CN1556113A - 抗sars冠状病毒的卵黄抗体及其制备方法和液体制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗SARS冠状病毒的卵黄抗体及其制备方法和液体制剂。本发明主要以健康产卵的母鸡为免疫动物，利用基因工程的方法重组基因蛋白S、M或E作为抗原；或特选代表SARS冠状病毒的S蛋白或M蛋白或E蛋白的抗原表位，利用多肽合成仪合成S、M或E的多肽作为抗原，或偶联后作为抗原；或野生型毒株全病毒灭活后作为抗原，通过初次免疫、加强免疫、收集鸡卵并从卵黄中提取抗SARS冠状病毒的卵黄抗体，该抗体还可制成液体制剂。本发明的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体及其液体制剂可用于预防因SARS冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗SARS冠状病毒的卵黄抗体及其制备方法和液体制剂。
背景技术
2002年11月份开始在我国广东地区出现的以发热、肺部感染为特征的疾病，国际上称为严重急性呼吸综合征(Severe Acute RespiratorySyndrome，简称SARS)。截止2003年5月26日止，全球已有31个国家发现了SARS病例，全球累计病例数达到8202例，我国内地有25个省市自治区有该病流行，累计病例数达到5316例。该病的流行对各国的经济和社会稳定都产生了非常严重的影响。
SARS病毒属于冠状病毒科，病毒粒子多呈圆形，有囊膜，外周有冠状排列的纤突，病毒直径在80-120nm之间。该病毒散在分布于细胞浆中，呈圆形，直径多在90nm左右。感染病毒的细胞线粒体肿胀，部分线粒体外膜或嵴溶解。
SARS冠状病毒为单链单节段(+)RNA病毒，全长29.725kb，具有11个ORF(Open Reading Frames)，分别编码：依赖于RNA的RNA聚合酶、4种结构蛋白(S，E，M，N蛋白)、5种未知蛋白，与其它宿主来源冠状病毒的序列比较，进化分析，呈一单独的分支。该病毒在增殖过程中虽没有逆转录过程，但RNA聚合酶没有矫正机制，变异较大，现已知SARS病毒至少有6个变种。这给治疗SARS带来了巨大困难。
经过序列测定并比较，SARS病毒基因组与其他冠状病毒的结构相似。SARS病毒基因组初步的基因组注释在NCBI(Genebank Accession No.NC 004718)完成，预测得到的主要蛋白质有RNA聚合酶蛋白(聚合酶1a，1b)，S蛋白(spike protein)，M蛋白(matrix protein)，N蛋白(nucleocapsidprotein)、E(small envelope protein)蛋白等。
SARS的流行病学特点及临床过程与以往的冠状病毒感染有极大的不同，大多数SARS发生在青壮年。SARS的最常见的传染途径为密切接触，包括传染性的飞沫以及直接与传染性体液接触。
截至目前，人们还没有找到很好的预防和治疗SARS病毒的方法。目前常用的预防SARS病毒的消毒剂主要有含氯消毒液和过氧乙酸消毒剂，以及最新研发出来的新型的含溴消毒剂，这些消毒剂尽管可以有效的杀灭冠状病毒，但同时它们对人体有比较强烈的刺激性和腐蚀性，因此只能用于日常物品的消毒，无法对人体进行消毒保护。在治疗SARS方面，目前人们还没有非常好的治疗手段，基本上都是针对出现的体征，进行对症治疗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是克服现有技术上的不足，提供一种方便、高效、无毒副作用、可对人体进行消毒的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体。
本发明所要解决的技术问题之二是提供一种所述抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法。
本发明所要解决的技术问题之三是提供一种使用方便的可预防和治疗SARS冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征的液体制剂。
本发明所采用的技术方案是：一种抗SARS冠状病毒的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现单一条带，Western Blotting检测可以在分子量约170～190KD处发现一条单一的特异性酶染条带；或按照变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，Western Blotting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性酶染条带；采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.5～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法，它包括以下步骤：
(1)、制备单一抗原或复合抗原：
①、基因重组法：利用基因工程的方法，构建含有SARS冠状病毒的S蛋白、M蛋白、E蛋白的表达质粒，在大肠杆菌宿主中进行表达，然后分离并纯化表达产物作为单一蛋白抗原；取上述分离纯化后的表达产物二种或二种以上进行组合可得所述的复合蛋白抗原。
②、多肽合成法：利用多肽合成仪合成SARS冠状病毒S蛋白或M蛋白或E蛋白的以下任一抗原表位的多肽，作为单一多肽抗原。所述S蛋白的抗原表位分别为：
PepS1(dvqapnytqhtssmrg)
PepS2(stgnynykyrylrhgklrp)
