KR970005333B1

KR970005333B1 - 이.콜리 패혈증(E.coli septicaemia)에 대한 가금류 보호용 백신

Info

Publication number: KR970005333B1
Application number: KR1019880013903A
Authority: KR
Inventors: 프렌체스커스 반덴보쉬 죠안스
Original assignee: 악조 엔. 브이; 에이. 디. 도마·에프.지.엠. 헤르만스
Priority date: 1987-10-26
Filing date: 1988-10-25
Publication date: 1997-04-15
Also published as: NZ226677A; IE60324B1; DD283331A5; CN1033008A; DK593488A; JP2718523B2; ES2042718T3; DE3871489D1; PT88850B; US5593679A; JPH01149734A; HUT48122A; AU610940B2; DK593488D0; CA1331445C; EP0314224A1; IE883130L; KR890006253A; ZA887694B; DK175528B1

Abstract

내용 없음.

Description

이.콜리 패혈증(E.coli septicaemia)에 대한 가금류 보호용 백신

제1도는 F11 서브유니트의 아미노산 서열.

제2도는 아미노산 서열을 기본으로 측정된 F11서브 유니트의 친수성도를 나타낸 프로파일.

본 발명은 에스케리키아 패혈증(E.coli septicaemia:이하 E. coli 패혈증으로 표기함)에 대한 가금류 보호용 백신 및 이 백신을 투여함으로써 가금류에서 E.cole 패혈증을 퇴치하는 방법에 관한 것이다.

E.coli 패혈증 또는 콜리바실로시스(colibacillosis)는 가금류(닭 및 칠면조 같은)에서 일반적으로 발생하는 질병으로써, 이로인해 상당한 손실이 발생하고 있다. 이 질병을 갖고있는 조류에게 나타나는 특징적인 증세는 공기 주머니 염증, 심막염 및 간주위염이 나타난다. 이 분야에서 연구된 대부분의 자료에 의하면, 상기 질병을 지닌 조류에게서 나타나는 반이상의 E. coli 균주가 01: K1, 02 : K1 또는 078 : K80의 세가지 혈청형증 한가지라는 것이다. 미합중국에서는 혈청형 035가 가장 빈번히 나타나고 있다. E. coli 패혈증은 호흡기 질병을 유발시키는 비루스 또는 미코플라즈마스(mycoplasmas)등에 의해 호흡계가 손상을 받은후에 체내에 침입하여 이차감염된 것이 일반적인 것으로 추정된다.

가금류에서의 콜리바실로시스의 발병학 분야에 중요한 역할을 하는 발병인자에 관해서는 거의 알려져 있지 않다. 표유류의 감염에 중요한 역할을 하는 E. coli 균주의 발병인자는 예를 들면 부착 섬모(attatchement fimbriae), 톡신 및 철-격리 기작(iron-sequestrating mechanesms)을 포함한다.

일반적으로 상당한 숙주 특이성이 있는 여러가지으 종류의 상이한 부착섬모가 제시되고 있다. CFA섬모는 인체에서 설사를 유발한다. K88섬모는 새깨돼지에서 설사를 유발하며, K99는 양, 송아지 및 새끼돼지에서 설사를 유발하고, P섬모는 (F11유형의 섬모포함)인체에서 요로감염을 유발한다. 또한 상기 유형의 부착섬모를 정제형태로 함유하는 백신을 투여하기 상기 동물에 있어서 상기 각각의 유형에 대해 면역 방어계를 유발시킬 수 있음이 발견되었다. 그러나 가금류내의 콜리바실로시스에 대해서는 유사한 발병인자가 확인되고 있지 않다.

E. coli 패혈증에 대해 가금류를 보호할 수 있는 백신이 발견되었으며, 이 백신은 F11유형의 섬모 또는 그들의 면역원 분절(section)또는 상기 섬모 또는 그들의 면역원 분절의 생산 또는 임의로는 분비를 암호하는 유전물질을 갖고있는 유기체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

특히 콜리바실로시스로 감염된 닭의 심장에서 분리된 E. coli 균주들이 인체내에서 요로감염을 일으키는 E. coli 균주내에서 발생하는 F11 유형의 섬모와 동일한 섬모를 생산한다는 것이 여러연구에 의해 관찰되었다.

