析；

图30所示为肠道菌群门分类水平物种分布图；

图31肠道菌群属分类水平物种分布图；

图32所示为LDA柱形图；

图33所示为群落丰度cladogram图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例记载的75％乙醇均指的是体积分数为75％的乙醇水溶液。

实施例1：乌苏里瓦韦总黄酮的制备

(1)取乌苏里瓦韦全草，洗去表面杂质，于通风、避光、阴干至恒重；粉碎后过80目筛，获得乌苏里瓦韦全草粉末；

(2)精密称定乌苏里瓦韦全草粉末1.0g，置于蒸馏烧瓶中，加入20.0mL75％乙醇，提取功率364W，超声温度为58℃，超声时间为50min，料液比为(1∶20)g/mL；

(3)将提取后的溶液取出，抽滤。

(4)使用旋转蒸发仪对抽滤液减压浓缩回收乙醇，浓缩液放置于蒸发皿中，得到浸膏，得到浸膏，用75％乙醇溶解，配制成供试品溶液；

(5)然后上样于D101型大孔树脂，设置上样浓度为0.34g/mL，上样吸附12h后，用体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱，流速为4BV/h，洗脱体积为4BV，收集洗脱液，旋转蒸发，冷冻干燥，即得乌苏里瓦韦总黄酮，用作抗类风湿性关节炎活性物质在制备抗类风湿性关节炎药物的应用。

(6)绘制总黄酮标准曲线：

A.于波长200～800nm扫描芦丁标准品显色后和样品显色后的吸收曲线，确定波长500nm为最佳测定吸收波长。

B.准确称取25.0mg芦丁标准品，用75％乙醇定容至25mL容量瓶，标准品浓度为1.0004mg/mL，分别吸取2.00mL、2.50mL、3.00mL、3.50mL、4.00mL于25mL比色管中，加75％乙醇至5mL；加入5％(质量)亚硝酸钠溶液0.8mL，摇匀，放置5min；加入0.8mL 10％(质量)硝酸铝溶液，摇匀，放置5min；再加入4％(质量)氢氧化钠溶液5mL，用75％乙醇定容，摇匀静置30min；分别于波长500nm处测定吸光度，同时用75％乙醇做对照，依照测得的吸光度值绘制标准曲线，见图1。

(7)将乌苏里瓦韦总黄酮冻干粉末用75％(体积)乙醇水溶液复溶并定容至100mL容量瓶，取10mL于25mL比色管中，加入5％亚硝酸钠0.8mL，摇匀，放置5min；加入0.8mL10％(质量)硝酸铝溶液，摇匀，放置5min；再加入4％(质量)氢氧化钠溶液5mL，用75％乙醇定容，摇匀静置30min，于波长500nm处测定吸光度，结合标准曲线，计算总黄酮的含量。

测得乌苏里瓦韦提取物冻干粉末总黄酮含量为557.8mg/g。

实施例2：

在实施例1的基础上，步骤(2)中不同超声功率、超声温度、超声时间、料液比为进行提取，并对步骤(3)抽滤获得的获得的提取液定容，测定总黄酮含量，每组实验重复3次。

在超声温度60℃、料液比1∶30(mL/g)、超声时间60min时，调整超声功率，结果如表1、图2所示。

表1超声功率对提取量的影响

在超声功率300W、料液比1∶30(mL/g)、超声时间60min，调整超声温度，结果如表2、图3所示。

表2超声温度提取量的影响

在超声功率300W、超声温度60℃、料液比1∶30(mL/g)时，调整超声时间，结果如表3、图4所示。

表3超声时间对提取量的影响

在超声功率300W、超声温度60℃、超声时间60min时，调整料液比，结果如表4、图5所示。

表4料液比对提取量的影响

进一步地，在超声功率364.41W，超声温度58.47℃，超声时间50min，料液比1∶20(mL/g)时，3次平行试验验证提取液中总黄酮提取量为17.944mg/g。

