CN106267193A

CN106267193A - 一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106267193A
Application number: CN201610852217.4A
Authority: CN
Inventors: 王玲; 杨峰; 苗小楼; 魏小娟; 罗永江; 刘宇; 郭文柱; 张彬; 罗金印; 杨珍
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2016-09-27
Filing date: 2016-09-27
Publication date: 2017-01-04

Abstract

本发明公开了一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，所述药物注入剂包含有特异性抗DP‑BM‑IgY卵黄抗体和中药组合物提取液，为乳房注入剂；并提供了其制备方法和应用。本发明的有益效果为：本发明中的特异性抗DP‑BM‑IgY卵黄抗体可定向杀灭奶牛乳腺炎主要致病菌，对奶牛多种类型的乳腺炎都有明显疗效，具有性质稳定、特异性强、无残留、无抗药性的特点；中药组合物兼具散瘀止痛、退毒下脓、凉血消肿、抗菌消炎及免疫增强的功效；组合得到的乳房注入剂药物，能够直接在乳房局部给药，靶向效果更好，从而提高生物利用度及药物疗效，对疾病的治疗更加有效、确切，并可降低药物引起的全身毒副作用，减少药物不良反应，使用方便，顺应性好，增加了使用的安全性。

Description

一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽用药技术领域，具体涉及一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂及其制备方法和应用。

背景技术

奶牛乳腺炎是由物理、化学或微生物等因素刺激奶牛乳腺所引发的一种炎症反应，其中多种病原微生物的感染是引起奶牛乳腺炎的主要病因。抗生素是奶牛乳腺炎首选治疗药物，但存在单一药物抗菌谱不够广、耐药性、药物残留蓄积、肠道菌群失调的问题。从根本上讲，抗生素治疗失败的原因主要归于奶牛乳腺特殊生理结构形成的药理学和药动学机制。另外，采用抗生素治疗选择的是单纯抗菌的思路，只重视了对微生物的杀灭，而未重视作为乳腺炎过程中矛盾的另一方面，即奶牛本身的炎症反应和炎症引起的免疫力下降的问题。

中兽医称乳房炎为乳痈，多是阳明经实热、厥阴肝经淤滞和冲任二脉失调，使乳房脉络不畅，乳汁积滞发热腐败而造成的炎性反应。中兽医理论认为，乳房炎的防治应着眼于肝胃，应疏肝气、散郁结、清胃热、消肿毒、通脉络。中草药治疗奶牛乳房炎，可避免产生耐药菌株和乳中残留抗生素，当前对于中药防治乳房炎的研究，重点是单味药物和复方药物对乳房炎的临床疗效。

鉴于奶牛乳腺炎发病初期，以微生物感染为主要矛盾，而随着疾病的发展，乳腺内炎症反应加强、感染受到控制，主要矛盾转变为炎症引发的免疫力低下，抗病力减弱。因此，乳腺免疫系统对临床型乳腺炎的进程有重要影响，提高免疫系统对炎区组织修复也有着根本意义，应改变原有的单纯抗菌的思路，把控制炎症反应本身、改善免疫系统作为治疗的要点之一。中药属于天然药物，具有抗菌消炎、不易使致病菌产生耐药性和增强机体免疫机能，提高动物抗应激、抗疾病能力，改善动物生产性能等多种功效，能克服大量使用抗生素带来的弊端。中药具有标本兼治的作用，它可直接抑制或杀灭乳腺炎的病原菌，或通过提高机体的免疫力而抑制或杀灭病原菌，在治疗奶牛乳腺炎方面具有巨大的潜力。

特异性卵黄抗体IgY 是一种良好的免疫球蛋白资源，无污染，无残留，具有高度的稳定性，对热、酸、碱具有较强的耐受性，可以针对不同抗原制备特异性抗体，专一性抑制杀灭病原体，近年来受到了国内外学者的高度关注。研究表明，口服特异性卵黄抗体IgY 可成功用于防治动物和人类因细菌、病毒感染引起的消化道疾病，如幽门螺杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、轮状病毒等引起的胃肠道感染，其效果呈剂量依赖性。口服特异性卵黄抗体IgY 在远离肠道部位的乳腺亦能够有效抑制细菌的生长，国外Coleman(1996)用抗无乳链球菌和抗金黄色葡萄球菌的IgY 抗体给泌乳期奶牛服用，结果牛奶的SCC 值很快降低，乳腺炎病情得到控制。针对上述问题，本发明将根据兽药类非抗生素生物制剂的发展方向，在中兽医理论的基础上，以散瘀止痛、退毒下脓、凉血消肿、抗菌消炎为原则，提供一种具有提高奶牛免疫力及抗病力的中药组合物，从根本达到标本兼治、祛邪固本的治疗功效。此外，利用产蛋鸡受到外来抗原（奶牛乳腺炎4种主要致病菌）的刺激会产业免疫应答，并生成相应抗体且抗体主要累计于卵黄这一特点，以产蛋鸡为生物转换器，大量、连续的生产抗奶牛乳腺炎主要致病菌的特异性卵黄免疫球蛋白IgY（Dominate pathogens of bovine mastitis，抗DP-BM-IgY）。制备的特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体可通过被动免疫途径防治奶牛乳腺炎，定向杀灭多种奶牛乳腺炎致病菌，尤其是抗生素无法有效杀灭的L-型耐药变种菌及其他耐药菌，而对奶牛乳房内的有益菌无影响。因此，抗DP-BM-IgY卵黄抗体有助于提高奶牛对乳腺炎主要致病菌的抗性，对奶牛多种类型的乳腺炎都有明显疗效，愈后奶牛乳腺炎不再复发，并以其性质稳定、特异性强、无残留、无抗药性而倍受关注。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种能够有效防治奶牛临床型乳腺炎和隐性乳腺炎的药物注入剂及其制备方法和应用，在兼具退毒下脓、提高奶牛免疫力及抗病能力的同时，还具有特异性防治奶牛乳腺炎主要致病菌如链球菌、葡萄球菌、G^—杆菌的作用。在预防及治疗奶牛乳腺疾病方面具有疗效显著、无毒副作用、不产生耐药性、不易复发的优势。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，所述药物注入剂包含有特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体和中药组合物提取液，为乳房注入剂。

