CN108524749A - 一种用于改善肠道菌群分布的中药组合物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于改善肠道菌群分布的中药组合物及应用,所述中药组合物包括如下质量配比的原料制成:生地黄14~18份、茯苓2~4份,天冬1~2份。本发明的组合物及其制剂能增加厚壁菌门/拟杆菌门的比例,促进肠道短链脂肪酸分泌,抑制炎症反应。厚壁菌门前者包括多种有益健康的微生物,能促进营养吸收和利用。肠道菌群多样性是肠道健康水平的重要指标,且与机体衰老密切相关。本发明所述组合物能明显提高肠道菌群多样性,增进肠道健康,降低疾病风险。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种用于改善肠道菌群分布的中药组合物及其应用。
(二)背景技术
人体是一个非常复杂的生态系统。在人的身体内外生活的微生物的细胞数量有百万亿之多,其中超过90%的共生微生物生活在人的消化道里,称为“肠道菌群”,它们对人体健康起着不可或缺的作用,其结构的失调与多种慢性疾病的发生发展关系密切。随着大量的肠道微生物研究的开展和深入,科学家发现一系列人类疾病,如糖尿病、肥胖、类风湿、帕金森病、心脑血管疾病及一些精神类疾病等都与肠道微生物相关。开发新的微生物诊断、治疗方法,以及利用“益生菌”产品来预防有害的微生物失衡已经取得很大进展。
近年来,研究发现传统中医药有很多药物和疗法可能是通过调整菌群来发挥预防和治疗疾病的作用的。中药富含多糖、寡糖及糖苷类成分,多糖摄入后可达远端的肠道,通过肠道微生物群落的作用发酵。由不同的微生物发酵途径产生的这些生物分子的进一步水解导致产生更多的ATP和简单的碳分子,重要的如短链脂肪酸(乙酸盐,丙酸盐、丁酸盐等),短链脂肪酸在肠道中既储存了能量又降低了渗透压,并且对于维持大肠的正常功能和结肠上皮细胞的形态和功能具有重要作用,此外,还可促进钠的吸收,丁酸在这方面的作用比乙酸和丙酸更强并且丁酸可增加乳酸杆菌的产量而减少大肠杆菌的数量。在对寡糖的研究中发现它可以改善人体内微生态环境,有利于双歧杆菌和其它有益菌的增殖,经代谢产生有机酸使肠内pH值降低,抑制肠内沙门氏菌和腐败菌的生长,提高人体免疫功能,可直接用来调节肠道菌群、润肠通便、调节血脂、调节免疫等。一系列的研究也不断的证实了中药疗效和肠道菌群的相关性,如2014年,国际微生物生态学会会刊发表“一种中药复方改善糖尿病过程中的肠道菌群结构变化特征”;2015年,上海交通大学团队发表研究论文证明了中医药食同源食品改变菌群、防治儿童遗传性肥胖的潜力。
近些年的研究也发现肠道菌群与衰老有着密切关系。主要表现在四个方面:(1)厚壁菌门/拟杆菌门比率下降;(2)短链脂肪酸含量下降。厚壁菌门/拟杆菌门的比率变化和短链脂肪酸产量下降直接相关,研究发现,老年人因营养缺乏或组织衰退会触发原本无害的共生菌失衡,导致机体发生致病性炎性反应。(3)肠道菌群多样性下降。随着年龄的增长,肠道菌群的多样性会发生变化,12岁之前肠道一直在构造过程中,即菌群的多样性和丰富度在逐渐增长,而到了40岁之后,肠道菌群的多样性开始下降;(4)兼性厌氧菌增加,如链球菌、肠杆菌,肠杆菌科细菌具有潜在的致病性,被定义为“Pathobionts”。利用中药调节肠道菌群分布,特别是减少致病菌,促进厚壁菌、脱铁菌等微生物形成优势,有利于改善机体对营养成分的吸收和利用,增强老年人体抵抗疾病的能力。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种能增加肠道中厚壁菌门/拟杆菌门比率、提升肠道丁酸含量、提高肠道菌群多样性、改善肠道健康水平的中药组合物及其制剂。
本发明采用的技术方案是:
本发明提供一种用于改善肠道菌群分布的中药组合物,所述中药组合物由如下质量配比的原料制成:生地黄14~18份、茯苓2~4份,天冬1~2份,更优选生地黄16份、茯苓3份,天冬1份。
进一步,所述中药组合物还包括1~2份地骨皮和/或1~2份麦冬和/或4~8份红参,即还包括1~2份地骨皮、1~2份麦冬或4~8份红参中的一种或多种。
进一步,所述中药组合物由如下质量配比的原料制成:生地黄14~18份、茯苓2~4份,1~2份地骨皮,1~2份麦冬,天冬1~2份,更优选生地黄16.3份、茯苓3.3份,1.2份地骨皮,0.8份麦冬,天冬1份。
进一步,所述中药组合物由如下质量配比的原料制成:生地黄14~18份、茯苓2~4份,地骨皮1~2份,天冬1~2份,麦冬1~2份,红参4~8份,更优选生地黄16.7份、茯苓3.7份,地骨皮1份,天冬1份,麦冬1份,红参6.1份。
