发明内容
本发明的目的在于针对目前兽医临床上抗生素的不合理使用,提供一种高效防治鸡大肠杆菌病的纯中药制剂,该制剂具有良好的治疗和预防效果。
本发明的技术方案是:一种防治鸡大肠杆菌病的纯中药散剂,其特征是,制成有效成分的原料药按重量份数计,黄藤150~350份、马尾连150~350份、十大功劳叶150~350份、龙胆150~350份、地锦草150~350份、杨树花100~200份、郁金100~200份、火炭母70~150份、厚朴70~150份、玄参70~200份、生地黄70~200份、香附70~200份、六神曲70~200份、麦芽70~200份、焦山楂70~200份。
优选配比为:黄藤300g、马尾连300g、十大功劳叶300g、龙胆300g、地锦草200g、杨树花200g、郁金200g、火炭母150g、厚朴150g、玄参150g、生地黄150g、香附100g、六神曲100g、麦芽100g、焦山楂100g。
本发明的另一个目的是提供一种防治鸡大肠杆菌病纯中药散剂的制备方法。该制备方法是按上述配比称取原料药,将黄藤粉碎后加0.2~0.5%的硫酸溶液浸渍提取;合并提取液,加入食盐进行盐析,滤过后得黄藤素沉淀物,干燥后备用;取其余的原料药,加入70~75%的乙醇加热回流提取,然后减压浓缩,喷雾干燥得干粉;将干粉与上述干燥后的黄藤素沉淀物合并,加入二氧化硅,粉碎,过筛,混匀,得到防治鸡大肠杆菌病的纯中药散剂。
具体包括以下步骤:
(1)将黄藤粉碎成粗粉,加入其质量5~12倍的浓度为0.2~0.5%(ml/ml)的硫酸溶液,浸渍24~48h后,过滤,收集滤液;药渣再加入4~8倍的0.2~0.5%(ml/ml)的硫酸溶液,浸渍24~48h后,过滤,收集滤液;合并两次滤液,滤液加入其质量8~12%的食盐,搅匀,室温静置24~48小时,滤过,得黄藤素沉淀物,60~70℃干燥至含水量为≤10.0wt%;产物所含的生物碱即盐酸巴马汀(C21H21NO4·HCl),按干燥品计算≥85.0%。
(2)取其余的原料药,加入70~75%(ml/ml)的乙醇加热回流提取两次,第一次加8~10倍量70%~75%(ml/ml)乙醇回流提取1±0.2h,第二次加4~6倍量70%~75%(ml/ml)乙醇回流提取0.5±0.1h;合并两次滤液,回收乙醇,减压浓缩至相对密度为1.20~1.35(60℃)的清膏,喷雾干燥至含水量为≤10.0wt%,得干粉;
(3)将干粉与上述干燥后的黄藤素沉淀物合并,加入二氧化硅(占总药物质量的1.8~2.0%),粉碎,过五号筛,混匀,分装,封口即得所制药物。
用法与用量
预防:混饲,鸡2.5g/kg饲料,连用7天
治疗:混饲,鸡5g/kg饲料,连用3~5日。
各原料药来源及药理作用
黄藤:防已科植物黄藤Fibraurea recisa Pierre.的干燥藤茎。清热解毒,泻火通便。用于热毒内盛,便秘,泻痢,咽喉肿痛,目赤红肿,痈肿疮毒。
马尾连:为毛茛科植物金丝马尾莲Thalictrum glandulosissimum W.T.Wang etS.H.Wang、多叶唐松草Thalictrum foliolosum DC、及高原唐松草T.cultratumWall.[T.deciternatum Boiv],等的根茎及根。清热燥湿,解毒。治痢疾,肠炎,传染性肝炎,感冒,麻疹,痈肿疮疖,结膜炎。
