CN104922586A

CN104922586A - 一种防治鸡球虫病的益生菌发酵中药制剂的制备及其应用

Info

Publication number: CN104922586A
Application number: CN201510025638.5A
Authority: CN
Inventors: 单宝龙; 陈雷; 谷巍; 秦波; 王红; 林显华; 王丽荣; 孙明杰; 崔斌; 王春凤
Original assignee: SHANDONG BAOLAI-LEELAI BIO-ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: SHANDONG BAOLAI-LEELAI BIO-ENGINEERING Co Ltd
Priority date: 2015-01-19
Filing date: 2015-01-19
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2035-01-19
Also published as: CN104922586B

Abstract

本发明公开了一种防治鸡球虫病的益生菌发酵中药制剂的制备及其应用，所述的中药包括青蒿、常山、马鞭草、黄柏、苦参、郁金、栀子、当归、陈皮、金银花、仙鹤草；通过三次熬制提取有效中药成分，然后以有效中药成分制成中药培养基底物，向中药培养基底物接种乳酸菌PP，培养制得益生菌发酵中药制剂用于防治鸡球虫病；与现有技术相比，本发明用益生菌发酵中药水提物作目标组合物，即促进了中药中多糖、淀粉、纤维素及药物活性成分进一步转化和分解，产生更有效地活性成分，又提高了益生菌活性，有利于益生菌及其代谢产物的生长和释放，且抗球虫疗效显著高于纯中药制剂。

Description

一种防治鸡球虫病的益生菌发酵中药制剂的制备及其应用

技术领域

本发明涉及一种防治鸡球虫病的益生菌发酵中药制剂的制备及其应用。

背景技术

鸡球虫病是当前养鸡业频发、高发、较难防治的主要疾病之一，本病分布广，感染率高，常发生在15~50日龄的鸡，尤其以15日龄左右鸡最易感，几乎有养鸡的地方都有球虫存在。据统计，其发病率达50%~70%，一旦发病死亡率可高达80%，且发病过的鸡生长发育迟缓，产蛋性能下降，全世界每年因鸡球虫病造成的损失可达80亿美元，我国每年用于抗球虫药的费用高达6亿~18亿美元。目前，防控鸡球虫病主要有药物防治和疫苗接种两种手段。用于防治鸡球虫病的药物已达50余种，其中以化学药物为主，使用球虫疫苗可以防治耐药性产生，但是强毒苗和弱毒苗可能造成球虫病原的扩散和毒力的返强，加上价格昂贵，在我国较难推广，球虫基因工程疫苗目前还处于实验室阶段，由于球虫的抗原很复杂，对基因工程疫苗研究仍有很多难题。自中国加入WTO后，在讲究绿色食品的今天，药物的毒性、“三致”及残留日益受到人们的重视，一些毒性大、安全性低的化学合成抗球虫药物逐渐被淘汰，国内外因此铭文禁止部分化学合成抗球虫药物的使用，而且要研究生产一种新型的高效、低毒、安全的化学合成抗球虫药物十分困难，且费用昂贵。

药物残留、耐药性产生、疫苗防治的局限性等问题的出现，加之人们对绿色、安全生活理念的追求重视，迫切需要我们研制一种安全、绿色无害防治鸡球虫病的方法。

一直以来，中药因疗效好、无副作用、无残留及增强机体免疫力等特点被用于防治各种疾病。多年来，研究者们也验证了部分中药对鸡球虫具有杀虫、抑虫的作用，但效果不尽人意。

发明内容

本研究根据中药抗鸡球虫病的防御机制，公开了一种防治鸡球虫病的益生菌发酵中药制剂的制备及应用。该制剂以含有青蒿、常山、马鞭草、黄柏、苦参、郁金、栀子等中药为原料作为培养液，并通过一种乳酸菌（戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus，PP）发酵的发酵液作为该制剂的有效成分。本发明用益生菌发酵中药水提物作目标组合物，即可促进中药中多糖、淀粉、纤维素及药物活性成分进一步转化和分解，产生更有效地活性成分，又可提高益生菌活性，有利于益生菌及其代谢产物的生长和释放，其抗球虫疗效显著高于纯中药制剂，且每克产品的乳酸菌PP活菌数达2.0×10⁹cfu/g以上。

本研究是通过以下技术方案实现的：

一种防治鸡球虫病的益生菌发酵中药配方，由以下质量份的组分组成：青蒿12-18质量份、常山12-18质量份、马鞭草8-12质量份、黄柏8-12质量份、苦参6-10质量份、郁金6-10质量份、栀子6-10质量份、当归6-10质量份、陈皮4-8质量份、金银花4-8质量份、仙鹤草4-8质量份。

优选的，所述组份如下：青蒿15份、常山15份、马鞭草10份、黄柏10份、苦参8份、郁金8份、栀子8份、当归8份、陈皮6份、金银花6份、仙鹤草6份。

防治鸡球虫病的益生菌发酵中药制剂的制备方法，包括以下步骤，

A、提取上述中药有效成分，提取方法如下：

第一遍：加8倍中药体积水浸泡1-2h后，先用武火加热，待沸腾后再用文火加热1h，纱布过滤得到初滤液；

药渣复煎2次：

第二遍：加5倍于第一遍药渣的体积水，煎煮50min，过滤，得二级滤液；

第三遍：加5倍于第二遍药渣的体积水，煎煮50min，过滤，得三级滤液；

合并二、三级滤液，先旋转蒸发低温浓缩后再与初滤液水浴浓缩后烘干得有效成分；

加水定容，得中药有效成分提取液，浓度为1 g·mL^-1，即每1 mL相当于生药1 g，冷藏备用；

B、制备中药培养基底物：

向上述的中药有效成分提取液，加入葡萄糖、蛋白胨、酵母膏制成中药培养基底物；

C、高压灭菌冷却后，向中药培养基底物接种乳酸菌PP，培养制得益生菌发酵中药制剂。

优选的，步骤B中制备中药培养基底物，按体积百分比向中药有效成分提取液中加入以下成分：葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.25%。