PepS3(psskrfqpfqqfg)
PepS4(vrdpktseildispc)
PepS5(aaeqdrntrevfa)
PepS6(lpdplkptkrsfi)
PepS7(psqernfttapaic)
PepS8(peldsfkeeldk)
PepS9(qelgkyeqyikwp)
PepS10(snfrvvpsgdvvrfp)
PepS11(ctdvstaihadqltpa)
PepS12(keeldkyfk nhtspdvd)
所述M蛋白的抗原表位分别为：
PepM1(madngtitveelkq)
PepM2(ysnrnrflyiik)
PepM3(artrsmwsfnpetn)
PepM4(aviirghlrmaghslgrc)
PepM5(gasqrvgtdsgf)
PepM6(nyklntdhagsndniallvq)
所述E蛋白的抗原表位分别为：
PepE1(mysfvseetgt)
PepE2(vkptvyvysrv)
PepE3(knlnssegvpdllv)
任取上述21种单一多肽抗原中的二种或二种以上进行组合可
得所述的复合多肽抗原。
③、多肽抗原偶联法：
其步骤是，
a、取1mg KLH或BSA于1.5ml离心管中，用100μl的PH10.0硼酸缓冲液充分溶解，10000rpm离心1分钟，将上清转移到干净的离心管；
b、称上述方法②制得的22个抗原表位之一的多肽1μmol，用100μl的pH10.0硼酸缓冲液溶解；
c、将步骤a制得的KLH或BSA溶液逐滴加到多肽溶液中；
d、边震荡边缓慢加入新鲜配制的0.3％戊二醛溶液0.1ml，室温作用2小时，中间倒转试管数次；
e、加入1M甘氨酸25μl，反应30min；
f、以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜，换液一次，继续透析不少于4小时。
按上述步骤对方法②制得的21个抗原表位的多肽偶联后的抗原作为单一多肽抗原，任取上述二种或二种以上单一多肽抗原进行组合可得所述的复合多肽抗原。
④、野生型毒株全病毒灭活法：
a、SARS冠状病毒的培养：取新鲜的SARS冠状病毒悬液，接种于Vero E6细胞，在33～35℃的CO2培养箱内培养5～9天后，收集病变细胞的上清液。
b、SARS冠状病病毒的灭活：向步骤a所制得的病毒上清液中，加入甲醛溶液使其终浓度为0.1～3％，37℃作用24～96小时，使SARS冠状病毒完全灭活。
c、SARS冠状病毒的浓缩：将经过步骤b灭活的病毒悬液超滤后得到浓缩的灭活SARS冠状病毒。
按照上述步骤所得到的灭活的SARS冠状病毒作为单一抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂与所述单一抗原或复合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不完全佐剂与所述单一抗原或复合抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃储存备用。
③、卵黄抗体的提取：
卵黄抗体的提取可采用以下四种方法之一：
a、用水稀释法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，以去离子纯水稀释，适当调节PH值，4℃搅拌4小时，离心后弃去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥，即得抗体。
b、采用PEG沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，加入3倍蛋黄体积的4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，取上清，然后向上清内逐滴滴加1/6上清体积40％的PEG后充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得抗体。
c、膜过滤法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，以去离子水稀释，4℃静置12小时后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD～200KD的蛋白物质，冷冻干燥即得抗体。
d、硫酸铵沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，提取3次：以等体积的生理盐水稀释收集到的蛋黄并混合均匀后，缓慢滴加2倍体积的50％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入2/3体积的40％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入1/2体积的33％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，将沉淀直接冷冻干燥即得抗体。
④、通过上述步骤采用单一抗原进行免疫后所得到的抗体作为单一抗体；或通过上述步骤采用复合抗原进行免疫后所得到的抗体作为复合抗体；或将所述单一抗体和复合抗体中的任意两种或两种以上抗体混合所得到的抗体作为组合抗体。
一种所述抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的液体制剂，它包含所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体。
