CN104524453B - 可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂及其应用 - Google Patents

可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂，其活性成分是由乳酸菌发酵以下按照质量百分比的原料配方得到的培养物：复合中草药77.7‑97.7％，麸皮0‑20％，硫酸铵1.3％，葡萄糖1.0％；所述复合中草药是由紫茎泽兰脱毒草粉、白术、茯苓、苦地丁、黄柏、莪术按质量比5:1:1:1:1:1混合而成。本发明还公开了该发酵中草药制剂的制备方法。本发明制备的发酵中草药制剂，既可以通过益生菌联合中草药防治肉鸡大肠杆菌腹泻，替代抗生素的功效，又可以发挥微生态制剂的益生效果，纯天然、无毒害、无药残、无异味、适口性好，使用安全方便。

Description

可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂及其应用。
背景技术
随着饲料工业的快速发展，抗生素等饲料添加剂所产生的耐药性和残留已经引起了科技工作者和消费者的关注和忧虑。分析欧盟提出的兽药残留控制目录可以发现，涉及的兽药主要是抗生素、化学合成药和激素类等。就此，欧盟1999年立法禁止使用除黄霉素、阿维拉霉素、莫能菌素和杆菌清之外的所有抗菌性和抗球虫药饲料添加剂。我国是世界第二大饲料生产大国，但随着人们物质生活水平的提高及科学技术的不断发展，饲料安全问题逐渐受到人们的广泛关注，尤其是在饲料添加剂的使用方面更为突出。目前抗生素、磺胺类和激素类药物饲料添加剂的应用较为普遍，这些添加剂的使用极易造成畜禽产品中药物残留，耐药性，更为严重的是对人体的“三致”(致癌、致畸、致突变)作用。无公害、安全、绿色畜产品已成为现代畜牧业发展的方向，中草药和微生态制剂作为饲料添加剂的两大类，具有纯天然、无毒害、无药残、安全方便、功能全面等优点已成为国内外开展此项研究的热点。
肉鸡在长期进化过程中，消化道内的微生物与宿主形成了稳定的共生关系，可保持肉鸡体内的微生态平衡。但随着肉鸡养殖规模的逐渐扩大，集约式的饲养模式和抗生素等预防药物的滥用，极大的影响了肉鸡体内的微生态平衡，导致肉鸡生产性能和免疫性能的下降，影响了肉鸡的品质。其中，鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一种常见多发病。该病可以在各种日龄鸡群中发病，会严重影响肉鸡的生长发育，给养鸡业造成很大的损失。
大肠杆菌的血清型较多，使用疫苗防治往往效果不佳，抗生素防治如前所述，又会产生耐药性和残留。因此，开发一种新型的纯天然、无毒害、无药残、安全方便的用于预防肉鸡大肠杆菌感染的饲料添加剂是目前研究的热点和难点。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂，既可以发挥中药替代饲用抗生素的功能，又可以发挥微生态制剂的益生效果。该发酵中草药制剂纯天然、无毒害、无药残、无异味，适口性好，使用安全方便。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂，其活性成分是由乳酸菌发酵以下按照质量百分比的原料配方得到的培养物：
复合中草药77.7-97.7％，麸皮0-20％，硫酸铵1.3％，葡萄糖1.0％；
所述复合中草药是由紫茎泽兰脱毒草粉、白术、茯苓、苦地丁、黄柏、莪术按质量比5:1:1:1:1:1混合而成。
优选的，该发酵中草药制剂的活性成分是由乳酸菌发酵以下按照质量百分比的原料配方得到的培养物：
复合中草药(紫茎泽兰脱毒草粉、白术、茯苓、苦地丁、黄柏、莪术按质量比5:1:1:1:1:1混合)87.7％，麸皮10％，硫酸铵1.3％，葡萄糖1.0％。
供发酵的乳酸菌选自罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或戊糖片球菌；优选为植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或戊糖片球菌；更优选的为鼠李糖乳杆菌。
该用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取配方中的原料，加入1-1.5倍量(g/mL)的水，搅拌均匀；
