CN101366852B

CN101366852B - 治疗鸭疫里氏杆菌病的中草药物及其制备方法

Info

Publication number: CN101366852B
Application number: CN2008101212219A
Authority: CN
Inventors: 鲍国连; 张先福; 韦强; 刘燕; 季权安; 肖琛闻
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-09-25
Filing date: 2008-09-25
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2028-09-25
Also published as: CN101366852A

Abstract

本发明公开了治疗鸭疫里氏杆菌病的中草药物及其制备方法，属于家禽用药物制造技术领域。该药物由下列重量份的原料药制成：黄连2-5份，黄柏2-5份，甘草3-8份；为取得更好的效果，还可与白术2-5份和丹皮2-5份进行组合。上述配方经水煎或水醇提取其活性有效成份后，可分别制备成粉剂或针剂，通过拌饲，拌水或注射，对发病鸭群进行预防或治疗。以0.03g/ml药物浓度进行试验，其中，治疗组3天后，病情已控制，死亡率由对照73％下降为36％；预防组死亡率由对照13％下降为1.3-2.8％，效果显著，和抗菌素治疗组治愈率相当。具有成本较低，使用方便，效果显著等特点。可在养鸭生产业中推广应用。

Description

治疗鸭疫里氏杆菌病的中草药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及家禽用药物制造技术领域，尤其涉及一种治疗鸭疫里氏杆菌病的中草药物及其制备方法。

背景技术

鸭疫里氏杆菌(Riemerella　anatipestifer，RA)感染，也称鸭传染性浆膜炎，是鸭的一种细菌性传染病。该病以纤维素性心包炎、气囊炎、肝周炎、输卵管炎、关节炎、脑膜炎等为主要病变特征，广泛分布于世界各养鸭国家和地区，主要危害8周龄以内的小鸭，3～4周龄的小鸭最易感染，死亡率最高可达70％，是造成养鸭业严重损失的主要传染病之一。

RA菌有21种血清型，不同血清型之间缺乏交叉保护能力，药物防治是当前控制该病的一项措施。但使用抗菌素存在耐药性、治疗效果差、肉品残留和成本较高等缺点。本发明试验分离菌对氨苄青霉素、先锋霉素、青霉素、新霉素、链霉素等常用抗生素均已表现耐药。由于各地区分离的菌株不同，饲养环境条件不同，对药物的敏感性并不完全相同，加之抗生素使用不当，常常治疗效果不一，增加生产成本，造成经济损失。因此，开发一种防治鸭传染性浆膜炎的纯天然中药产品，可以在一定程度上克服化学药物的耐药性和药物残留问题，对于保护养鸭业的发展和人类健康具有十分重要的意义。

目前市场上用于治疗鸭疫里氏杆菌病的中药产品仅有山东鲁港福友药业有限公司研制出的浆炎速停纯中药口服液，但并未公布其组方。在现有有关鸭疫里氏杆菌病中药制剂研究的公开文献中，也存在一些问题：一是中药组方公开不充分；二是中药制剂制备方法及治疗功效阐述不明确。因此，研制一种防治鸭传染性浆膜炎的中药制剂具有重要的意义。

发明内容

本发明目的是，针对目前市场上用于治疗鸭疫里氏杆菌病中药产品所存在的缺陷，提供一种有效治疗鸭疫里氏杆菌病的中草药物；本发明的另一目的是提供该中草药物的制备方法。

本发明药物选用黄连、黄柏、干草为原料药进行组合，使各原料药物功效产生协同作用，从而能够有效治疗鸭疫里氏杆菌感染。这是因为黄连，性味苦寒，归心肝胃大肠经，清热燥湿，泻火解毒；黄连的主要有效成分是小檗碱，含量达10％，黄连的抗菌作用和小檗碱的作用基本一致，即黄连的作用是其所含小檗碱的作用所致；黄连对葡萄球菌、肺炎球菌、霍乱弧菌、链球菌、志贺杆菌等许多革兰氏阳性或阴性细菌具有较强的抗菌作用。黄柏，主要功效是清热，燥湿，泻火，解毒，与黄连同样含较多的小檗碱，但其含量较黄连低，并含有其他成分，作用亦有些差异。甘草，味甘，平，主要功效：和中缓急，润肺，解毒，调和诸药。