十大功劳叶:小檗科植物阔叶十大功劳、细叶十大功劳的叶。具有清热补虚,止咳化痰的功效。适用于肺痨咳血、骨蒸潮热、头晕耳鸣、心烦、目赤等症。
龙胆:为龙胆科植物条叶龙胆、龙胆、三花龙胆或滇龙胆的干燥根及根茎。清热燥湿,泻肝胆火。用于湿热黄疸,阴肿阴痒,带下,强中,湿疹瘙痒,目赤,耳聋,胁痛,口苦,惊风抽搐。
地锦草:为大戟科植物地锦Euphorbia humifusawilld.或斑地锦EuphorbiamaculataL.的干燥全草。清热解毒,凉血止血,利湿退黄。用于痢疾,泄泻,咯血,尿血,便血,崩漏,疮疖痈肿,湿热黄疸。
杨树花:为杨柳科植物毛白杨、加拿大杨或同属数种植物的干燥雄花序。清热解毒;化湿止痢。
郁金:为姜科植物温郁金、姜黄、广西莪术或蓬莪术的干燥块根。行气化瘀,清心解郁,利胆退黄。用于经闭痛经,胸腹胀痛、刺痛,热病神昏,癫痫发狂,黄疸尿赤。
火炭母:蓼科植物火炭母Polygonum chinenseL.(P.sinenseL.),全株均可入药。清热解毒,利湿消滞,凉血止痒,明目退翳。用于痢疾,肠炎,消化不良,肝炎,感冒,扁桃体炎,咽喉炎,白喉,百日咳,角膜云翳,霉菌性阴道炎,白带,乳腺炎,疖肿,小儿脓疱疮,湿疹,毒蛇咬伤。
厚朴:木兰科植物厚朴Magnolia officinalis Rehd.et Wils.或凹叶厚朴Magnoliaofficinalis Rehd.et Wils.var. biloba Rehd.et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮。燥湿消痰,下气除满。用于湿滞伤中,脘痞吐泻,食积气滞,腹胀便秘,痰饮喘咳。
玄参:为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。凉血滋阴,泻火解毒。用于热病伤阴,舌绛烦渴,温毒发斑,津伤便秘,骨蒸劳嗽,目赤,咽痛,瘰疠,白喉,痈肿疮毒。
生地黄:为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的干燥块根。清热生津滋阴,养血。治阴虚发热,消渴,吐血,衄血,血崩,月经不调,胎动不安,阴伤便秘。
香附:为莎草科植物莎草Cyperus rotundusL.的干燥根茎。行气解郁,调经止痛。用于肝郁气滞,胸、胁、脘腹胀痛,消化不良,胸脘痞闷,寒疝腹痛,乳房胀痛,月经不调,经闭痛经。
六神曲:为辣蓼、青蒿、杏仁等药加入面粉或麸皮混和后,经发酵而成的曲剂。健脾和胃,消食调中。主治饮食停滞,胸痞腹胀,呕吐泻痢,产后瘀血腹痛,小儿腹大坚积。
麦芽:为禾本科植物大麦Hordeum vulgareL.的成熟果实经发芽干燥而得。行气消食,健脾开胃,退乳消胀。用于食积不消,脘腹胀痛,脾虚食少,乳汁郁积,乳房胀痛,妇女断乳。生麦芽健脾和胃,疏肝行气。用于脾虚食少,乳汁郁积。炒麦芽行气消食回乳。用于食积不消,妇女断乳。焦麦芽消食化滞。用于食积不消,脘腹胀痛。
焦山楂:取净山楂,照清炒法炒至表面焦褐色,内部黄褐色。消食健胃,行气散瘀。用于肉食积滞,胃脘胀满,泻痢腹痛,瘀血经闭,产后瘀阻,心腹刺痛,疝气疼痛;高脂血症。焦山楂消食导滞作用增强。用于肉食积滞,泻痢不爽。(山楂:为蔷薇科山里红Crataegus pinnatifida Bge.Var.major N.E.Br.、山楂C.pinnatifida Bge.或野山楂C.cuneata Sieb.etZucc.的成熟果实。)