优选的，乳酸菌PP接种量如下：按体积比3%接种 2.0×10⁸cfu/mL的乳酸菌PP于含有葡萄糖、蛋白胨、酵母膏的中药底物培养基中。

优选的，接种乳酸菌PP后在pH为6、 37℃的温度下培养12h制得益生菌发酵中药制剂。

优选的，步骤C中121℃高压灭菌20min。

本发明创造性的采用以下中药组合：青蒿、常山、马鞭草、黄柏、苦参、郁金、栀子、当归、陈皮、金银花、仙鹤草。

青蒿：清透虚热，凉血除蒸，除蒸，截疟。用于暑邪发热，阴虚发热，夜热早凉，骨蒸劳热，疟疾寒热，湿热黄疸。

常山：解热抗疟、功效分类、解毒药。

马鞭草：活血散瘀，截疟，解毒，利水消肿。用于症瘕积聚，疟疾，喉痹，痈肿，水肿，热淋。

黄柏：性味苦寒，有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮之功效。

苦参：用于热痢，便血，黄疸尿闭，赤白带下，阴肿阴痒，湿疹，湿疮，皮肤瘙痒，疥癣麻风。

郁金：活血止痛，行气解郁，清心凉血，利胆退黄。用于经闭痛经，胸腹胀痛、刺痛，热病神昏，癫痫发狂，黄疸尿赤。

栀子：热病心烦、肝火目赤、头痛、湿热黄疳、淋证、血痢尿血、口舌生疮、疮疡肿毒、扭伤肿痛。

当归：补血药；调经药；止痛药。

陈皮：理气健脾，调中，燥湿，化痰。主治脾胃气滞之脘腹胀满或疼痛、消化不良。湿浊阻中之胸闷腹胀、纳呆便溏。痰湿壅肺之咳嗽气喘。用于胸脘胀满，食少吐泻，咳嗽痰多。

金银花：既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发斑、热毒疮痈、咽喉肿痛等证。

仙鹤草：全草为强壮性收敛止血药，有强心、升血压、凝血、止血、凉血、抗菌等作用。

本发明的药理组合如下：

常山含有常山酮、青蒿中的青蒿素都能抑制或杀灭病原体活性，激发机体免疫力，增强白细胞吞噬作用，促进抗体形成的作用；仙鹤草等具有涩肠止泻、凉血止血的功能，能缓解由球虫病导致的出血、下痢，减缓感染鸡的临床症状。

中药因“绿色、安全、无毒无残留”等优点在防治动物性疾病的研究中应用较为广泛，益生菌作为一种新型绿色饲料添加剂，也以其独特的方式作用于动物机体，维持机体肠道微生态平衡，增强机体免疫力等方面达到防病治病和促生长的目的。

目前，益生菌发酵中药的研究较少，但疗效显著；中药作为益生菌的促生长因子，为益生菌的生长提供营养，促进其繁殖，提高生长性能；且益生菌生长中产酸、产气及代谢产物的释放有助于中药药效成分的转化、分解，产生更有效地活性成分，两者可相互协调，达到优势互补的作用。

综上，本发明创造性表现在以下几个方面：

1、采用新的中药组合，将中药的成分进行创造性的重组以及优化，提高其用于治疗球虫病的功效，从实施例能看出，其抗球虫指数（ACI）与西药组相当，且明显优于纯中药制剂，抗球虫效果相比纯中药制剂高一个等级；同时作为中药，中药的特点决定了药份的组成以及含量不同，其治疗效果差别很大，因此本实施例也很难通过有限次的试验获得。

2、创造性的将乳酸菌PP应用于治疗鸡球虫病，PP是新分离出的保藏菌种，有研究表明，乳酸菌PP有提高动物的生长性能的作用，但并没有其用于配合中药进行治疗鸡球虫病的报道，通过实施例可以看出，相对于纯中药，其能够大幅提高治疗效果，且加上中药的配合对鸡的其他身体健康特征不会造成影响，尤其相对于西药效果更为显著。

3、利用中药提取成分加上葡萄糖、蛋白胨等制备中药培养基底物，一方面弥补中药中营养成分的不均，为益生菌的生长提供充分的营养需求，最大程度保证益生菌的有效生长和繁殖；另一方面为益生菌发酵中药中中药有效成分的重组、转化提供营养支持，保证益生菌有效生长的同时中药活性成分的转化更为持久。

附图说明

图1：为给药一个疗程后益生菌发酵中药组肉鸡盲肠病理切片；

图2：为给药一个疗程后纯中药制剂组肉鸡盲肠病理切片；

图3：为给药一个疗程后感染不给药组肉鸡盲肠病理切片；

图4：为给药一个疗程后对照组肉鸡盲肠病理切片；

图5：为给药一个疗程后西药组肉鸡盲肠病理切片；

图6：18-36日龄各试验组鸡血清中白/球比（A/G）含量变化趋势；

图7：18-36日龄各试验组鸡总蛋白（TP）含量变化趋势；

图8：18-36日龄各试验组鸡尿素氮（BUN）含量变化趋势。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例一益生菌发酵中药制剂的制备

1试验材料

1.1 试验药物 抗球虫中草药青蒿、常山、马鞭草、黄柏、苦参、郁金、栀子、当归、陈皮、金银花、仙鹤草均购于山东省泰安市金泰联大药房。

1.2 试验菌株 乳酸菌：鼠李糖乳杆菌6133、植物乳杆菌7340、鼠李糖乳杆菌6-3、植物乳杆菌LP、戊糖片球菌PP；芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌C1- 0155、枯草芽孢杆菌C1-0090、纳豆芽孢杆菌C1-0048、枯草芽孢杆菌C1-0050、地衣芽孢杆菌C1-0309；上述菌株均由山东宝来利来生物工程股份有限公司生物研究院分离得到，现均被保存于宝来利来生物工程股份有限公司菌种资源库，通过常规分离方法可以分离制备；其中植物乳杆菌LP、戊糖片球菌PP、地衣芽孢杆菌C1-0309、枯草芽孢杆菌C1-0090均保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为：CCTCC M 2010150、CCTCC M 2012029、CCTCC M 2011301、CCTCC M 2010260。本专利申请所提及的乳酸菌PP为戊糖片球菌PP的简称。