进一步的，上述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，所述药物注入剂中，按照体积百分比计特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体：中药组合物提取液为（5%-15%）：（10%-25%）。

进一步的，上述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，所述药物注入剂中，按照体积百分比计特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体：中药组合物提取液为10%：20%。

进一步的，上述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，所述中药组合物由按照重量份计的以下原料药组成：漏芦5-15 份，蒲公英5-15份，紫花地丁5-15 份，连翘5-20份，地榆5-15 份，瓜蒌5-15 份，当归5-10 份，黄芪10-20 份。

进一步的，上述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，所述中药组合物由按照重量份计的以下原料药组成：漏芦6 份，蒲公英10份，紫花地丁10 份，连翘12份，地榆8份，瓜蒌10 份，当归7 份，黄芪15份。

进一步的，上述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，所述特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体的制备方法包括以下步骤：

a）选取制备多价菌体蛋白抗原的主要致病菌，无乳链球菌（S.agalactiae，CVCC55901，牛源）、停乳链球菌（S.dysgalactiae，CVCC55935 牛源）、金黄色葡萄球菌（S.aurrus，CVCC8029 牛源）及大肠杆菌（E.coli，O157:K88，CVCC1489 牛源），鉴定得到纯种，分别在营养肉汤培养物中进行体外扩大培养，营养肉汤培养物为加有体积百分比5-10 %犊牛血清、质量体积百分比1-2 %葡萄糖的LB 营养肉汤；将培养好的菌液离心浓缩，采用细菌裂解液结合超声细胞破碎方法，分别制备单一抗原，单一抗原进行等浓度组合即得所需的复合抗原；将制备的复合菌体蛋白抗原加入与等量的弗氏完全佐剂混合，充分乳化制得抗原免疫物；采用多次交替的免疫程序，通过肌肉、皮下多点注射式途径，免疫接种具有高免应答能力的180日龄健康产蛋鸡，首免后，收集免疫鸡产下的蛋为样品，即高免鸡蛋，备用；

b）采用水稀释法-冷冻法-聚乙二醇沉淀法分离提纯抗DP-BM-IgY，将分离出的卵黄用7-9倍体积磷酸缓冲液稀释，pH 值调至5.2，经冷冻、解冻、离心去除脂肪沉淀，收集的上清液经4 %、12 %的PEG-6000分别去除卵黄磷脂及蛋白沉淀，高速冷冻离心获得特异性抗DP-BM-IgY 卵黄抗体液，将其浓度调节到50 mg/mL，在无菌条件下采用微孔滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃保存，备用。

本发明的第二个目的是提供了上述一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂的制备方法，包括以下步骤：

1）特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体的制备方法：

a）选取制备多价菌体蛋白抗原的主要致病菌，无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌，鉴定得到纯种，分别在营养肉汤培养物中进行体外扩大培养，营养肉汤培养物为加有体积百分比5-10 %犊牛血清、质量体积百分比1-2 %葡萄糖的LB 营养肉汤；将培养好的菌液离心浓缩，采用细菌裂解液结合超声细胞破碎方法，分别制备单一抗原，单一抗原进行等浓度组合即得所需的复合抗原；将制备的复合菌体蛋白抗原加入与等量的弗氏完全佐剂混合，充分乳化制得抗原免疫物；采用多次交替的免疫程序，通过肌肉、皮下多点注射式途径，免疫接种具有高免应答能力的180日龄健康产蛋鸡，首免后，收集免疫鸡产下的蛋为样品，即高免鸡蛋，备用；

b）采用水稀释法-冷冻法-聚乙二醇沉淀法分离提纯抗DP-BM-IgY，将分离出的卵黄用7-9倍体积磷酸缓冲液稀释，pH 值调至5.2，经冷冻、解冻、离心去除脂肪沉淀，收集的上清液经4 %、12 %的PEG-6000分别去除卵黄磷脂及蛋白沉淀，高速冷冻离心获得特异性抗DP-BM-IgY 卵黄抗体液，将其浓度调节到50 mg/mL，在无菌条件下采用微孔滤膜过滤除菌，分装，-20 ℃保存，备用；

2）中药组合物提取液的制备方法：

按所述重量份称取各原料药，混合、搅拌、粉碎，加水煎煮，合并滤液、浓缩，得到浓缩滤液；之后用乙醇醇提，去乙醇后，在药液中加注射用水，杀菌，得到本发明的乳房注入剂中药提取液；

