JP2718523B2 - 家禽の大腸菌敗血症に対するワクチン - Google Patents
家禽の大腸菌敗血症に対するワクチンInfo
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- A61K39/0258—Escherichia
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、Escherichia coli（E.coli）敗血症から家
禽を防御するためのワクチンと、該ワクチンを投与する
ことによって家禽におけるE.coli敗血症に対抗する方法
とに関する。
禽を防御するためのワクチンと、該ワクチンを投与する
ことによって家禽におけるE.coli敗血症に対抗する方法
とに関する。
E.coli敗血症若しくは大腸菌症は通常（ニワトリ及び
シチメンチョウといった）家禽に発生し、かなりの損失
の原因となる疾患である。この疾患にかかった鳥類の特
徴的な症候は、気嚢炎症、心嚢炎及び肝周囲炎に現れ
る。この分野の研究のほとんどにおいて、前記疾患を持
つ鳥類に見られるE.coli株の半分以上が３種の血清型、
即ち01:K1、02:K1又は078:K80のいずれかに属すること
が明らかになっている。米国では血清型035もしばしば
見られる。一般にE.coli敗血症は、例えば呼吸器系疾患
を比き起こすウイルス又はマイコプラズマによって生体
が衰弱した後に気道を通って生体内に入る二次感染症で
あると言われている。
シチメンチョウといった）家禽に発生し、かなりの損失
の原因となる疾患である。この疾患にかかった鳥類の特
徴的な症候は、気嚢炎症、心嚢炎及び肝周囲炎に現れ
る。この分野の研究のほとんどにおいて、前記疾患を持
つ鳥類に見られるE.coli株の半分以上が３種の血清型、
即ち01:K1、02:K1又は078:K80のいずれかに属すること
が明らかになっている。米国では血清型035もしばしば
見られる。一般にE.coli敗血症は、例えば呼吸器系疾患
を比き起こすウイルス又はマイコプラズマによって生体
が衰弱した後に気道を通って生体内に入る二次感染症で
あると言われている。
家禽における大腸菌症の病原論で役割を演じるビルレ
ンス因子についてはほとんど知られていない。哺乳類に
おける感染症で役割を演じるE.coli株のビルレンス因子
には、例えば付着性フィムブリエ（線毛）、毒素及び鉄
分隔離メカニズムを挙げることができる。
ンス因子についてはほとんど知られていない。哺乳類に
おける感染症で役割を演じるE.coli株のビルレンス因子
には、例えば付着性フィムブリエ（線毛）、毒素及び鉄
分隔離メカニズムを挙げることができる。
通常は極めて宿主に特異的である多くの種々の付着性
フィムブリエが記述されて来た。即ちCFAフィムブリエ
は下痢のヒトに見られ、K88フィムブリエは下痢の仔ブ
タに、K99は下痢のヒツジ、仔ウシ及び仔ブタに、（F11
型を包含する）Ｐフィムブリエは尿道感染症のヒトに見
られる。更に、精製形態の前記型の付着性フィムブリエ
をワクチンとして投与するとそれぞれ動物の種類に応答
して感染防御免疫ができる。しかし家禽における大腸菌
症については同様のビルレンズ因子が同定されていな
い。
フィムブリエが記述されて来た。即ちCFAフィムブリエ
は下痢のヒトに見られ、K88フィムブリエは下痢の仔ブ
タに、K99は下痢のヒツジ、仔ウシ及び仔ブタに、（F11
型を包含する）Ｐフィムブリエは尿道感染症のヒトに見
られる。更に、精製形態の前記型の付着性フィムブリエ
をワクチンとして投与するとそれぞれ動物の種類に応答
して感染防御免疫ができる。しかし家禽における大腸菌
症については同様のビルレンズ因子が同定されていな
い。
F11型のフィムブリエ若しくはその免疫原性セクショ
ン（部分）、又は前記フィムブリエ若しくはその免疫原
性セクションの産生及び必要によっては分泌をコードす
る遺伝物質を含む有機体を含有することを特徴とする、
E.coli敗血症から家禽を防御するためのワクチンが発見
された。
ン（部分）、又は前記フィムブリエ若しくはその免疫原
性セクションの産生及び必要によっては分泌をコードす