本发明还提供一种所述用于改善肠道菌群分布的中药组合物的制备方法,所述方法为:将配方量原料混合,用水煎煮,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.30-1.40,得浸膏或干燥成粉末即为所述中药组合物。
进一步,所述水的用量为原料总重量的8-10倍。
进一步,所述煎煮分为3次,每次煎煮后过滤,滤饼加入水再次煎煮,合并滤液。
此外,本发明还提供一种所述用于改善肠道菌群分布的中药组合物在制备肠道菌群调节剂中的应用,所述肠道菌群调节剂能够增加肠道内厚壁菌门(Firmicutes)微生物丰度,降低拟杆菌门(Bacteroidetes)微生物比例,,增加厚壁菌门/拟杆菌门的比率,提高肠道菌群多样性和短链脂肪酸含量,改善肠道健康水平。
本发明中药组合物加入适当辅料(如淀粉、蜂蜜)可制成片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液或膏剂,也可作为活性成分添加到其他食品或药品中,所述药物有效剂量以生药量计为3.0~9.0g/日。
与现有技术相比,本发明的有益效果主要体现在:第一,本发明中药制剂能增加厚壁菌门/拟杆菌门的比率,促进肠道丁酸分泌,抑制炎症反应。厚壁菌门前者包括多种有益健康的微生物,能促进营养吸收和利用。第二,肠道菌群多样性是肠道健康水平的重要指标,且与机体衰老密切相关。本发明所述组合物能明显提高肠道菌群多样性,增进肠道健康,降低疾病风险。
目前市场上常见的肠道微生物调节剂主要包括益生菌和益生元。益生菌多为工分离培养而得,如双歧杆菌、乳酸杆菌等等。补充益生菌虽然有益肠道健康,但外来的益生菌难以在肠道内长期定植及形成分布优势,因此效果不能持续。益生元以水溶性多糖、寡糖为主,能促进有益微生物生长,但日用量较大(每日30-50g)且需长期服用。本发明的组合物为中药组方,并不通过外源补充益生菌来发挥作用,而是调节宿主体内已定植的微生物比例达到干预目的,制剂每日服用量仅1-3g(以固体制剂计算),效果持续且更为简便。根据中医理论及临床经验,针对气阴两虚人群,还可在处方中增加补益中药,使之更符合身体调理的需求。
(四)附图说明
图1为实施例4中组合物给药前肠道菌群多样性指数的变化,H-S表示高剂量给药组、L-S表示低剂量给药组、O-S表示老年动物对照组、Y-S表示年轻动物对照组。
图2为实施例4中组合物给药后肠道菌群多样性指数的变化,H-S表示高剂量给药组、L-S表示低剂量给药组、O-S表示老年动物对照组、Y-S表示年轻动物对照组。
图3各组动物肠道菌群分布情况。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
本发明实施例所用生地黄、茯苓、天冬、地骨皮、麦冬、红参均符合《中国药典》2015版的规定。
实施例1
1、中药组合物配方:生地黄400g,茯苓75g,天冬25g。
2、制备方法:取配方量的生地黄、天冬和茯苓,加10倍质量的水煎煮3次,第一次煎煮2小时,第二、三次分别煎煮1小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度为1.30~1.40(60℃),得浸膏约250g,加入200g蜂蜜混匀制成膏滋。
实施例2
1、中药组合物配方:生地黄163g,茯苓33g,天冬10g,地骨皮12g,麦冬8g。
2、制备方法:取配方量的生地黄、麦冬、天冬、地骨皮、茯苓,加8倍质量的水煎煮3次,第一次煎煮2小时,第二、三次分别煎煮1小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度为1.30~1.40(60℃),得浸膏约112g,加80g淀粉干燥制粒,制成颗粒剂。
实施例3
1、中药配方:生地黄150g,红参55g,茯苓33g,麦冬9g,天冬9g,地骨皮9g。
2、制备方法:取配方量的生地黄、麦冬、天冬、地骨皮、茯苓,加8倍质量的水煎煮3次,第一次煎煮2小时,第二、三次分别煎煮1小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度为1.30~1.40(60℃),得浸膏105g。红参粉碎成细粉,与浸膏及30~40g淀粉干燥制粒,压片包衣,制成片剂。亦可制粒后,整粒加入适量辅料装填胶囊,制成胶囊剂。
实施例4:中药组合物对老龄小鼠肠道微生态的影响
1.实验方法