所述加水煎熬是加入相对于原料药质量之和5-15倍质量的水，煎煮1-4 h，煎煮3 次；

所述乙醇醇提是在浓缩滤液中加入1倍浓缩液质量的乙醇，将醇沉液离心，取上清液，上清液去乙醇后再加入乙醇进行醇沉，醇沉液过滤，滤过液去乙醇，再加入去离子水，得到含生药量为0.5 g/mL的溶液，过滤，得滤液，即为该中药组合物的提取液；

3）乳房注入剂药物的制备方法：

取所述中药组合物提取液20 mL，在其中加入0.5 mL吐温-80和50 mg苯甲醇，混合均匀后，加注射用水至 90mL，氢氧化钠调pH 值至7.4，100℃灭菌30 min，冷却，至温度降至20℃，无菌加入抗DP-BM-IgY卵黄抗体10 mL，在无菌条件下进行灌装得成品乳房注入剂。

本发明的第三个目的是提供了上述一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂在制备用于防治奶牛乳腺炎的乳房注入剂药物中的应用。

进一步的，上述的应用，所述乳房注入剂药物的使用量为每头奶牛每个乳区20-60mL。

本发明的有益效果为：

（1）本发明提供的含有抗DP-BM-IgY卵黄抗体及中药组合物提取液的乳房注入剂药物，同时具有局部和全身作用。用药后药物可直接作用于乳腺组织，从而提高生物利用度及药物疗效，对疾病的治疗更加有效、确切，并可降低药物引起的全身毒副作用，减少药物不良反应，使用方便，顺应性好，增加了使用的安全性。其次，药物经乳腺组织局部吸收后可产生全身作用，特异性的防治奶牛乳腺炎的主要病原菌（包括对抗生素及消毒剂产生耐药性的致病菌），有助于克服多药耐药性，恢复有益菌群，有效降低病牛的感染率和对抗生素的依赖，是防治奶牛乳腺炎的良好剂型。

（2）本发明提供的抗DP-BM-IgY乳房注入剂的制备方法，选材方便、提取效率高、成本相对较低，易于形成规模化生产。

（3）本发明公开了一种治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂的用途，该药物通过将抗DP-BM-IgY卵黄抗体与中药复方活性成分进行偶联，可通过特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体定向捕捉无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌，制备出针对链球菌、葡萄球菌、G^—杆菌兽用靶向治疗药物。其次，中药复方提取液除具有清热解毒、退毒下脓、抗菌消炎的优点外，还兼具提高奶牛免疫力及抗病能力的特点，而且刺激性小、低毒无残留、不易产生耐药性，因此，对链球菌、葡萄球菌、G^—杆菌引起的奶牛临床型、隐性乳腺炎具有良好的靶向治疗和预防作用。长期给奶牛使用不会产生药物残留，无需停挤乳或弃乳期，能显著的节省成本，减少弃奶损失，具有预防保健和疾病治疗的双重效果，使奶农及奶牛养殖企业获得良好的经济效益。

（4）本发明通过制备抗DP-BM-IgY卵黄抗体与中药组合物提取液的乳房注入剂药物，能够直接在乳房局部给药，靶向效果大大提高，可进一步提高药物抗菌抑菌作用及生物利用度，对疾病的治疗更加有效、确切，并可降低药物引起的全身毒副作用，减少药物不良反应，使用方便，顺应性好，增加了使用的安全性。

附图说明

图1为抗DP-BM-IgY卵黄抗体的纯度检测结果。

其中： M-蛋白Marker；1-标准鸡IgY；2-提取的抗DP-BM-IgY。

具体实施方式

奶牛乳腺炎是奶牛乳腺组织炎症，主要由多种非特定的病原微生物引起的，常见主要致病菌为链球菌属、葡萄球菌属和肠杆菌属等。另外，环境因素和饲养管理对奶牛乳腺炎的发病率也有很大影响，当奶牛生活环境卫生条件差或挤奶不当损伤乳管，使得机体降低和丧失抗感染的能力，奶牛乳房容易遭受病原微生物侵袭而发生乳腺炎。其次，当乳房局部出现血液循环障碍时，乳腺黏膜系统受损，免疫能力降低，造成致病菌大量入侵、增殖引发炎症。本发明所述的特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体可通过被动免疫途径防治奶牛乳腺炎，定向杀灭多种奶牛乳腺炎致病菌，尤其是抗生素无法有效杀灭的L-型耐药变种菌及其他耐药菌，而对奶牛乳房内的有益菌无影响。因此，抗DP-BM-IgY卵黄抗体有助于提高奶牛对乳腺炎主要致病菌的抗性，对奶牛多种类型的乳腺炎都有明显疗效，愈后奶牛乳腺炎不再复发，并以其性质稳定、特异性强、无残留、无抗药性而倍受关注。

另外，传统中兽医理论认为，乳腺炎即乳痈，是痰、湿、气、血瘀结不散化而为炎。因饲养管理不善，久卧湿热之地，湿热毒气上蒸，侵害乳房。或因胃热雍盛，肝郁气滞，乳络失畅以致乳房气血凝滞，瘀结而生痈肿。本发明所述的中药组合物根据中兽医药和现代中医药学理论，以散瘀止痛、退毒下脓、凉血消肿、免疫增强为原则，按照一定的重量份组方而成的，既能活血化瘀、抗菌消炎，又能提高奶牛的免疫力和抗病力，达到标本兼治、祛邪固本的功效，利于预防和治疗奶牛乳腺炎。

