CN1544471A - 抗牛乳腺炎的卵黄抗体及其制备方法和制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗牛乳腺炎的卵黄抗体及其制备方法和制剂，旨在提供一种方便、高效、无毒副作用的抗牛乳腺炎的卵黄抗体，其产业化制备方法简单易行，提取效率高、产量高、成本低，使用后效果好，其制剂使用方便且可有效地预防和治疗奶牛乳腺炎。本发明主要以健康产卵的母鸡为免疫动物，利用引起牛乳腺炎常见病原菌为抗原，通过初次免疫、加强免疫、收集鸡卵并从卵黄中提取抗牛乳腺炎的卵黄抗体，其制剂包括液体制剂、固体制剂和半固体药膏制剂。本发明的抗牛乳腺炎的卵黄抗体及其制剂可用于预防和治疗因病原菌引起的牛乳腺炎。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗牛乳腺炎的卵黄抗体及其制备方法和制剂。
背景技术
奶牛乳房炎是奶牛养殖中常见疾病，随着奶牛业的迅速发展，该病发生率明显升高，其中显性乳房炎发病率达20-40％，隐性乳房炎发病率高达50-80％。病牛若得不到及时治疗，将会导致产奶量剧减，甚至造成无奶，严重地影响奶牛的生产性能，这将为养殖户带来巨大的经济损失。
经过科学研究、实验证明：病原微生物是引起乳房炎的主要病原，环境因素及管理方法、牛体状况也与本病的发生有关。引起乳房炎的主要病原菌是无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，其次有绿脓杆菌、化脓性棒状杆菌、乳房链球菌、诺卡氏菌等，另外，真菌如念珠菌属、毛孢子菌、胞浆菌属等、支原体如牛型支原体等、病毒如牛细小病毒等引起的感染也较为常见。
牛乳房炎有以下两种临床表现：
1、隐性乳房炎为临床乳房炎的潜伏期，该阶段没有明显的临床症状，只是产奶量有所下降，乳汁无明显眼观变化，只有应用生物试剂和仪器检测乳汁在物理、化学和生物等方面的变化，才能确定乳中有无病原菌存在。
2、临床乳房炎绝大多数临床乳房炎是由隐性乳房炎发展而来的。病牛呈现明显的临床症状，通常表现为乳房肿胀、乳孔闭塞，乳房触摸有硬块；乳汁稀稠异常，变色，带血或内含乳凝块、絮状物等。当细菌毒素及其分解产物进入血液循环，则呈现全身毒性作用，病牛会出现食欲减退，精神不振和体温升高等全身症状。
有关牛乳腺炎的防治，在预防方面主要通过以下措施：
(1)加强乳房炎尤其是隐性乳房炎的检测，做到及早发现和及早治疗，对感染牛要单独饲养，单独挤奶。
(2)注意挤奶卫生 挤奶前用清洁水喷淋乳头，用一次性棉纸或干净毛巾擦干净，且要保证一牛一块，挤奶后药浴乳头。
(3)讲究牛体卫生 对奶牛的尾毛、乳房及大腿根部皮毛定期刮剪，经常刷拭牛体。
(4)改善畜舍环境 要求畜舍通风良好，在奶牛乳房炎高发季节定期进行消毒，牛床保持清洁，垫草要定期更换，挤奶器具定时消毒及搞好饲养人员的个人卫生。
(5)提高营养水平，增加青绿多汁料和青贮料。
对于牛乳腺炎的治疗方面，一般临床乳房炎可采用乳房内灌注抗生素，如头孢畜健，每一发病乳区0.1-0.2g，每天一次；严重者除乳房灌注抗生素外，可配合肌注抗生素，如青霉素350万单位，链霉素4g，每日两次；同时可以用0.25％-0.5％普鲁卡因溶液400-500ml，一次静脉注射。通过这种办法治疗后的奶牛的牛奶在用药后48小时之内抗生素、激素等的残留量都非常的高，大大的超过了我国自定的绿色无污染标准和国际出口标准，这样的牛奶不得不被丢弃。这毫无疑问将造成非常大的经济损失。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是克服现有技术上的不足，提供一种方便、高效、无毒副作用的抗牛乳腺炎的卵黄抗体。
本发明所要解决的技术问题之二是提供一种上述抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三是提供一种使用方便的可预防和治疗牛乳腺炎的制剂。
本发明所采用的技术方案是：一种抗牛乳腺炎的卵黄抗体，其特征在于，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱检测可以在分子量170～190KD处呈现单一条带，Western Bloting检测可以在分子量170～190KD处发现一条单一的特异性条带；或按照变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，WesternBloting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性条带，采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.1～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法包括以下步骤：
(1)、制备单一抗原或复合抗原：
①、无乳链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下
培养48小时，得到所述无乳链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩
大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭
活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
②、停乳链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下
培养48小时，得到所述停乳链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩
大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭
活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
③、乳房链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下
培养48小时，得到所述乳房链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩
大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭
活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
④、诺卡氏菌的培养：以营养琼脂斜面传代，置于37℃培养48～72小
时，得到所述诺卡氏菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72
小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林24℃灭活24小时后，
冻成干粉后作为单一抗原。
⑤、牛念珠菌的培养：以营养琼脂斜面传代，置于37℃培养48～72小
时，得到所述牛念珠菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72
小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，
冻成干粉后作为单一抗原。
⑥、牛支原体的培养：以营养琼脂斜面传代，置于37℃培养48～72小
时，得到所述牛支原体的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72
小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，
冻成干粉后作为单一抗原。
⑦、金黄色葡萄球菌：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养
24小时，得到所述金黄色葡萄球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩
大培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24
小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
⑧、绿脓杆菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养
24小时，得到所述绿脓杆菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养
24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，
冻成干粉后作为单一抗原。
⑨、化脓性棒状杆菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃在厌
氧条件下培养24小时，得到所述化脓性棒状杆菌的纯种后，在肉
汤培养基中扩大培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马
林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