为了达到更好的疗效，本发明药物还可与白术和丹皮进行组合，这是因为白术，具有健脾益气、燥湿利水的作用，对于由脾气虚弱引起的食欲不振、消化不良、腹胀、便溏(大便稀烂)以及疲劳乏力等症状能较好地改善；由于白术有燥湿作用，对有形之水积聚形成的水肿，对无形之水积聚形成的痰饮(水液在体内运输、分布失常，停积在某一位置而导致的病证)，疗效都不错。丹皮，善清血，而又活血，因而有凉血散瘀的功效，使血流畅而不留瘀，血热清而不妄行，故对血热炽盛、肝肾火旺及瘀血阻滞等症都恃为要药。

但中药在体内、外的抑菌效果不尽一致，有些中药在体外无抑菌作用，可能在体内具有治疗作用。反之有些中药在体外有抑菌作用，在体内可能无效。本发明的临床动物试验也证明了这一点。黄连在体外对RA菌有很强抑制作用，但是其在体内单独并不能抵抗RA菌的攻击；但和黄柏、甘草、白术和丹皮按一定比例组合，则产生明显的抗菌作用，达到保护的目的；经拆方研究证明，单味中药不能有效抵抗RA菌的攻击。

本发明目的通过以下技术方案得以实现：

治疗鸭疫里氏杆菌病的中草药物，该药物主要是由下列重量份的原料药：黄连2-5份，黄柏2-5份，甘草3-8份，经水煎或水醇提取制备而成。

所述药物的优选为，各原料药的重量份为：黄连2份，黄柏2份，甘草4份。

治疗鸭疫里氏杆菌病的中草药物，该药物还可以与白术和丹皮进行组合，其具体组分与各组分的重量份为：黄连2-5份，黄柏2-5份，甘草3-8份，白术2-5份和丹皮2-5份。

所述药物的优选为：黄连2份，黄柏2份，甘草3.5份，白术2份和丹皮2.5份。

本发明可以采用中药制剂的常规方法制备成内服或注射制剂，例如可以将这些原料药研成粉末与鸭饲料按0.08-0.12∶1比例混合均匀后内服；也可对该中药进行水煎提取或水煎后再乙醇提取，制备成水煎液剂或注射剂，其中，水煎液剂可以净水1:1比例稀释供鸭饮用；注射剂按0.5ml/只注射；但是为了使该药物的各原料药更好地发挥药效，减少工作量，优选的可将这些原料药水煎后，将水煎液加入饮用水内供鸭饮用，但是这些不能用于限制本发明的保护范围。

治疗鸭疫里氏杆菌病中草药物的制备方法，该方法按如下步骤进行：将所述重量配比的黄连、黄柏、甘草3味药，加水煎提2次，每次30min，加水量以没过药面为宜，合并两次煎液，纱布过滤得滤液，即为活性组分药液。

所述制得的活性组分药液，加5倍量95％乙醇，4℃下静置24h，滤纸过滤除沉淀后，在85℃下减压蒸馏回收乙醇，100℃下继续蒸馏浓缩至每毫升中含有相当于原生药量1g，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后即成针剂药物。

如果还与白术和丹皮组合，其制备方法为：将所述重量配比的黄连、黄柏、甘草、白术和丹皮5味药，加水煎提2次，每次30min，加水量以没过药面为宜，合并两次煎液，纱布过滤得滤液，即为活性组分药液。

本发明的有益效果：

1.本发明药物选用黄连、黄柏、干草(或再加白术和丹皮)为原料药进行组合，使各原料药物产生协同作用，对临床鸭疫里氏杆菌感染发病鸭具有良好治疗效果。通过拌饲，拌水或注射，对鸭群进行预防或治疗。以0.03g/ml药物浓度进行试验，其中，治疗组3天后，病情已得到控制，死亡率由对照73％下降为36％；预防组死亡率由对照13％下降为1.3-2.8％，效果显著，和抗菌素治疗组治愈率相当。具有成本较低，使用方便，效果显著等特点。本发明药物用于生产，可生产无抗生素残留的鸭产品，对保障人民身体健康具有重要意义。