る遺伝物質を含む有機体を含有することを特徴とする、
E.coli敗血症から家禽を防御するためのワクチンが発見
された。
特に、大腸菌症に感染したニワトリの心臓から単離さ
れたE.coli株が、ヒトに尿道感染を引き起こすE.coli株
にも存在するF11型フィムブリエと同一のフィムブリエ
を産生することを研究によって示すことが可能となっ
た。
れたE.coli株が、ヒトに尿道感染を引き起こすE.coli株
にも存在するF11型フィムブリエと同一のフィムブリエ
を産生することを研究によって示すことが可能となっ
た。
E.coli敗血症に冒されたと鳥類の大部分が、F11型フ
ィムブリエを含有するE.coli株に感染していることを血
清学的に証明することが可能となった。
ィムブリエを含有するE.coli株に感染していることを血
清学的に証明することが可能となった。
このようなフィムブリエはSDS−PAGEによる見掛けの
分子量18.0kDのサブユニットタンパク質を含有する。
分子量18.0kDのサブユニットタンパク質を含有する。
上記フィムブリエは、37℃の固体寒天培地上で培養さ
れた野生鳥類のE.coliによって生産され得るものであっ
て、ブイヨン中でE.coliを培養しても見られない。（例
えばOxoid(R)製の）血液寒天（ベース）プレート上で細
菌を培養すると、18kDフィムブリエの最適発現が行なわ
れる。同様に適した培地にはpenassay寒天プレート（Di
fco(R)）がある。20℃で成長させると18kDフィムブリエ
は形成されない。
れた野生鳥類のE.coliによって生産され得るものであっ
て、ブイヨン中でE.coliを培養しても見られない。（例
えばOxoid(R)製の）血液寒天（ベース）プレート上で細
菌を培養すると、18kDフィムブリエの最適発現が行なわ
れる。同様に適した培地にはpenassay寒天プレート（Di
fco(R)）がある。20℃で成長させると18kDフィムブリエ
は形成されない。
F11フィムブリエはもう既に尿路疾患性野生型E.coli
株からクローン化されている（de Ree.J.M.et al.,FEMS
Micorobiology Lett.29,91−97,1985）。フィムブリエ
を含有しないE.coli K12株AM1727を、F11フィムブリエ
をコードする遺伝子を含有するプラスミドpPIL 291−15
によって形質転換すると、この形質転換株はF11フィム
ブリエを生産することができる。前記F11フィムブリエ
を、鳥類にしばしば存在する02:K1:H−血清型に属する
E.coli株CH4から精製された18kDフィムブリエと次の点
について比較した。
株からクローン化されている（de Ree.J.M.et al.,FEMS
Micorobiology Lett.29,91−97,1985）。フィムブリエ
を含有しないE.coli K12株AM1727を、F11フィムブリエ
をコードする遺伝子を含有するプラスミドpPIL 291−15
によって形質転換すると、この形質転換株はF11フィム
ブリエを生産することができる。前記F11フィムブリエ
を、鳥類にしばしば存在する02:K1:H−血清型に属する
E.coli株CH4から精製された18kDフィムブリエと次の点
について比較した。
a.形態.F11及び18kDフィムブリエは電子顕微鏡では同一
に見える：いずれのフィムブリエを長さ約１μｍ及び直
径約7nmである； b.分子量.SDS−PAGEによってF11及び18kDフィムブリエ
両方のサブユニットについて見掛けの分子量が18kDであ
ることが分かった； c.免疫化学的特異性.ELISAにおいて、F11及び18kDフィ
ムブリエは、de Ree,J.M.et al.によりJ.Clin.Microbio
l.24,121−125;1986に記述された抗−F11モノクローン
抗体には全く同様に反応するが、F1A、F1C、F7、F72、F
8、F9、F12又はF13型のフィムブリエに対するモノクロ
ーン抗体には反応しない； d.アミノ酸組成.18kDサブユニットのアミノ酸組成はF11
サブユニットの組成と本質的に同一である（van Die,I.
