CN112625123A - 用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体及其制备方法应用 - Google Patents

用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体及其制备方法应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于抑制新冠病毒SARS‑CoV‑2的卵黄抗体的制备方法，如下步骤：采用基因重组法制备SARS‑CoV‑2冠状病毒的S蛋白抗原；对抗原进行乳化；免疫：选健康的产蛋母鸡隔离饲养并进行注射免疫；从上述鸡卵中提取抗体。本发明利用基因工程的方法构建含有SARS‑CoV‑2冠状病毒S蛋白的抗原表位表达质粒，在大肠杆菌中进行表达，然后分离并纯化表达产物作为抗原，与佐剂混合乳化后，免疫健康产蛋母鸡，收集鸡蛋，提取蛋黄中卵黄抗体，该抗体是天然的免疫球蛋白，可以有效地抑制和清除SARS‑CoV‑2冠状病毒。

Description

用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体及其制备方法应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体及其制备方法与应用。
背景技术
新冠状病毒的临床特征包括以发热、乏力、干咳为主，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状，潜伏期一般是1-14天之间，在潜伏期就会有传染的危险，传播形式主要包括飞沫直接传播、接触传播等。
SARS-CoV-2病毒于β属冠状病毒，病毒颗粒多呈圆形或椭圆形，有包膜，外周有冠状排列的纤突，病毒直径在60-140nm之间。其基因特征与SARSr-Cov和MERS-CoV 有明显区别。目前研究显示其序列与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVAC45)同源性达85％以上。
SARS-CoV-2冠状病毒为单链RNA病毒，全长29.903kb，具有12个ORF(Open ReadingFrames)，分别编码RNA的RNA聚合酶、4种结构蛋白(S、E、M、N蛋白)、 6种未知蛋白。SARS-CoV-2不同于以往任何一种已知的六种能够感染人类的冠状病毒，该病毒在不同的蛋白上至少有17个位点涉及氨基酸的改变，这给特异性治疗 SARS-CoV-2带来巨大困难。
截止目前，人们还没有找到很好的预防和治疗SARS-CoV-2病毒的方法。目前常用的预防SARS-CoV-2病毒的消毒剂主要有含氯消毒剂和过氧乙酸消毒剂，这些消毒剂尽管可以有效杀灭冠状病毒，但同时它们对人体有比较强烈的刺激性和腐蚀性，因此只能用于日常物品的消毒，无法对人体进行消毒保护，另外对环境造成污染。在治疗方法，基本上都是针对疾病症状的对症治疗，有较多的负作用，且不能有效的控制病毒感染。临床上采用治愈患者的血浆是治疗SARS-CoV-2最为有效的方法，可以大幅降低危重患者的病死率。这反应的采用SARS-CoV-2中和抗体可以有效治疗SARS-CoV-2引起的严重急性性呼吸综合征，但是治愈患者的血浆来源有限，且处理程序复杂，存在潜在危险，不适合广泛推广。
现有技术实现方案中，还没有抗SARS-CoV-2卵黄抗体的报道。
发明内容
发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体及其制备方法；
本发明的另一目的在于提供上述用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体在制备防治新冠病毒SARS-CoV-2感染的产品的应用。
技术方案：本发明所述的一种用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用基因重组法制备SARS-CoV-2冠状病毒的S蛋白抗原；
(2)对步骤(1)中制备的抗原进行乳化：采上述抗原用弗氏完全佐剂按1:1混合后乳化作为初次免疫抗原；选用弗氏不完全佐剂与上述抗原按1:1混合后乳化作为加强免疫抗原；
(3)免疫：选健康的产蛋母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射步骤(2)中的免疫抗原，初次免疫后，隔两周开始加强免疫，每隔一周加强免疫一次，共加强免疫三次；从初次免疫后计算，第三十天开始收集鸡卵，该鸡卵中含有抑制新冠病毒SARS-CoV-2 的卵黄抗体，将鸡卵4℃存储备用；
(4)从上述鸡卵中提取抗体。
进一步地，步骤(1)中所述S蛋白抗原的S蛋白抗原表位包括
S1 IAWNSNNLDSKVGGNYNYLY
S2 LKPFERDISTEIYQ
S3 AVRDPQTLEILDIT
S4 VEQDKNTQEVFAQV
S5 DPSKPSKRSFIED
S6 NHTSPDVDLGDISGIN；