2.本发明药物原药充足，制备简单，价格低廉，每只鸭的治疗或预防费用仅为0.2元，而使用抗生素药治疗成本大约为0.3元。

具体实施方式

以下通过实施例与试验例对本发明作进一步的阐述，但应该理解本发明的内容并不局限于这些范围。

[实施例1]本发明水煎提取药物1

按重量配比称取黄连2g，黄柏2g，甘草4g3味原药，加水量以没过药面为宜，共加水煎煮两次，每次为30min，合并两次煎液200ml，纱布过滤得滤液，即为水煎提取药物。

[实施例2]本发明水煎提取药物2

本例药物配方为黄连5g，黄柏3.5g，甘草7g，其余制备步骤、工艺同实施例1。

[实施例3]本发明水煎提取药物3

本例药物配方为黄连3.5g，黄柏5g，甘草5g，其余制备步骤、工艺同实施例1。

[实施例4]本发明水煎提取药物4

本例药物配方为黄连2g，黄柏2g，甘草3.5g，白术2g，丹皮2.5g，其余制备步骤、工艺同实施例1。

[实施例5]本发明水煎提取药物5

本例药物配方为黄连5g，黄柏3.5g，甘草7.5g，白术3.5g，丹皮5g，其余制备步骤、工艺同实施例1。

[实施例6]本发明水煎提取药物6

本例药物配方为黄连3.5g，黄柏5g，甘草5g，白术5g，丹皮3.5g，其余制备步骤、工艺同实施例1。

[实施例7]本发明水醇提取药物7

按重量配比称取黄连5g，黄柏5g，甘草8g，白术5g和丹皮5g，加水煎煮两次，加水量以没过药面为宜，每次分别为30min，合并两次煎液300ml，经纱布过滤后，加5倍量95％乙醇，4℃下静置24h，滤纸过滤除沉淀后，在85 ℃下减压蒸馏回收乙醇，100℃下继续蒸馏浓缩至1g/ml(每毫升中含有相当于原生药量1g)，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后即成针剂药物。

[实施例8]本发明粉剂药物8

按重量配比称取原料药黄连4g，黄柏4g，甘草5g，白术3g和丹皮3g，直接研成粉末后，与鸭饲料按重量0.08-0.12∶1混合制成颗粒饲料，饲用。

[实验例1]本发明药物组方筛选及对RA人工发病鸭的治疗效果

1材料和方法

1.1材料

1.1.1药物天南星、白附子、黄连、白术等中药，均购自浙江中医学院大学路第二门诊部。

1.1.2实验鸭

7～10日龄樱桃谷非免疫鸭由浙江省桐乡市兽医防疫站提供，出生后至实验结束，饲喂不含任何药物添加剂的配合饲料。在浙江省农业科学院畜牧兽医研究所实验室(以下称本实验室)动物房适应3天后用于实验。

1.1.3菌种和培养基鸭疫里氏杆菌I、II型菌种由本实验室保存，马丁琼脂和肉汤培养基由本实验室自制。

1.2方法

1.2.1中药组方及筛选根据鸭传染性浆膜炎临床症状，按照中医辨证施治原则，组合成4个处方，分别是：

方1：以《疫疹一得》中的成方清瘟败毒饮为基础，加减组方。石膏15g、知母10g、桔梗10g、黄连10g、焦大黄10g、枳实10g、连翘10g、甘草10g、生地10g、水牛角10g、栀子10g、黄芩10g、赤芍10g、玄参10g、丹皮10g、鲜丹皮5g。

方2：天南星0.3g、白附子0.3g、天麻0.3g、党参2g、甘草2g、白术2g、半夏1g、黄芪2g。

方3：天南星0.3g、白附子0.3g、甘草0.3g。

方4：本发明实施例4水煎提取药物(黄连浆膜炎汤)各味中药共12g(黄连2g，黄柏2g，甘草3.5g，白术2g和丹皮2.5g)。

方1共160g混匀，用中药粉碎机粉碎，将80g中药与1Kg饲料混合制成颗粒，供16只雏鸭一个实验过程使用，其中8只提前2d饲喂中药饲料作预防组，另8只攻毒后给料作治疗组。其余80g中药分成5剂，每天1剂，每剂水煎2次，取汤80ml加入水里供8只雏鸭饮用。