⑩、毛孢子菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养
24小时，得到所述毛孢子菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养
24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，
冻成干粉后作为单一抗原。
、胞浆菌属的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培
养24小时，得到所述胞浆菌属的纯种后，在肉汤培养基中扩大
培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24
小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
、大肠杆菌的培养：以LB琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养
24小时，得到所述胞浆菌属的纯种后，在肉汤培养基中扩大培
养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小
时后，冻成干粉后作为单一抗原。
任取上述12种单一抗原中的二种或二种以上进行组合即得所述的复合抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂与所述单一抗原或复合抗原按照重量
比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不
完全佐剂与所述单一抗原或复合抗原重量比为1∶1混合乳化后作
为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述
免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周
加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收
集鸡卵，4℃储存备用。
③、卵黄抗体的提取：
卵黄抗体的提取可采用以下四种方法之一：
a、用水稀释法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离
得到蛋黄，以去离子纯水稀释，适当调节PH值，4℃搅
拌4小时，离心后弃去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥，
即得抗体。
b、采用PEG沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中
分离得到蛋黄，加入3倍蛋黄体积的4％的PEG进行稀
释，充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，取上
清，然后向上清内逐滴滴加1/6上清体积40％的PEG后
充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，收集沉淀，
冷冻干燥，即得抗体。
c、膜过滤法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得
到蛋黄，以去离子水稀释，4℃静置12小时后，以分子
量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集
150KD～200KD的蛋白物质，冷冻干燥即得抗体。
d、硫酸铵沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分
离得到蛋黄，提取3次：以等体积的生理盐水稀释收集
到的蛋黄并混合均匀后，缓慢滴加2倍体积的50％饱和
硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm离心10
分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入2/3体
积的40％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，
13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，
同步加入1/2体积的33％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，
将沉淀直接冷冻干燥即得抗体。
④、通过上述步骤采用单一抗原进行免疫后所得到的抗体作为单一
抗体；或通过上述步骤采用复合抗原进行免疫后所得到的抗体
作为复合抗体；或将所述单一抗体和复合抗体中的任意两种或
两种以上抗体混合所得到的抗体作为组合抗体。
一种上述抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制剂，它包含所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体。
它可以是液体制剂。
它也可以是固体制剂。
它也可以是半固体药膏制剂。
本发明的有益效果是：本发明通过用无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、诺卡氏菌、牛念珠菌、牛支原体、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、化脓性棒状杆菌、毛孢子菌、胞浆菌属菌体作为抗原免疫健康产蛋的母鸡，提取卵黄中的活性成分抗牛乳腺炎的卵黄抗体(抗乳腺炎IgY)，该抗体是一种天然的免疫球蛋白，可以有效地控制和杀灭相应的病原菌，采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度，经过体外抑菌实验检测，单一抗体浓度在1～1000μg/ml时可以明显抑菌，它具有方便、高效、无毒副作用、无残留特点，可用于预防和治疗奶牛因病原性微生物混合感染或单一感染引起的乳腺炎；本发明抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法简单、快速、易于掌握，提取效率高、低成本、高产量，同时易于产业化；本发明的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制剂，它使用方便且可有效地预防和治疗奶牛因病原性微生物混合感染或单一感染引起的乳腺炎，其中液体制剂可以直接注入牛乳腺导管内或作为喷雾剂，固体制剂可以通过口服进入牛体内，半固体药膏制剂可以被涂抹在牛体表。
以下通过实验例说明本发明的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的有益效果：
实验例一：所述抗乳腺炎的卵黄抗体体外抑菌实验
所述抗乳腺炎的卵黄抗体(5μg～250μg/ml)与相应的病原菌(无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、诺卡氏菌、牛念珠菌、牛支原体、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、化脓性棒状杆菌、毛孢子菌、胞浆菌属)在无菌条件下1∶1混合，37℃培养3小时后，取200μl上清加入相应的固体培养平板上培养，发现其浓度在50μg～150μg/ml可以有效抑制病原菌的生长。
实验例二：抗乳腺炎的卵黄抗体体内生物学活性实验
参照相关文献建立牛乳腺炎动物模型，试验分为治疗组(低剂量(1μg/kg)、中剂量(500μg/kg)、高剂量(1000μg/kg)抗乳腺炎的卵黄抗体)，对照组；治疗3、6、9天后，观察牛的情况。结果发现低剂量组治疗6天后，牛乳腺基本恢复正常，中、高剂量组治疗3天后牛乳腺基本恢复正常，而对照组牛乳腺炎无明显改善甚至加重。
附图说明
图1是本发明抗乳腺炎的卵黄抗体的制备方法主要工艺流程图。
具体实施方式
图1给出了本发明抗乳腺炎的卵黄抗体的制备方法主要工艺流程图。
实施例1：
本发明的抗牛乳腺炎的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱检测可以在分子量170～190KD处呈现单一条带，Western Bloting检测可以在分子量170～190KD处发现一条单一的特异性条带；或按照变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为12.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，Western Bloting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性条带，采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.1～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法是按以下步骤完成：
(1)、制备复合抗原：