采用下述实验研究乌苏里瓦韦抗类风湿性关节炎活性物质活性

1实验材料

1.1药物与试剂

乌苏里瓦韦抗类风湿性关节炎活性物质：根据实施例1方法制备获得；

雷公藤多苷片：购自湖南千金协力药业有限公司；

甲氨蝶呤片：购自上海信谊药广有限公司；

弗氏完全佐剂(FCA)：购自美国Sigma公司；

氯化钠注射液：购自黑龙江科伦制药有限公司；

多聚甲醛固定液：购自福州文莱生物科技有限公司；

水合氯醛：购自天津市致远化学试剂有限公司。

1.2实验动物

雄性SPF级SD大鼠，购于哈尔滨医科大学实验动物学部，生产许可证号：SCXK(黑)2019-001；

饲料：购自购于沈阳茂华生物科技有限公司，许可证号：SCXK(辽)2017-0001。

1.3仪器

TGL-20BRS高速台式冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；

FA2004c型电子天平：上海越平科学仪器制造有限公司；

SL01-11数显游标卡尺：德清盛泰芯电子科技有限公司。

2.实验方法及结果

造模：购买36只SD雄性大鼠，随机分为6组。每4只大鼠饲养于一笼内，笼底铺满无菌杨木刨花垫料，12h∶12h昼夜交替光照，温度23℃～25℃，湿度50％～60％，饲养期间大鼠自由饮水和进食，适应性饲养一周。大鼠适应良好后，随机选取6只为空白对照组，除空白对照组外的其他大鼠75％乙醇消毒后，利用1mL微量注射器于每只大鼠右后足掌处皮下注射0.1mL 1g/L FCA致炎(记为第0d)，注射时针头与皮肤夹角成5°斜向下刺入，数小时后即可观察到注射部位出现肉眼可见的肿胀。空白对照组大鼠使用相同方法在相同部位注射同体积0.9％氯化钠注射液。于第8d将每只大鼠右后足掌处皮下注射0.05mL 1g/L FCA加强免疫。

分组：造模成功大鼠随机分为6组，每组6只，分为空白对照组(CG)、模型组(MG)、甲氨蝶呤组(WPG)、雷公藤多苷组(CPG)、乌苏里瓦韦总黄酮高剂量组(LHG)、乌苏里瓦韦总黄酮低剂量组(LLG)。

WPG组灌胃9.45mg/kg/d，CPG组灌胃0.5mg/kg/3d，LHG组灌胃472.86mg/kg/d，LLG组灌胃283.5mg/kg/d，均利用三蒸水配制，模型组及空白对照组灌胃三蒸水，从第15d开始按10mL/kg对大鼠进行灌胃给药，每天早晨9点灌胃，至28d。

对如下指标进行观察及测定，数据结果以平均数±标准差

表示，采用SPSS26.0软件分析所得数据，p<0.05具有显著性差异，p<0.01具有极显著差异，p>0.05无统计学意义。

(1)生理指标：分别于第4d、8d、12d、16d、20d、24d、28d测量各组大鼠体质量，并使用数显游标卡尺测量每只大鼠右后足的足掌厚度，每只大鼠平行测量3次，取平均值。根据公式：足肿胀度＝(致炎后足掌厚度-致炎前足掌厚度)/致炎前足掌厚度×100％，计算大鼠右后足足肿胀度。

行为观察结果显示，CG组大鼠摄食积极，大鼠活跃，体质量均持续增加，皮毛光滑有光泽。相反，MG组大鼠毛发枯槁，体质量增长较缓，动作迟缓，活动减少。治疗后，给药组小鼠的精神状态均有所改善，但WPG组大鼠虽足肿胀症状减轻明显，可体质量增长缓慢，倦怠，皮毛粗糙，垫料潮湿。

大鼠体质量作为一种常规的实验指标，可以反映药物的安全性，通过体质量的增减变化从侧面反映药物的整体疗效。大鼠体质量的测定结果见表5。与CG组大鼠比较，MG组大鼠毛发枯槁，体质量增长较缓，动作迟缓，活动减少；与MG组比较，CG、CPG组、乌苏里瓦韦总黄酮组大鼠摄食积极，大鼠活跃，体质量均持续增加，皮毛光滑有光泽，但WPG组大鼠虽足肿胀症状减轻明显，但体质量增长缓慢，倦怠，皮毛粗糙，垫料潮湿，可能甲氨蝶呤造成大鼠不适。第28d，与CG组比较，MG组、WPG组大鼠体重极显著减轻(p<0.01)；与MG组比较，治疗组大鼠体重均显著高于模型组(p<0.05)。

表5实验组对类风湿性关节炎大鼠体重的影响(

n＝6)