本发明的有益效果是：本发明利用基因工程的方法构建含有SARS冠状病毒S蛋白或M蛋白或E蛋白的表达质粒，在大肠杆菌宿主中进行表达，然后分离并纯化表达产物作为抗原，或特选代表SARS冠状病毒的S蛋白或M蛋白或E蛋白的抗原表位，利用多肽合成仪合成S、M或E的多肽，偶联后作为抗原，免疫健康产蛋的母鸡，提取卵黄中的活性成分——抗SARS冠状病毒的卵黄抗体(抗SARS冠状病毒IgY)，该抗体是一种天然的免疫球蛋白，可以有效地抑制和清除SARS冠状病毒。采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度，经过体外抑菌实验检测，单一抗体浓度在0.5～20mg/ml时可以明显抑制SARS冠状病毒对人体的侵入。它具有使用方便、高效、无毒副作用，可对人体进行消毒的特点，可用于预防SARS冠状病毒引起的严重急性呼吸综合症；本发明中抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法简单、快速，提取效率高、成本低、产量高，易于产业化；本发明的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的液体制剂，可有效地预防SARS冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征。
以下通过实验例说明本发明的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的有益效果：
实验例：所述抗SARS冠状病毒的卵黄抗体病毒中和实验
抗SARS冠状病毒卵黄抗体(Anti-SARS IgY)(5μg～250μg/ml)与SARS冠状病毒在无菌条件下1∶1混合，37℃培养3小时后，取200ul上清加入Vero-E6细胞中培养，发现其浓度在100μg～1000μg/ml可以有效抑制SARS冠状病毒对Vero-E6细胞的感染。
附图说明
图1是抗SARS冠状病毒的卵黄抗体非变性聚丙烯凝胶电泳图谱；
图2是抗SARS冠状病毒的卵黄抗体变性聚丙烯凝胶电泳图谱；
图3是本发明抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法主要工艺流程图。
具体实施方式
图1为抗SARS冠状病毒的卵黄抗体非变性聚丙烯凝胶电泳图谱；
图2为抗SARS冠状病毒的卵黄抗体变性聚丙烯凝胶电泳图谱；
图3为本发明抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法主要工艺流程图。
实施例1：
本发明的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现单一条带，Western Blotting检测可以在分子量约170～190KD处发现一条单一的特异性酶染条带(如图1)；或按照变形聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，WesternBlotting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性酶染条带(如图2)；采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.5～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法是采用以下步骤完成的：
(1)、基因重组法制备复合抗原：
利用基因工程的方法，构建含有SARS冠状病毒S蛋白、M蛋白和E蛋白的表达质粒，在大肠杆菌宿主中分别进行表达，然后分离并纯化表达产物进行组合即得所述的复合蛋白抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂(Freund′s Adjuvant complete)与所述复合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不完全佐剂(Freund′s Adjuvant incomplete)与所述复合抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃储存备用。
③、用水稀释法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，以去离子纯水稀释，适当调节PH值，4℃搅拌4小时，离心后弃去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥，即得复合抗体。
实施例2：
本发明的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现单一条带，Western Blotting检测可以在分子量约170～190KD处发现一条单一的特异性酶染条带(如图1)；或按照变形聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，WesternBlotting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性酶染条带(如图2)；采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.5～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法是按以下步骤完成：
(1)、多肽合成法制备复合抗原：
利用多肽合成仪合成代表SARS冠状病毒S蛋白、M蛋白、E蛋白的以下各抗原表位的多肽，
所述S蛋白的抗原表位分别为：
PepS1(dvqapnytqhtssmrg)
PepS2(stgnynykyrylrhgklrp)