1.3 培养基 乳酸菌培养基（MRS）：葡萄糖2%、柠檬酸铵0.2%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.5%、硫酸锰0.02%、硫酸镁0.05%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、吐温-80 0.1%、pH6.0，固体培养基中需要加入1.5%琼脂粉；芽孢杆菌培养基：葡萄糖0.2%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、酵母膏0.5%、pH值7.0，固体培养基需要加入1.5%琼脂粉。

2试验方法

2.1中药有效成分的提取

常规水煎煮法。按重量比例称取中药复方，青蒿12份、常山12份、马鞭草8份、黄柏8份、苦参6份、郁金6份、栀子6份、当归6份、陈皮4份、金银花4份、仙鹤草4份，浸泡1-2 h后，煎煮三遍。第一遍加8倍体积水浸泡后，先用武火加热，待沸腾后再用文火加热1 h，六层纱布过滤得到初滤液。药渣复煎2次，第二遍加5倍体积水煎煮50 min，第三遍加5倍体积水煎煮50 min，过滤，合并2次滤液先旋转蒸发低温浓缩后再与初滤液水浴浓缩后烘干得有效成分。加水定容，得中药有效成分提取液，浓度为1 g·mL^-1，即每1 mL相当于生药1 g，4℃冷藏备用。

2.2乳酸菌、芽孢杆菌种子液的制备

将已保存的乳酸菌（6133、7340、LP、PP、6-3）、芽孢杆菌（C1-0155、C1-0090、C1-0048、C1-0050、C1-0309）种子液分别进行斜面培养24h，挑取新的乳酸菌、芽孢杆菌菌株分别接种于100mL液体培养基中活化，制备新鲜的种子液，平板法进行活菌计数后，4℃冷藏备用。

2.3中药培养益生菌底物的制备

上述2.1制备的中药提取液平均分成2份，一份中加入按体积计的葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.25%制得中药培养乳酸菌底物；另一份中加入按体积计的葡萄糖0.25%、蛋白胨1.0%、酵母膏0. 5%制得中药培养芽孢杆菌底物，121℃高压灭菌20min，冷却后，一份接入2.2中乳酸菌菌株（6133、7340、LP、PP、6-3）进行培养，另一份接入2.2中芽孢杆菌菌株（C1-0155、C1-0090、C1-0048、C1-0050、C1-0309）进行培养。

2.4中药培养益生菌条件优化

菌株发酵条件的摸索，包括（最优菌株筛选、中药含量g mL^-1、菌株接种量%、培养时间t、培养温度℃、PH）。

2.4.1最佳菌株筛选：乳酸菌菌株（6133、7340、LP、PP、6-3）、芽孢杆菌菌株（C1-0155、C1-0090、C1-0048、C1-0050、C1-0309）分别按照常规接种量，接种至1 g·mL^-1的中药培养基中，培养24h，进行活菌计数。

2.4.2最佳中药浓度摸索：将筛选的最佳菌株按照常规接种量在无菌条件下分别接入0.5 g·mL^-1、1 g·mL^-1、1.5 g·mL^-1、2.0 g·mL^-1、2.5 g·mL^-1、3.0 g·mL^-1的浓度的中药培养基中，在温度为37℃的条件下培养24h。采用平板计数的方法进行细菌计数。

2.4.3最佳接菌剂量摸索：分别按体积比0.5%、1.0%、2.0%、3.0%的乳酸菌PP接种量接菌到最佳浓度的中药，在温度为37℃的条件下培养24h。采用平板计数的方法进行细菌计数。

2.4.4最佳培养时间摸索：采用上述试验确定的最佳浓度中药作培养基接种最佳剂量菌株，在温度为37℃条件下，分别培养12h、18h、20h、24h、28h、32h、36h、48h。采用平板计数的方法进行细菌计数。

2.4.5最佳培养PH摸索：分别用0.5N NaOH和0.5NHCl将中药基础培养基的pH值调为4.5、5、5.5、6、6.5、7，灭菌后按照最佳接种量接入制备好的菌种，在温度为37℃的条件下培养最佳时间。采用平板计数的方法进行细菌计数。

2.4.6最佳培养温度摸索：采用上述试验确定的最佳优化条件，分别于16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、37℃、40℃的温度下培养最佳时间。采用平板计数的方法进行细菌计数。

2.5益生菌发酵中药制剂的制备

1.0 g·mL^-1的抗球虫中药提取液，按体积百分比加入葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.25%制成中药培养基底物，121℃高压灭菌20min，冷却后按体积比3%接种 2.0×10⁸ cfu/mL乳酸菌PP在pH为6、 37℃的温度下培养12h，制得益生菌发酵中药制剂，平板计数法计算活菌数。

3试验结果

3.1种子液制备

经斜面接种后，通过平板计数法制备得：乳酸菌各菌株的活菌数均为：2.0×10⁸ cfu/mL，芽孢菌各菌株的活菌数均为：2.0×10⁸ cfu/mL。

3.2最佳菌株筛选

表1 1 g·mL^-1复方中药对不同菌株生长性能的影响

菌株	活菌数（×10⁸cfu·mL^-1）	菌株	活菌数（×10⁸cfu·mL^-1）
				乳酸菌6133	9.0	芽孢C1-0155	5.5
乳酸菌7340	14.75	芽孢C1-0309	6.5
				乳酸菌PP	30.0	芽孢C1-0090	8.5
乳酸菌6-3	13.4	芽孢C1-0048	7.3
				乳酸菌LP	22.0	芽孢C1-0050	12.1