所述中药组合物的原料药包括漏芦、紫花地丁、连翘、地榆、瓜蒌、当归和黄芪。

所述中药组合物中各原料药的重量份分别为：漏芦5-15 份，蒲公英5-15 份，紫花地丁5-15 份，连翘5-20 份，地榆5-15 份，瓜蒌5-15 份，当归5-10 份，黄芪10-20 份。

各原料药的重量份优选为：漏芦6 份，蒲公英10 份，紫花地丁10 份，连翘12 份，地榆8 份，瓜蒌10 份，当归7 份，黄芪15 份。

各原料药的药理作用具体如下：

漏芦：学名 Stemmacanthauniflora （L.）Dittrich。性味：苦咸，寒。入胃、大肠经。功能主治：清热解毒，消痈，下乳，舒筋通脉。主要用于乳痈肿痛，痈疽发背，瘰疬疮毒，乳汁不通，湿痹拘挛，骨节疼痛、热毒血痢、痔疮出血。

蒲公英：拉丁学名 Herba Taraxaci。性味：甘，微苦，寒。功能主治：清热解毒，消肿散结。

紫花地丁：学名 Viola philippica。性味：苦、辛、寒，无毒。归心、肺经。具有清热解毒，凉血消肿，清热利湿的作用，主治疔疮，痈肿，瘰疬，黄疸，痢疾，腹泻，目赤，喉痹，毒蛇咬伤。

连翘：拉丁学名 Forsythia suspensa，英文名称fructus forsythiae。性味：苦、凉。归肺、心、小肠经。功能主治：清热解毒，消肿散结。用于痈疽，瘰疠，乳痈，丹毒，风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑，热淋尿闭。

地榆：学名Sanguisorba officinalis。性味：苦酸、寒，无毒。归肝、肺、肾、大肠经。功效：凉血止血，清热解毒，消肿敛疮。主治：吐血，咯血，衄血，尿血，便血，痔血，血痢，崩漏，赤白带下，疮痈肿痛，湿疹，阴痒，水火烫伤，蛇虫咬伤。

瓜蒌：拉丁学名 Fructus Trichosanthis，英文名称：Snakegourd Fruit。性味：甘苦、寒。归肺、胃、大肠经。功能主治：清热涤痰，宽胸散结，润燥滑肠。主要用于肺热咳嗽，痰浊黄稠，胸痹心痛，结胸痞满，乳痈，肺痈，肠痈肿痛，大便秘结。

当归：学名 Angelica sinensis。性味：甘、辛、苦，性温。归肝、心、脾经。功效：补血、活血、调经止痛、润燥滑肠。主治：血虚诸证、月经不调、经闭、痛经、症瘕结聚、崩漏、虚寒腹痛、痿痹、肌肤麻木、肠燥便难、赤痢后重、痈疽疮疡、跌扑损伤。

黄芪：拉丁学名 Leguminosae。性味：甘，微温。归肺、脾、肝、肾经。功效：补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌。用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，气虚水肿，痈疽难溃，久溃不敛，血虚痿黄，内热消渴。

本发明所用到的各种原料药都可从医药商店购买得到，其规格符合国家或行业标准即可。

本发明所述的中药组合物可用常规的中药制剂方法，制备成适合临床应用的适宜制剂，优选为适合局部外用的制剂，最优选为乳房灌注方法，采用该方法可使药物直接作用于患处，在乳腺内达到较高的药物浓度，更好地达到散瘀止痛、退毒下脓、凉血消肿、免疫增强的功效。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应说明，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1：

抗DP-BM-IgY卵黄抗体的制备：

1. 可溶性菌体蛋白抗原复合物的制备：

（1）选取具有特定抗原的致病性无乳链球菌（S.agalactiae，CVCC55901，牛源）、停乳链球菌（S.dysgalactiae，CVCC55935 牛源）、金黄色葡萄球菌（S.aurrus，CVCC 8029 牛源）及大肠杆菌（E.coli，O157:K88，CVCC1489 牛源）。主要致病菌的培养优选为均以血琼脂斜面培养基进行传代，37 ℃培养24 h，染色镜检无杂菌，得到纯种。分别将4种主要致病菌接种于LB肉汤培养基（内含5-10 %犊牛血清及1-2 %的葡萄糖）中进行扩大培养，置37 ℃恒温振荡培养箱中(150-200 r/min)，培养24 h，离心收集细菌细胞。

（2）单菌浓缩蛋白抗原的制备：将菌沉淀按照每克湿菌 + 3 mL pH 7.0 的PBS缓冲液的比例，漂洗2-3 次。按每克湿菌 + 5 mL细胞裂解液的比例，混悬细菌细胞，20-37 ℃温育10-20 min，同时轻轻摇动。细菌细胞破碎后的匀浆液用超声波粉碎仪超声破碎（超声时间 5s，间歇时间 10 s，超声 20 min，功率 400 W），10000 rpm冷冻离心10 min，弃去细菌碎片沉淀，上清即为含有目的蛋白的粗提物。取上清，18300 rpm离心30 min。弃上清，沉淀用0.5 %十二烷基肌氨酸钠悬浮，4 ℃作用1 h，18300 rpm离心30 min。弃上清，沉淀用双蒸水混悬，用改良Bradford法测定目的菌体蛋白浓度，将其浓度调节到1.0 mg/mL，分装后－20 ℃保存，备用。