基因重组法制备SARS-CoV-2冠状病毒的S蛋白抗原到的具体过程如下：(11)大肠杆菌感受态制备：将原核表达细菌BL21，Rosetta或OrigamiB划线接种到LB培养板上，放35～40℃培养箱过夜。第二天，挑取单菌落于LB培养基内，35～40℃，200～300rpm 摇床过夜培养；第三天，将过夜培养的菌液按1:100接种到新鲜的LB培养基内，35～40℃， 3000～5000rpm培养1～2h至OD600至0.6。将细菌培养液转入离心管内，冰上放置5～15 分钟，4℃3000～5000rpm离心10分钟；弃上清，用预冷的0.05M的CaCl2溶液轻轻重悬细胞，冰上放置30分钟，4℃3000～5000rpm离心10分钟；弃上清，加入预冷的含 15％甘油的0.05M的CaCl2溶液，重悬细胞，冰上放置后，100～200μl每管分装，液氮速冻后，-70℃保存；
(12)将含有重组的S蛋白抗原表位的质粒转化至原核表达细菌BL21、Rosetta或OrigamiB内：从-70℃冰箱中取出步骤(11)中原核表达细菌感受态，室温使其解冻，解冻后冰上放置；分别将上述50ng质粒加入到感受态内；40～45℃水浴热击80～100秒，然后冰上放置2分钟；加入1ml LB培养，35～40℃，150rpm振荡培养40～50分钟；取 100μl菌液涂布到含有对应的抗性的琼脂糖培养板上；
(3)抗原的原核表达：挑取培养板上的单个菌落，加入10ml LB培养，35～40℃200～300 rpm过夜培养，1:100～1:500接种到含有对应抗性的LB培养基中，继续培养，待OD600至1.0加入IPTG诱导表达，继续培养2～3小时；4℃，3000～5000rpm离心10分钟，去上清，加入适量PBS重悬，加入PMSF至终浓度为0.1mM，冰上预冷10分钟；超声破碎10分钟～30分钟，至菌液澄清；4℃，12000rpm离心10分钟，取上清；SDS-PAGE 电泳检测蛋白表达情况；
(4)将超声上清菌液，过镍亲和柱纯化，纯化的后的蛋白溶液，经脱盐柱处理，所得蛋白溶液经超滤浓缩，获得S蛋白抗原；
优化后的核酸序列L1为：
atcgcttggaactctaacaacctggactctaaagttggtggtaactacaactacctgtacctgaaaccgttcgaacgtgacatctctaccg aaatctaccaggctgttcgtgacccgcagaccctggaaatcctggacatcaccgttgaacaggacaaaaacacccaggaagttttcgc tcaggttgacccgtctaaaccgtctaaacgttctttcatcgaagacaaccacacctctccggacgttgacctgggtgacatctctggtatc aac。
进一步地，步骤(4)中鸡卵中提取抗体的具体过程为：用水稀释法提取卵黄抗体：从收集的免疫鸡卵中分离蛋黄，以去离子水稀释，调节pH值至7.0～7.4，4℃搅拌4～6小时，离心后弃去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥得卵黄抗体。
进一步地，步骤(4)中鸡卵中提取抗体的具体过程为：采用PEG沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫鸡卵中分离蛋黄，加入3倍蛋黄体积的4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后，4℃，12000rpm离心10分钟，取上清液，然后往上清液内逐滴滴加1/6 上清液体积的40％PEG后充分搅拌混匀后，同样条件离心，收集沉淀，冷冻干燥，得卵黄抗体。
进一步地，步骤(4)中鸡卵中提取抗体的具体过程为：硫酸铵沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫鸡卵中分离体积为V得蛋黄，加入体积为V的生理盐水，缓慢滴加体积为2V的50％的饱和硫酸铵，4℃下缓慢搅拌3小时，12000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，加入体积为2/3V的40％的饱和硫酸铵，4℃下缓慢搅拌3 小时，12000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，加入体积为1/2V的33％的饱和硫酸铵，4℃下缓慢搅拌3小时，取沉淀进行冷冻干燥，得卵黄抗体。
进一步地，步骤(4)中鸡卵中提取抗体的具体过程为：超滤法提取卵黄抗体：从收集的免疫鸡卵中分离蛋黄，以去离子水稀释，4℃下静置过夜后，用150KD切向流技术，收集分子量大于150KD的蛋白物质，得卵黄抗体。
本发明还提供了采用上述方法制的用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体。
本发明还提供了含有上述用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的液体制剂，所述液体制剂配方具体为：用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体1g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)4.45g,磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)3.2g，氯化钾(KCl)0.4g，氯化钠(NaCl)4.2g，山梨酸钾2g，蒸馏水986.75g。