方2、方3的药量分别为1剂的药量，每天1剂，每剂水煎2次，取煎剂100ml加入水里供10只雏鸭饮用。

方4的药量为1剂的药量，每天1剂，每剂水煎2次，取煎剂200ml，用自来水1：1稀释，供20只雏鸭饮用。

1.2.2药敏纸片的制备

取天南星、白附子、天麻、黄连、黄柏、甘草、白术、丹皮药物各1g、加水少许，煎汁过滤，得滤液5ml；方4药物共12g，加水少许，煎汁过滤，得滤液15ml；另将天南星1g用10ml乙醇浸渍48h，过滤取醇浸剂；滤纸打孔，直径5mm，将纸片浸入药液或醇浸剂里1h，之后取出放37℃温箱烘干备用。天南星煎剂除取少许做药敏纸片外，剩余的用乙醇沉淀后，过滤杂质，取滤液蒸馏乙醇后制作天南星注射剂

1.2.3体外抑菌方法

将在马丁琼脂斜面培养的细菌用马丁肉汤洗出，根据培养基的干湿状况，吸取100～150μL菌液均匀涂布于平皿内，待菌液吸干后再将药敏纸片放在平皿内适当位置，37℃下烛罐培养24h观察结果。

1.2.4人工发病治疗试验

根据已有的试验结果，给各组别的小鸭分别注射I型Ra细菌0.3ml/只，II型Ra细菌0.14ml/只，(I型、II型Ra含菌量均为7×10⁸cfu/ml)。除方1的混和饲料预防试验组提前2d给含有药物的颗粒饲料外，其余各试验组都在人工攻毒2h后给小鸭饮水服药。药液与水按重量1：1混合，平均每只鸭10ml量，自由饮用。各组鸭的临床症状和死亡情况连续观察10天。方4的药物用水稀释后其终生药浓度约为0.03g/ml。

1.3数据处理试验数据采用x²精确统计法统计。

2结果

2.1体外抑菌效果

在8味中药和4个组方中，天南星、白附子、天麻、甘草等4味中药和方1、方2、方3煎剂没有体外抑菌效果；黄连药敏纸片具有极好的体外抑菌效果，对I型、II型Ra细菌抑菌圈达26mm、27mm。黄柏虽对I、II2个血清型的Ra都有一定的抑菌作用，但抑菌圈较小，仅有6mm，白术与丹皮仅有4mm，属于不敏感范围；方4有22mm的抑菌圈，属于敏感范围，体外抑菌效果较好。

2.2体内治疗效果

2.2.1体内筛选结果

在出现临床症状和死亡时间上，表现为给药当天各组鸭均表现为食欲减退、站立困难、卧地缩成一团。第2d实验组鸭活力开始全面恢复，对照组也有一些鸭恢复活力。第3d对照开始出现死亡，第4d和第5d出现死亡高峰，第6d起死亡开始减少，如果没有临床症状，第8d起一般不再死亡。各组鸭死后解剖急性者没有明显病理变化，但第4d以后死亡鸭均见明显的浆膜炎病理症状。试验组康复鸭和对照耐过鸭心包有少许纤维素性渗出物粘连，肝脏和气囊基本正常。

对由I型RA菌发病的小鸭，方1的混饲预防、混饲治疗、水煎剂治疗组等3个组呈现37％～50％的死亡率，与相应的对照组相比无显著差异(P>0.05)，说明方1无效；方2、方3、天南星注射液等3个试验组呈现30％～55％的死亡率，与相应的对照组相比也无显著差异(P>0.05)。但对无论由I型还是II型RA菌发病的小鸭，方4都具有较好的治疗效果，死亡率为10％以下，与I型、II型RA对照组相比均具有显著差异(P<0.01)。详见表1.1。