注：1)空白组比较，aa：p<0.01，a：p<0.05。2)与模型组比较，bb：p<0.01，b：p<0.05。

足肿胀体积是反应RA大鼠炎症程度的外部客观指标，见表6，与CG组比较，MG组大鼠足肿胀度升高，具有极显著差异(p＜0.01)，可证明佐剂性关节炎大鼠模型建立成功。第24d后，与MG组大鼠足肿胀度比较，WPG组、乌苏里瓦韦总黄酮组均具有显著性差异(p<0.05)，其中LHG组具有极显著性差异(p<0.01)。第28d，与MG组大鼠组肿胀度比较，CPG组、WPG组、乌苏里瓦韦总黄酮组有显著性差异(p<0.05)，其中LHG组具有极显著性差异(p<0.01)，且作用效果呈剂量依赖性。证明各给药组对RA大鼠都具一定的治疗作用，LHG组改善大鼠足肿胀程度作用最为显著，表明乌苏里瓦韦总黄酮可减轻大鼠RA炎症，明显缓解大鼠多发性关节炎症的进展。

表6实验组对大鼠组织肿胀度的影响(

n＝6)

注：1)空白组比较，aa：p<0.01，a：p<0.05。2)与模型组比较，b：p<0.05，bb：p<0.01。

(2)小鼠脏器指数测定：

实验组对类风湿性关节炎大鼠脏器指数的影响如表7所示，与CG组比较，MG组大鼠的脾脏、胸腺、肝脏、肾脏指数均显著增加(p<0.05)，证明经弗氏完全佐剂造模后，AA大鼠脾脏、胸腺、肝脏、肾脏均有不同程度肿大。WPG组大鼠脾脏指数、胸腺指数、肝脏指数分别与MG大鼠接近，肾脏指数高于MG组，反映了目前西医抗类风湿性关节药物普遍存在的不良反应和不良反应较大的缺陷。与MG组比较，LHG组脾脏指数、胸腺指数、肝脏指数、肾脏指数均具极显著差异(p<0.01)，且与CG组无明显差异，证明乌苏里瓦韦总黄酮未对大鼠造成明显器质性损伤。

表7实验组总黄酮对大鼠脏器脂数的影响(

n＝6)

(3)小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量的测定：于第28d将每只大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，利用一次性使用微量采血管进行眼眶内眦静脉丛取血，置于15mL离心管中，低温2℃3000r/min离心15min，分离上层血清，-20℃低温保存。按照试剂盒说明方法用酶标仪检测血清TNF-α、IL-1β、IL-6的含量变化。

大鼠血清生化指标见表8。与CG组比较，MG组大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6含量均有极显著性增加(p<0.01)，且CPG组、WPG、LHG组与CG组TNF-α、IL-1β、IL-6含量接近，其中LHG组与CG组IL-1β、IL-6含量最为接近；与MG组比较，所有治疗组TNF-α、IL-1β、IL-6含量均有不同程度下降，除LLG组外均具有极显著性差异(p<0.01)；证明所有给药组对RA大鼠均具一定的治疗作用，乌苏里瓦韦总黄酮可显著降低佐剂性关节炎大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量(p＜0.01)。

表8实验组对类风湿性关节炎大鼠血清中炎症因子含量影响(

n＝6)

(4)大鼠踝关节病理学观察：于第28d颈椎脱臼处死大鼠，取每只大鼠右后足踝关节，剔除关节周围肌肉组织，4％多聚甲醛固定，脱钙，石蜡包埋，切片，利用苏木素-伊红(HE)染色，制成病理组织切片，于显微镜下观察踝关节组织病理形态。

如图6～图11所示，CG组大鼠踝关节关节腔完整，滑膜细胞结构完整、排列整齐，未出现增生、损伤及炎性浸润。

如图12～图17所示，与CG组比较，MG组大鼠出现严重软骨损伤及炎性细胞浸润。与MG组比较，各给药组大鼠上述病理状态均有不同程度改善，其中WPG组和LHG组尤为明显，滑膜细胞增生、滑膜组织充血及软骨细胞破坏等病理改变均较MG组明显减轻，炎性细胞浸润减少。

通过下述实验，验证乌苏里瓦韦总黄酮抗类风湿性关节炎的作用，证实乌苏里瓦韦总黄酮对佐剂性关节炎大鼠具有一定的治疗作用。

由于肠道微生物可通过降低维生素C水平而对类风湿关节炎患者产生影响，而佐剂性关节炎大鼠体内维生素C水平与“菌-肠-关节轴”之间的关系尚未见报道。因此，将基于16S rRNA测序技术探讨乌苏里瓦韦总黄酮对大鼠佐剂性关节炎模型肠道菌群的调节作用，重点研究了佐剂性关节炎大鼠血清中炎性细胞因子、VC含量以及肠道菌群之间的关系。