本发明还提供了由上述用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体在制备剂中的应用，所述喷雾剂的具体配方为：用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体1g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)4.45g,磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)3.2g，氯化钾(KCl) 0.4g，氯化钠(NaCl)4.2g，山梨酸钾2g，蒸馏水986.75g。
有益效果：(1)本发明利用基因工程的方法构建含有SARS-CoV-2冠状病毒S蛋白的抗原表位表达质粒，在大肠杆菌中进行表达，然后分离并纯化表达产物作为抗原，与佐剂混合乳化后，免疫健康产蛋母鸡，收集鸡蛋，提取蛋黄中卵黄抗体，该抗体是天然的免疫球蛋白，可以有效地抑制和清除SARS-CoV-2冠状病毒。体外实验显示，卵黄抗体浓度在0.2～5mg/ml时可以显著抑制SARS-CoV-2冠状病毒进入到细胞内。该抗体具有使用方便、高效、无毒副作用，可以对人体进行消毒，因而可以用于预防SARS-CoV-2 冠状病毒引起的严重呼吸综合征；本发明制备的本发明的SARS-CoV-2冠状病毒的卵黄抗体可用于制备液体制剂和固体制剂，服用后可以有效预防SARS-CoV-2冠状病毒引起的严重急性呼吸综合征。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1：
1、基因重组法制备抗原：
S蛋白的抗原表位为：
S1 IAWNSNNLDSKVGGNYNYLY
S2 LKPFERDISTEIYQ
S3 AVRDPQTLEILDIT
S4 VEQDKNTQEVFAQV
S5 DPSKPSKRSFIED
S6 NHTSPDVDLGDISGIN；
(11)大肠杆菌感受态制备：将原核表达细菌BL21，Rosetta或OrigamiB划线接种到LB培养板上，放35～40℃培养箱过夜。第二天，挑取单菌落于LB培养基内，35～40℃， 200～300rpm摇床过夜培养；第三天，将过夜培养的菌液按1:100接种到新鲜的LB培养基内，35～40℃，3000～5000rpm培养1～2h至OD600至0.6。将细菌培养液转入离心管内，冰上放置5～15分钟，4℃3000～5000rpm离心10分钟；弃上清，用预冷的0.05M 的CaCl2溶液轻轻重悬细胞，冰上放置30分钟，4℃3000～5000rpm离心10分钟；弃上清，加入预冷的含15％甘油的0.05M的CaCl2溶液，重悬细胞，冰上放置后，100～200 μl每管分装，液氮速冻后，-70℃保存；
(12)将含有重组的S蛋白抗原表位的质粒转化至原核表达细菌BL21、Rosetta或OrigamiB内：从-70℃冰箱中取出步骤(11)中原核表达细菌感受态，室温使其解冻，解冻后冰上放置；分别将上述50ng质粒加入到感受态内；40～45℃水浴热击80～100秒，然后冰上放置2分钟；加入1ml LB培养，35～40℃，150rpm振荡培养40～50分钟；取 100μl菌液涂布到含有对应的抗性的琼脂糖培养板上；
(3)抗原的原核表达：挑取培养板上的单个菌落，加入10ml LB培养，35～40℃200～300 rpm过夜培养，1:100～1:500接种到含有对应抗性的LB培养基中，继续培养，待OD600至1.0加入IPTG诱导表达，继续培养2～3小时；4℃，3000～5000rpm离心10分钟，去上清，加入适量PBS重悬，加入PMSF至终浓度为0.1mM，冰上预冷10分钟；超声破碎10分钟～30分钟，至菌液澄清；4℃，12000rpm离心10分钟，取上清；SDS-PAGE 电泳检测蛋白表达情况；
(4)将超声上清菌液，过镍亲和柱纯化，纯化的后的蛋白溶液，经脱盐柱处理，所得蛋白溶液经超滤浓缩，获得S蛋白抗原；
优化后的核酸序列L1为：
atcgcttggaactctaacaacctggactctaaagttggtggtaactacaactacctgtacctgaaaccgttcgaacgtgacatctctaccg aaatctaccaggctgttcgtgacccgcagaccctggaaatcctggacatcaccgttgaacaggacaaaaacacccaggaagttttcgc tcaggttgacccgtctaaaccgtctaaacgttctttcatcgaagacaaccacacctctccggacgttgacctgggtgacatctctggtatc aac；
2、抗原乳化
采上述抗原用弗氏完全佐剂按1:1混合后乳化作为初次免疫抗原；选用弗氏不完全佐剂与上述抗原按1:1混合后乳化作为加强免疫抗原；
3、免疫
选健康的产蛋母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射免疫抗原，初次注射选用初次免疫抗原免疫，隔两周开始加强免疫，每隔一周加强免疫一次，共加强免疫三次；从初次免疫后计算，第三十天开始收集鸡卵，该鸡卵中含有抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体，将鸡卵4℃存储备用；
4、从上述鸡卵中提取抗体