PepS3(psskrfqpfqqfg)
PepS4(vrdpktseildispc)
PepS5(aaeqdrntrevfa)
PepS6(lpdplkptkrsfi)
PepS7(psqernfttapaic)
PepS8(peldsfkeeldk)
PepS9(qelgkyeqyikwp)
PepS10(snfrvvpsgdvvrfp)
PepS11(ctdvstaihadqltpa)
PepS12(keeldkyfk nhtspdvd)
所述M蛋白的抗原表位分别为：
PepM1(madngtitveelkq)
PepM2(ysn rnrflyiik)
PepM3(artrsmwsfnpetn)
PepM4(aviirghlrmaghslgrc)
PepM5(gasqrvgtdsgf)
PepM6(nyklntdhagsndniallvq)
所述E蛋白的抗原表位分别为：
PepE1(mysfvseetgt)
PepE2(vkptvyvysrv)
PepE3(knlnssegvpdllv)
取上述21种多肽中的二种或二种以上进行组合即得所述的复合抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂(Freund′s Adjuvant complete)与所述复合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不完全佐剂(Freund′s Adjuvant incomplete)与所述复合抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃储存备用。
③、用PEG沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，加入3倍蛋黄体积的4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，取上清，然后向上清内逐滴滴加1/6上清体积40％的PEG后充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得复合抗体。
实施例3：
本发明的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现单一条带，Western Blotting检测可以在分子量约170～190KD处发现一条单一的特异性酶染条带(如图1)；或按照变形聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，WesternBlotting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性酶染条带(如图2)；采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.5～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法是按以下步骤完成：
(1)、抗原偶联法制备复合抗原：
其步骤是，
d、取1mg KLH(KEYHOLE LIMPET HEMOCYANIN，钥孔嘁血蓝素)或BSA(BOVINE SERUM ALBUMIN，牛血清白蛋白)于1.5ml离心管中，用100μl的PH10.0硼酸缓冲液充分溶解，10000rpm离心1分钟，将上清转移到干净的离心管；
e、称上述实施例2制得的22个抗原表位之一的多肽1μmol，用100μl的pH10.0硼酸缓冲液溶解；
f、将步骤a制得的KLH(KEYHOLE LIMPET HEMOCYANIN，钥孔嘁血蓝素)或BSA(BOVINE SERUM ALBUMIN，牛血清白蛋白)溶液逐滴加到多肽溶液中；
g、边震荡边缓慢加入新鲜配制的0.3％戊二醛溶液0.1ml，室温作用2小时，中间倒转试管数次；
h、加入1M甘氨酸25μl，反应30min；
i、以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜，换液一次，继续透析不少于4小时。
按上述步骤对实施例2制得的22个抗原表位的多肽偶联，取偶联后的抗原进行组合即得所述的复合抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂(Freund′s Adjuvant complete)与所述复合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不完全佐剂(Freund′s Adjuvant incomplete)与所述复合抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃储存备用。
③、用PEG沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，加入3倍蛋黄体积的4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，取上清，然后向上清内逐滴滴加1/6上清体积40％的PEG后充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得复合抗体。
实施例4：