按实施例1的方法制备的浸膏。C57BL/6小鼠,雌性,6周龄小鼠购买自上海斯莱克实验动物有限公司,6月龄小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。
称取适量实施例1制备的浸膏,溶于水中制成54mg/ml的储备液,高温高压灭菌后添加至小鼠饮用水中进行给药。实验动物及分组:年轻对照组,老年对照组,老年鼠给予高剂量组合物组和老年鼠给予低剂量组合物组,其中年轻对照组使用6周龄小鼠,其余3组使用6月龄小鼠作为老年组,高剂量组改善肠道菌群分布的组合物给药剂量为0.45g/kg·d(相当于生药量0.9g/kg·d),给药时将储备液稀释30倍,低剂量组给药剂量为0.09g/kg·d(相当于生药量0.18g/kg·d),给药时将储备液稀释150倍。小鼠提供充足的饲料和饮用水,年轻对照组和老年对照组饮用水不添加药物,22-24℃,L/D环境中饲养六周。
粪便样本提取:小鼠饲养六周后称重,随后断颈处死小鼠,70%乙醇浸泡2min后,于无菌操作台内解剖,将直肠至盲肠末端整段肠道剪下放于无菌培养皿中,在近回盲部盲肠1cm左右剪断,取该段内容物放于无菌EP管中,作为盲肠部粪便样品。将样本置于液氮淬灭5min后,-80℃存放。16s rDNA V3V4多样性测序:使用干冰保存粪便样品,进行16s rDNAV3V4多样性测序分析,测序数据分析流程:使用Illumina HiSeq 2500平台对小鼠肠道菌群进行测序后,首先对原始数据进行拼接,使用QIIME对数据进行过滤,每只小鼠平均得到53051个有效序列。然后使用uparse软件对所有样品的有效序列进行聚类,以97%的一致性将序列聚类成为OTUs。根据OTUs聚类结果,对每个OTU的代表序列做物种注释,得到对应的物种信息和基于物种的丰度分布情况。一方面,对OTUs进行丰度、Alpha多样性计算等分析,得到样品内物种丰富度和均匀度信息、不同样品或分组间的共有和特有OTUs信息等。另一方面通过T-test进一步挖掘分组样品间的群落结构差异。
2.实验结果
2.1菌群种类的变化——提升厚壁菌/拟杆菌比率
结果显示,改善肠道菌群分布的组合物给药后可对小鼠肠道微生物群落中的Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Deferribacteres(脱铁杆菌门)、Cyanobacteria(蓝藻细菌门)几个门水平的含量起到了调节作用;在属水平上共调节了44个属的含量,被调节的属除属于以上六个门外还属于Actinobacteria(放线菌门)。与文献报道相一致,机体衰老时F/B的比率从0.435下降到0.384。而老年鼠在服用高剂量或者低剂量的配方组合物后,F/B的比率从0.384分别可以提升到1.031和1.006。说明厚壁菌含量相对升高,而拟杆菌含量相对下降。说明组合物具有对肠道菌群分布的调节作用。
表1拟杆菌门和厚壁菌门在各实验组中的变化情况
注:**p<0.01,给药试验组vs.老年鼠对照组;##p<0.01,老年鼠对照组vs.年轻鼠对照组。
2.2物种多样性分析
对不同样品在97%一致性阈值下的Alpha Diversity分析指数进行统计,绘制Simpson及Shannon多样性指数组,Simpson和Shannon指数越大说明取到两个相同的概率越小,理论上多样性应该越高。从下表2可看出,当小鼠衰老时,肠道菌群多样性降低(但差异不显著,个体间差异较大),与文献中描述一致;当给予组合物后,相比老年鼠组,给药组的Simpson和Shannon指数都显著升高,且个体化差异显著减小。该实验说明改善肠道菌群分布的组合物可以稳定肠道菌群,增加其多样性。
表2 Shannon和Simpson指数在各实验组中的变化情况
注:*p<0.05,给药试验组vs.老年对照组;#p<0.05,老年鼠对照组vs.年轻鼠对照组
实施例5:中药组合物对老年鼠肠道丁酸含量的影响
1.实验方法
按实施例2的方式制备浸膏。采用C57BL/6小鼠,雌性,6周龄(年轻小鼠,15-18g),6个月龄(老年小鼠,25-30g),于浙江大学实验动物中心清洁级饲养。小鼠自由饮水进食,于温度25℃±1,湿度22%±1,12h光照/12h黑暗环境中饲养。实验小鼠分3组(n=8),年轻对照组,老年对照组,老年给药组。给药形式采用灌胃给药,给药组给予0.45g/kg·d(相当于生药量0.9g/kg·d)的浸膏水溶液,对照组给予10mg/kg/d的蒸馏水。连续给药6周。
小鼠饲养6周后称重,随后断颈处死小鼠,70%乙醇浸泡2min后,于无菌操作台内解剖,将整段肠道剪下放于无菌培养皿中,取其内容物放于无菌EP管中作为粪便样品。将样本置于液氮淬灭5min后,-80℃存放。