E. coli 패혈증을 나타내는 대다수의 조류들이 F11 유형의 섬모를 포함한 E. coli 균주로 삼염되었음이 혈청학적으로 입증되었다.

이같은 섬모는 SDS-PAGE에 의해 18.0KD의 겉보기 분자량(apparent molecular weight)을 갖는 서브유니트 단백질을 포함하고 있음이 알려졌다.

그들은 37℃에서 고체 아가 배지사에서 배양된 와일드타입의 조류 E. coli 균주에 의해 생성되지만, 상기 E. coli를 브로쓰(broth)중에서 배양하는 경우는 발견되지 않는다. 18KD섬모의 최적 발현은 상기 박테리아가 혈액 아가(기본) 플레이트(예를 들면 0xoid^(R))상에서 배양되는 경우에 발생한다. 또한 적절한 배지는 페나시 아가 플레이트(Difco^(R))이다. 20℃에서 중식하는 도안 18KD섬모는 형성되지 않는다.

과거에 이미 F11 섬모가 와일드-타입의 비병원성 E. coli 균주로 부터 클로닝되었다(de, Ree, J.M. 등, FEMS Microbiology Lett. 29, 91-97, 1985). 섬모가 없는 E. coli K12 균주 AM1727이 F11 섬모를 암호하는 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pPIL291-15에 의해 형질전환되고, 이 형질 전환된 균주는 F11 섬모를 생산할 수 있게 된다. 상기 F11 섬모는 하기 변수에 대해 조류내에서 빈번히 발생하는 02:K1:H-혈청형에 속하는 E.coli균주 CH4로부터 정제된 18KD 섬모와 비교되고 있다.

a. 형태학, F11 및 18KD 섬모는 전자 현미경에서 동일한 것으로 관찰된다. 양쪽 모두 섬모는 약 1㎛길이이며 약 7㎚직경을 갖고 있다;

b. 분자량. SDS-PAGE에 의해서 F11및 18KD 섬모 둘 모두의 서브유니트에 대해 겉보기 분자량 18KD가 관찰되었다;

c. 면역 화학적 특이성. ELISA에서는, F11 및 18KD 섬모가 de Ree, J.M. 등에 의해 J. Clin. Microbiol. 24, 121-125;1986에 제시된 -F11 모노클론 항체와 동일하게 반응하며, F1A, F1C, F7, F7₂, F8, F9, F12또는 F13 유형의 섬모에 대한 모노클론 항체와는 반응하지 않는다;

d. 아미노산 조정. 18KD 서브유니트의 아미노산 조성은 F11 서브유니트의 조성과 본질적으로 동일하다(Van Die, I. 등;in: D.L, Lark(ed.), Proteencarbohydrate interactions in biological systems, Academic press, London, p 39-46, 1986)(표 1 참고);

1)서열을 기초로 계산(제1도 참고)

2)6N HC1로 가수분해한후 울트라팩 8컬럼(LKB)을 사용하여 소듐 시스템(SODIUM system)에 의해 측정됨.

e. 아미노-말단부 아미노산 서열:18KD 서브유니트의 아미노 말단의 첫번째 17개 아미노산 서열이 F11 서브유니트에 대해 알려진 상응서열(Van Die, I. 등;1986)과 동일하다-제1도는 전체 F11 서브유니트 단백질의 아미노산 서열을 나타내었다. 이 서열로부터 16.4KD의 실질 분자량을 계산할 수 있다.