表1.1各种不同药物组方对鸭疫里氏杆菌人工发病后的治疗实验结果

组别

给药途径

细菌型

细菌量/ 口、

试验数

死亡数

死亡率

方1

混和饲料预防

I型

0.3ml

8

4

50％

方1

混和饲料治疗

I型

0.3ml

8

4

50％

方1

水煎剂饮水

I型

0.3ml

8

3

37％

方2

水煎剂饮水

I型

0.3ml

10

4

40％

方3

水煎剂饮水

I型

0.3ml

10

3

30％

天南星注射液

肌肉注射

I型

0.3ml

9

5

55％

方4

水煎剂饮水

I型

0.3ml^a

9

0

0％

方4

水煎剂饮水

II型

0.14ml^b

19

2

10％

对照1组

自来水

I型

0.3ml^c

19

10

52％

对照2组

自来水

II型

0.14ml^d

25

13

52％

注：a与c、b与d相比，差异极为显著(P<0.01)，其他组与相应RA型对照相比，P>0.05

2.2.2黄连浆膜炎汤(方4)的拆方试验结果

在明确方4具有较好治疗效果的基础上，为了进一步探讨引起治疗作用的根本药物，研究各药物之间的相互作用，寻求最简单的组方原则，将方4按照各种可能的组合方式进行了分解组合，进一步进行动物试验。以II型RA细菌按0.14ml/只攻毒，随后再给鸭按饮水法给药。结果，将方4任意拆分组合后，其效果均不如方4，个别组的死亡率还略有增加，如组合1和组合5。结果见表1.2。

表1.2黄连浆膜炎汤拆方重组后的人工发病治疗试验结果

组别

给药途径

细菌型

细菌量/只

试验数

死亡数

死亡率

黄柏

水煎剂饮水

II型

0.14ml

10

9

90％

黄柏+黄连

水煎剂饮水

II型

0.14ml

10

5

50％

白术+丹皮

水煎剂饮水

II型

0.14ml

10

4

40％

黄连

水煎剂饮水

II型

0.14ml

10

5

50％

甘草

水煎剂饮水

II型

0.14ml

10

8

80％

黄连+甘草

水煎剂饮水

II型

0.14ml

10

5

50％

对照组

自来水

II型

0.14ml

25

13

52％

注：以上各组方药与对照组相比均无差异(P>0.05)

3小结

3.1(方4)(黄连浆膜炎汤)进行各种拆分组合后，均没有治疗效果，说明构成黄连浆膜炎汤的各药物之间在煎煮过程中，其所含的有效成分之间可能发生了新的化学反应，产生了新的化学物质，而这种有效物质的产生依赖于构成黄连浆膜炎汤的各药物。缺少任何一种中药，都导致该有效成分的缺失，从而没有治疗效果。

实验结果显示，7味具有抗菌活性中药里有6味体外抑菌无效，只有黄连有较强的抗菌效果，说明对RA菌敏感的中药较少。方1(清瘟败毒饮)以混和饲料预防、混和饲料治疗、水煎剂饮水三种方式进行体内试验，均没有治疗效果，可能该方过去主要用于病毒性传染病的治疗。方2、方3是根据其具有咳嗽等呼吸道症状和歪颈、跛行等神经症状而拟的以天南星为主药的两个组方，无效的原因不明，可能是鸭疫里氏杆菌本身确实对其不敏感。而方4(黄连浆膜炎汤)不论其在体外还是体内均具有抗菌和治疗作用。

[实验例2]本发明药物对RA的体外抑制作用及其对菌体形态特征的影响

为了研究其抑菌效果，本实验开展了黄连浆膜炎汤对RA的最小抑菌浓度检测和在一定浓度药物作用下细菌形态变化的电镜观察。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1中药构成方4(黄连浆膜炎汤)的黄连等中药购自浙江中医学院大学路第二门诊部。

1.1.2菌株RAII型菌株分离自浙江省鸭疫里氏杆菌病的病死鸭中，由本实验室保存。

1.1.3培养基马丁琼脂和马丁肉汤培养基，由本实验室制备。

1.1.4仪器紫外可见分光光度计，北京瑞利分析仪器公司产品；震荡仪，江苏太仓医疗仪器厂；透射电镜，日本电子(JEOL)，型号，JEM-1200EX，加速电压 60KV，最大放大倍数10万倍。

1.2方法

1.2.1方4(黄连浆膜炎汤)水醇提取物的制备方法同实施例7。水醇提取物用磷酸盐缓冲液稀释配成含生药0.1g/ml，然后倍比稀释成0.05g/ml、0.025g/ml等10个浓度的药液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，—20℃保存备用。