et al.;in:D.L.Lark（ed.）,Proteincarbohydrate inte
ractions in biological systems,Academic press,Lond
on,ページ39−46,1986）（表１参照）； e.アミノ末端アミノ酸配列.18kDサブユニットのアミノ
末端の最初の17個のアミノ酸の配列はF11サブユニット
について公知の対応する配列と同一である（van Die,I.
et al.;1986）−第一図はF11サブユニットタンパク質全
体のアミノ酸配列を示す。実際の分子量16.4kDはこの配
列から算出することができる。
に見える：いずれのフィムブリエを長さ約１μｍ及び直
径約7nmである； b.分子量.SDS−PAGEによってF11及び18kDフィムブリエ
両方のサブユニットについて見掛けの分子量が18kDであ
ることが分かった； c.免疫化学的特異性.ELISAにおいて、F11及び18kDフィ
ムブリエは、de Ree,J.M.et al.によりJ.Clin.Microbio
l.24,121−125;1986に記述された抗−F11モノクローン
抗体には全く同様に反応するが、F1A、F1C、F7、F72、F
8、F9、F12又はF13型のフィムブリエに対するモノクロ
ーン抗体には反応しない； d.アミノ酸組成.18kDサブユニットのアミノ酸組成はF11
サブユニットの組成と本質的に同一である（van Die,I.
et al.;in:D.L.Lark（ed.）,Proteincarbohydrate inte
ractions in biological systems,Academic press,Lond
on,ページ39−46,1986）（表１参照）； e.アミノ末端アミノ酸配列.18kDサブユニットのアミノ
末端の最初の17個のアミノ酸の配列はF11サブユニット
について公知の対応する配列と同一である（van Die,I.
et al.;1986）−第一図はF11サブユニットタンパク質全
体のアミノ酸配列を示す。実際の分子量16.4kDはこの配
列から算出することができる。
F11と同様にＰフィムブリエの付着特性は、ヒト赤血
球のマンノース耐性血球凝集反応（MRHA）によって可視
化することができる。このMRHAは、十分な量の前記Ｐフ
ィムブリエを発現するE.coli細菌をマンノースの存在下
でヒト赤血球と混合すると見ることができる。
球のマンノース耐性血球凝集反応（MRHA）によって可視
化することができる。このMRHAは、十分な量の前記Ｐフ
ィムブリエを発現するE.coli細菌をマンノースの存在下
でヒト赤血球と混合すると見ることができる。
Ｐフィムブリエがヒト赤血球に付着するのに適した最
小の受容体構造は、二糖Galα１→4Galβであると同定
された（Kallenius,G.et al.Lancet ii,604−6;198
1）。この二糖をラテックス粒子に連結すると、ラテッ
クス凝集によって細菌上のＰフィムブリエの存在を特異
的に示す道具となる（de Man,P.et al.,J.Clin.Microbi
ol.25,401−6;1987）。
小の受容体構造は、二糖Galα１→4Galβであると同定
された（Kallenius,G.et al.Lancet ii,604−6;198
1）。この二糖をラテックス粒子に連結すると、ラテッ
クス凝集によって細菌上のＰフィムブリエの存在を特異
的に示す道具となる（de Man,P.et al.,J.Clin.Microbi
ol.25,401−6;1987）。
最近になって、F11フィムブリエ自体ではなくてこの
フィムブリエと関係する（「少量成分」とも指称され
る）特異的なアドヘシン（adhesins）が付着性の要因で
あることが分かった（van Die.I.et al.,Microbiol Pat
hogenesis 1,51−56;1986）。
フィムブリエと関係する（「少量成分」とも指称され
る）特異的なアドヘシン（adhesins）が付着性の要因で
あることが分かった（van Die.I.et al.,Microbiol Pat
hogenesis 1,51−56;1986）。
表２は、F11フィムブリエの発現と、尿路疾患性E.col
i株、F11フィムブリエ生産性組換えクローン、及び大腸
菌症に冒されたニワトリの心臓から単離された多数のE.