(2)取供发酵的乳酸菌菌粉接种至乳酸菌斜面培养基上，在35-38℃静置培养20-26h，接种斜面种子至乳酸菌液体培养基中，在35-38℃静置培养20-26h；然后按照体积百分数3％-6％接种到步骤(1)的加水混匀后的原料中，在35-38℃发酵44-50h后自然晾干，得发酵培养物；
(3)向步骤(2)的发酵培养物中加入枯草芽孢杆菌喷干粉，枯草芽孢杆菌喷干粉终浓度为1.0×108–3.0×108cfu/g，混合均匀，制粒，即得。
步骤(1)中，优选的，向原料中加入1.2倍量(g/mL)的水。
步骤(2)中，优选的，将乳酸菌菌粉接种到斜面培养基后，37℃静置培养24h，接种斜面种子至乳酸菌液体培养基中，37℃静置培养24h；然后按照体积百分数4％接种到步骤(1)的加水混匀后的原料中，在37℃发酵48小时后自然晾干，得发酵培养物；
步骤(3)中，优选的，枯草芽孢杆菌喷干粉终浓度为2.0×108cfu/g。
本发明的发酵中草药制剂是一种复合中草药微生态制剂，既可以通过乳酸菌联合中草药防治肉鸡大肠杆菌腹泻，替代抗生素的功效，又可以发挥微生态制剂的益生效果，纯天然、无毒害、无药残、无异味、适口性好，使用安全方便。
复合中草药中，白术味苦、甘，性温，主要化学成分为葎草烯、β-榄香醇、α-姜黄烯、苍术酮等，对伤寒杆菌、甲型副伤寒杆菌、福氏痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等均有不同程度的抑菌作用。
茯苓，味甘、淡，性平，主要化学成分为多糖、三萜、脂肪酸、甾醇类化合物，其中茯苓多糖具有增强免疫系统的作用，既增强细胞免疫，又增强体液免疫，能显著提高机体巨噬细胞的吞噬能力。
苦地丁，味苦，为罂粟科植物紫堇的干燥全草，含有多种生物碱，具有抗菌活性，对甲型链球菌、肺炎球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌均有抑制作用。
黄柏，苦，寒，含有小檗碱、药根碱、木兰花碱、黄柏碱等多种生物碱，具有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮之功效。
莪术，味辛、苦，性温，其主要化学成分为莪术呋喃烯酮、龙脑、姜黄烯、莪术二酮等，还含有抗氧化剂活性的姜黄素类化合物，具有抗菌、消炎的作用，对胃肠平滑肌也具有一定的影响。
紫茎泽兰为多年生草本或亚灌木，是植物界里的“杀手”，所到之处寸草不生，对环境的适应性极强。紫茎泽兰经脱毒后制备的脱毒草粉富含植物蛋白，可用于制作成草粉饲料，将紫茎泽兰变废为宝。
本发明的复合中草药组方，是发明人经过长期实验得出的经验方，其以紫茎泽兰脱毒草粉为主，辅以白术、茯苓、苦地丁、黄柏和莪术，各组分相互配伍，共同起到免疫增强的作用。在肉鸡饲料中作为添加剂，具有促长、诱食、增强免疫、改善肉鸡品质的功效。
本发明的复合中草药经乳酸菌发酵后，将中药成分由大分子转化为小分子，更利于有机体的吸收，提高了药物的药效；发酵过程中还会将中药中的有毒物质分解，并且能显著改善中药的口味，提高了其适口性。通过发酵将其制成微生态制剂，达到改善黏膜表面微生物或酶的平衡，或者刺激特异性或非特异性免疫机制的作用。在禽类生产上主要用来提前预防疾病和作为饲料添加剂使用。具有调节动物肠道内微生态平衡、促进动物生长、增强机体抗病能力。
本发明的有益效果：
本发明的发酵中草药制剂通过调节肠道菌群平衡，刺激免疫球蛋白sIgA和IgG分泌，同时促进T细胞介导因子IL-2和炎性因子IL-6的分泌，提高机体免疫力，有效防治肉鸡大肠杆菌引起的腹泻，减少死亡率，达到与杆菌清类抗生素防治大肠杆菌腹泻同样的效果。同时，该发酵中草药制剂能够明显促进肉鸡后期的育肥和生长，与杆菌清相比更加安全、绿色、高效、无残留。
附图说明
图1为实施例2中草药安全性试验中各组小鼠脏器解剖图；
图2为实施例3发酵中草药制剂对白羽肉鸡的抗感染效果试验中攻毒大肠杆菌后各组鸡只粪便情况。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：发酵中草药制剂的制备
1 材料与方法
1.1 复合中草药发酵前后抑菌性能的检测
1.1.1 材料
