CN113288937B

CN113288937B - 一种抗炎中药复方及其制备方法和应用

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Publication number: CN113288937B
Application number: CN202110735815.4A
Authority: CN
Inventors: 苏军峰; 奉建芳; 覃仕娜; 梁健钦; 李秋燕; 陈子兴; 朱素梅
Original assignee: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGI
Current assignee: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGI
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2041-06-30
Also published as: CN113288937A

Abstract

本发明属于中药复方技术领域，具体涉及一种抗炎中药复方及其制备方法和应用，复方组成包括以下重量份数原料：金果榄5‑15份、岗梅20‑45份、罗汉茶10‑25份、白鹤藤10‑25份，以及加上黄芩6‑18份、连翘10‑25份、南板蓝根10‑25份、山银花10‑25份中2‑4味药材组成的中药复方。本发明提供的抗炎中药复方可明显抑制由二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀程度，明显降低LPS刺激RAW264.7细胞产生的NO、IL‑6和TNF‑α水平。通过实验表明，本发明提供的抗炎中药复方具有显著的抗炎、抑制炎症的作用，疗效确切，安全性高，原料易得，在制备成药物制剂时，可加入药物可接受的载体，通过制剂学的常规技术制备得到不同剂型，可用于制备具有抗炎作用的药物。

Description

一种抗炎中药复方及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于中药复方技术领域，具体涉及一种抗炎中药复方及其制备方法和应用。

背景技术

炎症（inflammation），是生物组织受到某种刺激如外伤、感染等损伤因子的刺激所发生的一种以防御反应为主的基本病理过程。炎症发生在局部，同时也可影响全身，局部表现为变质、充血、渗出和增生三种基本变化，红、肿、热、痛和机能障碍为其五个主要表现。全身可有发热（发烧）、白细胞增多特别是在急性炎症、网状内皮系统细胞增生、实质器官的病变。炎症，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。通常情况下，炎症是有益的，是人体的自动的防御反应，但是有的时候，炎症也是有害的，例如对人体自身组织的攻击、发生在透明组织的炎症等等。

在炎症过程中，以血管系统为中心的一系列局部反应局限并消除损伤因子，同时也促进受损组织的愈合。液体的渗出可稀释毒素，吞噬搬运坏死组织以利于再生和修复，使致病因子局限在炎症部位而不蔓延全身。因此，炎症是以防御为主的天然的局部反应，一般而论，是对机体有利的。但是在有些情况下，炎症又是潜在有害的，炎症反应是一些疾病的发病基础，如严重的超敏反应炎症过于剧烈时可以威胁病人的生命。而且当炎症反应不断被触发，随着时间的推移，会损害机体，引发严重的疾病，如肺损伤、癌症等。此外，特殊部位或器官所发生的炎症可造成严重后果，如脑或脑的炎症可压迫生命中枢，声带炎症阻塞喉部导致窒息，严重的心肌炎可以影响心脏功能。感染和组织损伤等非感染因素能导致机体炎症反应，如果机体免疫功能较强，能够将炎症反应及时局限并清除细菌或者异物。但如果机体免疫功能较差，炎症反应不能局限，则会导致炎症介质失控性释放，从而引起的机体促炎-抗炎失衡的全身性非特异性炎症反应，损伤自身组织。此时，使用抗炎症药物进行抑制炎症反应就非常的有必要。

抗炎类药物在临床上的应用量非常庞大，被广泛应用的抗炎药不但包括非甾体类抗炎药、肾上腺皮质激素，也包括中药。在具有抗炎作用的药物中，化学合成类抗炎药是临床上使用最广泛的一类药物，但其副作用常较严重，主要表现为胃肠道、肝、肾、血液、神经系统等不良反应及过敏反应。因此寻找药效强、副作用小的天然抗炎药一直是新药研发的重要方向。随着研究的深入，中药的抗炎研究成为热点，中草药取自自然，保持了其自然的结构和活性，通过大量研究表明，无论是单味药或中药复方、中草药有效部位和有效成分，均不同程度显示抗炎作用。