中兽医认为肠道疾病是由湿热或疫毒引起的。热毒入血分,气血与热毒相搏,下迫大肠,而见痢疾及便血。治宜清热解毒,凉血止痢,健脾清阳,则血痢自已。本方中黄藤、马尾连、十大功劳叶清热燥湿、泻火解毒,共为君药;龙胆泻肝胆实火、清三焦湿热,郁金清热凉血,火炭母、地锦草、杨树花清热凉血,涩肠止泻,共为臣药;厚朴燥湿健脾、加强黄藤燥湿功效,香附行气和胃,六神曲、麦芽、焦山楂补脾健胃、化湿消积,清透邪热,又能升发清阳,鼓舞脾胃清阳之气上升而奏止泻止痢之功,玄参、生地黄清热凉血滋阴,共为佐使药。以上诸药合用,共奏清热解毒、燥湿止痢功效。
本发明的有益效果是:本发明根据中兽医基础理论,结合大肠杆菌病的发病机理,辩证施治,并采用现代化的中药提取技术,对传统中药散剂制备工艺进行重大创新改进,研制出了防治鸡大肠杆菌病的纯中药散剂。解决了传统中药散剂(只是对中药材进行简单的粉碎,混合、包装)存在的剂量大,中药有效成分体内溶出少,生物利用度低,药效慢等弊端。并且本发明通过混饲给药,方便快捷,疗效确切,非常适于在集约化规模养殖场推广使用,具有良好的市场前景和经济效益。经临床试验证明,本发明药物推荐剂量对鸡大肠杆菌病的有效率达到94%以上,治愈率达90%以上,优于目前临床上常用的防治鸡大肠杆病抗生素类药物,是目前临床上防治鸡大肠杆菌病效果较理想的药物,并有良好的促生长效果。
具体实施方式
实施例1:
配比:黄藤300g、马尾连300g、十大功劳叶300g、龙胆300g、地锦草200g、杨树花200g、郁金200g、火炭母150g、厚朴150g、玄参150g、生地黄150g、香附100g、六神曲100g、麦芽100g、焦山楂100g。
制备方法:
(1)将黄藤粉碎成粗粉,加0.2%硫酸溶液12倍量,浸渍48h后,过滤,收集滤液;药渣再加0.2%硫酸溶液8倍量,浸渍24h后,合并两次滤液,过滤,滤液加食盐600g(约为滤液质量的10%),搅匀,室温静置24小时,滤过,70℃干燥,得黄藤素提取物85.27g备用;
(2)取马尾连、郁金、十大功劳、厚朴、香附、火炭母、地锦草、杨树花、龙胆、六神曲、麦芽、焦山楂、玄参、生地黄,加热回流提取2次,第一次加10倍量75%乙醇1h,第二次加5倍量75%乙醇0.5h;合并药液,滤过,回收乙醇,减压浓缩至相对密度为1.25(60℃)的清膏,喷雾干燥,得提取物895.19g。
(3)步骤(2)提取物与上述干燥后的黄藤素提取物合并,加二氧化硅19.54g(占总药的19.54%),粉碎,过五号筛,混匀,得1000g。
测定黄藤素提取物,水分7.6%,含黄藤素(盐酸巴马汀C21H21NO4)86.3%;除黄藤外,其余14味药经提取所得提取物,测得水分6.0%,收率35.8%。
以下结合实验数据说明其治疗及防治效果
一、对鸡人工感染大肠杆菌病的治疗效果
1、试验药物:实施例1制备的中药散剂。
2、对照药物
①恩诺沙星可溶性粉(5%),批号:2011114,齐鲁动保厂生产。
②处方组成与实施例1相同,但采用传统散剂制备工艺,只是对方中各味药材进行粉碎、过筛、混合包装而成。
3、试验鸡:1日龄SPF鸡,购自济南斯帕法斯家禽有限公司,许可证号SCXK(鲁)20090002,饲养至22日龄时备用。
4、菌(毒)种:鸡大肠杆菌(O1、O2、O78)标准菌株,购自中国兽医药品监察所