1仪器与材料

1.1仪器

1.2试剂及耗材

2方法

2.1大鼠血清维生素C含量测定

2.1.1供试品溶液的制备

取大鼠血清，每组取3只大鼠血清等量合并为一个样品，每个样品500μL，共6个样品，分别加入170μL 10％偏磷酸溶液，混匀，4000r/min，4℃，离心10min，取上清液，利用HPLC法进样测定VC含量，每个样品测定3次，取平均峰面积值。

2.1.2标准品溶液的配制及标准曲线的建立

精密称取2.02mg维生素C标准品，溶于10mL 2.5％偏磷酸中，得维生素C标准储备液备用。分别配制5μg/mL、10μg/mL、12.5μg/mL、15μg/mL、20μg/mL、30μg/mL维生素C系列标准溶液，每个浓度进样3次，以维生素C标准品(μL/mL)为横坐标，色谱峰平均峰面积为纵坐标建立标准曲线。

2.1.3HPLC色谱条件的确定

色谱条件：Kromasil C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；流动相为100mmol/L KH₂PO₄∶甲醇(90∶10)；流速0.6mL/min；进样量5μL；柱温25℃；检测波长243nm。

2.1.4精密度试验

精密吸取15μL/mL维生素C对照品溶液，连续进样6次，色谱条件同上，测定峰面积值，计算RSD值。

2.1.5重复性试验

按上述方法制备供试品，重复6次。将供试品按上述色谱条件进样，测定峰面积值，计算RSD。

2.1.6加样回收率试验

在6份已知维生素C含量的血清样本中分别加入已知量的维生素C标准品，色谱条件同上，测定峰面积值，计算回收率。

2.1.7大鼠血清中维生素C含量测定方法

将各样品按上述HPLC色谱条件和方法进样，测定各样品峰面积，代入线性方程，计算各组大鼠血清中维生素C含量。

2.2 16S rRNA测序技术检测大鼠肠道菌群变化

2.2.1大鼠粪便样品的收集

于第28d抚摸大鼠腹部刺激排便，收集各组大鼠粪便，置于干冰中，后移至-80℃冰箱保存备用。

2.2.2 DNA的提取和PCR扩增

采用CTAB法提取样本基因组DNA，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和浓度，使用无菌水稀释样品至1ng/μl。用341F(5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’)和806R(5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)引物对V3+V4可变区进行PCR扩增。

2.2.3 Illumina Novaseq测序

将PCR产物进行等浓度混样并使用琼脂糖凝胶电泳纯化，利用

DNA PCR-Free Sample Preparation Kit试剂盒进行文库的构建，经过Qubit定量和文库检测合格后，使用NovaSeq 6000PE250进行上机测序(深圳微科盟科技集团有限公司)。使用UPARSE软件根据97％的相似度对序列进行操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTU)聚类，并使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用QIIME2、LEfSe、R软件对测序结果进行Alpha多样性、Beta多样性、差异菌属等生物信息学分析。上述分析运用默认参数。

2.3统计学分析

用SPSS 26.0软件对实验数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，结果以均数±标准差

表示，p<0.05表示差异有统计学意义。

3结果与讨论

3.1大鼠血清维生素C含量测定结果

3.1.1标准品线性及线性范围

以进样浓度(mg/mL)为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制维生素C标准曲线，见图18，线性回归方程为：y＝8.2736x+36.043，r＝0.9995，维生素C浓度在5～25mg/mL范围内线性关系良好。维生素C标准品的高效液相色谱图见图19，出峰时间为3.6596min。