1.2.2纸片体外抑菌法参照实验例1。

1.2.3试管体外抑菌法及OD值测定取试管13支，分别加入肉汤2ml，再加入37℃下震荡培养10h的细菌各100μl(含菌量约为7×10⁹cfu/ml)，之后加入各不同浓度药液50μl，设药物对照、细菌对照，震荡培养17h。测定时再设立一个未震荡培养的细菌对照。以纯肉汤调零，在波长600nm测定OD值。1.2.4电镜观察取细菌对照组及0.1g/ml浓度组培养17h的RA和0.1×2^-3g/ml培养3、6、17h的RA，以5000g离心10min，吹打，再加适量双蒸水，用悬滴法把样品沾在铜网上，用2％PTA(磷钨酸)负染，电镜观察结果。

2结果

2.1纸片扩散法结果

0.1g/ml黄连浆膜炎汤浓度组的抑菌圈为15mm，0.1×2^-1g/ml、0.1×2^-2g/ml、0.1×2^-3g/ml、0.1×2^-4g/ml浓度组抑菌圈分别是11.5mm、13.5mm、9mm、7mm。0.1×2^-5g/ml以上各浓度组无抑菌圈。除2^-2浓度组外，药物抑制细菌增殖效果和药物浓度呈正相关。

2.2试管体外抑菌法结果

试管抑菌实验结果表明：药物浓度越高，细菌生长越少，随药物浓度的降低，肉汤由清亮状态向浑浊状态过渡。紫外分光光度计测定的OD值以0.1g/ml×2^-2组最低，为0.103，随着稀释度的增加，药物浓度越来越小，0.1g/ml×2^-6组OD值和细菌培养对照组的完全一样，说明在药物稀释至2^-6倍时，已没有抑菌能力。纯药物对照组的OD值是0.004，是细菌未培养对照组OD值0.131的3％，是细菌培养对照组OD值1.210的0.33％，表明药物对OD值的影响甚微，可忽略不计。总体来讲，药物抑制细菌增殖效果和药物浓度呈正相关。

表2.1不同药物浓度下RA菌OD值测定结果

药物浓度concentration	OD值values	药物浓度concentration	OD值values
				0.1g/ml×2⁰	0.120	0.1g/ml×2^-７	1.234
0.1g/ml×2^-１	0.106	0.1g/ml×2^-８	1.309
				0.1g/ml×2^-２	0.103	0.1g/ml×2^-９	1.195
0.1g/ml×2^-３	0.151	0.1g/ml×2^-１0	1.270
				0.1g/ml×2^-４	0.777	药物对照(无菌)	0.004
0.1g/ml×2^-５	1.150	细菌对照(无药，培养)	1.210
				0.1g/ml×2^-６	1.210	细菌对照(无药，未培养)	0.131

注：细菌未培养对照系指在测定OD时，临时吸取细菌100μl，直接进行光密度测定。

2.3透射电镜观察结果

正常里氏杆菌II型菌外观呈椭圆形，形似花生，菌体内可见染色较深的皱褶纹理。有些菌体侧面可见赘生物。而在0.1g/ml药物浓度下，RA菌体固缩，或内部断裂，皱褶纹理不均匀。在0.1g/ml×2^-3浓度为亚杀菌浓度，即0.0125g/ml浓度下，药物作用3h细菌菌体外形与正常细菌区别不大，但内部皱褶开始变得不均匀；药物作用6h后细菌菌体变长，长度是正常RA菌的2～3倍，并且内部皱褶减少，纹理变得不均匀。药物作用17h时细菌呈卷曲状态或折叠趋势，深染部分高度浓缩于菌体中间。

3小结

3.1本实验药物经提纯后，纸片体外抑制法表明，在0.1g/ml×2^-5以上稀释度时即没有抑菌活性。试管体外抑菌结果也表明在0.1g/ml×2^-5浓度其浑浊度明显增大，OD值已接近细菌对照组的OD值，纸片法和试管法所测结果一致。从实验可以看出，在0.1g/ml高浓度下，抑菌圈最大，但0.1g/ml×2^-１浓度的抑菌圈反不如0.1g/ml×2^-2抑菌圈大，试管法测定结果也证明了在0.1g/ml×2^-2浓度时，OD值最小，就体外抑菌作用而言，0.1g/ml×2^-2浓度抑菌作用最强。