5、培养基:营养琼脂平板、营养肉汤培养基,按常规方法制备,4℃冰箱保存备用
6、菌种的复壮和活菌计数:将冻干保存的鸡大肠杆菌开启后接种于普通营养肉汤培养基中,按常规方法培养、平皿计数,大肠杆菌为8×108CFU/ml。使用前,将保存菌种先接种普通平板,于37℃培养24h后,挑选典型菌落接种于肉汤中,又经37℃培养18h取出,将此肉汤培养物1ml/只颈部皮下注射健康鸡复壮。从死鸡肝脏无菌分离大肠杆菌并接种平板培养,最后挑选典型菌落,用普通肉汤培养,制备攻毒菌液。然后进行10倍递增稀释,用营养琼脂平板进行活菌计数,计数结果为大肠杆菌为6×108CFU/ml。
7、试验饲料:无药配合饲料。每日给料3次,自由饮水。
8、试验场地:室温20~24℃,相对湿度60%~70%。
3、试验方法:
3.1试验动物及其处理:取22日龄SPF鸡210只,随机分成6个组。各组称体重。具体处理如下表
表1试验鸡的给药途径及分组情况
组别 |
数量(只) |
初体重(g,x±sd) |
处理 |
Ⅰ试验药物高剂量组 |
50 |
182.7±33.1 |
感染混饲10g/kg |
Ⅱ试验药物中剂量组 |
50 |
194.0±28.4 |
感染.混饲5g/kg |
Ⅲ试验药物低剂量组 |
50 |
182.7±30.5 |
感染混饲2.5g/kg |
Ⅳ对照药物组1 |
50 |
179.3±31.4 |
感染混饮1g/L |
Ⅴ对照药物组2 |
50 |
180.3±32.9 |
感染,混饲20g/kg |
Ⅵ阳性对照组 |
50 |
184.7±26.7 |
感染不给药 |
Ⅶ空白对照组 |
50 |
183.0±26.4 |
不感染不给药,隔离饲养 |
3.2人工感染及用药方法:Ⅰ~Ⅵ组颈部皮下注射大肠杆菌培养液,按每100g体重接种大肠杆菌菌液0.30mL,约含1.35亿个菌。Ⅰ~Ⅴ组于攻毒后出现症状时投服试验药物,用药前禁水2h。连续用药5天,Ⅵ~Ⅶ组不用药。
3.3临床观察及观察指标
攻毒后每天注意观察各组临床症状,主要包括精神状态、食欲、粪便等,分别记录各组发病时间、发病及死亡情况。并剖检病死鸡,观察病变程度,作细菌分离培养,确定死因,观察期为第1次用药后的15d。
3.4疗效评价指标
3.4.1治愈在试验期间,鸡经给药后,大肠杆菌病症状消失,其精神状态、食欲、呼吸等恢复正常者均属治愈。治愈率=症状消失鸡数/试验鸡数。
3.4.2有效用药后治愈的和没有死亡但有临床症状表现的鸡均为有效。有效率=存活鸡数/试验鸡数。
3.4.3死亡率:在试验期间,出现大肠杆菌病的典型症状并死亡,尸体剖检心脏、肝脏有典型的病变特征,判定为大肠杆菌病引起感染死亡。根据死亡鸡数计算死亡率。
3.5数据分析
利用生物学统计方法进行显著性检验,其中死亡率、有效率和治愈率用卡方检验。
4、试验结果
阳性对照组鸡在攻毒6h后,开始表现怕冷、扎堆、精神不振,采食减少或不食,拉稀,排黄绿色或白色粪便等症状,发病率达100%,攻毒后12h陆续出现急性死亡鸡只,24h内共有15只死亡,死鸡仰脖,剖检发现轻度病变:注射部位黄色渗出物,点状出血,心包炎,肝周炎不明显,最主要病理变化是盲肠出血、十二指肠出血等典型的大肠杆菌病的病变。取肝脏病料在伊红-美兰鉴别培养基上划线培养,菌落紫黑色,并带有金属光泽。病理变化和病原学检查证实了病鸡系大肠杆菌感染引起的死亡。