用水稀释法提取卵黄抗体：从收集的免疫鸡卵中分离蛋黄，以去离子水稀释，调节pH值至7.0～7.4，4℃搅拌4～6小时，离心后弃去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥得卵黄抗体。
本实施例中的卵黄抗体可用于制备液体制剂，具体配方为：用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体1g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)4.45g,磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)3.2g，氯化钾(KCl)0.4g，氯化钠(NaCl)4.2g，山梨酸钾2g，蒸馏水986.75g。该制剂可用于人体消毒，防治新冠病毒。
实施例2：本实施例的具体过程与实施例1中基本一致，其不同在于从鸡卵中提取抗体的具体过程为：采用PEG沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫鸡卵中分离蛋黄，加入3倍蛋黄体积的4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后，4℃，12000rpm离心10 分钟，取上清液，然后往上清液内逐滴滴加1/6上清液体积的40％PEG后充分搅拌混匀后，同样条件离心，收集沉淀，冷冻干燥，得卵黄抗体。
本实施例中的卵黄抗体可用于制备喷雾剂，具体配方为：用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体1g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)4.45g,磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)3.2g，氯化钾(KCl)0.4g，氯化钠(NaCl)4.2g，山梨酸钾2g，蒸馏水986.75g。该喷雾剂可用于防治新冠病毒引起的严重急性呼吸综合征。
实施例3：本实施例的具体过程与实施例1中基本一致，其不同在于从鸡卵中提取抗体的具体过程为：硫酸铵沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫鸡卵中分离体积为V 得蛋黄，加入体积为V的生理盐水，缓慢滴加体积为2V的50％的饱和硫酸铵，4℃下缓慢搅拌3小时，12000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，加入体积为 2/3V的40％的饱和硫酸铵，4℃下缓慢搅拌3小时，12000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，加入体积为1/2V的33％的饱和硫酸铵，4℃下缓慢搅拌3小时，取沉淀进行冷冻干燥，得卵黄抗体。
实施例4：本实施例的具体过程与实施例1中基本一致，其不同在于从鸡卵中提取抗体的具体过程为：从收集的免疫鸡卵中分离蛋黄，以去离子水稀释，4℃下静置过夜后，用150KD切向流技术，收集分子量大于150KD的蛋白物质，得卵黄抗体。
实施例5：对含有抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的活性测定
实验一、采用ELISA检测所制备的含有抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的活性：
1、抗原包埋
将SARS-CoV-2冠状病毒灭活后作为抗原，用抗原包被稀释进行稀释，调整浓度为10μg/ml，将稀释抗原加入到酶标板内，每孔200μl，放置4℃过夜。
2、封闭及抗原抗体的反应
1)取出酶标板甩去包被液，在吸水纸上拍干酶标板；
2)每孔加入300μl PBST，放置2分钟后，甩去孔内液体，在吸水纸上拍干酶标板；
3)每孔加入300μl含有5％BSA的PBST进行封闭，室温放置2小时；
4)甩掉封闭液，在吸水纸上拍干酶标板；
5)每孔加入300μl PBST，放置2分钟后，甩去孔内液体，在吸水纸上拍干酶标板；
6)将稀释好的卵黄抗体(1:1000～1:100000)加入到孔内，每孔100μl，室温放置 2小时；
7)甩去一抗稀释液，在吸水纸上拍干酶标板；
8)每孔加入300μl PBST，放置2分钟后，甩去孔内液体，在吸水纸上拍干酶标板，重复4次；
8)每孔加入稀释的HRP标记的抗鸡IgY的二抗(1:5000)，室温放置1小时；
9)弃去二抗稀释液，在吸水纸上拍干酶标板
10)每孔加入300μl PBST，放置2分钟后，甩去孔内液体，在吸水纸上拍干酶标板，重复4次；
3、显色
1)每孔加入100μl TMB显色液，放置3～10分钟
2)每孔加入100μl 2M硫酸终止反应
3)设定酶标仪程序，检测450nm下的OD值，计算结果
4、实验结果
该抗体的ELISA检测效价为1:50000。
实验二：检测所制备的含有抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的中和活性
1)将含有抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体稀释成0.1％、0.5％、1％、2％、5％；