由表1可知，经中药底物培养后，乳酸菌PP活菌数最高，菌株生长性能好。

3.3最佳中药浓度摸索

表2 不同浓度中药复方对乳酸菌PP生长性能的影响

中药复方浓度(g·mL^-1)	0.5	1	1.5	2.0	2.5	3.0
							活菌数（×10⁶cfu·g^-1）	13.2	25.4	20.8	19.4	15.7	15.0

由表2可知，1g·mL^-1中药复方中乳酸菌PP活菌数最高，菌株生长性能好。

3.4最佳接菌剂量摸索

表3 中药复方对不同量乳酸菌PP生长性能的影响

乳酸菌PP浓度(%)	0.5	1.0	2.0	3.0
					活菌数（×10⁶cfu·g^-1）	11.5	22.7	28.5	40.0

由表3可知，乳酸菌PP接种剂量为3.0%，乳酸菌PP活菌数最高，菌株生长性能好。

3.5最佳培养时间摸索

表4 不同发酵时间中药复方对乳酸菌PP生长性能的影响

发酵时间 h	12	18	20	24	28	32	36
								活菌数（×10⁶cfu·g^-1）	7.2	6.0	6.3	5.6	4.8	5.7	5.7

由表4可知，在最佳接种浓度和剂量下，培养12h乳酸菌PP的活菌数最高，菌株生长性能好。

3.6最佳培养PH摸索

表5 不同pH中药复方对乳酸菌PP生长性能的影响

pH	4.5	5.0	5.5	6.0	6.5	7.0
							活菌数（×10⁸cfu·mL^-1）	5.1	5.7	6.6	7.8	7.2	5.4

由表5可知，pH为6.0条件下，乳酸菌PP的活菌数最高，菌株生长性能好。

3.7最佳培养温度摸索

表6 不同温度条件下中药复方对乳酸菌PP生长性能的影响

温度（℃）	16.0	20.0	24.0	28.0	32.0	37.0	40.0
								活菌数（×10⁸cfu·mL^-1）	4.3	5.5	7.2	7.4	7.8	9.4	8.6

由表6可知，在既定条件下，37℃时乳酸菌PP的活菌数最高，菌株生长性能好。

3.8益生菌发酵中药制剂的活菌数

表7 优化条件下益生菌发酵中药制剂12h的活菌数

由表7可知，通过发酵条件的优化，乳酸菌PP的活菌数达2.4×10⁹ cfu/mL，菌株生长性能最好。

4结论

4.1 经中药提取液培养益生菌试验得出：按体积比3%接种 2.0×10⁸ cfu/mL乳酸菌PP培养于浓度为1.0 g·mL^-1的抗球虫中药提取液，在pH为6、 37℃的温度下培养12h，乳酸菌的活性最高，生长良好，培养条件适宜。

4.2 经试验验证益生菌发酵中药制剂的配制如下：按重量比例称取中药复方制剂，经水煎提取制备浓度1.0 g·mL-1的抗球虫中药提取液，按体积百分比加入葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.25%制成中药培养基底物，121℃高压灭菌20min，冷却后按体积比3%接种 2.0×10⁸cfu/mL乳酸菌PP在pH为6、 37℃下培养12h制得益生菌发酵中药制剂。

实施例二益生菌发酵中药制剂防治蛋鸡球虫病试验

1试验材料

1.1试验药物

益生菌发酵的中药成分：青蒿、常山、马鞭草、黄柏、苦参、郁金、栀子、当归、陈皮、金银花、仙鹤草均购于山东省泰安市金泰联大药房。

纯中药制剂的成分：青蒿、常山、秦皮、鸦胆子、白头翁、地锦草、仙鹤草、金鸡纳均购于山东省泰安市金泰联大药房。

西药：地克珠利、磺胺嘧啶购于山东省泰安市兽医防疫站。

菌株：一种乳酸菌（戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus，PP）——乳酸菌PP，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2012029。

球虫株：试验前期已经保存分离得到的柔嫩艾美耳球虫卵囊经复壮后采用血球计数板计数后，接种备用。

1.2试验饲料

试验所用饮水器、料盘等均在80℃干燥箱中烘烤0.5 h以上，以确保外界环境无球虫。试验所用饲料基础日粮及营养水平见表8，未添加任何抗生素和抗球虫药。

表8 基础日粮配方及营养水平

日粮组成	百分比（％）	营养水平	百分比（％）
				玉米	56.6	代谢能 ME（MJ.kg^-1）	12.06
豆粕	36.0	粗蛋白(%)	21.6
				豆油	3.0	钙 (%)	0.98
磷酸氢钙	1.8	总磷 (%)	0.68
				石粉	1.3	有效磷 (%)	0.49
食盐	0.3	蛋氨酸 (%)	0.47
				预混料	1.0	蛋氨酸＋胱氨酸 (%)	0.78
合计	100	赖氨酸(%)	1.15

注：①预混料可为每千克全价料提供： Mn 75 mg；Zn 75 mg，Fe 95 mg，Cu 10 mg，I 0.6 mg，Se 0.3 mg，VA 10000 IU，VD₃2750 IU，VE 20 mg，VK₃ 2 mg，VB₁1.8 mg，VB₂ 6 mg，泛酸 12 mg，烟酸66 mg，VB₆ 4.5 mg，叶酸：1mg，VB₁₂ 0.01 mg，生物素0.15 mg，胆碱 1000 mg。②营养水平为计算值。

2试验方法

2.1试验分组

10日龄的海兰褐蛋鸡270只随机分成9组，Ⅰ组为对照组，Ⅱ组为感染不给药组，Ⅲ组为地克珠利和磺胺混合给药组，Ⅳ为1.0‰纯中药1组、Ⅴ为2.0‰纯中药2组、Ⅵ为3.0‰纯中药3组、Ⅶ为1.0‰益生菌发酵中药1组、Ⅷ为2.0‰益生菌发酵中药2组、Ⅸ为3.0‰益生菌发酵中药3组，每组3个重复，每个重复10只鸡。12日龄始，给药组采用饮水方式给药，一天2次，给药8天，西药组按说明书给药，纯中药1、2、3组及益生菌发酵中药1、2、3组分别按照鸡饮水体积的1.0‰、2.0‰、3.0‰给药。