3.1.2精密度试验

精密度试验结果见表9，RSD为0.70％。表明此仪器精密性良好。

表9精密度实验结果

3.1.3重复性试验

重复性试验结果见2，峰面积平均值为175.9，RSD为2.5％。

表10重复性实验结果

3.1.4加样回收率试验

从加样回收实验可知，加标后样品中的VC含量均提高，说明大鼠血清中含有VC。加样回收率试验结果见表3，RSD值为1.47％，符合实验要求。

表11加样回收率试验结果

3.1.5大鼠血清维生素C含量测定

按上述色谱条件测定样品中VC含量，分离度大于1.5，理论塔板数大于6000。大鼠血清中的维生素C高效液相色谱图见图20，出峰时间为3.705min。

将供试品维生素C峰面积代入3.1.1项下回归方程中，各组大鼠血清维生素C平均含量见表4。测定结果显示，与CG组比较，MG组、CPG组、LLG组大鼠血清中维生素C含量具有极显著差异(p＜0.01)，WPG组大鼠血清中维生素C含量具有显著差异(p＜0.05)，LHG组无显著差异。与MG组比较，所有治疗组大鼠血清中维生素C含量均具有极显著差异(p＜0.01)。证明乌苏里瓦韦总黄酮、雷公藤、甲氨蝶呤均可有效提高佐剂性关节炎大鼠体内维生素C含量，且高剂量乌苏里瓦韦总黄酮组效果最佳。

表12供试品维生素C含量测定结果(

n＝3)

3.2大鼠肠道菌群变化

3.2.1 OTU分析

在给定相似度下聚类所得到的每个样品的OTU绘制Venn图，6组共有9496个OTU，共有OTU为555个，说明各组皆有被归类为相同OTU的序列。CG、CPG、LHG、LLG、WPG、MG组特有OTU个数分别为1690个、1831个、1474个、1328个、1392个、1226个，见图21。

3.2.2 Alpha多样性分析

Alpha多样性指数可以反映肠道菌群的丰富度和多样性，其中，observed otus、Chao1指数可用于衡量物种丰富度的指标，observed otus、Chao1指数越大，说明物种的丰富度越高。Shannon指数用于衡量物种多样性，Shannon指数值越大，说明物种多样性越高。如表5所示，Shannon指数显示了各组的肠道菌群多样性无显著性差异(p>0.05)，说明雷公藤多苷、甲氨蝶呤、乌苏里瓦韦对肠道菌群的多样性无明显影响。Observed otus和Chao 1指数分析显示，与MG组比较，CPG、WPG、LHG组菌群丰度显著升高(p<0.05)，其中CPG和LHG组具有极显著差异(p<0.01)，与CG组的菌群多样性无显著性差异(p>0.05)。说明LHG组物种丰度趋近于正常对照组而有别于模型组，提示乌苏里瓦韦(LU)总黄酮具有改善佐剂性关节炎大鼠物种丰度作用。

表13α多样性分析

Alpha多样性稀释曲线(Rarefaction Curve)是从样品中随机抽取一定测序量的数据，统计它们所代表物种数目或多样性指数，以测序数据量与物种多样性来构建的曲线，曲线的平缓程度反映了测序深度对于观测样本多样性的影响大小，曲线越平缓，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性，继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新OTU。本次实验Alpha多样性稀释曲线如图22所示，曲线趋向平坦，说明本发明测序数据量合理，样本测序深度充分。

3.2.3β多样性分析

β多样性分析中的PCA主成分分析常用于样本多样性分析，样本间距离越远代表样本间多样性差异越大。如图23中主坐标分析图所示，CPG、WPG、LHG组样本与CG组样本相距较近，多样性差异较小，菌群特征接近，而与MG组样本间多样性差异较大。证明经乌苏里瓦韦总黄酮治疗干预后，可引起大鼠肠道菌群结构的变化。

3.2.4物种组成分析

3.2.4.1门水平上差异

测序结果显示，在门分类水平主要检测出21个菌门，分别为：Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Tenericutes(软壁菌门)、Actinobacteria(放线菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Verrucomicrobia(疣微菌门)、TM7、Chloroflexi(绿弯菌门)、Gemmatimonadetes(芽单胞菌门)、Unclassified、Nitrospirae、Cyanobacteria、Euryarchaeota、Elusimicrobia、Armatimonadetes、Chlorobi、WS3、Planctomycetes、AD3、Other，见图24。与CG组比较，MG组大鼠厚壁菌门丰度明显降低，拟杆菌门、变形菌门丰度明显升高。与MG组比较，各给药组大鼠厚壁菌门均明显上调，拟杆菌门和变形菌门丰度明显下调。说明在门水平上Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes菌门可能参与了乌苏里瓦韦总黄酮抗RA过程。