中药由于其化学成分复杂，每一个单味中药都含有不同的有效成分，抗炎作用机理也十分复杂，现代医学认为，中草药主要是通过影响下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴、炎症介质、自由基类物质和相关炎症细胞因子这几方面来达到抗炎目的。单味药中有效成分已经十分复杂，由两种或两种以上单味中药组成的中药复方有效成分更加复杂。曹丽娟等通过金铃子散及其单味药对二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型抗炎作用发现，单味中药醋延胡索抗炎作用最显著，金铃子散效果抗炎效果明显优于各单味药。目前，通过对已知中药有效成分进行研究发现，生物碱、多糖和苷类抗炎活性成分显著。中药所含化学成分非常复杂，其中有效成分具有明显生物活性并起一定的医疗作用，在治疗较为复杂的疾病时，通过疾病特点选用多种中药根据病情、治疗方法、药物性能和综合效果的需要配合使用，中药复方不但可以通过各味药之间相互协同增强疗效，也可以相互拮抗降低毒性以适应病情需要。在抗炎方面，中药复方通过多靶点，多途径联合作用发挥抗炎效果，相对西药而言，中药复方具有多成分、多靶点、多途径整体调节的巨大优势。

中药复方药效机制不是将全方所有单味药药效简单叠加在一起的机械组合，而是中药复方有效成分通过不同途径、针对不同靶点来发挥特定的药效，中药复方药效经常容易受到诸多因素的影响，如产地、炮制、品种、煎服法等，但最重要的影响因素即为针对不同病症发挥主要疗效的中药复方有效成分。中药中的化学成分复杂，可变因素很多，配伍中可能存在化学变化，人们主观上是难预见的，各味药之间的协同关系，需要有效成分与实际应用在同一病理模型上测定，才能得出最佳协同关系。

在挖掘新的抗炎中药复方方面，科研人员也一直在不断进行研究，检索到相关的文献如：申请号为202010840293 .X的中国专利公开了一种抗炎中药复方的水提物、其药物组合物与应用，该发明的抗炎中药复方包括以下按质量份计各组分：5～25质量份金牛七、5～25质量份朱砂七、5～25质量份景天三七；该发明所限定的提取得到的水提物和药物组合物可作为慢性前列腺炎的抗炎药物。又如，申请号为200810240527.6的中国专利公开了一种具有镇痛抗炎作用的药物组合物及其制备方法，该发明药物组合物由桑寄生、续断、乌药、当归、月季花、三七等原料药组成，还可在此基础上加入荔枝核、夏枯草、瞿麦等原料药；药理药效实验表明：该发明药物组合物对于盆腔炎有明显的抗炎及改善病理组织学改变的作用；对于急慢性炎症有明显抗炎作用，对于醋酸致小鼠疼痛有显著镇痛作用，且无毒副作用。然而，目前现有的大多数抗炎中药复方都是针对某一病症的炎症进行研发的，应用范围较小。中草药的抗炎作用机制十分复杂，难以具体分类，一种中草药的不同活性成分往往具有不同的作用机制。目前国内外的众多研究机构也开展了很多中草药抗炎的探索，但某些临床疗效远未达到理想水平。因而，在当前情况下，从民族药中筛选出药效强、副作用小的天然抗炎复方，是新药开发的重要途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗炎中药复方及其制备方法和应用，该中药复方内各原料组分能够起到协同抗炎的作用，具有显著的抗炎效果，可应用于制备具有抗炎作用的药物。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

一种抗炎中药复方，由以下重量份数的原料制成：金果榄5-15份；岗梅20-45份；罗汉茶10-25份；白鹤藤10-25份。

进一步的，所述的抗炎中药复方，还包括以下重量份数的原料：黄芩6-18份；连翘10-25份。

或者，所述的抗炎中药复方，还包括以下重量份数的原料：南板蓝根10-25份；连翘10-25份。

或者，所述的抗炎中药复方，还包括以下重量份数的原料：黄芩6-18份；连翘10-25份；南板蓝根10-25份；山银花10-25份。

本发明的中药复方，在制备成药物制剂时，可加入药物可接受的载体，按照制剂学的常规技术制备。其中的中药部分可以采用中药原料药制备得到，也可以通过共同提取中药原料得到，也可以通过其他方式得到，如：通过粉碎、水提、醇提等方法得到中药活性物质、这些中药活性物质可以是浸膏形式的物质，可以是干浸膏也可以是流浸膏，根据制剂的不同需要决定制成不同的浓度。

本发明进一步提供所述的抗炎中药复方的制备方法，包括以下步骤：

（1）按重量份数取各原料药材，用药材8～12倍量体积浓度为50%～70%的乙醇，加热回流提取1～3次，每次提取时间1～2h，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩回收乙醇，干燥成稠膏；

（2）药渣加8～10倍量的水，煎煮1～2h，滤过，滤液浓缩，干燥成稠膏；

（3）两种稠膏混匀，干燥成干膏，粉碎，即得；或者将两种稠膏混匀，干燥成干膏，加入药学上可接受的载体按常规方法制成口服液、片剂、颗粒剂、胶囊剂、缓释剂、滴丸剂、喷雾剂或粉雾剂等。