2.2人工感染鸡球虫

14日龄接种新鲜孢子化得球虫卵囊，接种量5.0×10⁴个/只鸡，21日龄剖杀试验鸡，进行药物抗球虫疗效评价判定。具体分组给药成分如下表9。

表9 试验分组

组别	处理	药物成分	给药浓度g L^-1	给药方式
					Ⅰ	对照	-	-	饮水
Ⅱ	感染不给药	-	-	饮水
					Ⅲ	西药	磺胺嘧啶钠粉/地克珠利混合	0.1	饮水
Ⅳ	纯中药制剂1	青蒿、常山、白头翁、仙鹤草等	1.0	饮水
					Ⅴ	纯中药制剂2	青蒿、常山、白头翁、仙鹤草等	2.0	饮水
Ⅵ	纯中药制剂3	青蒿、常山、白头翁、仙鹤草等	3.0	饮水
					Ⅶ	益生菌发酵中药1	中药、乳酸菌及其代谢产物	1.0	饮水
Ⅷ	益生菌发酵中药2	中药、乳酸菌及其代谢产物	2.0	饮水
					Ⅸ	益生菌发酵中药3	中药、乳酸菌及其代谢产物	3.0	饮水

2.3纯中药制剂制备

按重量比例称取中药复方：青蒿4份、常山5份、白头翁10份、仙鹤草3份、榧子3份、槟榔5份、金银花3份、黄芪5份，进行水煎提取其有效成分，提取液浓度为1.0 g·mL^-1。

2.4 益生菌发酵中药的制备

2.4.1中药提取液制备

按重量比例称取中药复方：青蒿15份、常山15份、马鞭草10份、黄柏10份、苦参8份、郁金8份、栀子8份、当归8份、陈皮6份、金银花6份、仙鹤草6份，进行水煎提取其有效成分，提取液浓度为1.0 g·mL^-1（方法同实施例一2.1，仅质量份不同，但同理可按同实施例一2.1质量份制备实施例二的中药制剂）。

2.4.2益生菌发酵中药制备

称取1.1×10⁹cfu·g^-1 乳酸菌PP 0.6g溶于3mL蒸馏水中，制得2.0×10⁸ cfu/mL菌液，以体积比3%的比例添加于97mL（2.4.1）制备的中药提取液中在pH为6、 37℃的温度下培养12h，取出备用。

2.5药物防治鸡球虫病疗效评价指标

2.5.1 临床症状

感染球虫卵囊后逐日每组鸡进行临床观察，并记录各组鸡的精神、食欲、粪便变化和死亡情况，并对死亡鸡随时进行剖检记录。

2.5.2增重情况

于感染后第0 d、8 d、15d、21d早晨逐只空腹称重，记录并计算各组的平均增重。

2.5.3 疗效评价指标

病变和卵囊数观察：试验结束称重后，各组鸡全部扑杀，观察内脏病变，摘取盲肠，刮取粪便检查球虫卵囊数，冲洗盲肠，检查病变情况，记录病变和病变值。

2.5.4粪便记分

0分，正常；1分，有少量血便；2分，中等量血便；3分，有许多血便；4分，无正常粪便。

2.5.5病变记分和病变值

0分，肠道中无眼观异常；1分，肠道充血或增厚；2分，肠道增厚，有少量出血和渗出；3分，肠道弥漫性出血；4分，肠道严重出血或有肠芯。

病变值＝每组鸡肠道平均病变记分×10

2.5.6卵囊值（OPG值）

OPG值即每克粪便中的卵囊值数（×10⁶）

当OPG值为0～0.1时，卵囊值为0；当OPG值为0.1～1.0，卵囊值为1；

当OPG值为2.0～5.0时，卵囊值为10；当OPG值为6.0～10.0时，卵囊值为20；

当OPG值为≥11.0时，卵囊值为40；

2.5.7 成活率（%）＝（各组成活鸡数÷各组试验鸡数）×100%

2.5.8 增重率（%）＝（试验结束后平均体重－试验开始平均体重）÷试验开始平均体重×100%

相对增重率（%）＝（用药组或感染不用药组的增重率÷不感染不用药组的增重率) ×100%

2.5.9 抗球虫指数（ACI）＝（成活率＋相对增重率）－（病变值＋卵囊值）

目前，国内外根据抗球虫指数（ACI）来判定药物的抗球虫疗效。ACI≥180者，判定为高效抗球虫药；ACI为160-180者，判定为中效抗球虫药；ACI为120-160者，判定为低效抗球虫药；ACI＜120者，判为无效抗球虫药。

3结果与分析

3.1感染球虫鸡临床效果观察

鸡感染球虫第4-5天后，球虫定植于鸡肠道，寄生于肠道上皮细胞，破坏肠黏膜，造成感染，出现肠道炎症、出血、肠壁溃疡等现象，临床表现为鸡精神萎靡、饮水量增加、消瘦、贫血，拉酱红色血便，严重脱水而死；试验中接种球虫后感染不给药组鸡精神萎靡不振、食欲下降、羽毛松乱、饮水量增加，解剖患病鸡盲肠肿大甚至出现盲肠芯，纯中药制剂组鸡精神状态稍好，饮水基本正常，血便相对感染部给药组减少，而益生菌发酵中药组及西药组鸡精神状态良好、饮水正常、血便很少，肠道病变不严重，肠壁略增厚，有少许出血点但内容物正常，表明益生菌发酵中药组对抵抗蛋雏鸡球虫病起到了显著疗效，有力地防治球虫对鸡的侵害。