3.2对于50μl浓度为0.1g/ml×2^-2黄连浆膜炎汤而言，仅相当于1.25mg左右的生药量，细菌震荡培养10h后，其细菌量大约7×10⁹cfu/ml，就是说1.25mg黄连浆膜炎汤生药量即可抑制7×10⁸个即七亿个RA细菌的增殖。

3.3电镜结果观察发现，本药物对RA菌的作用，主要是通过改变细菌结构而抑制细菌增殖的。药物进入菌体后，细菌染色体纹理不均匀，菌体染色较深的内容物变得浓缩和聚集，引起菌体变形，菌体通过弯曲而折断，进而死亡，可能与菌内物质丢失和泄漏有关。

[实验例3]本发明药物对RA菌病的临床治疗试验

2008年7月8日，浙江省桐乡市某野鸭场2800只13日龄雏陆续出现死亡的现象，在不到一周的时间内，先后有840只雏野鸭发病，373只死亡，发病率为30％，死亡率为13％。雏野鸭大部分表现为精神萎靡、食欲减退或废绝缩颈嗜睡，眼睑和鼻孔处附粘性分泌物，一侧或双侧的眼睑肿胀、怕光、流泪，眼睑被粘性分泌物粘连在一起；排灰绿色或黄白色稀粪，继而水样腹泻；有的病雏出现打转、扭颈等神经症状，还有部分病鸭出现跛行、关节肿胀、触之有波动感。经临床初步诊断，疑似鸭疫里氏杆菌，决定采用了黄连浆膜炎汤进行临床治疗试验。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1供试鸭浙江省桐乡市某野鸭场患病鸭群及病死雏野鸭。

1.1.2中药本发明方4(黄连浆膜炎汤)，配方及制备方法参照实施例4。

1.1.3药敏试验中药药敏纸片采用自制消毒纸片在中药中浸泡30分钟后干燥备用，氯霉素等10种抗生素药敏纸片购于上海医学化验所。

1.1.4培养基血琼脂平板、普通琼脂平板、改良马丁肉汤、厌氧肉肝汤培养基。

1.1.5生化反应反应管购于上海生化所和浙江省军区卫生防疫检验所。

1.1.6标准血清购自中国兽药监察所。

1.2方法

1.2.1临床试验

把全群剩余雏野鸭2416只分成治疗组(属重病鸭)38只、预防组451只、抗生素组1927只；以600g中药煎得药液10000ml，各组兑等量水，终浓度0.03g/ml，治疗实验组和预防高剂量组按30ml/只给药；预防低剂量组按10ml/只给药，中剂量组20ml/只给药；自由饮用，饮完药液后给自来水，各对照组饮自来水，抗生素组由鸭主自行采用速克加聚肌胞肌注治疗。各组连续给药三天。

1.2.2病原分离鉴定按常规方法纯分离病原并纯培养，对菌体形态、细菌培养生长特性和生化特性进行鉴定。

1.2.3染色镜检主要对菌体形态、细菌培养生长特性和生化特性进行鉴定。

1.2.4生化试验将分离菌株移植于普通琼脂或血琼脂斜面上，培养24h后，用马丁肉汤洗下，适量地接种于微量发酵管，放入灭菌培养皿中，置于37℃恒温箱中培养48h后，检查生化反应管。

1.2.5血清型鉴定采用兔RA抗体以玻片凝集试验检测菌株的凝集特性，鉴定其血清型。

1.3药敏试验先用ATCC₂₅₉₂₂(来自WHO)、0₇₈、0₁标准株(来自中监所)做预备试验，标准株敏感度落在规定范围内。然后用同样操作程序对分离菌进行试验。判断标准：抑菌圈直径为d≥15mm为高度敏感，10mm≤d<15mm为中度敏感，d<10mm为耐药。

2结果

2.1临床试验结果

治疗组为精神萎靡不振、几乎难以站立及缩颈嗜睡类重症病鸭。连续治疗3天后，病情已得到控制，死亡率为36％，比对照组的73％大大减少。预防对照组不经任何治疗时，死亡率和平时一样，达到13％，而三个给药组死亡率分别为1.5％、2.8％、1.3％，均表现出显著的预防效果，和抗菌素治疗组治愈率相当。卡方统计结果也表明，各试验组与相应的对照组相比，P<0.01，差异显著，见表3.1。