本发明的另一个目的在于提供所述的抗炎中药复方在制备具有抗炎作用的药物中的应用。

本发明抗炎中药复方所用到的各味中药的药性如下：

金果榄，为防己科植物青牛胆Tinospora sagittata （Oliv）. Gagnep. 或金果榄Tinospora capillipes Gagnep.的干燥块根。性味苦寒，有清热解毒，利咽，止痛之功效。功能主治：清热解毒。治急慢性扁桃体炎，急性咽喉炎，口腔炎，腮腺炎，乳腺炎，阑尾炎，痈疽疔疮，急慢性肠炎，菌痢，胃痛，热嗽失音。各家论述：①《本草再新》："滋阴降火，止渴生津"。②《广西实用中草药新选》：治胃痛，外感高热症，接触性皮炎等。

岗梅，为冬青科植物梅叶llexasprella (Hook.etAm.) Champ. exBenth的根，具有清热解毒，生津，利咽，散瘀止痛之功效，用于流感高热，急性扁桃体炎、咽喉炎、肺脓肿，跌打损伤，疥疮，颈淋巴结核。药理作用：有扩张管状血管、增加冠脉流量和加强心收缩力的作用。各家论述：①《岭南采药录》："清热毒。煎凉茶多用之。又治疥虫"。②《陆川本草》："清凉解毒，生津止泻。治热病口燥渴，热泻，一般喉疾"。③《实用中草药》："治急性扁桃体炎，咽喉炎，肺脓肿，感冒"。

罗汉茶，为胡桃科植物黄杞Engelhardia roxburghiana Wall.的干燥叶，是广西民间用量较大的壮药材，具有清热解毒，生津解渴、解暑利湿的功效，主治脾胃湿滞，胸腹胀闷，感冒发热，疝气腹痛。性状鉴别：偶数羽状复叶，具小叶片6-8片、通常不完整，小叶片多卷曲，展平后呈长椭圆状披针形，或略呈镰刀状弯曲，长6-13cm，宽2-5cm，革质，全缘，上表面褐色或灰绿色，下表面浅灰绿色，主脉突出，侧脉羽状；小叶柄长约0.5cm。质脆，易破碎。

白鹤藤，为旋花科植物白鹤藤Argyreia acuta Lour.的茎叶。具有祛风除湿，化痰止咳，散瘀止血，解毒消痈的功效。主治风湿痹痛，水肿，臌胀，咳喘痰多，带下，崩漏，内伤吐血，跌打积瘀，乳痈，疮疖，烂脚，湿疹。相关论述：①《广西民间常用草药手册》：“理血，祛风，除湿。治跌打损伤，内外伤出血及妇女血崩，白带。”②《全国中草药汇编》：“祛风利尿，化痰止咳，止血活络，拔毒生肌。主治肾炎水肿，肝硬化腹水，风湿疼痛，内伤吐血，急慢性支气管炎，外用治乳脉炎，疮疖脓肿，湿疹”。

黄芩，为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，性味苦，寒。归经：归肺、胆、脾、大肠、小肠经。功能主治：清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎。用于湿温、暑温胸闷呕恶，湿热痞满，泻痢，黄疸，肺热咳嗽，高热烦渴，血热吐衄，痈肿疮毒，胎动不安。相关论述：①《神农本草经》：“主诸热黄疸，肠澼泄痢，逐水，下血闭，恶疮疽蚀火疡。”②《滇南本草》：“上行泻肺火，下行泻膀胧火，男子五淋，女子暴崩，调经清热，胎有火热不安，清胎热，除六经实火实热” 。

连翘，中药名为木樨科连翘属植物连翘Forsytniasuspensa（Thunb.）Vahl的干燥果实。具有清热解毒，消肿散结，疏散风热的功效，主治疮痈肿毒，瘰疬痰核，风热外感，温病初起，热淋涩痛。药理作用：连翘有广谱抗菌作用，抗菌主要成分为连翘酚及挥发油，对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌有很强的抑制作用，对其他致病菌、流感病毒以及钩端螺旋体也均有一定的抑制作用。相关论述：①《神农本草经》：“主寒热，鼠瘘、瘰疬、痈肿、恶疮、瘿瘤、结热、蛊毒。”②《珍珠囊》：“连翘之用有三：泻心经客热，一也；去上焦诸热，二也，为疮家圣药，三也” 。