F11과 같이 P 섬모의 접착특성은 인체 적혈구의 만노즈 내성 혈구응집 반응(MRHA)에 의해 육안 관찰될 수 있다. 이 MRHA는 상기 P 섬모를 충분한 양으로 발현하는 E. coli 박테리아를 만노즈 존재하에 인체 적혈구와 혼합시키면 곧 관찰할 수 있다. 인체 적혈구에 P섬모를 부착시키는데 적절한 최소의 수용체 구조는 디사카라이드 Gal α 1→4Gal β (kallenius, G. 등. Lancet ii, 604-6; 1981)로 확인되었다. 이 디사카라이드를 라텍스(latex)입자와 결함(coupling)시킴으로써, 라텍스 응집 반응에 의해 박테리아 상에서 P섬모를 상세히 설명할 수 있는 기구를 얻을 수 있다(de Man, P.등, J.Clin. Microbiol. 25, 401-6;1987).

최근에 F11 섬모자체는 아니지만 이 섬모와 결합되어 있는 특정 접착성분(또한 부성분(minor components)으로도 명명됨)이 접착작용에 주로관여함이 알려졌다(van Die, I. 등., Microbiol, Pathogenesis 1, 51-56;1986).

표 2에는 F11 섬모의 발현 및 요로병원성 E. coli 균주의 접착특성간의 상호관계, F11 섬모 생산성 재조합 클론 및 콜리바실로시스로 인해 고통을 받는 닭의 감염된 심장에서 분리한 다수의 E. coli 균주들을 제시하였다. 이 표로부터 상기 닭에서 분리된 E. coli의 F11 섬모가 적어도 인체 E. coli의 F11 섬모와 동일한 수용체를 인식한다는 결론을 내릴수 있다.

(a)H291은 인체 E. coli 이고, F11 참고균주는 C1976이다. AM1727/pPIL 291-15는 섬모없는 K12 균주 AM 1727의 F11-섬모 생산성 재조합 클론이다. CH번호는 콜리바실로시스로 고통받는 닭에서 분리된 E. coli 균주들이다.

(b)항-F11 혈청을 사용한 전체 박테리아 ELISA;log 역가는 백그라운드 값의 최소 두배에 달하는 A540 값을 나타내는 최고의 혈청 희석치로 정의된다.

(c)항-F11 혈청을 사용한, 조악한 섬모제제의 웨스턴 블로팅.

(d)인체 적혈구와의 만노즈 내성 혈구 응집 반응.

(e)Gal α 1→4Galβ 로 코팅된 라텍스 입자의 응집 반응

기호의 의미;

-;상술한 시험에 반응이 나타나지 않음.

+부터 ++++;상술한 시험에서 반응성의 증가정도.

본 발명에 의한 백신은 또한 F11 섬모와 함께 또는 F11 섬모 대신에 F11 섬모의 면역원 분절을 포함할수도 있다. 예를들어 이같은 면역원 분절은 18KD 서브유니트, 그들의 집합체(aggregates),또는 그들의 단편, 또는 F11 섬모의 특징적인 접착성분 또는 그들의 집합체 또는 그들의 단편을 의미하는 것으로 이해할 수 있다. 18KD 서브유니트 단편 또는 이 유형의 F11접착성분의 단편은 가금류에서 F11 유형의 E. coli에대해 보호성 항체형성을 자극할 수 있는 한개 이상의 에피토프를 포함하는 폴리 펩티드를 의미할 수도 있다.

18KD 서브유니트의 적절한 폴리 펩티드 단편 또는 F11 접착성분의 적절한 폴리펩티드 단편은 여러 공지된 기법을 사용하여 확인할 수 있다. 이같은 기법은 T.P.Hoop 및 K.R. Woods에 의해 제시되었는데, 즉아미노산 사슬의 연속적인 분체(segments)에 대한 평균 친수성을 측정하는 방법이다(아미노산 서열로부터 단백질 항원성 결정부위의 예측방법;Proc. Natl. Ace, Sci. 78,3824-3828;1981). 이같은 측정방법의 결과를 제2도에 도시했다. 이 도면에서는 공지된 아미노산 서열을 기초로한 F11서브유니트의 친수성 프로파일이 도시되어 있다. 여기에 도시된 프로파일은 매 7개의 아미노산에 대한 친수성의 중량 평균치를 나타내고있다. 가장 현저한 친수성을 갖는 영역들이 항원성 결정부위를 구성하는 영역으로 추정된다. 제2도에서 이영역은 검은 블록으로 표시 했으며, 이들은 다음 아미노산 부분에 해당한다.:

24-33 Ile-Ser-Gln-Lys-Ser-Ala-Asp-Gin-Ser-Ile

45-57 Ala-Gly-Gly-Thr-Ser-Lys-Pro-Met-Asp-Ler-Asp-Ile-Glu

67-78 Lys-Gln-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Asn-Gly-Lys-Val-Gln

87-95 Thr-Gly-Gln-Ala-Glu-Glu-Leu-Ala-Thr

123-130 Pro-Leu-Lys-Asp-Gly-Asp-Asn-Val

136-142 Leu-Val-Lys-Lys-Ala-Asn-Gly

F11 섬모의 18KD 서브유니트의 항원 결정부위들 또한 이 영역들 내에 위치한 것으로 예측된다. 동일한 모델을 사용하여 I. van Die, W. Hoekstra와 H. Bergmans(Microbiol. Pathoginesis 3, 149-154;1987)에 의해 F11 섬모에 관한 유사한 결론이 얻어졌다.

18KD 서브유니트 또는 F11 접착성분(adhesines)의 적절한 화학적 활성 폴리펩티드 단편들은 또한 특허출원 WO84/03506-소위 펩-스캔방법-(pep-scanmethod)에서 제시된 방법으로 확인할 수 있으며, 여기에서는 조사중인 단백질의 부분서열에 상응하는 일련의 일부 중첩성 폴리펩티드들을 합성하고, 이들과 항체간의 반응성을 조사하였다.

면역원성 특성을 증가시키기 위해 이같은 폴리펩티드 단편들을 캐리어에 임의로 결합시킬 수도 있다.

F11 섬모 또는 그들의 면역원성 분절(sections)은 F11 유형의 와일드 타입 E. coli 균주 또는 그들의 유도체로부터 공지의 방법으로 그 섬모를 분리하며, 임의로는 그들의 면역원성 분절을 분리하여 제조할 수 있다.

F11 섬모 또는 그들의 면역원성 분절은 이들의 생산 및 임의로 이들의 분비를 암호하는 유전물질을 포함하고 있는 재조합 DNA로 형질전화시킨 세포로부터 출발하여 제조할 수도 있다. 또한, 특히 더 적은 폴리펩티드 단편의 경우, 예를들면 고체상을 사용한 메리필드(Merrifield)방법에 의해 완전히 합성적으로 제조할 수 있다.

본 발명에 의한 백신은 또한 F11 섬모 또는 그들의 면역원성 분절의 생산 및/또는 분비를 암호하는 유전물질을 포함하는 유기체를 함유할 수 있다.

바람직하게는 이경우 비변원성 유기체를 포함할 것이다.

이들 유기체는 그들의 특성에 따라 상기 항원물질을 생산할 수 있으며, 또는 바람직한 항원물질을 암호화하는 재조합 폴리누클레오티드를 갖을 수도 있다.

비루스 또는 박테리아는 그중에서도 특히 그의 재조합 유기체로서 사용될 수도 있다. 상기 재조합 유기체는 그들 스스로 바람직한 항원성 물질을 생산할 수 있으며 임의로 그것을 분비할 수도 있다.

본 발명에 의한 백신은 바람직하게는 비경구적으로 투여되며, 예를들면 피하 또는 근육내 주사로 투여된다. 상기 백신은 예장접종시킨 조류의 능동면역을 위해, 그리고 그 자손의 수동 면역을 위해 산란용 조류에 투여될 수 있다. 면역화된 산란중인 조류의 경우 그들 체내에 생성된 항체는 물론 그들 알의 난황내에 도입되며, 따라서 그후 부화된 병아리내로 도입된다.