3.2.4.2属水平上差异

测序结果显示，在属分类水平主要检测出21个菌属，分别为：Unclassified、Allobaculum(别样棒菌属)、Ralstonia(劳尔氏菌属)、Oscillospira(颤螺菌属)、Ruminococcus(胃瘤菌属)、Lactobacillus(乳酸杆菌属)、Streptococcus(链球菌属)、Coprococcus(粪球菌属)、Paraprevotella(帕拉普氏菌属)、Aggregatibacter(结肠杆菌)、Bifidobacterium(双歧杆菌属)、Clostridium(梭状芽孢杆菌属)、Turicibacter、Blautia(布劳特氏菌属)、Dorea(多尔氏菌属)、Pseudomonas(假单胞菌属)、Desulfovibrio(脱硫弧菌属)、Prevotella(普雷沃菌属)、Kaistobacter(凯斯通氏菌属)、Bacillus(芽孢杆菌属)、Other，见图25。与CG组比较，MG组大鼠Unclassified、Oscillospira、Lactobacillus菌属丰度明显降低，Allobaculum、Ralstonia菌属丰度明显升高。与MG组比较，CPG组、LHG组、LLG组大鼠Unclassified、Ralstonia、Oscillospira菌属丰度上调，WPG组Ralstonia菌属丰度下调。说明在属水平上Unclassified、Ralstonia、Oscillospira菌属可能参与了乌苏里瓦韦总黄酮抗RA过程。

3.2.5物种差异判别分析

为进一步评估分组间细菌群落的显著性，选用多级物种差异判别分析(lineardiscriminate analysis size effect,LEfSe)在属水平上筛选各组显著差异的细菌类群，见图26和27。LDA柱形图中每一横向柱形体代表一个物种，柱形体长度对应LDA值，LDA值越大表示差异越大，在各组中丰度较高的菌属为该属特征微生物。cladogram图由内到外分别对应界门纲目科属不同的分类层级，层级间连线代表所属关系，每个圆圈点代表一个物种，非黄色节点为该组特征微生物。

分析结果显示，与CG组比较，CPG组、LHG组差异菌属增多。其中CPG组Gammaproteobacteria(γ-变形菌属)、Pseudomonadales(假单胞菌属)、Vibrionaceae(弧菌属)、Pseudomonadaceae、Vibrio(弧菌属)、Pseudomonas(假单胞菌属)、Stenotrophomonas(寡养单胞菌属)、Bdellovibrionales(蛭弧菌)、Delftia(戴尔福特菌属)、Enhydrobacter(水栖菌属)、Moraxellaceae(莫拉菌属)、Serratia(沙雷氏菌属)丰度增加，LHG组Faecalibacterium(普拉梭菌)、Bacteroides(拟杆菌属)、Bacteroidaceae、Porphyromonadaceae、Parabacteroides、Dialister、Butyricimonas、Eubacterium(真杆菌属)、Sarcina、Gemmiger丰度增加。与MG组比较，WPG组、CPG组、LHG组差异菌属均增多。

综上所述，LU总黄酮治疗通过降低大鼠血清中细胞因子含量、提高大鼠血清中VC含量、升高大鼠肠道内厚壁菌门及别样棒菌属(Allobaculum)丰度、降低大鼠肠道内变形菌门及劳尔氏菌属(Ralstonia)丰度，显着抑制AA大鼠的RA状态。关节囊、半月板、软骨、滑膜等均能产生炎性介质，与炎性细胞因子密切相关，进而炎性细胞因子产生关节炎，反之，关节炎又刺激各种炎性细胞因子生成，互为因果。TNF-α、IL-1β、IL-6是三种常见的炎性细胞因子，在发生关节炎时，这三种炎性因子含量会显著增加。VC是一种经典的抗氧化剂，可通过减少炎性细胞因子含量和氧化应激来缓解各种器官损伤和包括关节炎在内的各种炎症反应。有研究证明，机体内VC含量较高时，可显着降低TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，并有效缓解炎性细胞因子导致的机体内的各种炎性反应。VC曾被报道可预防炎症性关节炎的发展，这可能是通过调节自身免疫反应和改善炎症来实现的。此外，RA患者通常缺乏VC且需要高剂量补充以维持血浆内的VC水平。所以，降低体内细胞因子含量，逆转由于炎症反应导致的体内VC含量降低，或许可以有效阻止RA的发生。本章实验测定结果表明MG组大鼠血清中VC含量显著低于CG组(p＜0.01)，并且MG组大鼠血清中VC含量明显低于CG组。而经LU高剂量总黄酮治疗后，大鼠体内的炎性因子含量有所降低且与CG组极为接近，无显著差异；LHG组大鼠血清中VC含量也与CG组较为接近。证实LU高剂量总黄酮可有效改善佐剂性关节炎大鼠体内VC含量下降。