供试菌株：罗伊氏乳杆菌(商品名称：罗伊氏乳杆菌菌粉；商品号：2014061401；生产厂家：山东宝来利来生物工程股份有限公司)；植物乳杆菌LP(已于2010年06月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC M 2010150，记载在中国专利申请CN201010240725.X中)；鼠李糖乳杆菌(商品名称：鼠李糖乳杆菌菌粉；商品号：2014091203；生产厂家：山东宝来利来生物工程股份有限公司)；戊糖片球菌(已于2012年02月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2012029，记载在中国专利申请CN201210082246.9中)；枯草芽孢杆菌B7348(已于2010年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2010260，记载在中国专利申请CN201010589074.5中)；指示菌为鸡大肠杆菌O1，为山东农业大学惠赠的菌株。紫茎泽兰脱毒草粉购自昆明科宝饲料科技有限公司。
培养基(按质量百分比计)：
乳酸菌斜面培养基：葡萄糖2％、柠檬酸铵0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、吐温-80 0.1％、琼脂1.5％、pH为6.5。
大肠杆菌液体培养基：蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、牛肉膏0.3％、pH为7.2-7.4；
大肠杆菌固体培养基(1.5％或0.8％的琼脂)：1.5％或0.8％的琼脂、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、牛肉膏0.3％、pH为7.2-7.4；
乳酸菌液体培养基：葡萄糖2％、柠檬酸铵0.2％、乙酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.5％、硫酸锰0.02％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、吐温-80 0.1％、pH为6.0。1.1.2抑菌样品的制备：各中药磨粉后，准确称取复合中草药(紫茎泽兰脱毒草粉、白术、茯苓、苦地丁、黄柏、莪术按质量比5:1:1:1:1:1混合)10g，溶于100mL蒸馏水中，盛放于250mL三角瓶中，121℃灭菌30min。待凉后按4％接种量(体积比)接种活化后的乳酸菌液，37℃静置培养30h，发酵液3000rpm离心3min得到上清液备用，并设未发酵中药为对照。
指示菌的制备：接种鸡大肠杆菌O1斜面种子至100mL大肠杆菌液体培养基中，37℃振荡培养过夜，得到大肠杆菌菌悬液备用。
1.1.3 体外抑菌实验(牛津杯法)
吸取15mL50℃左右的大肠杆菌固体培养基(1.5％的琼脂)倒入灭菌培养皿中，使其在平皿的底部均匀分布、凝固，作为底层，吸取指示菌液500μL加入下层已凝固的平皿中，同时加入5mL、50℃左右上层大肠杆菌固体培养基(0.8％的琼脂)，充分摇匀，作为菌层。在每个平板上放置已灭菌的牛津杯(直径为8mm)5个，稍微下压，使其与平板培养基无缝隙。取发酵上清液280μL加入到牛津杯中，静置5-10min，放入37℃培养箱中过夜，次日测量抑菌圈大小并记录。抑菌圈直径大于20mm为极敏，抑菌圈直径15～20mm为高敏，抑菌圈直径为10～15mm为中敏，抑菌圈直径小于10mm为低敏，无抑菌圈的为不敏感。
1.2 供发酵菌株的筛选
原料配方(是按质量百分比计)：
一、复合中草药(紫茎泽兰脱毒草粉、白术、茯苓、苦地丁、黄柏、莪术按质量比5:1:1:1:1:1混合)97.7％、硫酸铵1.3％、葡萄糖1％；
二、复合中草药(紫茎泽兰脱毒草粉、白术、茯苓、苦地丁、黄柏、莪术按质量比5:1:1:1:1:1混合)60％、麸皮37.7％、硫酸铵1.3％、葡萄糖1％。
按配方称取各组分，混合均匀，并加入水，搅拌均匀，料水比1:1.2(g/mL)，将植物乳杆菌菌粉、戊糖片球菌菌粉和鼠李糖乳杆菌菌粉分别接种乳酸菌斜面培养基，37℃静置培养24h，分别接种斜面种子至乳酸菌液体培养基中，37℃静置培养24h，然后按照4％接种量接种发酵。对上述配方进行生料发酵48小时，测定气味、pH及活菌数。
1.3 用于发酵的原料配方的改良
综合考虑成本和发酵的效果，对发酵培养中草药的配方进行了的改良，配方中尽可能的提高中草药含量。设定以下配方：
配方一：复合中草药(紫茎泽兰脱毒草粉、白术、茯苓、苦地丁、黄柏、莪术按质量比5:1:1:1:1:1混合)97.7％、硫酸铵1.3％、葡萄糖1％；