本发明的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现单一条带，Western Blotting检测可以在分子量约170～190KD处发现一条单一的特异性酶染条带(如图1)；或按照变形聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，WesternBlotting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性酶染条带(如图2)；采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.5～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法是按以下步骤完成：
(1)、野生型毒株全病毒灭活法制备抗原：
a、SARS冠状病毒的培养：取新鲜的SARS冠状病毒悬液，接种于Vero E6细胞，在33～35℃的CO2培养箱内培养，每天对细胞病变效应进行观察并记录，培养5～9天后，收集病变细胞的上清液。
b、SARS冠状病病毒的灭活：向步骤a所得到的病毒上清液中，加入甲醛溶液使其终浓度为0.1～3％，37℃作用24～96小时，使SARS冠状病毒完全灭活。
c、SARS冠状病毒的浓缩：将经过步骤b灭活的病毒悬液超滤后得到浓缩的灭活SARS冠状病毒。
按照上述步骤所得到的灭活的SARS冠状病毒作为单一抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂(Freund′s Adjuvant complete)与所述单一抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不完全佐剂(Freund′s Adjuvant incomplete)与所述单一抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃储存备用。
③、膜过滤法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，以去离子水稀释，4℃静置12小时后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD～200KD的蛋白物质，冷冻干燥即得单一抗体。
实施例5：
本发明的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现单一条带，Western Blotting检测可以在分子量约170～190KD处发现一条单一的特异性酶染条带(如图1)；或按照变形聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，WesternBlotting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性酶染条带(如图2)；采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.5～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法是按以下步骤完成：
(1)、基因重组法制备单一抗原：
利用基因工程的方法，构建含有SARS冠状病毒M蛋白的表达质粒，在大肠杆菌宿主中分别进行表达，然后分离并纯化表达产物分别作为单一抗原；
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂(Freund′s Adjuvant complete)与所述单一抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不完全佐剂(Freund′s Adjuvant incomplete)与所述单一抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃储存备用。
③、膜过滤法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，以去离子水稀释，4℃静置12小时后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD～200KD的蛋白物质，冷冻干燥即得单一抗体。
实施例6：
本发明的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现单一条带，Western Blotting检测可以在分子量约170～190KD处发现一条单一的特异性酶染条带(如图1)；或按照变形聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，WesternBlotting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性酶染条带(如图2)；采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.5～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法是按以下步骤完成：
(1)、多肽合成法制备单一抗原：利用多肽合成仪合成SARS冠状病毒的S蛋白的抗原表位为PepS1(dvqapnytqhtssmrg)的多肽作为单一抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂(Freund′s Adjuvant complete)与所述单一抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不完全佐剂(Freund′s Adjuvant incomplete)与所述单一抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃储存备用。