（3）菌体蛋白抗原复合物的制备：将相同蛋白浓度的4种单一抗原进行等浓度组合即得复合菌体蛋白抗原。

2. 多价菌体蛋白抗原免疫物的制备及动物免疫方案：

（1）免疫佐剂的选择：免疫佐剂优选为弗氏佐剂，初次免疫选用弗氏完全佐剂（FCA），加强免疫（二免、三免）均选用弗氏不完全佐剂（FIA），两者在母鸡血清及卵黄中诱导产生中和抗体的量上具有不同的效能。

（2）抗原免疫物的制备：初次免疫，将实施例 1中制备的10 mL 复合菌体蛋白抗原与等量弗氏完全佐剂（FCA）混合，采用快速乳化法，冰浴条件下，利用超声波粉碎仪反复乳化3-4 次（每次乳化10-15 s，置4 ℃冰箱，间隔1 min），直至完全乳化抗原和佐剂混合物。乳化完全后，冷藏备用。加强免疫均选用弗氏不完全佐剂（FIA），与所述实施例 1中制备的复合菌体蛋白抗原等量混合、充分乳化，作为免疫抗原用于免疫产蛋母鸡，免疫效果更佳。

（3）免疫方案：制定多次交替的免疫程序，选择具有高免应答能力的健康产蛋鸡(180日龄)，采用肌肉、皮下多点注射式途径，免疫间隔设定为10日、免疫3次（基础免疫1次、加强免疫2次）、免疫接种剂量为0.50 mg的免疫方案。首免后，收集免疫鸡产下的蛋为样品，即高免鸡蛋，备用。

3. 抗DP-BM-IgY卵黄抗体的分离纯化及制备：

采用水稀释法--冷冻法--聚乙二醇（PEG-6000）沉淀法分离提纯抗DP-BM-IgY，分别采用4 %、12 %的PEG-6000进行纯化，以进一步去除卵黄磷脂及蛋白沉淀，脱脂、沉淀蛋白效果好，制备的抗DP-BM-IgY得率平均可达到50-60 mg/蛋，抗体纯度可达90 %以上。具体地，将高免鸡蛋用碘酒和酒精棉球进行消毒处理，分离蛋黄和蛋清，刺破蛋黄膜，收集无膜蛋黄液并计量体积。取卵黄液 + 去离子水以1: 6-10 的比例混合(v/v，每个鸡蛋的卵黄液平均按15 mL计)，pH 值调至5.0-6.0，-20 ℃过夜（约8-10 h），4 ℃解冻，析出的上清液及卵黄沉淀高速冷冻离心，弃去脂肪沉淀。收集上清液，根据上清液的体积加入4 % 的PEG-6000 (w/v)，轻轻搅拌使其完全溶解，4 ℃静置2-3 h，高速冷冻离心，以进一步去除卵黄中的磷脂（离心后的黄色沉淀主要是蛋黄中的磷脂，蛋白主要存在上清液中）。收集上清液，根据上清液的体积加入12 % 的PEG-6000 (w/v)，轻轻搅拌使其完全溶解，4 ℃静置1-2 h，以沉淀其中的蛋白抗体，高速冷冻离心，获得的抗DP-BM-IgY卵黄抗体沉淀。

用少量0.1M PBS 溶液溶解沉淀，用改良Bradford法测定其中抗DP-BM-IgY卵黄抗体的蛋白浓度，并将其浓度调节到50 mg/mL，4℃保存，备用。

实施例2：

中药组合物的制备方法，所述中药提取液为乳房注入剂，具体为：

中药提取液1号的制备：

1. 按所述重量称取各原料药（单位：g）：漏芦5，蒲公英5，紫花地丁5，连翘5，地榆5，瓜蒌5，当归5，黄芪10。

2. 将各原料药混合，搅拌、粉碎，加水1000mL, 浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液过滤；然后滤渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液过滤；滤渣再加入500 mL水，第3次煎煮2h，煎煮液过滤。将上述3 次过滤液合并，70℃水浴浓缩至150 mL，滤过得浓缩滤液。在浓缩滤液加入浓度为95 %乙醇，使乙醇浓度达到60 %，将醇沉液离心，取上清液，70℃水浴挥发去乙醇。再加入浓度95 %乙醇进行醇沉，醇沉液经滤纸滤过得滤过液。滤过液经70℃水浴挥发去乙醇，加入去离子水，使溶液含生药量为0.5 g/mL，用0.25 μm微孔滤膜过滤，得滤液，即为该中药组合物的提取液。