配方二：复合中草药(紫茎泽兰脱毒草粉、白术、茯苓、苦地丁、黄柏、莪术按质量比5:1:1:1:1:1混合)77.7％、麸皮20％、硫酸铵1.3％、葡萄糖1％；
配方三：复合中草药(紫茎泽兰脱毒草粉、白术、茯苓、苦地丁、黄柏、莪术按质量比5:1:1:1:1:1混合)87.7％、麸皮10％、硫酸铵1.3％、葡萄糖1％。
上述配方中均为质量百分比计算。
按配方称取各组分，混合均匀，并加入水，搅拌均匀，料水比1:1.2(g/mL)，将鼠李糖乳杆菌菌粉接种乳酸菌斜面培养基，37℃静置培养24h，接种斜面种子至乳酸菌液体培养基中，37℃静置培养24h，然后按照4％接种量接种上述配方进行生料和熟料发酵48小时，测定气味及活菌数。
2、结果
2.1 复合中草药发酵前后抑菌性能的检测
表1 复合中草药发酵前后对大肠杆菌抑菌性能的影响
由表1可知，未经发酵的复合中草药对大肠杆菌没有抑制作用，经植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和戊糖片球菌的菌粉发酵后抑菌性能增强，具有显著抑制大肠杆菌的作用。故复合中草药经乳酸菌发酵后对大肠杆菌的抑菌性能显著提高。
2.2 供发酵菌株的筛选
表2 供发酵菌株的筛选
由表2可以看出，采用乳酸菌鼠李糖乳杆菌菌粉的发酵效果相对较好，发酵后培养物中的活菌数明显提高，气味也得到了改善。
2.3 用于发酵的原料配方的改良
表3 鼠李糖乳杆菌发酵中草药结果
由表3可知，鼠李糖乳杆菌生料发酵活菌数较高，从节约成本考虑，选用配方三进行后续试验，即复合中草药87.7％、麸皮10％、硫酸铵1.3％、葡萄糖1％(均为质量百分比)。
2.4 发酵中草药制剂的制备工艺
准确称取复合中草药87.7g(紫茎泽兰脱毒草粉、白术、茯苓、苦地丁、黄柏、莪术按质量比5:1:1:1:1:1混合)、麸皮10g、硫酸铵1.3g和葡萄糖1g，混合均匀盛放于密闭玻璃袋中，加120mL自来水搅拌均匀。将鼠李糖乳杆菌菌粉接种乳酸菌斜面培养基，37℃静置培养24h，接种斜面种子至乳酸菌液体培养基中，37℃过夜静置培养24h，然后按照4％接种量接种，发酵48小时后自然晾干，添加枯草芽孢杆菌B7348喷干粉终浓度为2.0×108cfu/g，混合均匀，用KL120型颗粒饲料机进行制粒，粒径4.4mm，粒长6.0mm。制成的颗粒料活菌数≥3.0×108cfu/g。
实施例2：复合中草药安全性试验
(一)急性经口毒性试验
1 材料与方法
1.1 试验材料向复合中草药中加入20倍体积的水(g/mL)，浸泡1h，蒸煮3次。过滤合并，将合并后的提取液浓缩至生药量与提取液体积比为4:1、2:1、1:5、1:10(g/mL)时，分别取样进行灌胃。小白鼠购自山东鲁抗医药股份有限公司。
1.2 试验设计取小白鼠100只，雌雄各半，预饲3天后，随机分为5组，灌胃浓度分别为4g/mL、2g/mL、0.2g/mL和0.1g/mL，另设对照组，灌胃自来水。灌胃剂量为0.02mL/g小鼠重。连续灌胃两天，每次灌胃后密切观察2小时，2小时后常规饮食，每天定时观察记录，连续观察14天。
1.3 样本采集及检测方法
1.3.1 肉眼观察：详细记录被毛和皮肤、眼睛和黏膜、呼吸、循环、自主神经和中枢神经系统、肢体活动和行为等改变。特别注意是否出现震颤、抽搐、流涎、腹泻、嗜睡和昏迷等症状。应记录毒作用体征出现和消失的时间和死亡时间。
1.3.2 小鼠体重：于试验开始时、7d和14d分别对每组雌雄小鼠进行称重，比较其体重情况。
1.3.3 病理学检查：14d时对各组小鼠取5只进行尸检，观察脏器器官病变，对观察有变化的脏器需进行组织病理学检查。
2、结果
2.1 各组小白鼠的生长和死亡情况
表4 复合中草药对各组雌性小鼠生长和死亡情况的影响
由表4可知，在试验周期内雌性小白鼠体态观察正常，各组均没有出现死亡情况，解剖仔细观察肝脏、肾脏和脾脏等器官，均没有肉眼可见病变。
表5 复合中草药对各组雄性小鼠生长和死亡情况的影响
由表5可知，在试验周期内雄性小白鼠体态观察正常，各组均没有出现死亡情况，解剖仔细观察肝脏、肾脏和脾脏等器官，均没有肉眼可见病变。
2.2 各组小白鼠的器官指数和解剖情况
复合中草药对各组小鼠器官指数的影响结果见表6，解剖情况见图1。
表6 复合中草药对各组小鼠器官指数的影响
由表6和图1可以看出，脾脏指数除试验Ⅴ组最低，显著低于对照组外(P＜0.05)，其余各试验组均低于对照组，但差异均不显著(P＞0.05)；试验小鼠体态正常，肝脏、脾脏、心脏和肾脏均无肉眼可见变化，这说明在试验浓度4g/mL范围内复合中草药对小鼠是安全的。
