CN103610759A - 一种预防鸡球虫病的香菇连翘混合发酵产物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防鸡球虫病的香菇连翘混合发酵产物及其制备方法，利用香菇的药食同源和连翘的免疫调节特性，在香菇发酵培养基中加入重量15-25%的连翘粉末，装菌袋，按重量10-15%接入香菇种子培养液；在24～27℃，相对湿度58-62%条件下，黑暗混合培养18-23天；将长满菌丝的发酵混合物60℃下烘干，粉碎。按照4%的比例添加于雏鸡饲料中，经实验表明，香菇连翘混合发酵产物减少了攻虫后的盲肠病变、降低盲肠卵囊数和相对卵囊产量，具有一定的预防鸡球虫病的作用。生产工艺简单，直接混合于饲料中使用即可，便于规模化生产和应用，具有广阔的应用前景。

Description

一种预防鸡球虫病的香菇连翘混合发酵产物及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，一种预防鸡球虫病的香菇连翘混合发酵产物及其制备方法。

背景技术

鸡球虫病是养禽业中常见的寄生虫病，危害十分严重，全球普遍发生，15-50日龄的雏鸡发病率高，集约化养鸡场的发病率可达50%-70%，严重时死亡率可高达80%，而且病愈的雏鸡，生长发育迟缓，长期不能康复。雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫后，大量肠上皮细胞受损、出血，严重者造成死亡。目前，针对鸡球虫病的防治主要采用疫苗和抗生素。常用的疫苗有美国的强毒Coccivac，中国的 Eimerivax Plus 弱毒苗，然而，这些疫苗均有其自身的缺点：(1)免疫程序和使用方法不好控制；(2)生产量有限，难以满足现代养鸡业的需要；(3)球虫可能复壮和返强等，因而难以广泛应用。常用的抗生素有莫能霉素、拉萨霉素、盐霉素和磺胺类药物等，然而，长期大量使用抗生素会导致禽蛋、禽肉中抗生物素残留超标，严重影响禽产品质量。因此，研究和创制新型抗球虫的饲料添加剂对于保障养禽业健康发展意义重大。

中草药取自自然，并保持了其自然结构和活性，是经过几千年筛选后保留下来的确有实效、无毒副作用的天然物质。它具有多效性、双向调节和适应原作用等优势。许多滋阴、补血、益气、助阳的中草药物均能提高机体的免疫功能，对动物机体体液免疫、细胞免疫及非特异性免疫功能均有一定的促进作用。对动物免疫系统具有调节作用，可以提高免疫器官组织细胞的活性，促进机体免疫器官的生长及抗体的合成，从而提高动物的防病抗病能力。真菌是自然界分布广泛，种类繁多，具有很大研究和开发价值的一类微生物，其中隶属于高等大型食药用真菌的实用价值尤为突出。香港中文大学张树庭教授曾将食药用真菌定义为：无叶、无根、无花，自身结果；可食、可补、可药，周身是宝。另一方面，由于食药用真菌具有较强的纤维素类物质分解能力，并能产生丰富的次生代谢物质，故而在含有中药的培养基中通过食药用真菌独特的生长代谢可能会出现新的功能效果。

连翘是中国临床常用传统中药之一，又名黄花条、连壳、青翘、落翘、黄奇丹等。为木犀科，连翘属，植物连翘的干燥果实，连翘有抗菌、强心、利尿、镇吐等药理作用，常用连翘治疗急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结结核、尿路感染等症，为双黄连口服液、双黄连粉针剂、清热解毒口服液、连草解热口服液、银翘解毒冲剂等中药制剂的主要原料。

香菇又名香蕈或冬菇，属担子菌纲，伞菌目，侧耳科，香菇属，作为著名的食用菌类，其在营养、保健、医疗等方面存在的巨大的应用潜力近年来备受关注，香菇子实体、菌丝体及发酵液均具抗癌、保肝、降胆固醇、提高机体免疫力的作用，其中起主要作用的有效物质即为多糖。利用香菇的这一特性，采用香菇发酵转化中草药。香菇生长过程中能够分泌一系列的酶，将纤维素、木质素类大分子物质降解，并同时将中草药转化为菌体蛋白和香菇多糖，具有较高的营养价值和免疫增强的功能。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防鸡球虫病的香菇连翘混合发酵产物及其制备方法。