南板蓝根，为爵床科植物马蓝Baphicacanthus cusia（Nees）Bremek. 的干燥根茎及根。味苦，性寒。归心经、胃经。功能主治：清热解毒；凉血消肿。主温毒发斑；高热头痛；大头瘟疫；丹毒；痄腮；病毒性肝炎；流行性感冒；肺炎；疮肿；疱疹。药理研究表明，水煎剂具一定的抑菌作用，体外对病毒增殖有抑制作用，还具解热、抗炎作用。临床应用：用于温毒发斑,高热头痛及大头瘟等证；治温毒发斑，高热头痛，常配大青叶、生石膏、黄芩等药，以清热解毒，凉血化斑。

山银花，中药材名，为忍冬科植物灰毡毛忍冬Loniceramacranthoides Hand.-Mazz．、红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、华南忍冬Lonicera confusa DC.或黄褐毛忍冬Lonicera fulvotometosa HsuetS．C．Cheng的干燥花蕾或带初开的花。清热解毒，疏散风热。主治痈肿疗疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热。药理作用：①抗病原微生物作用灰毡毛忍冬、华南忍冬提取物在体外对多种致病性细菌有不同程度的抑制作用，如金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、青霉菌、黄曲霉菌等；②保肝、利胆作用黄褐毛忍冬中的三萜皂苷对小鼠各种化学性肝损伤有明显的保护作用。另外，还有解热和抗氧化等作用。

本发明的有益效果为：

1、本发明提供的抗炎中药复方的高低剂量组有类似地塞米松的抗炎效果，该抗炎中药复方的两种不同剂量浓度均可明显抑制由二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀程度，说明本发明的抗炎中药复方具有良好的抗炎作用。

2、本发明抗炎中药复方组能够明显抑制由LPS引起的细胞炎症形态的改变，表明本发明的抗炎中药复方具有明显的抑制炎症的作用。

3、本发明抗炎中药复方含药血清对细胞NO、IL-6和TNF-α分泌量的影响试验结果显示：模型组细胞生成的NO、IL-6和TNF-α水平明显高于正常组，提示LPS刺激可模拟RAW264.7细胞的炎症反应。与模型组比较，本发明4个不同的抗炎中药复方高低剂量组对细胞产生的NO、IL-6和TNF-α水平均具有显著的抑制作用（P<0.01）。

4、通过实验表明，本发明提供的抗炎中药复方具有显著的抗炎、抑制炎症的作用效果，该中药复方内各原料组分能够起到协同抗炎的作用，疗效确切，安全性高，原料易得，可在制备具有抗炎作用的药物中进行应用。

附图说明

图1为不同浓度LPS对RAW264.7细胞NO分泌量的影响图；

图2为不同剂量的抗炎中药复方（F1、F2、F3、F4）含药血清对RAW264.7细胞活性的影响图；

图3为不同剂量的地塞米松对RAW264.7细胞活性的影响图；

图4为LPS诱导24 h后RAW264.7细胞形态图。

具体实施方式

实施例1

一种抗炎中药复方，由以下重量份数的原料制成：金果榄5份；岗梅20份；罗汉茶10份；白鹤藤10份。

所述的抗炎中药复方的制备方法，包括以下步骤：

（1）按重量份数取各原料药材，用药材8倍量体积浓度为50%的乙醇，加热回流提取3次，每次提取时间1h，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩回收乙醇，干燥成稠膏；

（2）药渣加8倍量的水，煎煮1h，滤过，滤液浓缩，干燥成稠膏；

（3）两种稠膏混匀，干燥成干膏，粉碎，即得。

实施例2

一种抗炎中药复方，由以下重量份数的原料制成：金果榄10份；岗梅30份；罗汉茶18份；白鹤藤18份；黄芩12份；连翘18份。

所述的抗炎中药复方的制备方法，包括以下步骤：

（1）按重量份数取各原料药材，用药材10倍量体积浓度为60%的乙醇，加热回流提取2次，每次提取时间1.5h，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩回收乙醇，干燥成稠膏；

（2）药渣加9倍量的水，煎煮1.5h，滤过，滤液浓缩，干燥成稠膏；

（3）两种稠膏混匀，干燥成干膏，加入药学上可接受的载体按常规方法制成片剂。

实施例3

一种抗炎中药复方，由以下重量份数的原料制成：金果榄12份；岗梅38份；罗汉茶22份；白鹤藤22份；南板蓝根23份；连翘23份。

所述的抗炎中药复方的制备方法，包括以下步骤：

（1）按重量份数取各原料药材，用药材11倍量体积浓度为65%的乙醇，加热回流提取2次，每次提取时间1.5h，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩回收乙醇，干燥成稠膏；