中药提取液2号的制备：

1. 按所述重量称取各原料药（单位：g）：漏芦15，蒲公英15，紫花地丁15，连翘20，地榆15，瓜蒌15，当归10，黄芪20。

中药提取液3号的制备：

1. 按所述重量称取各原料药（单位：g）：漏芦10，蒲公英12，紫花地丁12，连翘15，地榆10，瓜蒌12，当归8，黄芪18。

2. 将各原料药混合，搅拌、粉碎，加水1000mL，浸泡0.5 h后，煎煮2 h，煎煮液过滤；然后滤渣加入500 mL水，第2次煎煮2 h，煎煮液过滤；滤渣再加入500 mL水，第3次煎煮2h，煎煮液过滤。将上述3 次过滤液合并，70℃水浴浓缩至150 mL，滤过得浓缩滤液。在浓缩滤液加入浓度为95 %乙醇，使乙醇浓度达到60 %，将醇沉液离心，取上清液，70℃水浴挥发去乙醇。再加入浓度95 %乙醇进行醇沉，醇沉液经滤纸滤过得滤过液。滤过液经70℃水浴挥发去乙醇，加入去离子水，使溶液含生药量为0.5 g/mL，用0.25 μm微孔滤膜过滤，得滤液，即为该中药组合物的提取液。

中药提取液4号的制备：

1. 按所述重量称取各原料药（单位：g）：漏芦6，蒲公英10，紫花地丁10，连翘12，地榆8，瓜蒌10，当归7，黄芪15。

中药提取液5号的制备：

1. 按所述重量称取各原料药（单位：g）：漏芦4，蒲公英8，紫花地丁8，连翘10，地榆5，瓜蒌7，当归5，黄芪10。

实施例3：

乳房注入剂药物的制备方法：

取所述中药提取液20 mL，在其中加入0.5 mL吐温-80和50 mg苯甲醇，混合均匀后，加注射用水至90 mL，氢氧化钠调pH 值至7.4，100℃灭菌30 min，冷却，至温度降至20 ℃左右，无菌加入抗DP-BM-IgY卵黄抗体10 mL，在无菌条件下进行灌装，得成品乳房注入剂（优选为50 mL/支）。抗DP-BM-IgY卵黄抗体：中药提取液：注射用水的体积比为10：20：70。

进一步的，所述中药提取液优选为4号提取液（溶液含生药量为0.5 g/mL），所述抗DP-BM-IgY卵黄抗体蛋白浓度50 mg/mL，最终注入剂药物中生药含量为0.1 g/mL。

进一步的，上述的应用，所述注入剂药物的使用量为每头奶牛每个乳区20-60 mL。

实施例4：

抗DP-BM-IgY卵黄抗体法纯度检测：

采用SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)，用于分离蛋白的凝胶选择为：由7.5 %的分离胶和5.0 % 的浓缩胶组成的凝胶分离系统。电流：11 mA，电压：220 V，时间：50 min，Marker 采用低相对分子质量标准蛋白质，采用考马斯亮蓝R-250 染色法。抗DP-BM-IgY卵黄抗体的纯度检测结果，如图1所示。

图1中，提取的抗DP-BM-IgY卵黄抗体蛋白质中含有少量41～44 Kda的IgY，而在标准商品化鸡IgY中位于45 Kda处的条带己被彻底除去。经软件Bandscan分析，IgY纯度可达90 %以上。其中： M-蛋白Marker；1-标准鸡IgY；2-提取的抗DP-BM-IgY。

实施例5：

乳房注入剂药物的急性毒性试验：

（1）试验动物与受试药物

昆明系清洁级小鼠60只，小鼠体重20±2 g，雌雄各半，雌性小鼠未产未孕。饲养条件：试验清洁级颗粒鼠粮（苏饲审（2008）01008），室内温度22±2 ℃，相对湿度为30 %～60 %，自由采食与饮水。连续观察1周，临床健康即可用于试验，试验期间按常规饲养。

受试药为实施例3制备获得的乳房注入剂药物，其中含抗DP-BM-IgY抗体的浓度为5.0 mg/mL。

（2）试验方法

将健康小鼠随机分成5个剂量组和1个对照组，组间剂量比设为1:1.4。每组10只，雌雄各半，并对每只小鼠进行称重。灌胃前8 h、灌胃后4 h禁食，但可自由饮水。

各药物剂量组根据小鼠体质量，按照1.00、1.40、1.96、2.74、3.84 g/kg的药物剂量计算给药量，以等浓度口服液经口灌喂给药，每日最大灌胃量不超过1.0 mL/只。对照组灌服生理盐水。试验期间所有小鼠自由采食与饮水。

（3）观察指标

给药后3 h内，每隔30 min观察1次小鼠的健康状况、中毒表现及死亡过程，包括采食饮水、行为及反应、自主活动、呼吸急促或放缓状态、被毛松散度、症状起始时间和持续时间、死亡等情况；之后，每隔2 h观察1次；2 d后，每天观察6次，连续观察7 d，统计死亡率。

组织病理学检查：实验期间对死亡小鼠及时进行解剖并记录病变情况，尤其是其肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、肠道、胃的病理变化，包括各脏器的外观形态颜色、大小、质地，胃肠发明是否出现腹部胀气，并观察大便性状和色泽。第8天，对所剩存活小鼠进行称重、断颈处死，剖检观察、记录腹腔内的液体状况以及心、肝、脾、肺、肾的病理变化。

（4）试验结果与分析

给药灌胃后，2.74、3.84 g/kg剂量组小鼠出现精神沉郁、活动量减少的现象，未见其他明显的异常反应。灌胃后第2～3 d，1.00、1.40、1.96、2.74 g/kg剂量组小鼠饮食、饮水量均有一定程度的增加，活动增多，精神状态良好，未出现异常反应。而3.84 g/kg药物剂量组小鼠精神欠佳，至试验结束出现2例死亡小鼠。