①、无乳链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下
培养48小时，得到所述无乳链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩
大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭
活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
②、停乳链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下
培养48小时，得到所述停乳链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩
大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭
活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
③、乳房链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下
培养48小时，得到所述乳房链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩
大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭
活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
④、诺卡氏菌的培养：以营养琼脂斜面传代，置于37℃培养48～72小
时，得到所述诺卡氏菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72
小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林24℃灭活24小时后，
冻成干粉后作为单一抗原。
⑤、牛念珠菌的培养：以营养琼脂斜面传代，置于37℃培养48～72小
时，得到所述牛念珠菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72
小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，
冻成干粉后作为单一抗原。
⑥、牛支原体的培养：以营养琼脂斜面传代，置于37℃培养48～72小
时，得到所述牛支原体的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72
小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，
冻成干粉后作为单一抗原。
⑦、金黄色葡萄球菌：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养
24小时，得到所述金黄色葡萄球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩
大培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24
小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
⑧、绿脓杆菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养
24小时，得到所述绿脓杆菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养
24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，
冻成干粉后作为单一抗原。
⑨、化脓性棒状杆菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃在厌
氧条件下培养24小时，得到所述化脓性棒状杆菌的纯种后，在肉
汤培养基中扩大培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马
林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
⑩、毛孢子菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养
24小时，得到所述毛孢子菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养
24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，
冻成干粉后作为单一抗原。
、胞浆菌属的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培
养24小时，得到所述胞浆菌属的纯种后，在肉汤培养基中扩大
培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24
小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
、大肠杆菌的培养：以LB琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养
24小时，得到所述胞浆菌属的纯种后，在肉汤培养基中扩大培
养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小
时后，冻成干粉后作为单一抗原。
取上述12种单一抗原进行组合即得所述的复合抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂(Freund′s Adjuvant complete)与所述
复合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强
免疫均选用弗氏不完全佐剂(Freund′s Adjuvant incomplete)与所述
复合抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述
免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周
加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收
集鸡卵，4℃储存备用。
③、用水稀释法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，
以去离子纯水稀释，适当调节PH值，4℃搅拌4小时，离心后弃
去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥，即得复合抗体。
实施例2：
本发明的抗牛乳腺炎的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱检测可以在分子量170～190KD处呈现单一条带，Western Bloting检测可以在分子量170～190KD处发现一条单一的特异性条带；或按照变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为12.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，Western Bloting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性条带，采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.1～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法是按以下步骤完成：
(1)、制备复合抗原：
①、无乳链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下
培养48小时，得到所述无乳链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩
大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭
活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
②、停乳链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下
培养48小时，得到所述停乳链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩
大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭
活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
③、乳房链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下