3.2抗球虫疗效

用药后各处理组成活率、血便、盲肠病变、卵囊值、抗球虫指数如表10所示。

表10 药物评价结果

组别	处理	成活率%	相对增重率%	平均血便计分	盲肠病变值	病变计分卵囊值	抗球虫指数ACI
								Ⅰ	对照组	100	100	0	0	0	200
Ⅱ	感染不给药组	67.7	70.6	3.0	25	3	110.3
								Ⅲ	西药组	90.0	81.2	1.0	10	1	160.2
Ⅳ	纯中药制剂1	73.3	74.2	2.5	20	2.5	125
								Ⅴ	纯中药制剂2	83.3	77.5	2.2	18	2	140.8
Ⅵ	纯中药制剂3	73.3	73.7	2.3	18	2.5	126.5
								Ⅶ	益生菌发酵中药1	86.6	80.2	2.2	15	2	149.8
Ⅷ	益生菌发酵中药2	90	86.5	1.5	12	1	163.5
								Ⅸ	益生菌发酵中药3	86.6	78.4	2.0	12	2	151.0

从表10可以看出：

（1）感染不给药组死亡率高于30%，属于球虫模型建立的范围之内。

（2）纯中药组抗球虫疗效中等均低于益生菌发酵中药组和西药组。

（3）给药组中益生菌发酵中药2组鸡的成活率、盲肠病变值及卵囊值与西药组相当；但相对增重率显著高于西药组8.1%（P﹤0.05），抗球虫指数（ACI）明显高于西药组，且大于160，抗球虫效果良好。

4结论

经试验证明，以2.0g·kg^-1益生菌发酵中药饮水防治鸡球虫病有显著疗效，且优于西药以及现有的中药，有利于鸡球虫病的防治。

通过试验可以看出：益生菌发酵中药制剂对蛋雏鸡抗球虫有良好的效果，它不仅能降低鸡死亡率，也能提高鸡日增重，抑制卵囊在鸡机内的生长繁殖，减少球虫对盲肠的损害程度，全方位综合抵抗球虫对机体的侵害，强有力的起到了抗鸡球虫病的作用，其中以2‰益生菌发酵中药组效果最优。

实施例三益生菌发酵中药制剂防治肉鸡球虫病试验

1试验材料同实施例二

仅组分的质量份不同：

益生菌发酵的中药成分：青蒿18份、常山18份、马鞭草12份、黄柏12份、苦参10份、郁金10份、栀子10份、当归10份、陈皮8份、金银花8份、仙鹤草8份，进行水煎提取其有效成分，提取液浓度为1.0 g·mL^-1。（方法同实施例一2.1，仅质量份不同，但同理可按同实施例一2.1质量份制备实施例三的中药制剂）。

纯中药制剂的成分：青蒿5份、常山6份、白头翁12份、仙鹤草4份、榧子4份、槟榔6份、金银花4份、黄芪7份，进行水煎提取其有效成分，提取液浓度为1.0 g·mL^-1。

2试验方法

2.1试验分组及给药

300只AA⁺肉雏鸡随机分成5组，每组3个重复，每个重复20只鸡，Ⅰ组为对照组，Ⅱ组为感染不给药组，Ⅲ组为西药组（地克珠利和磺胺混合给药组），Ⅳ为2‰益生菌发酵中药组、Ⅴ为2‰纯中药制剂组。12日龄始，一天2次，给药8天，西药组按说明书给药，益生菌发酵中药组及纯中药组均按鸡饮水体积2‰给药。

2.2人工感染鸡球虫

14日龄接种新鲜孢子化球虫卵囊，接种量8.0×10⁴个/只鸡，21日龄每组随机剖杀9只鸡，每个重复3只试验鸡，进行药物抗球虫疗效评价判定。具体分组给药如下表11。

表11 试验分组

组别	处理	给药浓度g kg^-1	给药方式
				Ⅰ	对照组	-	饮水
Ⅱ	感染不给药组	-	饮水
				Ⅲ	西药组	0.1	饮水
Ⅳ	2‰益生菌发酵中药组	2.0	饮水
				Ⅴ	2‰纯中药制剂组	2.0	饮水

2.3药物防治肉鸡球虫生长性能的测定

试验鸡饲喂至11、21、28、36日龄时称量每组鸡的体重及饲料消耗量，分别计算11-21、21-28、28-36日龄阶段每组鸡的平均日增重及料重比（F/G），观察鸡的生长性能。

2.4药物防治肉鸡球虫免疫指标的测定

试验鸡饲喂至36日龄，每组鸡随机翅下采血，离心分离血清，ELISA试剂盒法测定鸡免疫指标含量。

2.5药物防治肉鸡球虫血清指标的测定

试验鸡饲喂至21、28、36日龄时，每组鸡随机翅下采血，离心分离血清，购买科华生物公司生产的血清因子总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、尿素氮（BUN）检测试剂盒，用生物生化仪检测血清因子含量变化。

2.6药物防治肉鸡球虫病疗效评价指标同实施例二（2.5）

3结果与分析

3.1 各试验组对肉鸡感染球虫生长性能的影响

不同日龄阶段，各组鸡生长性能的变化，见表12。

表12 各组对感染球虫肉鸡生长性能的影响

注：同列同一日龄阶段数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0．05)，相同小写字母或无字母表示差异不显著(P＞0.05)。

3.1.1 各试验组肉鸡平均日增重的影响

由表12可以看出：球虫在鸡体内感染至11-21日龄，益生菌发酵中药组平均日增重极显著高于感染不给药组50%（P﹤0.01），高于纯中药组16.1%，高于对照组、西药组（磺胺+地克珠利）；纯中药给药组的平均日增重高于感染不给药组29.1%，低于对照组及西药组；

球虫在鸡体内感染至21-28日龄，益生菌发酵中药组、纯中药组平均日增重均显著高于感染组20.0%；

球虫在鸡体内感染至28-36日龄，益生菌发酵中药组平均日增重极显著高于感染组20.0%（P﹤0.01），高于纯中药组及西药组4.3%，与对照组增重效果相当。

3.1.2各试验组肉鸡料重比F/G的影响

球虫在鸡体内感染前后（11-21日龄），益生菌发酵中药组料重比（F/G）极显著低于感染组33.0%（P﹤0.01），低于西药组8.8%，低于纯中药组11.4%；纯中药组料重比（F/G）极显著低于感染组24.6%，高于西药组3.0%。