试验过程中小鼠自由采食与饮水，经称重，各药物组及对照组小鼠的体质量在第7d试验结束时，体质量较初始体重均有一定程度的增加，存活的小鼠体质量均在30 g以上，1.00、1.40、1.96、2.74 g/kg剂量组在观察期间未见死亡，未出现毒性反应。小鼠剖检检查结果显示，各药物组小鼠的主要组织器官正常，脏器无实质性异常变化。

急性毒性试验结果表明，采用改良寇氏法计算注入剂药物的LD₅₀为5394.0 mg/kg，95 %置信区间为：3548.4--4010.6 mg/kg，属于基本无毒。

实施例6：

中药提取液4号的体外抑菌试验：

（1）试验菌株：无乳链球菌(S. agalactiae)、乳房链球菌(S. uberis) 为本实验室从乳房炎患牛乳汁中分离鉴定的优势菌株。停乳链球菌(S. dysgalactiae)[ATCC 35666]、金黄色葡萄球菌（S. aureus) [CMCC(B) 26003]、大肠埃希菌（E. coli) [CMCC(B) 44102]、变形杆菌(Proteusbacillus vulgaris) [CMCC(B) 49027]、化脓性链球菌 (S. pyogenes)[ATCC 19615]、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa) [CICC 10419]，分别购自中国普通微生物菌种保藏管理中心和中国工业微生物菌种保藏与管理中心，具有ATCC官方授权。

（2）试验方法

MIC 的测定：按美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的常量稀释法（macrodilution），测定实验菌株的最小抑菌浓度MIC值，通过管碟法观察其体外抑菌活性。稀释液为MH 肉汤。

琼脂稀释法：

接种菌量的准备：取各菌（细菌）的肉汤培养物，按10倍稀释法，用0.9 %无菌生理盐水溶液，制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的供试菌悬液，再用MH 肉汤稀释至含菌量为1×10⁷ CFU /mL，备用。

含药琼脂平板的制备：采用对倍稀释法，用MH 肉汤稀释待测药物，6 mL/管，1# 管至10# 管中的药物浓度依次为500 mg/mL（原药浓度）、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL、15.625 mg/mL、7.81 mg/mL、2.91 mg/mL、1.95 mg/mL、0.98 mg/mL。11# 管为不含药物的生长对照。取33个无菌培养皿，分别对其进行标注(1#～11#)。制备MH 营养琼脂11瓶，54 mL/瓶，121℃灭菌15 min。待温度降至50 ℃左右，链球菌用平板加入2 %小牛血清，再吸取1#～11# 管内不同浓度的待测药物6 mL，依次加入54 mL 的MH营养琼脂中(药物:琼脂=1：9，v/v)，充分混匀，倾注灭菌平皿，20 mL/皿，琼脂厚度以4 mm为宜。

接种：在平板上划定区域，移液枪吸取制备好的稀释菌液1～2 μL，接种琼脂平板表面，每个接种点约含10⁴个菌。接种后形成的菌液圈直径约5～8 mm。培养：接种点菌液干后，将平板菌置于37 ℃恒温培养箱中孵育16～24 h。

结果判断：菌落生长被完全抑制的最低药物浓度即为受试中药对检测菌的最低抑菌浓度（完全无菌生长的平板所对应的药物浓度作为最低抑菌浓度）。单一菌落生长可忽略不计。各菌重复3次，求平均值。

管碟法：采用牛津杯加注药液的体外抑菌法。

培养基平板的制备：水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）琼脂培养基（pH 7.2-7.4）按商品说明书进行配制。121 ℃灭菌15 min，待温度降至50～60℃左右，倾注无菌平皿，使琼脂厚度为4 mm。链球菌使用含5 %脱纤维绵羊血（v/v）的MH琼脂平板。MH琼脂平板使用前应置35 ℃孵育30 min，使其表面干燥。

牛津杯加注药液法：将制备的菌液用灭菌生理盐水稀释至最佳涂布浓度，用灭菌棉签蘸取菌液，将多余的菌液沿管壁挤出，然后均匀涂布至MH琼脂平板，共3次，每次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂抹一周，以取得均匀接种。平板加盖置放于超净工作台内，干燥至少3 min，不超过15 min。将灭菌牛津杯在酒精灯上微灼，在每个琼脂平板表面上等距离放置4只牛津杯，并在每只牛津杯中加入受试药液原液200 uL。在牛津杯上覆盖2张灭菌滤纸（以防培养时水珠掉下影响实验结果），合盖，平皿平置，于37℃恒温培养箱中孵育20～24h。

结果观察：用游标卡尺测量药物对各菌的抑菌环直径，并评价其抑菌效果。试验在相同条件下重复1次，两次结果应基本一致，否则不予报道。结果判定：抑菌环直径小于10mm，为无抑菌作用；介于在10～15 mm，为抑菌作用较弱；大于20 mm，为具有较强抑菌作用。