(二)复合中草药亚慢性毒性试验
1 材料与方法
1.1 试验材料将购买的小白鼠基础日粮粉碎，然后各组按设计量精确加入复合中草药，由山东鲁抗医药股份有限公司加工制成条状饲料备用。
1.2 试验动物昆明系小白鼠，购自山东鲁抗医药股份有限公司。20±2g，身体健康，共120只，雌雄各半。
1.3 染毒剂量的选择及分组取120只昆明系小白鼠，预饲3天，随机分为4组，每组30只，雌雄各半。Ⅰ组为空白对照组，饲喂基础日粮；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组为受试药物组，在基础日粮中添加质量百分比分别为2％、5％和8％的复合中草药。各组均自由饮水与采食，采用经口染毒，试验期为90d。每天观察动物的毒性反应，每月称重1次，详细记录耗料量，每月计算各组动物平均增重，分析小白鼠体重变化情况。
1.4 样本采集及检测方法
1.4.1 小鼠体重及食物利用率试验第30d、60d、90d准确计算各组小鼠的体重变化情况及食物利用率。食物利用率即小鼠每食入100g饲料所增长的体重克数。
1.4.2 血清生化指标试验第30d、60d、90d，各组随机选取小白鼠10只(雌雄各5只)，
眼球取血分离血清，检测血液生理指标：谷草转氨酶(AST)活性、谷丙转氨酶(ALT)活性和尿素氮(BUN)含量。
1.4.3 脏器系数试验第30d、60d、90d，各组随机选取小白鼠10只(雌雄各5只)，在剖检的同时称取小鼠体重及各主要脏器(肝脏、肾脏、脾脏)重量，做好记录，计算各脏器系数。计算公式：脏器系数(mg/g)＝脏器重量/小鼠体重。
1.4.4 病理学检查凡是在染毒过程中死亡的小鼠均应及时解剖，肉眼检查后再进行病理组织学检查。观察有病变时作组织化学或电镜镜检。
1.4.5 数据处理试验结果以平均数±标准差表示，用SPSS13.0应用软件进行组间数据的显著性检验，用LSD进行组间多重比较，对试验数据进行统计分析。
2、结果
2.1 复合中草药对小鼠体重的影响
表7 复合中草药亚慢性毒性试验小白鼠体重变化情况
由表7可知，各组小白鼠在试验期间体重均有增加，且各试验组与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)，可见长期给药对小白鼠体重无不良影响。
2.2 复合中草药对小鼠血液生化指标的影响
小白鼠连续给药30d、60d和90d血清生化指标测定结果分别见表8-10。由表8、表9和表10可知，统计学分析显示，30d、60d和90d各试验组小白鼠血清谷草转氨酶活性、谷丙转氨酶活性和尿素氮含量与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。
表8 复合中草药对小白鼠血清生化指标的影响(30d)
表9 复合中草药对小白鼠血清生化指标的影响(60d)
表10 复合中草药对小白鼠血清生化指标的影响(90d)
2.3 复合中草药对小鼠脏器系数的影响小白鼠连续给药30d、60d和90d各组脾脏指数、肾脏指数和肝体比测定结果见表11、表12和表13。统计学分析显示，与对照组相比，复合中草药各浓度组脏器系数均无显著性差异(P>0.05)。
表11 复合中草药对小白鼠脏器系数的影响(30d)
表12 复合中草药对小白鼠脏器系数的影响(60d)
表13 复合中草药对小白鼠脏器系数的影响(90d)
2.4 病理学变化
对给药30d、60d、90d小白鼠剖检，经肉眼观察均未见任何异常和可疑病变。分别将30d、60d、90d剖杀的对照组、复合中草药8％组小白鼠的肝脏、肾脏和脾脏进行组织病理学切片检查，结果均未发现异常显微病理学变化。
小结：本试验整个试验过程中，各试验组小白鼠行为、步态、毛色、粪便性状与空白对照组相比，未见任何异常，且各组小白鼠饮水、采食、体重均正常，均无死亡现象。未发现复合中草药对小白鼠生长发育产生不良影响，结果表明复合中草药在最高浓度8％范围内，长期应用对小白鼠无亚慢性毒性。
实施例3：发酵中草药制剂对白羽肉鸡的抗感染效果试验
1 试验材料与方法
1.1 试验设计与日粮组成