본 발명에 의한 백신은 또한 경구, 비강내로 투여되며, 또는 에어로졸을 흡입함으로써 투여될 수 있는데, 이 경우 백신은 F11 섬모, 단백질 또는 그들의 면역원 분절의생산 및 분비를 암호하는 유전불질이 존재하고 있는 살아있느느 비병원성 유기체를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 백신은 먼저 그들로부터 유래된 단백질 또는 폴리펩티드들 제공하거나, F11 섬모를 생산하거나 상술한대로 F11섬모, 단백질 또는 폴리펩티드를 함유하는 미생물을 제공함으로써 제조될 수 있다.

섬모가 E. coli로 부터 산출되는 후자의 경우가 가장 바람직한 구체예이다. 일반적으로 F11 섬모를 갖는 E. coli를 배양한 후, F11 섬모를 박테리아로부터 분리해 내는데, 이를테면 기계적 분리(전단) 및/또는 가열하여 분리하고 세포를 제거(원심분리 및/또는(초고속) 여과)해 낸다. 그후 초고속 여과, 컬럼 크로마토그래피 또는 특이적 침전(암모늄 설페이트, 또는 다른염을 사용하거나 pH를 변화시켜 섬모의 등전점에 맞춤으로써)에 의해 배양 배지로부터의 오염물질 및/또는 박테리아 멤브레인을 제거함으로써 섬모를 추가 정제시킬 수 있다.

비경구적 예방접종을 위해, 활성성분은 일반적으로 수용액 또는 현탁액중에 포함되며, 흔히 그 가용 수명 또는 활성을 증가시키기 위해 염, 포르말린, pH완충액, 유화제 및 면역반응을 개선시키기 위한 보조제 같은 다른성분과 혼합된다. 적절한 보조제는 예를들면 광물유, 뮤라밀 디펩티드, 알루미늄 히드록사이드, 사포닌, 폴리음이온 및 양쪽성 물질등이 해당된다.

백신의 조성 및 그 예방접종시스템은 둘 모두 변화시킬 수 있으며, 이는 보호효과를 제공하기 위한 조류의 유형, 조류의 연령 및 중량, 목적하는 방어효과의지속기, 투여방법 및 목적하는 바가 모계항체에의한 수동면역 인지 또는 능동면역 인지에 따라 결정된다.

백신중의 활성성분 유효량은 비경구용 백신의 약 10-100㎍/용량이다.

주로 F11 섬모를 갖고 있는 E.coli에 대한 상술한 능동 면역화 방법이 건강한 조류를 보호하기 위한 처리 방법으로 적용될 것이다. F11 섬모를 갖고 있는 E. coli에 의해 이미 감염된 조류들 또한 F11 섬모에 대해 지향성을 지닌 항체 또는 그들의 부분 또는 집합체로 처리할 수 있음을 두말할 나위도 없다.

실시예 1

섬모의 정제

섬모를 정제하기 위해, 3종류의 와일드 타입 E. coli 균주를, 37℃에서 혈액아가 기제 플레이트(Osoid)상에서 하룻밤 동안 배양했다. 이를 위해 CH2(078:K80:H4), CH4(02:K1:H-)와 CH6(01:K1:H-)E.coli 균주를 사용하였으며, 이들은 콜리바실로시스로 고통받는 닭의 감염된 심장에서 분리했다. F11 섬모 클론 AM1727-pPIL 291-15(De Ree 등, 1985)를 Biostat발효조(Braun) 내에서 37℃의 일정온도로 50㎍/㎖ 앰피실린을 함유하는 브레인 하트 침출물 브로쓰 중에서 16시간동안 배양했는데, 이때 pH는 7.4이며 산소 포화도는 약 40%였다.

박테리아를 pH 7.5의 10mM 트리스-염산 완충액으로 수거했다.

박테리아를 Sorval Omnimixer 내의 얼음중에서 1분간 15회 연속 처리하거나;65℃에서 15분동안 박테리아를 가열하거나;상술한 2가지 처리방법을 병용하여 박테리아를 처리함으로써 박테리아로부터 섬모를 방출시켰다.

그후 박테리아를 원심분리 및 여과하여 제거하고, 조악한 섬모 용액을 농축하여 섬모를 YM 100필터가 구비된 Amicon 셀내에서 강력하게 세척했다.