用药48h~72h后鸡只精神明显好转,采食量增加,各试验组病鸡的临床症状有不同程度改善。具体试验结果见表2:
表2治疗大肠杆菌临床试验结果统计表
注:﹡表示感染对照组的自愈率。
生物学统计结果表明:试验药物高、中剂量与恩诺沙星可溶性粉组治愈率均极显著高于阳性对照组自愈率﹝P<0.01﹞;试验药物高、中剂量组的治愈率显著高于恩诺沙星对照药物组(P<0.05);试验药物高、中剂量组的治愈率极显著高于对照药物传统散剂组,差异显著(P<0.01);试验药物低量组的治愈率显著高于对照药物传统散剂组(P<0.05);对照药物传统散剂组治愈率稍高于阳性对照组自愈率,差异不显著(P>0.05)。
本发明药物对鸡大肠杆菌引起的感染的治疗效果较好,优于恩诺沙星、传统散剂。推荐用量及疗程为:混饲,每1kg饲料加本发明中药散剂5g,连用3~5天。
二、对鸡人工感染大肠杆菌病的防治效果
1试验目的
本试验旨在验证该制剂对鸡的大肠杆菌引起的感染预防效果,找出适用剂量和疗程,并对鸡应用该制剂的安全性进行考察。
2试验材料
2.1试验药物实施例1的纯中药散剂。
2.2对照药物金霉素预混剂,批号:20110618,山东明发兽药有限公司生产。
2.3试验动物1日龄健康海兰公雏,按常规饲养管理,自由采食及饮水。
2.4菌种鸡大肠杆菌(O1、O2、O78),购自中国兽医药品监察所
2.5培养基营养琼脂,肉汤培养基,鸡肉汤培养基。
3、试验方法
3.1试验动物及其处理:1日龄海兰公雏,饲养至13日龄时,Ⅰ-Ⅳ组用药48h后人工感染大肠杆菌菌液,继续用药至第7天,Ⅴ组攻毒不用药。各组处理见表3。
表3试验设计
3.2人工感染:Ⅰ—Ⅴ组试验鸡分别肌肉注射大肠杆菌培养液0.3ml(约含2.7×108CFU活菌)。Ⅵ组、Ⅶ组与其它组隔离饲养,各组饲喂同一饲料,自由采食。
3.3临床治疗及疗效观察:Ⅰ-Ⅳ组用药48h后人工感染大肠杆菌菌液,继续用药至第7天。停药后继续观察3天。每天注意观察鸡群的精神、食欲、饮水,攻毒后观察临床症状,剖检病死鸡,确定死因。试验结束时各组鸡分别称重。
3.4结果统计:统计各组死亡率、有效率、治愈率、相对增重,及料肉比。其中死亡率、有效率和治愈率用卡方检验,增重进行t检验。
4、试验结果
4.1人工感染6-8h后,感染组普遍出现发病症状,表现为精神不振、怕冷挤堆、食量明显减少,并且排稀便。但用药组继续用药后,各治疗组的病情很快得到控制,症状明显减轻且逐渐恢复,无一例死亡;阳性对照组鸡只病情继续加重且陆续出现死亡。试验结束后,各组鸡只全部剖检观察病变,确定死因,结果详见表4。
表4预防鸡大肠杆菌病效果统计表
注:﹡表示阳性对照组的自愈率
4.2、各试验组的增重情况统计
于13日龄、20日龄时分别称测鸡只体重,并由此计算平均增重和相对增重率,见表5。
表5应用试验药物对鸡增重的影响
4.3、药物安全性分析
安全试验组的试验鸡精神、食欲正常,试验期间未出现明显的临床症状和病变。试验结果表明5倍量使用该药对鸡安全。
5结果与分析
5.1预防治疗效果生物学统计表明,各用药组与阳性对照组之间差异极显著(P<0.01),试验药物高、中剂量组之间之间差异皆不显著(P>0.05)。试验药物高中剂量组与对照药物组之间差异显著(P<0.05)。
5.2增重效果表5结果表明,试验药物与阳性对照组之间差异显著(P<0.05)表明本发明药物对鸡只有明显的增重效果。