培养48小时，得到所述乳房链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩
大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭
活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
取上述3种单一抗原进行组合即得所述的复合抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂(Freund′s Adjuvant complete)与所述
复合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强
免疫均选用弗氏不完全佐剂(Freund′s Adjuvant incomplete)与所述
复合抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述
免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周
加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收
集鸡卵，4℃储存备用。
③、用PEG沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋
黄，加入3倍蛋黄体积的4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后4
℃，1300rpm离心10分钟，取上清，然后向上清内逐滴滴加1/6上
清体积40％的PEG后充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，
收集沉淀，冷冻干燥，即得所述复合抗体。
实施例3：
本发明的抗牛乳腺炎的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱检测可以在分子量170～190KD处呈现单一条带，Western Bloting检测可以在分子量170～190KD处发现一条单一的特异性条带；或按照变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为12.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，Western Bloting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性条带，采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.1～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法是按以下步骤完成：
(1)、制备单一抗原：
诺卡氏菌的培养：以营养琼脂斜面传代，置于37℃培养48～72小时，
得到所述诺卡氏菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72小时收集
菌体，所述菌体用0.5％福尔马林24℃灭活24小时后，冻成干粉后作
为单一抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂(Freund′s Adjuvant complete)与所述
单一抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强
免疫均选用弗氏不完全佐剂(Freund′s Adjuvant incomplete)与所述
单一抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述
免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周
加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收
集鸡卵，4℃储存备用。
③、膜过滤法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，
以去离子水稀释，4℃静置12小时后，以分子量为200KD和150KD
的膜分别过滤，收集150KD～200KD的蛋白物质，冷冻干燥即得
所述单一抗体。
实施例4：
本发明的抗牛乳腺炎的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱检测可以在分子量170～190KD处呈现单一条带，Western Bloting检测可以在分子量170～190KD处发现一条单一的特异性条带；或按照变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为12.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，Western Bloting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性条带，采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.1～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法是按以下步骤完成：
(1)、制备单一抗原：
毛孢子菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养24
小时，得到所述毛孢子菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养24小
时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干
粉后作为单一抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂(Freund′s Adjuvant complete)与所述
单一抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强
免疫均选用弗氏不完全佐剂(Freund′s Adjuvant incomplete)与所述
单一抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述
免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周
加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收
集鸡卵，4℃储存备用。
③、酸铵沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，
提取3次：以等体积的生理盐水稀释收集到的蛋黄并混合均匀后，
缓慢滴加2倍体积的50％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，
13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入
2/3体积的40％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm
离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入1/2体积的
33％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，将沉淀直接冷冻干燥即得抗体。
实施例5：
取通过实施例1所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法制得的复合抗体与通过实施例3所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法制得的单一抗体混合得到组合抗体。
实施例6：
取通过实施例1和实施例2所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法制得的两种复合抗体与通过实施例3和实施例4所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法制得的两种单一抗体混合得到组合抗体。
实施例7：
取通过实施例3和实施例4所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法制得的两种单一抗体混合得到组合抗体。
实施例8：
取通过实施例6所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法制得的组合抗体400mg与磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)4.45g、磷酸二氢钾(KH2PO4)3.40g、山梨酸钾2g、氯化钠4.22g和蒸馏水98.643g混合制得抗牛乳腺炎的卵黄抗体的液体制剂1000g，它可以作为喷雾剂用于预防和治疗奶牛因病原性微生物感染引起的乳腺炎。