（3）结果与分析：（见表 1）

表 1 中药提取液4号的最小抑菌浓度(MIC)及抗菌活性。

结果显示，中药提取物4号对不同奶牛乳房炎常见病原菌表现出不同的抑菌作用，对链球菌属的抑菌效果较强，MIC值小于31.25 mg/mL，对金黄色葡萄球菌和变性杆菌具有一定的抑菌作用，MIC为62.5 mg/mL，而对常见肠杆菌具有较弱的抑菌作用，MIC值在125mg/mL左右。其次，中药提取物4号的原药（500 mg/mL）对试验菌株均有一定抑制作用，但抑菌强度不同。对链球菌属及金黄色葡萄球菌具有较好的抑菌效果，抑菌环直径介于21-23mm之间；对金黄色葡萄球菌及肠杆菌具有较弱的抑菌活性，抑菌环直径介于15-18 mm之间，在牛津杯周围可见明显的药物作用圈，作用圈内可见少量散在小菌落。

实施例7：

乳房注入剂药物的临床疗效观察试验：

1. 材料与方法：

1.1 试验药品：

乳房注入剂药物，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所创新兽药工程重点研究室制备。对照药：注射用氨苄西林钠（2 g/支，郑州百瑞动物药业有限公司）。奶牛乳腺炎诊断液（LMT 诊断液），由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所中兽医研究室制备。

1.2 试验方法：

患病奶牛分别来自甘肃省荷斯坦奶牛繁育示范中心、甘肃秦王川奶牛场试验场，共计26头28个乳区。奶牛临床型乳房炎10头10个乳区，奶牛隐性乳房炎16头18个乳区（其中2头患牛为双乳区炎症症状）。

奶牛临床型乳房炎诊断标准为：奶牛产奶量下降，乳房部分肿胀发红，有热和痛感，牛奶中有薄片、絮状物、脓块或血液，牛奶呈稀水样或挤不下来。严重时则表现为乳房突然肿胀、发热、变硬、乳区敏感，甚至表现体温升高、饮食大减或废绝、精神萎顿等。根据临床症状、乳房触诊和乳汁检查，可确定为临床型乳腺炎。

奶牛隐性乳房炎的确诊：乳房及乳样无上述症状及表现，LMT诊断液现场诊断呈阳性，乳区乳样经细菌分离培养、鉴定，可见常见致病菌生长。

奶牛乳房炎治愈标准：眼观为临床红肿热痛症状消失，乳汁正常，现场LMT诊断为阴性结果，乳区奶样的细菌分离培养无细菌生长。

试验分组：

（1）4头临床型乳房炎患牛及4头隐性乳房炎患牛，为抗生素治疗对照组，采用注射用氨苄西林钠，按照说明书方法使用。

（2）其余18头患病奶牛为注入剂药物治疗组，乳房注入剂药物的使用：将患病乳区乳汁挤干，注入药物50 mL/乳区，每日2 次，3 天为1疗程。

治愈判定标准：

（1）临床症状消失，乳汁正常；（2） LMT 诊断为阴性。

1.3 奶牛乳腺炎患牛的疗效观察：

药物治疗试验结果如表 2所示。

表 2

结果表明，使用乳房注入剂药物后，患牛乳房部位红、肿、热、痛、硬症状明显减轻，消肿快，无不良反应，回奶迅速，肉眼观察奶样恢复正常，奶产量逐渐提高。对于急性临床型病例，乳房注入剂的治愈效果低于对照抗生素药物，但该药对隐性乳房炎具有较好的治疗效果，用药5天后，有10头12个乳区的乳房炎症状消失或明显改善，头治愈率和乳区治愈率均高于对照药物组。

本发明制备抗DP-BM-IgY卵黄抗体所使用的菌种购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC），其中，无乳链球菌（分类命名：S.agalactiae，编号CVCC55901，牛源）、停乳链球菌（分类命名：S.dysgalactiae，编号CVCC55935 牛源）、金黄色葡萄球菌（分类命名：S.aurrus，编号CVCC 8029 牛源）及大肠杆菌（分类命名：E.coli，O157：K88，编号CVCC1489牛源）。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，其特征在于，所述药物注入剂包含有特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体和中药组合物提取液，为乳房注入剂。

2.根据权利要求1所述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，其特征在于，所述药物注入剂中，按照体积百分比计特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体：中药组合物提取液为（5%-15%）：（10%-25%）。

3.根据权利要求2所述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，其特征在于，所述药物注入剂中，按照体积百分比计特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体：中药组合物提取液为10%：20%。

4.根据权利要求1-3任一所述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，其特征在于，所述中药组合物由按照重量份计的以下原料药组成：漏芦5-15 份，蒲公英5-15份，紫花地丁5-15 份，连翘5-20 份，地榆5-15 份，瓜蒌5-15 份，当归5-10 份，黄芪10-20 份。

5.根据权利要求4所述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，其特征在于，所述中药组合物由按照重量份计的以下原料药组成：漏芦6 份，蒲公英10份，紫花地丁10 份，连翘12份，地榆8 份，瓜蒌10 份，当归7 份，黄芪15份。

6.根据权利要求5所述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂，其特征在于，所述特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体的制备方法包括以下步骤：

7.根据权利要求5所述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）特异性抗DP-BM-IgY卵黄抗体的制备方法：

2）中药组合物提取液的制备方法：

3）乳房注入剂药物的制备方法：

8.根据权利要求1所述的一种用于治疗奶牛乳腺炎的药物注入剂在制备用于防治奶牛乳腺炎的乳房注入剂药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述乳房注入剂药物的使用量为每头奶牛每个乳区20-60 mL。