섬모를 연속적으로 정제하는데, 예를들면 섬모를 암모늄 설페이트로 침전시키고 그들을 소듐데옥시콜레이트로 용해시킨뒤 자당구배에서 원심분리 시키는 Korhonen 등에 의해 제시된 것과 같은 다소 변형된 방법(Infect. Immun. 27, 568-575,1980)에 의해 정제시켰다.

이 방법으로 정제된 섬모제제는 전자 현미경상에서 동일한 섬모구조를 나타내었다.(Van den Bosch, J.F등에 의해 Infect. Immun.29, 26-233,1980 제시된 것과 같은 구조). 모든 섬모 제제는 SDS-PAGE내에서 18KD에 해당하는 한개의 단일 밴드를 나타내며(Lugtenberg, B.등에 의해 FEBS Lett. 58, 254-258,1975에 제시된 바와 같음), 웨스턴 블로팅에서 모든 섬모에 대해 생겨난 모든 항혈청과 반응한다.(Muileraman, H.G.등, Anal. Biochem. 120, 46-51, 1982에 제시됨).

실시예 2

A. 본 발명에 의한 섬모를 함유하는 백신은 유화제로서 폴리 솔베이트 80과 솔비탄 모노올리에이트를 사용하여 광물유(저점도 파라핀)를 기제로한 유중수 유탄액 상태로 제조했다.

B. 와일드 타입 CH4(02:K1:H-)E. coli 균주로 부터 정제된 F11 섬모 50㎍/㎖를 함유되도록 2A에서처럼 백신을 제조했다.

C. 클론 Am1727-ppil 291-15로부터 정제된 F11 섬모 50㎍/㎖를 함유하도록 2A에서 처럼 백신을 제조했다. 이 클론의 샘플은 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes of the Pasteur Institute in Paris에 기탁번호 I-709로 1987년 10월 19일자로 기탁되었다.

실시예 3

능동 면역방법

능동면역화 실험을 위해, 실시예 2에서처럼 백신을 제조하고 이를 조사하려는 조류는 근육내 주사시킨뒤, 특이적인 항-섬모 혈청 항체역가의 발생정도를 ELISA 방법으로 측정했다.

A. ELISA

ILISA를 실시하고저, 각 웰내에 0.04M PBS(ph 7.2)1㎖당 2.5㎍의 섬모를 포함하고 있는 실시예 1과 같이 제조된 정제 섬모 용액 100㎍를 가한 PVC미소역가 플레이트를 실온에서 하룻밤동안 항온처리 시켰다.

그후 이 플레이트들을, 각 웰내에 PBS중의 5% BSA용액 100㎍를 가해 37℃에서 20분동안 항온처리 시키고, 이를 물로 세척한뒤 공기중에서 건조시켜 처리했다. 항-섬모 혈청은 1시간동안 37℃에서, 완충액(pH7.4, 0.2M NaHPO, 0.2M NACL, 0.1% BSA와 0.05% Tween 80)을 사용해 일련의 희석 배수로 희석하고, 각 웰내에서 상기 혈청 100㎍를 항온처리함으로써 조사했다. 세척후 플레이트들은 각 웰에 희석된 콘쥬게이트(토끼 항-닭 IgG/PO(H+L), Nordic)100㎍를 가해 30분동안 항온처리 시키고, 이를 다시 1회 세척했다. 항체 활성은 각 웰에 100㎍의 효소 기질용액(증류수 15㎖, 소듐아세테이트/시트르산 완충액(pH 5.5)중의 0.14% 우레아퍼록사이드 용액 1.5㎖와 DMSO중의 0.6% TMB용액 0.2㎖를 함유함)을 가해 착색정도를 비색법으로 측정해 정량했다. 상기 효소 반응은 어두운 상태에서 실시하였으며, 각 웰당 4N HSO50㎍를 가함으로써 10분후 종료시키고, 그 흡효광도를 450nm(AA)에서 Microelisa판독기(Organon Teknika)로 측정했다.