实施例9：
取通过实施例1所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法制得的复合抗体与氢化植物油、羟丙甲纤维素和硬脂酸镁混合后制成固体片剂，每片含所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体0.3mg、氢化植物油5mg、羟丙甲纤维素25mg、硬脂酸镁2mg。该固体片剂可以通过口服进入牛体内，以预防和治疗奶牛因病原性微生物感染引起的乳腺炎。
实施例10：
取通过实施例3所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法制得的单一抗体与卡波姆940和丙二醇混合，调节pH值到7.4，制成半固体药膏制剂，其中上述各成分的含量为：
所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体 0.3％
卡波姆940 1％
丙二醇： 40％
该半固体药膏制剂可以被涂抹在牛体表，以预防和治疗奶牛因诺卡氏菌感染引起的乳腺炎。
Claims (6)
1、一种抗牛乳腺炎的卵黄抗体，其特征在于，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱检测可以在分子量170～190KD处呈现单一条带，Western Bloting检测可以在分子量170～190KD处发现一条单一的特异性条带；或按照变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，Western Bloting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性条带，采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.1～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
2、一种权利要求1所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)、制备单一抗原或复合抗原：
①、无乳链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下培养48小时，得到所述无乳链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
②、停乳链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下培养48小时，得到所述停乳链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
③、乳房链球菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，37℃在厌氧条件下培养48小时，得到所述乳房链球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
④、诺卡氏菌的培养：以营养琼脂斜面传代，置于37℃培养48～72小时，得到所述诺卡氏菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林24℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
⑤、牛念珠菌的培养：以营养琼脂斜面传代，置于37℃培养48～72小时，得到所述牛念珠菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
⑥、牛支原体的培养：以营养琼脂斜面传代，置于37℃培养48～72小时，得到所述牛支原体的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养48～72小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
⑦、金黄色葡萄球菌：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养24小时，得到所述金黄色葡萄球菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
⑧、绿脓杆菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养24小时，得到所述绿脓杆菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
⑨、化脓性棒状杆菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃在厌氧条件下培养24小时，得到所述化脓性棒状杆菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
⑩、毛孢子菌的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养24小时，得到所述毛孢子菌的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
、胞浆菌属的培养：以牛血清琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养24小时，得到所述胞浆菌属的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
、大肠杆菌的培养：以LB琼脂斜面传代，置于37℃条件下培养24小时，得到所述胞浆菌属的纯种后，在肉汤培养基中扩大培养24小时收集菌体，所述菌体用0.5％福尔马林25℃灭活24小时后，冻成干粉后作为单一抗原。
任取上述12种单一抗原中的二种或二种以上进行组合即得所述的复合抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂与所述单一抗原或复合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不完全佐剂与所述单一抗原或复合抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃储存备用。
③、卵黄抗体的提取：
卵黄抗体的提取可采用以下四种方法之一：
a、用水稀释法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，以去离子纯水稀释，适当调节PH值，4℃搅拌4小时，离心后弃去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥，即得抗体。
b、采用PEG沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，加入3倍蛋黄体积的4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，取上清，然后向上清内逐滴滴加1/6上清体积40％的PEG后充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得抗体。
c、膜过滤法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，以去离子水稀释，4℃静置12小时后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD～200KD的蛋白物质，冷冻干燥即得抗体。
d、硫酸铵沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，提取3次：以等体积的生理盐水稀释收集到的蛋黄并混合均匀后，缓慢滴加2倍体积的50％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入2/3体积的40％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入1/2体积的33％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，将沉淀直接冷冻干燥即得抗体。
④、将通过上述步骤采用单一抗原进行免疫后所得到的抗体作为单一抗体；或通过上述步骤采用复合抗原进行免疫后所得到的抗体作为复合抗体；或将所述单一抗体和复合抗体中的任意两种或两种以上抗体混合所得到的抗体作为组合抗体。
3、一种权利要求1所述抗牛乳腺炎的卵黄抗体的制剂，其特征在于，它包含所述的抗牛乳腺炎的卵黄抗体。
4、根据权利要求3所述的一种制剂，其特征在于，它是液体制剂。
5、根据权利要求3所述的一种制剂，其特征在于，它是固体制剂。
6、根据权利要求3所述的一种制剂，其特征在于，它是半固体药膏制剂。
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