2.2培养结果

在巧克力琼脂平板上生成的菌落表面光滑、微突起，圆形呈奶油状。但在普通大气环境中进行培养，菌落较小，呈露珠状。鲜血琼脂平板培养墓上的菌落为不溶血的露珠状小菌落。挑单个菌落涂片，革兰氏染色呈阴性，在油镜下观察可见大小比较整齐的小杆菌，多数为单个存在，偶有成对或成链状排列，美兰染色较浅，两极浓染，符合里氏杆菌形态特征。

2.3生化反应

将分离菌株移植于普通琼脂或血琼脂斜面上，培养24h后用马丁肉汤洗下菌苔，取适量接种于葡萄糖、蔗糖、硫化氢等微量发酵管，放入灭菌培养皿中，置37℃培养箱内培养48h后，菌均不发酵本试验中的9种糖；22株菌的硫化氢、M-R、V-P、吲哚试验、枸椽酸盐利用试验均呈阴性，尿素酶、过氧化氢均呈阳性。鉴定为里氏杆菌。

2.4血清型鉴定

经鉴定为血清2型里氏杆菌。

表3.1浙江桐乡市临床试验死亡记录与统计表2008年7月18日

2.5药敏试验

将分离到的里氏杆菌对15种常用抗生素和本次试验用的中药做药敏试验。药敏实验结果表明分离菌对中草药、头孢曲松、头孢哌酮等高度敏感；而对氟哌酸、氯霉素、卡那霉素、四环素、头孢噻肟等中敏；对氨苄青霉素、先锋霉素、青霉素、新霉素、链霉素等表现耐药。结果见表3.2。

表3.2分离菌药敏试验结果单位mm

药敏纸片	抑菌直径	药敏纸片	抑菌直径	药敏纸片	抑菌直径
						中药	18	氯霉素	12	新霉素	0
氟哌酸	14	先锋霉素	0	链霉素	0
						头孢曲松	17	卡那霉素	14	诺氟沙星	9
头孢哌酮	16	四环素	13	头孢噻肟	14
						氨苄青霉素	0	青霉素	0	磺胺+T	0

3小结

3.1鸭传染性浆膜炎病是危害养鸭业最为严重的细菌性传染病，往往是一个场发病，整个养殖区便都流行起来，其危害性在某些地区甚至超过了常见的病毒性传染病，损失极为惨重。因此本临床研究的防治效果显著为今后解决这一难题展现出光明的前景。

3.2如本次药敏实验结果表明分离菌对氨苄青霉素、先锋霉素、青霉素、新霉素、链霉素等常用抗生素均表现耐药，因此本次试验仍然具有重要意义。试验结果表明，在开始给药的前三天，治疗组治疗效果与对照组相比，没有明显区别。但从第4天开始，各试验组鸭开始停止死亡，而对照组鸭仍然死亡。这是因为，治疗初期细菌已在病鸭体内大量繁殖，可能已经对鸭体造成了不可逆的病理变化，此时，对这些病鸭而言已经无药可医。从第四天起，治疗组鸭停止死亡，这是因为药物已经抑制了少量细菌在鸭体内的生长，显示出治疗效果。

Claims

1.治疗鸭疫里氏杆菌病的中草药物，其特征在于该药物由下列重量份的原料药水煎或水提醇沉制备而成：黄连2-5份，黄柏2-5份，甘草3-8份，白术2-5份和丹皮2-5份。

2.按权利要求1所述的中草药物，其特征在于各原料药的重量份为：黄连2份，黄柏2份，甘草3.5份，白术2份和丹皮2.5份。

3.按权利要求1或2所述中草药物的制备方法，其特征在于按以下步骤进行：将所述重量配比的黄连、黄柏、甘草、白术和丹皮5味药称量，加水煎提2次，每次30min，加水量没过药面，合并两次煎液，纱布过滤得滤液，即为药液。

4.按权利要求3所述中草药物的制备方法，其特征在于将制得的药液，加5倍量95％乙醇，4℃下静置24h，滤纸过滤除沉淀后，在85℃下减压蒸馏回收乙醇，100℃下继续蒸馏浓缩至每毫升中含有相当于原生药量1g，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后即成注射针剂药物。