일차 혈청 희석도는 1:50이었다. 대조용으로 예방접종 이전에 얻어진 혈청을 각 플레이트의 웰에 투입하여 측정하였으며, 최소한 8개의 웰 중에서 1:50의 비율로 희석시켜 측정함으로써 백그라운드 흡광도를 측정했다. 항체 역가는 대조용의 A백그라운드치의 최소한 1.15배에 해당하는 A이 얻어지는 최대 혈청희석도로 정의했다.

B. SPF 브로일러의 예방접종

6주령 SPF 브로일러(Gezondheidsdienst voor Pluinvee (Poultuy Health Service), Doorn, Netherlands)를 실시예 2B에서 제조된 것과 같은 백신 1㎖로 근육내 주사 처리시켰다. 4주후, 동일물질을 사용하여 추가 자극주사(booster injection) 처리했다. 결과는 표 3에 도시했다.

*추가 자극주사

C. 브로일러 부화용 암닭(broiler breeding hen)의 예방접종

각각 20주령된 8마리의 브로일러 부화용 암닭으로 구성된 2개의 군을(Euribird, Boxmeer, Netherlands)각각 실시예 2B와 2C에서 제조된 바와 같은 백신 1㎖로 근육내 주사처리 했다. 일차 주사 6주후에 추가자극주사를 각각 동일한 백신을 사용하여 실시했다. 표 4에서 밝혀진 바와 같이, 브로일러 부하용 암닭의 혈청중에서 높은 항체생산을 발견할 수 있었으며, 동시에 그 알의 난황으로 항체가 전이되었고, 부화된 병아리의 혈청에도 항체의 전이가 발견되었다.

1)1차주사 10주후 채취한 혈청 샘플.

2)1차주사 11주후 채취한 8개 달걀에서 얻어진 평균값.

3)1차주사 12주후에 채취한 달걀로부터 부화된 1주령 병아리 5마리에서 얻어진 평균값.

동일한 결과가 CH4 균주 및 클론 AM1727-pPIL291-15의 F11 섬모들을 사용한 예방접종에서도 얻어졌다. ELISA에 의하며, 2개의 제제사이에 완전 교차반응이 있음이 확인되었다.

실시예 4

부화용 암닭의 예방접종에 의한 브로일러의 보호효과

브로일러 부화용 암닭을 클론 AM1727-pPIL 291-15로 부터 정제된 F11 섬모로 예방접종 시켰다)실시예 3C 참고).

이 예방접종된 부화용 암닭에서 부화된 브로일러 병아리 및 예방접종 시키지 않은 대조용 암닭에서 부화된 브로일러 병아리를 3주령째에 우측후부의 흉부 공기주머니 내에 박테리아 현탁액 0.2㎖를 주사함으로써 공격감염 시켰다. 사용된 박테리아 균주는 모두 콜리바실로 시스로 감염된 닭의 감염된 심장에서 분리된 것이다. 박테리아는 밤새 혈액 아가 기본플레이트(Oxoid)상에서 배양시킨뒤 PBS중에서 적절한 농도로 현탁시켰다. 브로일러 병아리들은 음식과 립(lib)을 가한 물을 넣은 감압 격리실에 넣어두었다.

표 5에서 알수 있는 바와 같이, 우수한 방어효과가 예방접종된 부화용 암닭으로 부터 부화된 브로일러 병아리로 전이되었다. 예방접종시키지 않은 대조용과 비교해 볼때, 모든 균주에 대해 F11 섬모로 예방접종시켜 얻어진 방어효능(efficacy of protection)은 85%였다.

외관상으로는 실험실적으로 F11 섬모를 발현하지 않는 규주 CH7을 사용한 공격감염에 대해서도 또한 방어효과가 부여된다는 것은 놀라운 일이다. 이로부터 이 균주가 사실 생체내에서 F11 섬모를 발현하지만 실험실적 발현에서는 검출에 사용되는 방법이 감지할 수 있는 제한치 이하로 발현된다고 추측할 수 있다.