选取体重均匀、健康状况基本相同的240只1日龄肉鸡随机分成4个组，每组3个重复，每个重复20只。试验预试期7d，饲喂基础日粮，饮用煮开后凉透的自来水，正试期35d。Ⅰ组为对照组，Ⅱ组在基础饲料中添加质量百分比为1％的本发明实施例1制备的发酵中草药制剂；Ⅲ组在基础饲料中添加质量百分比为1％的未发酵中草药制剂，该未发酵的中草药制剂制备方法同实施例1中发酵中草药制剂的制备，区别在于，中草药未经乳酸菌发酵，直接与枯草芽孢杆菌B7348喷干粉混合，制粒；Ⅳ组为市售杆菌清组，各组均饲喂六合基础饲料。其中杆菌清主要成分为头孢噻呋和磷霉素，100克兑300斤水长期使用。
用于攻毒试验的大肠杆菌O1、O2和O78为山东农业大学惠赠。
1.2 饲养管理
试验鸡各重复采用分笼饲养，自由采食和饮水。舍内光照、温度和湿度严格按照常规饲养管理要求进行控制，按常规免疫程序对雏鸡进行新城疫及法氏囊免疫。每日换食换水前进行食槽和饮水器杀菌消毒。试验期间详细记录各组饲料消耗及试验鸡的健康状况。
1.3 样本采集及检测方法
1.3.1 生长性能的测定
预饲期7d，于肉鸡35日龄各重复取5只鸡进行剖杀取样，剩余鸡只进行攻毒试验，灌胃接种1mL大肠杆菌菌悬液(O1、O2和O78的混合液1.0×1010cfu/mL)，连续攻毒两天。详细记录8-35日龄期间各试验组供料量、剩余料量，计算各试验组总耗料量、平均日增重、平均日采食量和料重比。统计35日龄攻毒后各重复鸡只死亡情况。
1.3.2 盲肠菌群检测
分别于35d、42d从每个重复中随机选取5只鸡，颈静脉放血处死，无菌分离直肠和盲肠，取其内容物，采用平板培养计数法分别计数肠道乳杆菌和大肠杆菌数。菌群数量以每克肠道内容物所含细菌群落总数的对数((lgCFU)/g)表示。
1.3.3 肠液中sIgA含量的测定
分别于35d、42d从每个重复中随机抽取5只鸡，颈动脉放血处死，无菌操作取盲肠内容物，在灭菌生理盐水中摇匀，采用鸡sIgA ELISA试剂盒测定肠液中sIgA的含量。
1.3.4 血清免疫球蛋白G和炎性因子白介素含量的测定
分别于35d、42d从每个重复中随机抽取5只禁食(自由饮水)12h后的肉鸡，心脏采血，3000r/min离心10min分离血清。采用鸡血清ELISA试剂盒测定免疫球蛋白G、炎性因子IL-2和IL-6含量。
2 结果
2.1 发酵中草药制剂对肉鸡攻毒大肠杆菌后鸡只死亡及粪便情况的影响
在肉鸡35日龄时，剖杀部分鸡只，对剩余鸡只进行攻毒，腹腔注射大肠杆菌(O1、O2和O78的混合液1.0×1010cfu/mL)1mL，连续两天，观察7天。记录各组鸡只死亡情况，结果如表：
表14 攻毒大肠杆菌后各组鸡只死亡情况
从每组每个重复攻毒后死亡情况来看，杆菌清组死亡只数最少，只死亡两只；发酵组次之平均死亡率为6.67％，死亡三只，而且观察鸡只生长情况较对照组和未发酵组较好，解剖发现病变较轻，这与复合中草药的杀菌性能密切相关。与对照组相比，未发酵组也表现出较好的抗大肠杆菌感染的作用，平均死亡率为28.89％，远低于对照组，对照组平均死亡率为82.22％。
攻毒大肠杆菌后各组鸡只粪便情况见图2，由图2可知，对照组鸡只粪便拉稀严重，有绿色粪便，如箭头所示；发酵组粪便良好，成型，干湿度较好；未发酵组有轻微稀便，但整体看来较对照组好；杆菌清组粪便基本成型，但湿度较对照高，如箭头所示。由鸡只粪便图可知，发酵组粪便最好，说明使用发酵中草药制剂后能够有效治疗由于大肠杆菌感染引起的肉鸡腹泻，治疗效果较杆菌清组好。
2.2 发酵中草药制剂对肉鸡盲肠菌群的影响
表15 发酵中草药制剂对肉鸡盲肠菌群含量的影响(lg cfu.g-1)
由表15可知，对大肠杆菌数的影响，35d时各试验组均显著低于对照组(P<0.05)，杆菌清组最低，其次为发酵组，发酵组低于对照组10.15％，但杆菌清组和发酵组相差不大；42d时各试验组均显著低于对照组(P<0.05)，发酵组低于对照组7.96％，和杆菌清组相差不大。乳杆菌方面，35d时发酵组最高，分别高出对照组和杆菌清组4.34％和4.86％(P<0.05)；42d时发酵组显著高于其余各组(P<0.05)，分别高出对照组和杆菌清组6.16％和9.16％。
小结：在控制大肠杆菌方面杆菌清组效果较好，但和发酵组相差不大。但是在促进有益菌乳杆菌增殖上发酵组效果优于杆菌清组。
2.3发酵中草药制剂对肉鸡盲肠内容物sIgA和血清免疫球蛋白G含量的影响
表16 发酵中草药制剂对肉鸡盲肠内容物sIgA和血清免疫球蛋白G含量的影响
由表16可知，盲肠内容物sIgA含量：35日龄时，各组间差异不显著，未发酵组最高，高出对照组5.72％；42日龄时即攻毒后，发酵组含量最高，显著高于未发酵组和杆菌清组(P<0.05)，分别高出33.06％和38.13％。这说明大肠杆菌攻毒后发酵中草药制剂能够提高盲肠内容物sIgA含量，增强肉鸡免疫力；