coli株の付着特性との相関関係を比較して示すものであ
る。この表から、ニワトリから単離されたE.coliのF11
フィムブリエは少なくともヒトE.coliのF11フィムブリ
エと同じ受容体を認識すると言える。
i株、F11フィムブリエ生産性組換えクローン、及び大腸
菌症に冒されたニワトリの心臓から単離された多数のE.
coli株の付着特性との相関関係を比較して示すものであ
る。この表から、ニワトリから単離されたE.coliのF11
フィムブリエは少なくともヒトE.coliのF11フィムブリ
エと同じ受容体を認識すると言える。
本発明のワクチンは、F11フィムブリエと一緒に若し
くはF11フィムブリエの代わりにF11フィムブリエの免疫
原性セクションを含有することもできる。前記免疫原性
セクションとは、例えば18kDサブユニット又はそのサブ
ユニットの集合体若しくはフラグメント、或いはF11フ
ィムブリエ又はその集合体若しくはフラグメントに特徴
的なアドヘシンであると理解してよい。上記18kDサブユ
ニットのフラグメント又は前記型のF11アドヘシンは、
家禽においてF11型のE.coliに対する感染防御抗体を刺
激することができる１個以上のエピトープを含有するポ
リペプチドであり得る。
くはF11フィムブリエの代わりにF11フィムブリエの免疫
原性セクションを含有することもできる。前記免疫原性
セクションとは、例えば18kDサブユニット又はそのサブ
ユニットの集合体若しくはフラグメント、或いはF11フ
ィムブリエ又はその集合体若しくはフラグメントに特徴
的なアドヘシンであると理解してよい。上記18kDサブユ
ニットのフラグメント又は前記型のF11アドヘシンは、
家禽においてF11型のE.coliに対する感染防御抗体を刺
激することができる１個以上のエピトープを含有するポ
リペプチドであり得る。
18kDサブユニット又はF11アドヘシンの適当なポリペ
プチドフラグメントは、例えば公知の方法によって見い
出だすことができる。このような方法は、T.P.Hopp及び
K.R.Woods（Prediction of protein antigenic determi
nants from aminoacid sequences;Proc.Natl.Acad.Sci.
78,3824−3828;1981）によって記述されており、該方法
はアミノ酸鎖の連続するセグメントの平均親水性を測定
することによるものである。この測定の結果を第２図に
示す。この図には公知のアミノ酸配列を基にしたF11サ
ブユニットの親水性の分布を表してある。ここに図示し
た分布はアミノ酸７個毎にその７個の親水性の重み付き
平均値を順次プロットしたものである。最も強い親水性
を有する領域は恐らく抗原決定基を構成する領域である
と考えられる。第２図ではこれらの領域を黒く塗って示
してあり、それらはアミノ酸セグメント： 24−23 Ile−Ser−Gln−Lys−Ser−Ala−Asp−Gln−S
er−Ile 45−57 Ala−Gly−Gly−Thr−Ser−Lys−Pro−Met−A
sp−Leu−Asp−Ile−Glu 67−78 Lys−Gln−Gly−Gln−Ala−Ala−Lys−Asn−G
ly−Lys−Val−Gln 87−95 Thr−Gly−Gln−Ala−Glu−Glu−Leu−Ala−T
hr 123−130 Pro−Leu−Lys−Asp−Gly−Asp−Asn−Val 136−142 Leu−Val−Lys−Lys−Ala−Asn−Gly に対応する。
プチドフラグメントは、例えば公知の方法によって見い
出だすことができる。このような方法は、T.P.Hopp及び
K.R.Woods（Prediction of protein antigenic determi
nants from aminoacid sequences;Proc.Natl.Acad.Sci.