1)각 균주 혈청형에 대해, F11 발현 및 항원투여 단위가 표시되어 있다.

2)항원투여/전체 항원투여 이후 7일 이내에 죽은 닭의 수.

3)카이 제곱시헙법(chi-square test) : P0.0001.

실시예 5

수동 면역방법에 의한 브로일러의 방어효과

토끼에 정제된 F11 섬모를 접종하고 56℃에서 30분동안 활동을 정지시켜 항혈청을 제조했다.

회석시키지 않은 F11 항 혈청 1㎖를 3주령 브로일러(Euribrid, Boxmeer, Netherlands)에 정맥내 주사시켰다.

항 혈청을 정맥재 주사한후 1시간내에, 상기 병아리들은 우측 후부의 흉부 공기주머니에 박테리아 현탁액 0.2㎖를 주사하ㅕ 감염시켰다. 대조용으로, 항 혈청이 투여되지 않은 병아리들을 동일한 투여량의 박테리아로 감염시켰다. 사용된 박테리아 균부는 모두 콜리바실로시스로 감염시킨 닭의 감염된 심장으로부터 분리된 것이다. 혈액 아가 기본플레이트(Oxoid^(R))상에서 하룻밤동안 박테리아를 배양한뒤, 이 박테이아를 PBS내에 현탁시키고 적절한 농도로 희석했다.

병아리들은 음식과 립을 가한 물과 함께 감압하의 격리실에 넣어 두었다.

이 실험으로부터 F11 섬모 항 혈청은 브로일러에게, 감염에 사용된 6종유의 E. coli 균주중에 5종류(표6)에 대한 우수한 방어효과를 제공한다는 것이 명백해졌다. 비록 CH6 균주가 F11 섬모를 생상한다고느 ㄴ하나, CH6 균주를 사용한 감염에 대한 방어효과는 매우 낮았다. 이 균주는 F11 섬모외에 또한 일종이상의 다른 강력한 발병인자를 생산할 것으로 추정할 수도 있으나 항체 농도가 너무 낮다. 이 균주의 박테리아에 대한 방어 효과를 제고할 수 없을 가능성도 있다.

어떠한 F11 섬모자체도 생산하지 않는것으로 알려진 CH7 균주를 사용한 가염에 대해서도 상당한 방어 효과가 얻어졌다는 것은 매우 놀라운 일이다. 이로부터 사실상 이 균주는 생체내에서 F11 섬모를 생산하지만 생체외에서의 F11 섬모생산 정도가 너무낮아 현재 사용되는 검출방법으로는 검출할 수 없을 정도인 것으로 추론 할수 있다.

*카이 제곱 시험

Claims

F11 유형의 섬모 또는 이들의 면역원 분절, 또는 이 섬모 또는 이들의 면역원 분절의 생산을 암호하고, 임의로 그들의 분비를 암호하는 유전물질을 갖고 있는 유기체를 함유하는 것을 특징으로 하는 E. coli패혈증에 대한 가금류 보호용 백신.
제1항에 있어서, 상기 백신은 상술된 면역원 분절로서, 상기 F11 섬모 서브유니트 단백질의 아미노산서열 분절에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 면역원성 폴리펩티드를 함유하는 것을 특징으로하는 백신.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 백신이 보조제를 함유하는 것을 특징으로 하는 백신.
상기 백신이 F11 유형의 섬모 또느 그들의 분절 또는 집합체에 대한 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 E. coli 패혈증에 대한 가금류 보호용 조성물.
제1항 내지 제3하엥 의한 백신 또는 제4항에 의한 조성물을 투여하는 것을 특징으로하는 E. coli 패혈증에 대한 가금류의 보호 방법.
E. coli 패혈증에 대해 가금류를 보호하는데 유효한 백신을 제조하기 위해 F11 유형의 섬모 또는 그들의 면역원 분절 또는 섬모 또는 면역원 분절을 암호하고, 임의로 그들의 분비를 암호하는 유전물질을 갖고 있는 유기체를 사용하는 방법.