（2）药渣加10倍量的水，煎煮2h，滤过，滤液浓缩，干燥成稠膏；

（3）两种稠膏混匀，干燥成干膏，加入药学上可接受的载体按常规方法制成颗粒剂。

实施例4

一种抗炎中药复方，由以下重量份数的原料制成：金果榄15份；岗梅45份；罗汉茶25份；白鹤藤25份；黄芩18份；连翘25份；南板蓝根25份；山银花25份。

所述的抗炎中药复方的制备方法，包括以下步骤：

（1）按重量份数取各原料药材，用药材12倍量体积浓度为70%的乙醇，加热回流提取1次，每次提取时间2h，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩回收乙醇，干燥成稠膏；

（3）两种稠膏混匀，干燥成干膏，加入药学上可接受的载体按常规方法制成胶囊剂。

实施例5

一种抗炎中药复方，由以下重量份数的原料制成：金果榄9份；岗梅30份；罗汉茶15份；白鹤藤15份；黄芩10份；连翘15份；南板蓝根15份；山银花15份。

所述的抗炎中药复方的制备方法，包括以下步骤：

（3）两种稠膏混匀，干燥成干膏，加入药学上可接受的载体按常规方法制成口服液或滴丸剂。

实施例6

本发明抗炎中药复方的抗炎作用评价。

1 实验材料、仪器

1.1实验材料

金果榄（批号：Y20102609）、罗汉茶（批号：Y20102602）、岗梅（批号：Y20102601）、白鹤藤（批号：Y20102603）、黄芩（批号：Y20102604）、连翘（批号：Y20102608）、南板蓝根（批号：Y20102605）、山银花（批号：Y20102607）均为饮片，购自南宁市万药堂药业有限公司；1×PBS、DMEM培养基、胎牛血清均购自Biological Industries公司，批号：2053260；RAW 264.7细胞株（SCSP-5036，中国科学院上海生命科学研究院）；昆明小鼠（SYXK(桂）2019-0001，湖南斯莱克景达实验动物有限公司）；醋酸地塞米松片（浙江仙琚制药股份有限公司，批号：200419）；噻唑蓝（MTT，北京索莱宝科技有限公司）；脂多糖（LPS，北京索莱宝科技有限公司，批号：713A032）；小鼠白介素（IL-6）酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：1643EKS686）；小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附测定试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：K52V8YIWX6）；二甲基亚砜（DMSO，细胞培养级，北京索莱宝科技有限公司）；乙醇消毒液（广西北仑河医科工业集团有限公司）。

1.2 实验仪器与耗材

电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司），酶标仪（TECAN Austria GmbH公司），二氧化碳培养箱（日本松下健康医疗器械株式会社），台式离心机（四川蜀科仪器有限公司），倒置显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司），移液枪枪头（Corning公司），96孔细胞培养板（Corning公司），细胞培养瓶（Corning公司），吉尔森P型移液器(Pipetman)（北京博仪兴业科技公司），血球计数板（上海市求精生化试剂仪器有限公司），显微镜盖玻片（江苏世泰实验器材有限公司）。

2 方法

2.1抗炎中药复方的制备

抗炎中药复方由金果榄9g、岗梅30g、罗汉茶15g、白鹤藤15g、黄芩10g、连翘15g、南板蓝根15g、山银花15g组合而成4个复方，用字母（F₁、F₂、F₃、F₄表示），其中F₁：金果榄、岗梅、罗汉茶、白鹤藤；F₂：金果榄、岗梅、罗汉茶、白鹤藤、黄芩、连翘；F₃：金果榄、岗梅、罗汉茶、白鹤藤、南板蓝根、连翘；F₄：金果榄、岗梅、罗汉茶、白鹤藤、黄芩、连翘、南板蓝根、山银花。

制法：取上述4个处方药材，分别置于2L的圆底烧瓶中，加入10倍量60%乙醇，加热回流提取1次，提取时间1.5h，滤过，滤液减压浓缩回收乙醇，干燥成稠膏。药渣加10倍水，煎煮1.5h，滤过，滤液浓缩，干燥成稠膏。两种稠膏混匀，干燥成干膏，粉碎，即得。