综上所述,该制剂对鸡的大肠杆菌引起的感染有良好的预防效果,并有良好的促生长效果。推荐临床使用剂量:混饲,每1kg饲料加本发明中药散剂2.5g,连用7天。
实施例2:
配比:黄藤300g、马尾连300g、十大功劳300g、龙胆300g、地锦草200g、杨树花200g、郁金200g、火炭母150g、厚朴150g、玄参150g、生地黄150g、香附150g、六神曲100g、麦芽100g、焦山楂100g。
制备方法:
(1)将黄藤粉碎成粗粉,加0.4%硫酸溶液8倍量,浸渍48h后,过滤,收集滤液,药渣再加0.4%硫酸溶液6倍量,浸渍48h后,合并两次滤液,过滤,滤液加食盐约340g,搅匀,室温静置48小时,滤过,70℃干燥,得黄藤素沉淀物85.34g,备用。
(2)取马尾连、郁金、十大功劳、厚朴、香附、火炭母、地锦草、杨树花、龙胆、六神曲、麦芽、焦山楂、玄参、生地黄,加热回流提取2次,第一次加8倍量70%乙醇1h,第二次加5倍量70%乙醇0.5h。合并药液,滤过,回收乙醇,减压浓缩至相对密度为1.25(60℃)的清膏,喷雾干燥,得干粉896.03g,
(3)步骤(2)提取物与上述干燥后的黄藤素提取物合并,加二氧化硅18.63g,粉碎,过五号筛,混匀,得1000g。
测定黄藤素提取物,水分7.4%,含黄藤素(盐酸巴马汀C21H21NO4)87.2%;除黄藤外,其余14味药经提取所得提取物,测得水分5.8%,收率35.8%。
实施例3:
配比:黄藤300g、马尾连300g、十大功劳300g、龙胆300g、地锦草200g、杨树花200g、郁金200g、火炭母150g、厚朴150g、玄参150g、生地黄150g、香附150g、六神曲100g、麦芽100g、焦山楂100g。
制备方法:
(1)将黄藤粉碎成粗粉,加0.5%硫酸溶液5倍量,浸渍24h后,过滤,收集滤液,药渣再加0.5%硫酸溶液4倍量,浸渍24h后,合并两次滤液,过滤,滤液加食盐250g,搅匀,室温静置24小时,滤过,70℃干燥,得黄藤素沉淀物86.07g,备用。
(2)取马尾连、郁金、十大功劳、厚朴、香附、火炭母、地锦草、杨树花、龙胆、六神曲、麦芽、焦山楂、玄参、生地黄,加热回流提取2次,第一次加8倍量75%乙醇1h,第二次加5倍量75%乙醇0.5h。合并药液,滤过,回收乙醇,减压浓缩至相对密度为1.26(60℃)的清膏,喷雾干燥,得干粉894.98g。
(3)步骤(2)提取物与上述黄藤素提取物合并,加二氧化硅18.99g,粉碎,过五号筛,混匀,得1000g。
测定黄藤素提取物,水分7.2%,含黄藤素(盐酸巴马汀C21H21NO4)86.9%;除黄藤外,其余14味药经提取所得提取物,测得水分6.2%,收率35.8%。
实施例4
配比:黄藤150g、马尾连150g、十大功劳150g、龙胆150g、地锦草150g、杨树花100g、郁金100g、火炭母70g、厚朴70g、玄参100g、生地黄100g、香附100g、六神曲70g、麦芽70g、焦山楂70g。
制备方法:同实施例1。
实施例5
配比:黄藤350g、马尾连350g、十大功劳350g、龙胆350g、地锦草350g、杨树花200g、郁金200g、火炭母150g、厚朴150g、玄参200g、生地黄200g、香附200g、六神曲200g、麦芽200g、焦山楂200g。
制备方法同实施例1。