2)将培养好的SARS-CoV-2冠状病毒按照每106的Vero E6细胞的1/2接种量中含100TCID50进行稀释
3)试验组：将不同稀释度的含有抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体与等量的SARS-CoV-2冠状病毒相加；对照组用无菌的PBS代替；混匀后放入37℃作用1小时，分别接种至含有106 Vero E6细胞中，37℃培养箱中培养，逐日观察细胞病变情况。
结果：SARS-CoV-2冠状病毒卵黄抗体在1％以上浓度下对SARS-CoV-2冠状病毒有有效的抑制作用。
经以上实验验证，本方案制备的SARS-CoV-2冠状病毒卵黄抗体在防治 SARS-CoV-2冠状病毒方面具有良好的效果。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。
序列表
<110> 南京蛋球球生物医学技术合伙企业（有限合伙）
<120> 用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体及其制备方法应用
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<151> 2020-02-19
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr
1 5 10 15
Asn Tyr Leu Tyr
20
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp
1 5 10
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1 5 10 15
<210> 7
<211> 273
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcgcttgga actctaacaa cctggactct aaagttggtg gtaactacaa ctacctgtac 60
ctgaaaccgt tcgaacgtga catctctacc gaaatctacc aggctgttcg tgacccgcag 120
accctggaaa tcctggacat caccgttgaa caggacaaaa acacccagga agttttcgct 180
caggttgacc cgtctaaacc gtctaaacgt tctttcatcg aagacaacca cacctctccg 240
gacgttgacc tgggtgacat ctctggtatc aac 273

Claims (9)

1.一种用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)采用基因重组法制备SARS-CoV-2冠状病毒的S蛋白抗原；
(2)对步骤(1)中制备的抗原进行乳化：采上述抗原用弗氏完全佐剂按1:1混合后乳化作为初次免疫抗原；选用弗氏不完全佐剂与上述抗原按1:1混合后乳化作为加强免疫抗原；
(3)免疫：选健康的产蛋母鸡隔离饲养并进行鸡肌肉多点注射步骤(2)中的免疫抗原，初次免疫后，隔两周开始加强免疫，每隔一周加强免疫一次，共加强免疫三次；从初次免疫后计算，第三十天开始收集鸡卵，该鸡卵中含有抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体，将鸡卵4℃存储备用；
(4)从上述鸡卵中提取抗体。
2.根据权利要求1所述的用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述S蛋白抗原的S蛋白抗原表位包括
S1 IAWNSNNLDSKVGGNYNYLY
S2 LKPFERDISTEIYQ
S3 AVRDPQTLEILDIT
S4 VEQDKNTQEVFAQV
S5 DPSKPSKRSFIED
S6 NHTSPDVDLGDISGIN；
基因重组法制备SARS-CoV-2冠状病毒的S蛋白抗原到的具体过程如下：
(11)大肠杆菌感受态制备：将原核表达细菌BL21，Rosetta或OrigamiB划线接种到LB培养板上，放35～40℃培养箱过夜。第二天，挑取单菌落于LB培养基内，35～40℃，200～300rpm摇床过夜培养；第三天，将过夜培养的菌液按1:100接种到新鲜的LB培养基内，35～40℃，3000～5000rpm培养1～2h至OD600至0.6。将细菌培养液转入离心管内，冰上放置5～15分钟，4℃3000～5000rpm离心10分钟；弃上清，用预冷的0.05M的CaCl2溶液轻轻重悬细胞，冰上放置30分钟，4℃3000～5000rpm离心10分钟；弃上清，加入预冷的含15％甘油的0.05M的CaCl2溶液，重悬细胞，冰上放置后，100～200μl每管分装，液氮速冻后，-70℃保存；
(12)将含有重组的S蛋白抗原表位的质粒转化至原核表达细菌BL21、Rosetta或OrigamiB内：从-70℃冰箱中取出步骤(11)中原核表达细菌感受态，室温使其解冻，解冻后冰上放置；分别将上述50ng质粒加入到感受态内；40～45℃水浴热击80～100秒，然后冰上放置2分钟；加入1ml LB培养，35～40℃，150rpm振荡培养40～50分钟；取100μl菌液涂布到含有对应的抗性的琼脂糖培养板上；