香菇连翘混合固体发酵培养基，是在香菇发酵培养基中加入重量15-25%的连翘粉末；

所述的香菇发酵培养基，其干重量%：玉米粒78%，麸皮15%，米糠5%，糖1%，CaCO₃1%，按总干重量︰水=100︰110加水。

香菇连翘混合发酵产物，它是用下述方法制得：

（1）按常规方法将香菇菌种的活化及液体种子培养基培养，制备种子培养液；

（2）香菇连翘混合固体发酵培养基装菌袋，按重量10-15%接入种子培养液；

（3）在24～27℃，相对湿度58-62%条件下，黑暗混合培养18-23天；

（4）将长满菌丝的发酵混合物60℃下烘干，粉碎后即为香菇连翘混合发酵产物。

香菇连翘混合发酵产物在制备预防鸡球虫病药物中的应用。

本发明提供了一种预防鸡球虫病的香菇连翘混合发酵产物及其制备方法，利用香菇的药食同源和连翘的免疫调节特性，进行混合固体发酵。通过对发酵前后营养成分分析表明，混合固体发酵能有效降低基质中的淀粉和粗脂肪含量，淀粉减少了46.78%，粗脂肪降低了14.44%；混合固体发酵显著提高了还原糖、氨基酸、蛋白质、维生素B1的含量，使基质中还原糖由原来的1.53%增加到13.98%，蛋白质由原来的12.80%增加到19.76，维生素B1由原来的1.32%增加到3.98%，氨基酸总量增加了18.54%。经动物实验表明，与对照组相比，香菇连翘混合发酵产物减少了攻虫后的盲肠病变、降低盲肠卵囊数和相对卵囊产量，流式细胞术检测结果表明，与对照组相比，香菇连翘混合发酵产物能够调节CD4⁺/CD8⁺T细胞比值。综合实验结果，该混合发酵产物具有一定的预防鸡球虫病的作用。

本发明制备了一种预防鸡球虫病的香菇连翘混合发酵产物，制备方法和生产工艺简单，直接混合于饲料中使用即可，便于规模化生产和应用，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

实施例1香菇连翘混合固体发酵

（1）香菇菌种的活化及液体种子培养

将香菇菌种在无菌条件下接种于PDA斜面培养基上，25℃培养9d活化菌种，将斜面菌种分割成2cm²大的小块转接到液体种子培养基中（马铃薯20%，琼脂0.5%，MgSO₄1.5%，KH₂PO₄1%），250mL三角瓶装液量80mL，然后在25℃，150r/min条件下培养8d。

（2）香菇连翘混合固体发酵

固体发酵基础培养基：玉米粒78%，麸皮15%，米糠5%，糖1%，CaCO₃1%，水110%（按发酵基质干重）。

加入连翘的混合固体培养基：在上述固体发酵基础培养基中加入15-25%的连翘粉末（过60目筛）。

将混合固体发酵培养基装入25cm×15cm×0.005cm食用菌专用袋，每袋500g，控制通气量一致，无菌条件下接入10-15%液体菌种，在24～27℃，相对湿度60%左右条件下黑暗混合培养18-23天。

实施例2 混合发酵后主要成分的测定

将长满菌丝的发酵产物去袋，充分混匀后于60℃下烘干，四分法取样，经微型植物试样粉碎机粉碎后过60目筛，采用常规或国标方法测定多糖、还原糖、粗蛋白、粗脂肪、淀粉和VB1等主要成分，如附表1所示。

                                                 

采用氨基酸自动分析仪自动分析仪，对发酵基料和发酵后产物进行氨基酸分析，结果如附表2所示。

 

 

实施例3香菇连翘混合发酵产物预防鸡球虫病的效果检测

（1）混合发酵产物的制备

将香菇连翘混合发酵产物去袋，充分混匀后60℃下烘干，微型植物试样粉碎机粉碎过60目，按照4%的比例添加于雏鸡饲料中。香菇普通固体发酵产物做同样处理，用于对照试验。

（2）试验动物分组和处理

刚出壳的海兰公雏40只，购自长春市北方种鸡厂，未注射任何疫苗，饲养于严格用火焰消毒无球虫的铁笼中。饮水器和饲槽等用具经严格的蒸煮消毒。饲料按肉雏鸡营养需要自行配制，未添加任何抗生素及抗球虫药。