2.2动物

昆明种小鼠，体重 18~22g，雌雄各半。实验前置动物于本校动物房适应环境3天，室温20～25℃，标准颗粒饲料喂食，自由饮用纯水，实验前小鼠禁食不禁水12 h。

2.2.1动物分组、造模与给药

将100只小鼠随机分为10组，每组10只，雌雄各半，分为模型组（生理盐水）、阳性对照组（地塞米松片，0.1g/kg）和抗炎中药复方（F₁、F₂、F₃、F₄）高低剂量组（均以生药量计，根据人与小鼠等效剂量系数换算，其中高剂量为临床等效剂量的2倍，即F1高低剂量3.16g/kg、1.58g/kg，F2高低剂量6.947g/kg、3.47g/kg，F3高低剂量5.12g/kg、2.56g/kg，F4高低剂量10.74g/kg、5.37g/kg，灌胃体积0.2mL/10g）。每天灌胃给药1次（临用时均用水制成相应药液），连续给药7d。末次（第7d）灌胃给药30min后，取20µL二甲苯涂布于各组小鼠右耳的前后两面以复制炎症模型，并以其左耳作为空白对照。

2.2.2耳肿胀度

造模30min后颈椎脱臼处死动物，割下双耳，用直径为8mm的打孔器在小鼠左、右耳对称部位打下圆耳片，使用十万分之一分析天平精密称定质量，并计算耳肿胀度和肿胀抑制率。（耳肿胀度＝右圆耳片质量－左圆耳片质量，肿胀抑制率＝［（模型组耳平均肿胀度－给药组耳平均肿胀度）/模型组耳平均肿胀度］×100%）。

2.3细胞实验

2.3.1抗炎中药复方含药血清的制备

将45只小鼠随机分为9组，每组5只，雌雄各半，分为阳性对照组（地塞米松片，0.1g/kg）和抗炎中药复方（F₁、F₂、F₃、F₄）高低剂量组（剂量同上述动物实验），每天灌胃给药1次（临用时均用水制成相应药液），连续给药7d。末次（第7d）灌胃给药1h后，各组小鼠摘眼球取血，以 13000 r/min 离心后取上层血清，-80℃冰箱保存，备用。

2.3.2细胞实验前准备

（1）含药血清浓度的配制

将含药血清加入适量DMEM培养基稀释至所需浓度。

（2）细胞完全培养基的配制

比例为90%DMEM高糖培养基 +10%胎牛血清的细胞完全培养基。

（3）细胞冻存液的配制

比例为10%DMSO +10%胎牛血清+90%DMEM高糖培养基的细胞冻存液。

（4）LPS溶液的配制

取2mg LPS粉末，在生物安全柜内加1mL PBS溶解，配制成母液浓度为2mg/ml的LPS储存液，0.22μm微孔滤器过滤后分装，-20℃避光保存。

（5）MTT溶液的配制

取50mgMTT粉末，在生物安全柜内加10mL PBS溶解，配制成母液浓度为5mg/ml的MTT储存液，0.22μm微孔滤器过滤后分装，-20℃避光保存。

（6）Griess试剂的配制

Griess Ⅰ液：取100mg对氨基苯磺酰胺，避光加入10mL 5% H3PO4溶液，使其完全溶解。

Griess Ⅱ液：取10mg N-1-萘乙二胺盐酸盐，避光加入10mL PBS，使其完全溶解。

2.3.3细胞复苏

（1）将实验所需的不同规格移液枪枪头、离心管进行高压灭菌，待烘干后放入生物安全柜中，打开紫外线灯，照射30min。

（2）把RAW264.7细胞冻存管从液氮罐（-80℃）中取出，放入提前预热好的37℃水浴锅中，使之迅速解冻。（RAW264.7细胞状态在十代以内细胞活性较好）

（3）在生物安全柜中，将细胞融解液吸到新的离心管内，加3ml含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，吹打混匀，离心，弃上清，然后加入适量完全培养基轻轻吹打，用移液枪将细胞悬液吸取至15ml培养瓶中，轻轻摇晃培养瓶并吹打混匀，放入37℃、5% CO₂培养箱中培养。

2.3.4 RAW264.7细胞培养及传代

（1）将培养瓶中的RAW264.7细胞置于显微镜下，观察细胞状态，细胞呈球状且透亮，贴壁生长，培养瓶表面喷洒酒精后放入超净操作台中，吸出培养瓶内的培养基，加入PBS轻轻洗涤细胞3次，洗去细胞代谢产物与培养基。

（2）使用细胞刮轻轻刮培养瓶壁，使细胞完全脱落，移至离心管，离心5min，1000rpm。

（3）细胞离心后，弃去上清，加入3ml含10%胎牛血清的DMEM完全培养基吹打，传入新的培养瓶中（一传三），轻轻晃动培养皿使细胞均匀分布，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。