肠道菌群的改变可能会导致RA的早期发展，而VC能够降解肠道微生物功能与RA程度，并且其功能与促炎细胞因子水平TNF-α、IL-6呈正相关。肠道微生物菌群失调与RA炎症反应密切相关，肠道菌群通过调节远端器官的免疫功能或代谢物通过受损的肠上皮细胞直接进入血液循环系统，合成并释放炎症相关因子，诱发炎症反应，促进RA继发性炎症的发展。增加肠屏障保护功能菌丰度，如厚壁菌门的丰度，可降低肠源性内毒素释放，减轻炎症。在本实验中，MG组大鼠变形菌门丰度最高，而经过LU高剂量黄酮治疗后，大鼠体内变形菌门丰度则显著降低，接近CG组。且RA患者体内变形菌门丰度高于正常人体内变形菌门的丰度，与本实验结果一致。目前国内外对于别样棒菌属的研究较少，在本发明中，经过LU高剂量黄酮治疗后，大鼠体内别样棒菌属丰度显著升高，说明其可能与RA的发病机制密切相关，值得进一步深究该菌属在RA防治中的意义。目前对于劳尔氏菌属的报道多集中于其对植物的病害研究上，而关于其与RA的相关作用则甚少有人研究，本发明首次发现在RA小鼠与正常小鼠中劳尔氏菌属丰度的变化，也可为后续有关RA的防治方面提供一定的理论数据。

本实验所采用的阳性药物有两种，分别是甲氨蝶呤与雷公藤，甲氨蝶呤被欧洲抗风湿病联盟和美国风湿病学会定位于早期RA治疗的首选用药，但其肝毒性较大，高剂量可致肾衰竭。雷公藤多苷可防治类风湿性关节炎，其毒性主要表现在对肝脏具有直接损伤作用，并具有肾毒性反应，可损伤肾小管与肾间质。本发明结果表明，WPG组和CPG组大鼠脏器均出现不同程度损伤，而LHG组大鼠未出现此不良反应，LU总黄酮用于治疗RA疗效显著，且较甲氨蝶呤、雷公藤多苷更具安全性，值得临床推广应用。

通过对大鼠佐剂性关节炎模型中各实验组的促炎细胞因子、血清中维生素C含量、大鼠肠道菌群变化研究结果推测乌苏里瓦韦高剂量总黄酮可通过上调大鼠肠道菌群中Unclassified、Ralstonia、Oscillospira菌属丰度，进而提高佐剂性关节炎大鼠体内维生素C含量，降低TNF-α、IL-1β、IL-6含量，从而发挥抗RA作用。

本实验对乌苏里瓦韦总黄酮提取工艺进行了探究，筛选出一种乌苏里瓦韦总黄酮最佳提取工艺。根据动物实验结果可知，高剂量乌苏里瓦韦总黄酮组的抗RA效果强于低剂量组，这可能与大鼠体内黄酮的累计有关。所以对乌苏里瓦韦总黄酮的提取工艺进行探究，有利于找出更好的提取乌苏里瓦韦总黄酮的方法，为研究乌苏里瓦韦总黄酮抗RA提供科学的理论依据和实验基础。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.乌苏里瓦韦总黄酮在制备抗类风湿性关节炎药物方面的应用；

乌苏里瓦韦总黄酮是按下述步骤制备的：

步骤三、然后上样于D101型大孔树脂，用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发，冷冻干燥，即得乌苏里瓦韦提取物；

其中，步骤二中乙醇水溶液的体积分数为75％，步骤三中乙醇水溶液的体积分数为50％。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤一中过80目筛。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤二所述的超声功率为180W-360W，超声温度为40℃-80℃，超声时间为40min-80min，料液比为(1∶10)g/mL-(1∶60)g/mL。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤二所述的超声功率为364W，超声温度为58℃，超声时间为50min，料液比为(1∶20)g/mL。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤三中上样浓度为0.34g/mL，上样吸附时间为12h。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于步骤三中洗脱流速为4BV/h，洗脱体积为4BV。