③、硫酸铵沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，提取3次：以等体积的生理盐水稀释收集到的蛋黄并混合均匀后，缓慢滴加2倍体积的50％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入2/3体积的40％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入1/2体积的33％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，将沉淀直接冷冻干燥即得单一抗体。
实施例7：
本发明的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体，它按照非变性聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现单一条带，Western Blotting检测可以在分子量约170～190KD处发现一条单一的特异性酶染条带(如图1)；或按照变形聚丙烯凝胶电泳(分离胶浓度为6.0％)进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，WesternBlotting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性酶染条带(如图2)；采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.5～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法是按以下步骤完成：
(1)、制备单一抗原：先利用多肽合成仪合成SARS冠状病毒的M蛋白的抗原表位为PepM2(ysnrnrflyiik)的多肽，再按以下步骤进行多肽偶联，
a、取1mg KLH(KEYHOLE LIMPET HEMOCYANIN，钥孔嘁血蓝素)或BSA(BOVINE SERUM ALBUMIN，牛血清白蛋白)于1.5ml离心管中，用100μl的PH10.0硼酸缓冲液充分溶解，10000rpm离心1分钟，将上清转移到干净的离心管；
b、称上述抗原表位为PepM2(ysnrnrflyiik)的多肽1μmol，用100μl的pH10.0硼酸缓冲液溶解；
c、将步骤a制得的KLH(KEYHOLE LIMPETHEMOCYANIN，钥孔嘁血蓝素)或BSA(BOVINE SERUMALBUMIN，牛血清白蛋白)溶液逐滴加到多肽溶液中；
d、边震荡边缓慢加入新鲜配制的0.3％戊二醛溶液0.1ml，室温作用2小时，中间倒转试管数次；
e、加入1M甘氨酸25μl，反应30min；
f、以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜，换液一次，继续透析不少于4小时。
按上述步骤进行多肽偶联后的溶液作为单一抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂(Freund′s Adjuvant complete)与所述单一抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不完全佐剂(Freund′s Adjuvant incomplete)与所述单一抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃储存备用。
③、硫酸铵沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，提取3次：以等体积的生理盐水稀释收集到的蛋黄并混合均匀后，缓慢滴加2倍体积的50％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入2/3体积的40％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入1/2体积的33％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，将沉淀直接冷冻干燥即得单一抗体。
实施例8：
取通过实施例1所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法制得的复合抗体与通过实施例4所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法制得的单一抗体混合得到组合抗体。
实施例9：
取通过实施例1和实施例2所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法制得的两种复合抗体与通过实施例4和实施例6所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法制得的两种单一抗体混合得到组合抗体。
实施例10：
取通过实施例5和实施例6所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法制得的两种单一抗体混合得到组合抗体。
实施例11：