（4）当细胞生长至80%~90%左右，可以传代，一般培养36h后即可传代。

2.3.5细胞的冻存

（1）从培养箱中取出RAW264.7细胞，用PBS清洗3次，使用细胞刮轻轻刮培养瓶壁，使细胞完全脱落，移至离心管，封口膜封口，1000rpm/min室温离心5min，离心后弃去上清液，用细胞冻存液轻轻吹打细胞。

（2）每只冻存管中加入1mL混悬液，盖好瓶盖，做好标记（细胞名称，代数，日期，冻存人信息）。放入程序降温盒中，-80℃冰箱放置12h后，转至液氮罐内。

2.3.6细胞计数

（1）视待测细胞混悬浓度，加DMEM培养基适当稀释以每小格的细胞数可数为度。

（2）取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

（3）将细胞混悬液摇匀，用移液枪吸取1uL细胞混悬液，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘打入，让细胞混悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余混悬液。

（4）静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将细胞计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。

（5）计数区是由16个大方格组成，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个大方格（即100小格）的菌数。计数原则：只计完整细胞，聚集成团的细胞按一个细胞计算，压线细胞按照“数上不数下、数左不数右”的原则计数。

细胞悬液中的细胞密度按下列式子进行计算：

细胞数/mL=（4个大正方格的细胞总数/4）×10⁴×细胞悬液稀释倍数

（6）测数完毕，取下盖玻片，用水将细胞计数板冲洗干净，洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒内保存。

2.3.7 MTT法检测药物的细胞毒性

取对数生长期的RAW264.7细胞以1×10⁵/mL的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μL。转移至37℃，5%CO₂培养箱中培养24h，弃去旧培养基。给药组为8个抗炎中药复方（F₁、F₂、F₃、F₄高低剂量组的含药血清），每孔加入100μL的含药血清DMEM培养基，空白对照组每孔加入100μL的10%胎牛血清DMEM培养基。每组设立6个复孔，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养24h后，取出，加入20μL MTT，再放回37℃，5%CO2培养箱中培养4h，然后吸出培养基与MTT，每孔加入DMSO 150μL，避光振摇10分钟，于酶标仪490nm处测OD值。计算细胞存活率：存活率(%) =（给药组OD值/对照组OD值）×100%。

2.3.8 Griess试剂法检测RAW264.7细胞中NO的分泌量

取对数生长期的RAW264.7细胞以5×10⁵/mL的细胞密度接种于96孔板中，每孔100μL。放置在培养箱条件为37℃，5%CO₂中培养24h，弃去旧培养液，给药组和阳性药组每孔均加入100μL含药血清DMEM培养基，模型组每孔加入100μLDMEM完全培养基，空白对照组每孔加入200μL的DMEM完全培养基。放置细胞培养箱中培养1h，取出。除空白对照组外，每孔加入100μL LPS溶液。放置在37℃，5%CO₂培养箱中培养24h。24小时后，取出96孔板于显微镜下观察细胞状态。然后每孔吸取100μL上清液移至新的96孔板中，加入Griess Ⅰ液50μL，放置到细胞培养箱中培养10min，取出，再加入Griess Ⅱ液50μL，至培养箱中培养10min，取出，摇床振摇5min，于酶标仪550nm波长处测定其OD值。

2.3.9 ELISA法检测RAW264.7细胞分泌IL-6、TNF-α 水平

取对数生长期的RAW264.7细胞接种在96孔板中，细胞种板密度为5×10⁵/mL，每孔加100μL细胞悬液。至细胞培养箱中培养24h，取出，弃去旧培养基。给药组和阳性药组每孔均加入100μL含药血清DMEM培养基，模型组每孔加入100μLDMEM完全培养基，空白对照组每孔加入200μL的DMEM完全培养基。放置细胞培养箱中培养1h，取出。除空白对照组外，每孔加入100μL LPS溶液。放置在37℃，5%CO₂培养箱中培养24h。吸取各孔上清液至1.5mLEP管中，离心机4℃，13000rpm/min的转速离心10min，取上清液至新的EP管中，按照ELISA试剂盒说明操作。

2.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 21.0进行统计分析，计量资料以“均数±标准差”（

±s）表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1抗炎中药复方对小鼠耳廓肿胀度的影响

由表1所示，阳性对照组地塞米松与模型组生理盐水的小鼠耳廓肿胀度分别为3.84 ±1.29 和11.18 ±1.28，地塞米松组的小鼠耳廓肿胀度低于生理盐水组，并且有极显著性差异( P＜0. 01)，说明地塞米松具有明显的抗炎效果。抗炎中药复方F₁、F₂、F₃、F₄的高低剂量组耳肿胀度与生理盐水组相比显著减小，有极显著性差异（P＜0.01），说明该抗炎中药复方的两种不同剂量浓度均可明显抑制由二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀程度。抗炎中药复方组与地塞米松组对比，F₁和F₃低剂量组耳肿胀度具有较显著差异（P＜0.05）。综述所述，均表明抗炎中药复方具有明显的抗炎作用。