球虫在鸡体内感染后两周（21-28日龄），益生菌发酵中药组料重比（F/G）显著低于感染组约10.6%，高于纯中药组6.0%，且低于西药4.7%；纯中药组料重比（F/G）与西药组相当。

球虫在鸡体内感染28-36日龄，益生菌发酵中药组料重比（F/G）显著低于感染组16.5%（P﹤0.05），显著低于对照组4.6%（P﹤0.05），纯中药组料重比与对照组无显著差异，效果相当。

3.2各试验组对肉鸡感染球虫免疫指标的影响 结果见表13。

表13感染球虫36日龄各试验组肉鸡免疫指标的影响

组别	IgG﹙ng/L）	IL-12 ﹙ng/L）	IFN-γ﹙ng/L）	IL-10 ﹙ng/L）
					对照组	21.12±1.9	14.51±0.6	15.7±1.3	57.61±0.72
感染组	19.08±3.0	11.3±0.6^a	14.8±0.9^a	49.21±1.9^a
					西药组	20.01±1.26	15.8±1.6	16.24±0.7	58.14±0.49
益生菌发酵中药组	21.19±0.86	17.18±2.01^ab	17.04±0.4^ab	60.21±1.9^ab
					纯中药制剂组	19.17±1.94	15.43±0.33	16.58±0.2^ab	56.67±0.49

注：同列同一日龄阶段数据肩标不同小写字母表示差异显著(P＜0．05)，相同小写字母或无字母表示差异不显著(P＞0.05)

由表13可得出：益生菌发酵中药组鸡36日龄，IL-12的表达量极显著高于感染不给药组52%（P﹤0.01），且分别高于纯中药组、西药组11.3%、8.7%；IFN-γ的表达显著高于感染不给药组15.1%（P＜0.05），且高于其它各给药组；IL-10显著高于感染不给药组22.3%，且高于其它各给药组；IgG的表达高于感染不给药组7.3%，且高于其它各给药组；益生菌发酵中药组各细胞因子的表达趋势，说明益生菌发酵中药制剂能够提高鸡体抵抗球虫感染炎症的能力，修复黏膜，且能维持机体免疫水平的平衡。

3.3各试验组对肉鸡感染球虫血清指标的影响 结果见表14、15、16。

表14 21日龄肉鸡感染球虫病各组血清指标的表达

ALB

GLB

A/G

AST

ALT

TP

BUN

对照组

14.68±0.90

12.38±0.33

1.19±0.08

214.37±1.82

3.42±0.17

27.07±0.15

0.56±0.10

感染组

16.49±0.15

14.74±0.36

1.12±0.038

240.68±0.78

3.65±0.04

31.24±0.89

0.53±0.10

西药组

15.87±0.096

14.81±0.93

1.28±0.37

234.27±0.42

6.59±0.28

30.68±0.15

0.66±0.02

2‰益生菌发酵中药组

14.83±0.14

12.86±0.94

1.14±0.06

220.48±1.62

5.50±012

27.49±0.19

0.59±0.10

2‰纯中药制剂组

15.18±0.80

13.48±0.34

1.29±0.06

224.30±2.32

3.55±0.16

28.97±0.25

0.58±0.15

由表14得出：21日龄时，感染不给药组鸡血清中白/球比（A/G）、尿素氮（BUN）的代谢相对与对照组均显著降低(P＜0.05)，总蛋含量（TP）代谢显著升高；益生菌发酵中药组各项指标含量相对其它中药恢复正常，说明益生菌发酵中药组的鸡肝、肾功能各项指标正常。

表15 28日龄肉鸡感染球虫病各组血清指标的表达

ALB

GLB

A/G

AST

ALT

TP

BUN

对照组

15.97±0.38

15.22±0.60

1.05±0.07

278.94±3.0

3.42±0.17

31.19±0.82

0.52±0.09

感染组

17.49±0.77

17.39±0.44

0.82±0.04

244.03±7.0

3.65±0.04

20.61±0.16

0.38±0.07

西药组

16.97±0.14

14.76±0.58

1.15±0.07

207.07±3.4

6.59±0.28

31.73±0.80

0.46±0.01

2‰益生菌发酵中药组

15.31±0.33

13.41±0.02

1.14±0.10

199.80±1.8

6.50±012

30.72±0.28

0.45±0.01

2‰纯中药制剂组

14.37±0.30

13.25±0.50

1.07±0.06

258.64±4.0

3.12±0.15

32.19±0.95

0.47±0.08

由表15得出：28日龄时，感染不给药组鸡血清中白/球比（A/G）、总蛋白含量（TP）、尿素氮（BUN）的代谢等均显著降低(P＜0.05)，益生菌发酵中药组、西药组各项指标含量相对恢复正常，说明给药组肝、肾功能各项指标相对正常。

表16 36日龄肉鸡感染球虫病各组血清指标的表达

ALB

GLB

A/G

AST

ALT

TP

BUN

对照组

16.10±0.67

15.85±0.09

1.03±0.14

325.89±12.31

0.99±0.15

31.95±1.74

0.39±0.01

感染组

17.47±0.83

18.89±0.85

0.93±0.06

313.19±1.67

2.15±0.23

36.36±2.59

0.51±0.09

西药组

15.37±1.00

15.05±0.18

1.03±0.38

341.31±1.34

2.04±0.23

30.42±2.59

0.46±0.03

2‰益生菌中药组

17.03±0.33

13.74±0.39

1.07±0.16

321.53±18.7

1.04±033

30.79±0.14

0.40±0.02

2‰纯中药制剂组

15.10±0.69

16.85±0.07

1.04±0.16

305.86±11.1

1.09±0.17

31.75±2.14

0.41±0.03

由表16得出：36日龄时，感染不给药组尿氮素（BUN）的代谢量相对于对照组升高31%，白球比（A/G）值相对对照组降低约10%，表明感染不给药组存活鸡至感染后2周其肝功能、肾功能都有不同程度的损伤。