取通过实施例8所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法制得的组合抗体400mg与磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)4.45g、磷酸二氢钾(KH2PO4)3.40g、山梨酸钾2g、氯化钠4.22g和蒸馏水98.643g混合制得抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的液体制剂1000g，它可以作为喷雾剂用于预防SARS冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征。
实验例1：
取通过实施例7所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法制得的组合抗体按照如下步骤进行酶联免疫吸附实验检验抗体的活性：
1、抗原包埋
将ELISA板的A1、A2孔为空白对照。利用SARS灭活病毒作为抗原，并用包被液稀释抗原，使其浓度为10ug/ml。将稀释后的抗原加入酶标板，每孔200ul，放于4℃过夜。
2、封闭及抗原抗体的反应
①、取出酶标板倒去包被液，然后在干净纸巾上拍干酶标板。
②、以300ul的PBST加入酶标板各孔中，室温放置3分钟后，倒去PBST，将酶标板倒置于纸巾拍干，重复此步骤两次。
③、向每孔加入200ul PBST-BSA封闭，室温放置1.5小时。
④、倒掉封闭液，在干净纸巾上拍干酶标板。
⑤、以300ul的PBST加入酶标板各孔中，室温放置3分钟后，倒去PBST，将酶标板倒置于纸巾拍干，重复此步骤两次。
⑥、依次吸取稀释后的一抗(PBST稀释1000倍)加入相应孔中，每孔200ul，室温放置1.5小时。
⑦、弃去一抗稀释液，在干净纸巾上拍干酶标板。
⑧、以300ul的PBST加入酶标板各孔中，室温放置3分钟后，倒去PBST，将酶标板倒置于纸巾拍干，重复此步骤两次。
⑨、吸取稀释后的二抗(PBST稀释20000倍)加入相应孔中每孔200ul，室温放置1.5小时。
⑩、弃去二抗稀释液，在干净纸巾上拍干酶标板。以300ul的PBST加入酶标板各孔中，室温放置3分钟后，倒去PBST，将酶标板倒置于纸巾拍干，重复此步骤三次。
3、显色
①、以0.4mg/ml的浓度，用低物缓冲液溶解邻苯二胺，并按0.1ul/ml的比例加入30％的H2O2。
②、依次向每孔中加入200ul底物溶液，同时开始计时3～5分钟。
③、向每孔加入50ul的4M硫酸终止反应。
④、室温放置5分钟后，打开酶标仪及打印机，设定酶标仪的程序测492nm处的O.D.值，并将结果打印出来。
4、实验结果
| 抗原 | SARS灭活病毒(1∶10稀释) | |||
| 一抗(1mg/ml) | 阴性对照1∶2,000 | 阴性对照1∶4,000 | SARS抗体1∶2,000 | SARS抗体1∶4,000 |
| 结果 | 0.036 | 0.036 | 0.453 | 0.352 |
5、结论
该抗体的综合效价为8×106/g。
实验例2：
取通过实施例4所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法制得的抗体按照如下步骤进行中和实验，用以检验所得到的卵黄抗体体外拮抗SARS冠状病毒生物活性的效果：
1、将实施例4所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体作系列倍比稀释，使之成为1∶10，1∶100，1∶1000，1∶10000。
2、将培养好的SARS冠状病毒按照每106的Vero E6细胞的1/2接种量中含100TCID50进行稀释
3、试验组：将不同稀释度抗SARS冠状病毒的卵黄抗体与等量SARS冠状病毒(病毒滴度为100TCID50)相加；对照组：用无菌的Hanks液替代抗SARS冠状病毒的卵黄抗体与等量SARS冠状病毒相加；混匀后放入37℃作用1小时，分别接种至含有106的Vero E6细胞中，37℃培养箱中培养，逐日在普通显微镜下观察细胞病变情况。
结果：实施例4所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体能保护50％VeroE6细胞不发生病变的抗体稀释度，在1∶100与1∶1000之间。对照组则无明显的保护效果。
结论：实施例4所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体能够有效的抑制SARS冠状病毒对Vero E6细胞的侵袭。
Claims (3)
1、一种抗SARS冠状病毒的卵黄抗体，其特征在于：它按照非变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现单一条带，Western Blotting检测可以在分子量约170～190KD处发现一条单一的特异性酶染条带；或按照变性聚丙烯凝胶电泳进行检测，经过考马斯亮蓝R250染色后，图谱呈现两条条带，Western Blotting检测可以在分子量约65KD和25KD处发现两条特异性酶染条带；采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度为0.5～20mg/ml；经过酶联免疫吸附实验测定其效价为1∶50-1∶100000。
2、一种生产权利要求1所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)、制备单一抗原或复合抗原：
①、基因重组法：利用基因工程的方法，构建含有SARS冠状病毒的S蛋白、M蛋白、E蛋白的表达质粒，在大肠杆菌宿主中进行表达，然后分离并纯化表达产物作为单一抗原；
取上述分离纯化后的表达产物二种或二种以上进行组合可得所述的复合抗原。
②、多肽合成法：利用多肽合成仪合成SARS冠状病毒S蛋白或M蛋白或E蛋白的以下任一抗原表位的多肽作为单一抗原，
所述S蛋白的抗原表位分别为：