血清IgG含量：35日龄时，发酵组最高，但各组间差异均不显著(P>0.05)；42日龄时，发酵组最高，显著高于杆菌清组(P<0.05)，高出28.04％，但和对照组和未发酵组相比，差异不显著(P>0.05)。小结：35日龄肉鸡攻毒大肠杆菌后，和其他组相比，发酵组的免疫球蛋白G含量较高，这与微生态制剂可以提高肉鸡免疫力有关。
2.4 发酵中草药制剂对肉鸡血清白介素IL-2和IL-6含量的影响
表17 发酵中草药制剂对肉鸡血清白介素含量的影响(pg/mL)
由表17可知，35日龄时血清中IL-2和IL-6各组间差异均不显著(P>0.05)；42日龄时，发酵组IL-2含量最高，显著高于对照组和杆菌清组(P<0.05)，分别高出45.47％和32.80％。这说明发酵中草药制剂的使用具有促进IL-2产生的作用，IL-2的产生可以发挥抗大肠杆菌感染的功能，同时激活B细胞分泌IgA，有利于肠道粘膜和内容物产生更多的SIgA，提高肉鸡免疫力。由表可知，42日龄时发酵组血清IL-6含量最高，分别高出对照组和杆菌清组28.78％和16.81％(P<0.05)。这说明发酵中草药制剂的使用具有促进炎症介导因子IL-6产生的作用，提高肉鸡对抗大肠杆菌引起的炎症反应的能力，同时IL-6能够刺激参与免疫反应的细胞增殖、分化并提高其功能。
2.5 发酵中草药制剂对肉鸡生长性能的影响
表18 发酵中草药制剂对肉鸡生长指标的影响
由表18可知，平均日采食量：8-14d时除对照组外其余各试验均无显著性差异(P>0.05)；15-21d时试验Ⅱ组和Ⅳ组平均日采食量最高，显著高于对照组(P<0.05)；22-28d时试验Ⅳ组最高，和试验Ⅱ组间差异不显著(P>0.05)，但均显著高于对照组(P<0.05)；29-35d试验Ⅱ组显著高于对照组(P<0.05)。这说明在饲喂发酵中草药制剂后能够促进肉鸡后期的采食量，这可能与其复合微生态制剂促进肠道健康水平有关。
平均日增重方面，8-14d时试验Ⅱ组和Ⅲ组显著低于对照组和杆菌清组(P<0.05)；15-21d和22-28d时试验Ⅱ组和Ⅳ组平均日增重均显著高于对照组(P<0.05)，发酵组和杆菌清组差异不显著(P>0.05)；29-35d时试验Ⅱ组显著高于对照组(P<0.05)，但在一定程度上低于杆菌清组。这说明饲喂发酵中草药制剂可以促进肉鸡后期的肥育，同杆菌清效果相当。
料重比方面，8-14日龄，杆菌清组料重比最低，显著低于其余各组(P<0.05)。发酵组和未发酵组最高，显著高于对照组(P<0.05)；15-21d、22-28d和29-35d时对照组料重比最高，显著高于其余各组(P<0.05)。其中杆菌清最低，但和试验Ⅱ组差异不显著(P>0.05)。
总结：由生长性能结果可知，添加发酵中草药制剂对肉鸡前期的日采食量和日增重影响不大，但能够明显提高肉鸡生长后期的日采食量，促进肉鸡后期的育肥和生长。发酵中草药制剂效果接近于杆菌清组，说明该微生态制剂可以替代饲用抗生素发挥促生长的作用应用在肉鸡生产中。
小结：
1、肉鸡基础日粮中添加质量百分比为1.0％的发酵中草药制剂可以抵抗由于大肠杆菌感染引起的肉鸡腹泻，改善粪便情况，减少鸡只死亡，治疗效果和杆菌清使用效果一样；
2、发酵中草药制剂由于添加了微生态制剂，改善了肠道微生态平衡。发酵组在抑制了大肠杆菌的生长方面效果等同于杆菌清组，但在促进有益菌乳杆菌增殖上发酵组效果优于杆菌清组；
3、和使用杆菌清相比，大肠杆菌攻毒后饲喂肉鸡添加了1.0％发酵中草药制剂的日粮，肉鸡盲肠内容物sIgA含量和血清免疫球蛋白G含量提高，增强肉鸡免疫力；
4、和使用杆菌清相比，发酵中草药制剂能够更加促进T细胞介导因子IL-2和炎性因子IL-6的分泌，提高肉鸡抵抗大肠杆菌的能力。
5、发酵中草药制剂能够明显促进肉鸡后期的育肥和生长，与杆菌清相比更加安全、绿色、无残留。
结论：发酵中草药制剂可以安全应用在肉鸡养殖中，具有较好的抵抗大肠杆菌引起的腹泻，减少鸡只死亡，改善肠道健康，提高分泌型免疫球蛋白A含量和免疫球蛋白G水平，增强肉鸡免疫力，促进T细胞介导因子IL-2和炎性因子IL-6的分泌，提高肉鸡抵抗大肠杆菌的能力，摒弃杆菌清这一抗生素在治疗肉鸡大肠杆菌病方面的使用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (8)