(3)抗原的原核表达：挑取培养板上的单个菌落，加入10ml LB培养，35～40℃200～300rpm过夜培养，1:100～1:500接种到含有对应抗性的LB培养基中，继续培养，待OD600至1.0加入IPTG诱导表达，继续培养2～3小时；4℃，3000～5000rpm离心10分钟，去上清，加入适量PBS重悬，加入PMSF至终浓度为0.1mM，冰上预冷10分钟；超声破碎10分钟～30分钟，至菌液澄清；4℃，12000rpm离心10分钟，取上清；SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况；
(4)将超声上清菌液，过镍亲和柱纯化，纯化的后的蛋白溶液，经脱盐柱处理，所得蛋白溶液经超滤浓缩，获得S蛋白抗原；
优化后的核酸序列L1为：
atcgcttggaactctaacaacctggactctaaagttggtggtaactacaactacctgtacctgaaaccgttcgaacgtgacatctctaccgaaatctaccaggctgttcgtgacccgcagaccctggaaatcctggacatcaccgttgaacaggacaaaaacacccaggaagttttcgctcaggttgacccgtctaaaccgtctaaacgttctttcatcgaagacaaccacacctctccggacgttgacctgggtgacatctctggtatcaac。
3.根据权利要求1所述的用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中鸡卵中提取抗体的具体过程为：用水稀释法提取卵黄抗体：从收集的免疫鸡卵中分离蛋黄，以去离子水稀释，调节pH值至7.0～7.4，4℃搅拌4～6小时，离心后弃去沉淀，将上清浓缩、冷冻干燥得卵黄抗体。
4.根据权利要求1所述的用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中鸡卵中提取抗体的具体过程为：采用PEG沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫鸡卵中分离蛋黄，加入3倍蛋黄体积的4％的PEG进行稀释，充分搅拌混匀后，4℃，12000rpm离心10分钟，取上清液，然后往上清液内逐滴滴加1/6上清液体积的40％PEG后充分搅拌混匀后，同样条件离心，收集沉淀，冷冻干燥，得卵黄抗体。
5.根据权利要求1所述的用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中鸡卵中提取抗体的具体过程为：硫酸铵沉淀法提取卵黄抗体：从收集的免疫鸡卵中分离体积为V得蛋黄，加入体积为V的生理盐水，缓慢滴加体积为2V的50％的饱和硫酸铵，4℃下缓慢搅拌3小时，12000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，加入体积为2/3V的40％的饱和硫酸铵，4℃下缓慢搅拌3小时，12000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水溶解沉淀，加入体积为1/2V的33％的饱和硫酸铵，4℃下缓慢搅拌3小时，取沉淀进行冷冻干燥，得卵黄抗体。
6.根据权利要求1所述的用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中鸡卵中提取抗体的具体过程为：超滤法提取卵黄抗体：从收集的免疫鸡卵中分离蛋黄，以去离子水稀释，4℃下静置过夜后，用150KD切向流技术，收集分子量大于150KD的蛋白物质，得卵黄抗体。
7.采用权利要求1所述方法制的用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体。
8.含有权利要求1所述用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体的液体制剂；
所述液体制剂配方具体为：用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体1g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)4.45g,磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)3.2g，氯化钾(KCl)0.4g，氯化钠(NaCl)4.2g，山梨酸钾2g，蒸馏水986.75g。
9.由权利要求1所述用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体在制备喷雾剂中的应用，
所述喷雾剂的具体配方为：用于抑制新冠病毒SARS-CoV-2的卵黄抗体1g，磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)4.45g,磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)3.2g，氯化钾(KCl)0.4g，氯化钠(NaCl)4.2g，山梨酸钾2g，蒸馏水986.75g。
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