精密称取0.3g粪便样品于1.5ml EP管中,加1ml MillIQ水,涡旋混匀后,12000r/min离心10分钟,取上清液于10ml离心管中,涡旋混匀,再加入100ul浓盐酸(12mol/L)混匀,加入乙醚2.0mL,振荡30次后4000r/min离心5min,置冰箱(4℃)内放置30min,取上层乙醚溶液GC分析备用。
GC分析条件:Agilent technologies 7890A;检测器:火焰离子化检测器(FID);色谱柱:DB624毛细管柱;升温程序:初始柱温80℃,保持5min,以20℃/min的速度升至200℃,保持5min;FID和进样口温度:分别为280℃和250℃;进样量:1μl;载气:氮气;柱流:4.0ml/min;分流比5:1。
肠道菌群检测方法与实施例4相同。
2.实验结果
实验结果表明,年轻鼠对照组肠道中正丁酸含量比老年鼠对照组高,但没有显著性差异。年老给药组正丁酸的含量显著升高,与老年对照组相比,差异具有显著性。
表3各组动物肠道正丁酸的含量
注:**p<0.01,老年鼠试验组vs.老年鼠对照组
实验结果表明,老年鼠肠道内厚壁菌较年轻鼠含量偏低,但拟杆菌含量相对较高,与文献和此前的研究一致。组合物给药后,显著提升厚壁菌的相对丰度,降低拟杆菌的相对丰度,改善了菌群分布。
实施例6:组合物对狗肠道微生物的影响
1.实验方法
按实施例3的方式制备片剂。选择年龄6-8岁比格犬8只,每日给予相当于饲料重量2%的片剂,连续给药30天。在服药前收集实验狗连续10天的粪便样本;在服药结束后,连续收集实验狗15天的粪便样本。采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit Qiagen粪便DNA快速提取试剂盒提取所有样本的DNA,并进行浓度和质量的鉴定。PCR扩增16S rRNA V3-V4区,Illumina HiSeq 2500平台高通量测序。
利用Uparse软件(V8.1.1861)测序数据进行聚类,并使用RDP Classifier(Version 11.4)方法与Silva数据库(http://www.arb-silva.de)进行肠道微生物注释分析,并统计不同时间阶段肠道在各个分类水平:kingdom(界),phylum(门),class(纲),order(目),family(科),genus(属),species(种)上的群落组成。使用Qiime(Version1.9.1)软件统计计算不同时间阶段人肠道微生物菌群物种多样性、有益菌含量、致病菌含量的动态变化。
2.实验结果
受试动物在给药30天后,所有动物肠道厚壁菌门微生物相对比率均有所升高(如下表4),而拟杆菌门变化不显著,导致厚壁菌门/拟杆菌门比率显著上升。
表4厚壁菌门/拟杆菌门比例在给药前后的变化
注:**p<0.01,*p<0.05,给药后vs.给药前。
Claims (9)
1.一种用于改善肠道菌群分布的中药组合物,其特征在于所述中药组合物由如下质量配比的原料制成:生地黄14~18份、茯苓2~4份,天冬1~2份。
2.如权利要求1所述用于改善肠道菌群分布的中药组合物,其特征在于所述中药组合物还包括1~2份地骨皮和/或1~2份麦冬和/或4~8份红参。
3.如权利要求2所述用于改善肠道菌群分布的中药组合物,其特征在于所述中药组合物由如下质量配比的原料制成:生地黄14~18份、茯苓2~4份,1~2份地骨皮,1~2份麦冬,天冬1~2份。
4.如权利要求2所述用于改善肠道菌群分布的中药组合物,其特征在于所述中药组合物由如下质量配比的原料制成:生地黄14~18份、茯苓2~4份,地骨皮1~2份,天冬1~2份,麦冬1~2份,红参4~8份。
5.如权利要求2所述用于改善肠道菌群分布的中药组合物,其特征在于所述中药组合物为片剂、胶囊、膏滋、颗粒剂。
6.一种权利要求1-4之一所述用于改善肠道菌群分布的中药组合物的制备方法,其特征在于所述方法为:将配方量原料混合,用水煎煮,过滤,滤液浓缩至相对密度为1.30-1.40,得浸膏或干燥成粉末即为所述中药组合物。
7.如权利要求6所述的制备方法,其特征在于所述水的用量为原料总重量的8-10倍。
8.如权利要求6所述的制备方法,其特征在于所述煎煮分为3次,每次煎煮后过滤,药渣加入水再次煎煮,合并滤液。
9.一种权利要求1所述用于改善肠道菌群分布的中药组合物在制备肠道菌群调节剂中的应用。
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