1.一种可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂，其特征在于，其活性成分是由乳酸菌发酵以下按照质量百分比的原料配方得到的培养物：
复合中草药77.7-97.7％，麸皮0-20％，硫酸铵1.3％，葡萄糖1.0％；
所述复合中草药是由紫茎泽兰脱毒草粉、白术、茯苓、苦地丁、黄柏、莪术按质量比5:1:1:1:1:1混合而成；
供发酵的乳酸菌选自罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或戊糖片球菌；
由以下步骤制备而成：
(1)称取配方中的原料，加入1-1.5倍量的水，搅拌均匀；
(2)取供发酵的乳酸菌菌粉接种至乳酸菌斜面培养基上，在35-38℃静置培养20-26h，接种斜面种子至乳酸菌液体培养基中，在35-38℃静置培养20-26h；然后按照体积百分数3％-6％接种到步骤(1)的加水混匀后的原料中，在35-38℃发酵44-50h后自然晾干，得发酵培养物；
(3)向步骤(2)的发酵培养物中加入枯草芽孢杆菌喷干粉，枯草芽孢杆菌喷干粉终浓度为1.0×108–3.0×108cfu/g，混合均匀，制粒，即得。
2.如权利要求1所述的可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂，其特征在于，其活性成分是由乳酸菌发酵以下按照质量百分比的原料配方得到的培养物：
复合中草药87.7％，麸皮10％，硫酸铵1.3％，葡萄糖1.0％。
3.如权利要求1所述的可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂，其特征在于，所述供发酵的乳酸菌选自植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或戊糖片球菌。
4.如权利要求3所述的可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂，其特征在于，供发酵的乳酸菌为鼠李糖乳杆菌。
5.权利要求1至4任一项所述的可用于预防肉鸡大肠杆菌感染的发酵中草药制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取配方中的原料，加入1-1.5倍量的水，搅拌均匀；
(2)取供发酵的乳酸菌菌粉接种至乳酸菌斜面培养基上，在35-38℃静置培养20-26h，接种斜面种子至乳酸菌液体培养基中，在35-38℃静置培养20-26h；然后按照体积百分数3％-6％接种到步骤(1)的加水混匀后的原料中，在35-38℃发酵44-50h后自然晾干，得发酵培养物；
(3)向步骤(2)的发酵培养物中加入枯草芽孢杆菌喷干粉，枯草芽孢杆菌喷干粉终浓度为1.0×108–3.0×108cfu/g，混合均匀，制粒，即得。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，向原料中加入水的量为配方中原料质量的1.2倍。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，枯草芽孢杆菌喷干粉终浓度为2.0×108cfu/g。
8.权利要求1至4任一项所述的发酵中草药制剂在制备提高肉鸡免疫力的产品中应用。
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Denomination of invention: Fermented Chinese herbal preparation capable of preventing escherichia coli infection in broiler chickens and application of fermented Chinese herbal preparation

Effective date of registration: 20180413

Granted publication date: 20161005

Pledgee: Bank of Tai'an Limited by Share Ltd

Pledgor: Shandong Baolai-leelai Bio-engineering Co., Ltd.

Registration number: 2018370000070

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PC01 Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right

Date of cancellation: 20190729

Granted publication date: 20161005

Pledgee: Bank of Tai'an Limited by Share Ltd

Pledgor: Shandong Baolai-leelai Bio-engineering Co., Ltd.

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