PepS1(dvqapnytqhtssmrg)
PepS2(stgnynykyrylrhgklrp)
PepS3(psskrfqpfqqfg)
PepS4(vrdpktseildispc)
PepS5(aaeqdmtrevfa)
PepS6(lpdplkptkrsfi)
PepS7(psqemfttapaic)
PepS8(peldsfkeeldk)
PepS9(qelgkyeqyikwp)
PepS10(snfrvvpsgdvvrfp)
PepS11(ctdvstaihadqltpa)
PepS12(keeldkyfk nhtspdvd)
所述M蛋白的抗原表位分别为：
PepM1(madngtitveelkq)
PepM2(ysnmrflyiik)
PepM3(artrsmwsfnpetn)
PepM4(aviirghlrmaghslgrc)
PepM5(gasqrvgtdsgf)
PepM6(nyklntdhagsndniallvq)
所述E蛋白的抗原表位分别为：
PepE1(mysfvseetgt)
PepE2(vkptvyvysrv)
PepE3(knlnssegvpdllv)
任取上述21种单一抗原中的二种或二种以上进行组合可得所述的复合抗原。
③、抗原偶联法：
其步骤是，
a、取1mg KLH或BSA于1.5ml离心管中，用100μl的PH10.0硼酸缓冲液充分溶解，10000rpm离心1分钟，将上清转移到干净的离心管；
b、称上述方法②制得的22个抗原表位之一的多肽1μmol，用100μl的pH10.0硼酸缓冲液溶解；
c、将步骤a制得的KLH或BSA溶液逐滴加到多肽溶液中；
d、边震荡边缓慢加入新鲜配制的0.3％戊二醛溶液0.1ml，室温作用2小时，中间倒转试管数次；
e、加入1M甘氨酸25μl，反应30min；
f、以pH8.5硼酸缓冲液透析过夜，换液一次，继续透析不少于4小时。
按上述步骤对方法②制得的21个抗原表位的多肽偶联后的抗原作为单一抗原，任取上述二种或二种以上单一抗原进行组合可得所述的复合抗原。
④、野生型毒株全病毒灭活法：
a、SARS冠状病毒的培养：取新鲜的SARS冠状病毒悬液，接种于Vero E6细胞，在33～35℃的CO2培养箱内培养5～9天后，收集病变细胞的上清液。
b、SARS冠状病病毒的灭活：向步骤a所得到的病毒上清液中，加入甲醛溶液使其终浓度为0.1～3％，37℃作用24～96小时，使SARS冠状病毒完全灭活。
c、SARS冠状病毒的浓缩：将经过步骤b灭活的病毒悬液超滤后得到浓缩的灭活SARS冠状病毒。
按照上述步骤所制得的灭活的SARS冠状病毒作为单一抗原。
(2)、制备抗体：
①、佐剂的选用：
初次免疫选用弗氏完全佐剂与所述单一抗原或复合抗原按照重量比1∶1混合乳化后作为免疫抗原；所有的加强免疫均选用弗氏不完全佐剂与所述单一抗原或复合抗原重量比为1∶1混合乳化后作为免疫抗原。
②、对产卵母鸡的免疫及取卵：
选用健康的白种来行母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射所述免疫抗原，此为初次免疫，隔2周后开始加强免疫，以后每隔一周加强免疫一次，共免疫三次。从初次免疫后算起，第三十天开始收集鸡卵，4℃储存备用。
③、卵黄抗体的提取：
卵黄抗体的提取可采用以下四种方法之一：
a、用水稀释法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，以去离子纯水稀释，适当调节PH值，4℃搅拌4小时，离心后弃去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥，即得抗体。
b、采用PEG沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，加入3倍蛋黄体积的4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，取上清，然后向上清内逐滴滴加1/6上清体积40％的PEG后充分搅拌混匀后4℃，1300rpm离心10分钟，收集沉淀，冷冻干燥，即得抗体。
c、膜过滤法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，以去离子水稀释，4℃静置12小时后，以分子量为200KD和150KD的膜分别过滤，收集150KD～200KD的蛋白物质，冷冻干燥即得抗体。
d、硫酸铵沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫的鸡卵中分离得到蛋黄，提取3次：以等体积的生理盐水稀释收集到的蛋黄并混合均匀后，缓慢滴加2倍体积的50％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入2/3体积的40％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，于4℃，13000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，同步加入1/2体积的33％饱和硫酸铵，于4℃作用3小时，将沉淀直接冷冻干燥即得抗体。
④、将通过上述步骤采用单一抗原进行免疫后所得到的抗体作为单一抗体；或通过上述步骤采用复合抗原进行免疫后所得到的抗体作为复合抗体；或将所述单一抗体和复合抗体中的任意两种或两种以上抗体混合所得到的抗体作为组合抗体。
3、一种实现权利要求1所述抗SARS冠状病毒的卵黄抗体的液体制剂，其特征在于，它包含所述的抗SARS冠状病毒的卵黄抗体。
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