所有试验雏鸡随机分为4组，每组10只。试验Ⅰ组，在日粮中添加4%的香菇连翘混合发酵产物；试验Ⅱ组，在日粮中添加4%的香菇普通固体发酵产物；试验Ⅲ组，普通日粮攻虫组（红对照组）；试验Ⅳ组，普通日粮未攻虫组（白对照组）。具体处理见附表3。

 表3. 动物分组及处理

  

（3）检测指标及检测方法

1）平均日增重

ΔＷ=宰杀时重-攻虫时重/试验天数

2）盲肠卵囊计数

接种卵囊的第7天剖杀，取其盲肠。用组织匀浆机捣碎盲肠（捣碎液用去离子水），取1g盲肠样品，进行10倍稀释。取盲肠稀释液一滴置血球记数板中，在低倍镜下计算记数室四角4个大方格（每个大方格又分为16个中方格）中球虫卵囊总数，除以4求平均值，乘10⁴ 即为1mL液体的卵囊数，然后乘10即为OPG值。 

计算公式：OPG= a×10⁵

3）盲肠病变计分

剖检盲肠，肉眼观察盲肠病变，按Johnson设计的病变记分法记分。将盲肠病变分为0～+4五个等级。0分：无肉眼病变；+1分：盲肠壁有很少量散在的瘀血点，肠壁不增厚，内容物正常；+2分：病变数量较多，盲肠内容物明显带血，肠壁稍增厚；+3分：盲肠内有多量血液或有盲肠芯，盲肠壁增厚明显，盲肠中粪便含量少。+4分：因充满大量血液或肠芯而盲肠肿大，肠芯含有粪渣或不含，死亡鸡只也记+4分。两侧病变不一致时，以严重一侧为准。

4）细胞免疫水平（CD4⁺、CD8⁺ T细胞）检测

各组鸡宰杀前逐只翅下静脉采血，按1ml血样加100μL 2%的Na₂EDTA制成抗凝血，混匀后制成细胞悬液，分装于2mL的离心管中，调整细胞数10⁶/mL/管，加入1.5mL FACS缓冲液，2000 r/min离心5 min，弃上清，洗涤两次，加入适量的FACS缓冲液将细胞混匀，每管分别加入10μL的CD₄ ⁺-PE和CD₈ ⁺-FITC的单克隆抗体，4℃下避光孵育1h，加入1.5 mL FACS缓冲液，2000 r/min，离心5min，弃上清，加入1.5 mL FACS缓冲液，混匀，用无菌纱网过滤，加入10μL的10%多聚甲醛固定，上流式细胞仪检测，检测数据采用Flowjo8.8.4软件分析。

5）检测结果

平均日增重、盲肠卵囊计数、盲肠病变计分各项检测指标结果如附表4所示。结果表明，试验Ⅰ组与其他各组相比，盲肠病变计分最小，盲肠乱囊数和相对卵囊产量最小，说明制备的香菇连翘混合发酵产物具有一定的预防鸡柔嫩艾美耳球虫的功能。

 

细胞免疫水平（CD4⁺、CD8⁺ T细胞）检测结果如表5所示。结果表明，制备的香菇连翘混合发酵产物的CD4⁺/CD8⁺T细胞比值最高，具有一定的免疫调节作用。

 

Claims (4)

1.香菇连翘混合固体发酵培养基，是在香菇发酵培养基中加入重量15-25%的连翘粉末。

2.根据权利要求1所述的香菇连翘混合固体发酵培养基，其特征在于：所述的香菇发酵培养基，其干重量%：玉米粒78%，麸皮15%，米糠5%，糖1%，CaCO₃1%，按总干重量︰水=100︰110加水。

3.香菇连翘混合发酵产物，它是用下述方法制得：

（1）按常规方法将香菇菌种的活化及液体种子培养基培养，制备种子培养液；

（2）将权利要求1所述的香菇连翘混合固体发酵培养基，装菌袋，按重量10-15%接入种子培养液；

（3）在24～27℃，相对湿度58-62%条件下，黑暗混合培养18-23天；

（4）将长满菌丝的发酵混合物60℃下烘干，粉碎后即为香菇连翘混合发酵产物。

4.香菇连翘混合发酵产物在制备预防鸡球虫病药物中的应用。