西药组尿氮素（BUN）含量相对对照组升高约17.9%，表明西药组鸡肾功能受到一定的影响；益生菌发酵中药组鸡血清中各项指标含量与对照组相比无显著性差异。

3.4肉鸡感染球虫各试验组疗效评价指标结果见表17。

表17肉鸡感染球虫病疗效评价指标

组别	成活率%	相对增重率%	平均血便计分	盲肠病变值	克粪便卵囊OPG值	病变计分卵囊值	抗球虫指数ACI
								空白对照组	100	100	0.0	0.0	0.0	0	200
感染不给药组	86.67	88.11	3.0	30	11.56×10⁶	30	114.78
								西药组	93.3	96.18	1.0	10	2.5×10⁶	10	169.48
2‰益生菌发酵中药组	96.67	99.6	1.5	12.5	2.98×10⁶	10	173.77
								2‰纯中药制剂组	93.3	95.35	1.5	11	5.35×10⁶	20	157.65

从表17可以看出：益生菌发酵中药组鸡成活率、相对增重率显著高于感染组，且高于西药组。益生菌发酵中药组的血便计分、盲肠病变值均低于感染组，益生菌发酵中药组的卵囊排出量与西药组无显著差异，极显著低于感染组，这说明益生菌发酵中药能极显著抑制感染鸡体内卵囊的繁殖。

抗球虫指数（ACI）是评价药物抗球虫效果的综合指标，益生菌发酵中药组ACI高于160，抗球虫效果优等且效果好于西药组，亦可用于防治鸡球虫病的纯中药制剂组ACI为157.65，介于120-160，抗球虫效果中等。

4结论

4.1 益生菌发酵中药对感染肉鸡生长性能的影响

通过测定肉鸡感染球虫给药前后（11-36日龄）鸡平均日增重及料重比得出：益生菌发酵中药能显著降低鸡的料肉比，全面提高肉鸡的生长性能，拌料给药也能改善鸡的增重效果和料重比，效果与西药相似。

4.2 益生菌发酵中药对感染球虫肉鸡免疫功能的影响

试验结果表明，益生菌发酵中药给药后免疫细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-10含量有所升高，IL-10在免疫应答过程中起了重要作用，保证了机体免疫应答的正常调控，以便快速的杀灭球虫病原，这也说明感染球虫鸡饲喂益生菌发酵中药后能提高机体免疫应答水平，从而提高机体对病原的抵抗力。

4.3 益生菌发酵中药对感染球虫肉鸡肝、肾功能的影响

由感染球虫后21日龄始至36日龄鸡血清中肝、肾功能指标变化趋势可以得出：益生菌发酵中药组机体在对抗球虫感染时，血清指标如白蛋白、球蛋白的表达是由低慢慢升高，然后恢复正常，且没有影响肝、肾功能的正常运行，而西药组尿素氮(BUN)代谢相对于正常组一直升高，这表明西药在防治球虫感染时影响了肾脏功能的代谢。

4.4 益生菌发酵中药对感染球虫肉鸡的抗球虫效果

抗球虫指数（ACI）是评价药物抗球虫效果的综合指标，试验中发现鸡感染球虫7天后，益生菌发酵中药饮水给药组鸡成活率、增重率均良好，盲肠受损程度得到良好修复，球虫卵囊排出量严重受到抑制，且ACI显著高于对照组及其它给药组，效果优等；说明益生菌发酵中药制剂在防治肉鸡球虫感染中有显著效果，可用于肉鸡球虫病的防治。

由图1-5看出，益生菌发酵中药组、西药组肠绒毛排列紧密、柱状细胞、杯状细胞含量正常、内分泌细胞含量增多，形状较规则；空白对照组肠绒毛排列紧致、形状完整，细胞排列分布集中有序；感染不给药组有大量出血点且免疫细胞分布较少；纯中药组肠绒毛形状较规则、细胞分布较完整有序。

Claims

1.一种防治鸡球虫病的益生菌发酵的中药配方，其特征在于：由以下质量份的组分组成：青蒿12-18质量份、常山12-18质量份、马鞭草8-12质量份、黄柏8-12质量份、苦参6-10质量份、郁金6-10质量份、栀子6-10质量份、当归6-10质量份、陈皮4-8质量份、金银花4-8质量份、仙鹤草4-8质量份。

2.根据权利要求1所述的防治鸡球虫病的益生菌发酵的中药配方，其特征在于：所述组份如下：青蒿15份、常山15份、马鞭草10份、黄柏10份、苦参8份、郁金8份、栀子8份、当归8份、陈皮6份、金银花6份、仙鹤草6份。

3.一种防治鸡球虫病的益生菌发酵中药制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤，

A、提取上述中药有效成分，提取方法如下：

药渣复煎2次：

B、制备中药培养基底物：

4.根据权利要求3所述的防治鸡球虫病的益生菌发酵中药制剂的制备方法，其特征在于，步骤B中制备的中药培养基底物，是按体积百分比向中药有效成分提取液中加入以下成分制得：葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、酵母膏0.25%。

5.根据权利要求3所述的防治鸡球虫病的益生菌发酵中药制剂的制备方法，其特征在于，乳酸菌PP接种量如下：按体积比3%接种 2.0×10⁸cfu/mL乳酸菌PP于含有葡萄糖、蛋白胨、酵母膏的中药底物培养基。

6.根据权利要求3所述的防治鸡球虫病的益生菌发酵中药制剂的制备方法，其特征在于，接种乳酸菌PP后在pH为6、 37℃的温度下培养12h制得益生菌发酵中药制剂。

7.根据权利要求3所述的防治鸡球虫病的益生菌发酵中药制剂的制备方法，其特征在于，步骤C中121℃高压灭菌20min。