3.2 LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的作用浓度筛选

测定8种浓度的LPS对RAW264.7细胞NO分泌量的影响，LPS的8种实验浓度依次为0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.8μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，作用时间均为24h，结果见附图1。与空白组5.34μmol/L的 NO 分泌量相比，8种浓度的LPS均能显著促进细胞的NO分泌量（P＜0.01）。在1μg/m L处细胞的NO分泌量达到最高，为93.96μmol/L，在2-10μg/mL内，细胞的NO分泌量呈下降趋势。为使LPS高效诱导RAW264.7细胞构建体外炎症模型，选取对细胞无毒性且对其NO分泌量影响最大的1μg/m L作为构建炎症模型的LPS刺激浓度，这也是体内外抗炎研究中常用的浓度LPS。

3.3药物对RAW264.7细胞毒性的影响

3.3.1 MTT比色法测定

采用MTT比色法检测不同剂量浓度的抗炎中药复方（F₁、F₂、F₃、F₄）含药血清、阳性对照药地塞米松对RAW264.7细胞活性的影响，结果见附图2、附图3显示。抗炎中药复方含药血清F₁、F₂、F₃、F₄高低剂量组，与空白对照组（细胞存活率为100%）相比，均显示没有细胞毒性，细胞存活率在97.81%-111.63%之间。阳性对照药地塞米松在浓度5~80μM时与空白对照组无差异，说明在该浓度范围内地塞米松无细胞毒性。

3.3.2细胞形态变化

正常细胞培养24 h后镜下观察，可见贴壁细胞胞体较小，呈圆形或椭圆形，少量细胞可见伪足或突起，单核，呈明显的RAW264.7细胞形态（见附图4空白组对照组）。LPS诱导24h后镜下观察，造模组RAW264.7细胞呈梭形或长梭形改变，大量细胞呈现伪足或突起，胞体内可见吞噬小泡呈炎症反应变化（见附图4模型组），而给药组能够明显抑制细胞形态的改变，只有少部分细胞呈长梭形（见附图4给药组），表明抗炎中药复方具有明显的抑制炎症的作用。

3.4 抗炎中药复方含药血清对细胞NO、IL-6和TNF-α分泌量的影响

结果显示（表2），模型组细胞生成的NO、IL-6和TNF-α水平明显高于正常组，提示LPS刺激可模拟RAW264.7细胞的炎症反应。与模型组比较，F₁、F₂、F₃、F₄高低剂量组对细胞产生的NO、IL-6和TNF-α水平均具有显著的抑制作用（P<0.01）。与地塞米松组相比，F₁、F₂、F₃、F₄高低剂量组对细胞产生的NO水平具有显著的抑制作用（P<0.01）；F₁高剂量组、F₂低剂量组和F₄低剂量组对细胞产生的IL-6水平具有较显著的抑制作用（P<0.05）；F₂高低剂量组和F₄低剂量组对细胞产生的TNF-α水平具有较显著的抑制作用（P<0.05）。综上所述，表明抗炎中药复方具有明显的抗炎效果。

Claims

1.一种抗炎中药复方，其特征在于，由以下重量份数的原料制成：金果榄5-15份；岗梅20-45份；罗汉茶10-25份；白鹤藤10-25份。

2.根据权利要求书1所述的抗炎中药复方，其特征在于，还包括以下重量份数的原料：黄芩6-18份；连翘10-25份。

3.根据权利要求书1所述的抗炎中药复方，其特征在于，还包括以下重量份数的原料：南板蓝根10-25份；连翘10-25份。

4.根据权利要求书1所述的抗炎中药复方，其特征在于，还包括以下重量份数的原料：黄芩6-18份；连翘10-25份；南板蓝根10-25份；山银花10-25份。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的抗炎中药复方的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）两种稠膏混匀，干燥成干膏，粉碎，即得；或者将两种稠膏混匀，干燥成干膏，加入药学上可接受的载体按常规方法制成口服液、片剂、颗粒剂、胶囊剂、缓释剂、滴丸剂、喷雾剂或粉雾剂。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的抗炎中药复方在制备具有抗炎作用的药物中的应用。