78,3824−3828;1981）によって記述されており、該方法
はアミノ酸鎖の連続するセグメントの平均親水性を測定
することによるものである。この測定の結果を第２図に
示す。この図には公知のアミノ酸配列を基にしたF11サ
ブユニットの親水性の分布を表してある。ここに図示し
た分布はアミノ酸７個毎にその７個の親水性の重み付き
平均値を順次プロットしたものである。最も強い親水性
を有する領域は恐らく抗原決定基を構成する領域である
と考えられる。第２図ではこれらの領域を黒く塗って示
してあり、それらはアミノ酸セグメント： 24−23 Ile−Ser−Gln−Lys−Ser−Ala−Asp−Gln−S
er−Ile 45−57 Ala−Gly−Gly−Thr−Ser−Lys−Pro−Met−A
sp−Leu−Asp−Ile−Glu 67−78 Lys−Gln−Gly−Gln−Ala−Ala−Lys−Asn−G
ly−Lys−Val−Gln 87−95 Thr−Gly−Gln−Ala−Glu−Glu−Leu−Ala−T
hr 123−130 Pro−Leu−Lys−Asp−Gly−Asp−Asn−Val 136−142 Leu−Val−Lys−Lys−Ala−Asn−Gly に対応する。
F11フィムブリエの18kDサブユニットの抗原決定基も
上記領域内に位置することが予測される。I.van Die,W.
Hoekstra及びH.Bergmans（Microbiol.Pathogenesis ３,
149−154;1987）によってF11フィムブリエに対しても同
じモデルを使用して同様の結論が出された。
上記領域内に位置することが予測される。I.van Die,W.
Hoekstra及びH.Bergmans（Microbiol.Pathogenesis ３,
149−154;1987）によってF11フィムブリエに対しても同
じモデルを使用して同様の結論が出された。
18kDサブユニット若しくはF11アドヘシンの適当な免
疫化学的活性ポリペプチドフラグメントも同様に、特許
出願WO 84/03506明細書に記述された所謂ペップ−スキ
ャン法（pep−scan method）によって見つけることがで
きる。前記ペップ−スキャン法では、当該タンパク質の
部分配列に対応する一部重なり合った一連のポリペプチ
ドを合成し、抗体を用いてそれらの反応性を調査する。
疫化学的活性ポリペプチドフラグメントも同様に、特許
出願WO 84/03506明細書に記述された所謂ペップ−スキ
ャン法（pep−scan method）によって見つけることがで
きる。前記ペップ−スキャン法では、当該タンパク質の
部分配列に対応する一部重なり合った一連のポリペプチ
ドを合成し、抗体を用いてそれらの反応性を調査する。
免疫原性を高めるために、このようなポリペプチドフ
ラグメントを必要によってはキャリヤ（担体）に連結し
てもよい。
ラグメントを必要によってはキャリヤ（担体）に連結し
てもよい。
F11フィムブリエ若しくはその免疫原性セクション
は、F11型の野生E.coli株若しくはその誘導体からフィ
ムブリエを公知の方法で分離し、必要によってはその免
疫原性セクションを単離することによって調製すること
ができる。
は、F11型の野生E.coli株若しくはその誘導体からフィ
ムブリエを公知の方法で分離し、必要によってはその免
疫原性セクションを単離することによって調製すること
ができる。
F11フィムブリエ若しくはその免疫原性セクション
は、F11フィムブリエ若しくはその免疫原性セクション
の産生及び必要によっては分泌をコードする遺伝物質を
含有する組換えDNAを用いて形質転換された細胞から出
発して産生することもできる。
は、F11フィムブリエ若しくはその免疫原性セクション
の産生及び必要によっては分泌をコードする遺伝物質を
含有する組換えDNAを用いて形質転換された細胞から出
発して産生することもできる。
更に、特にポリペプチドフラグメントがより小さい場
合には、例えば固相を使用するMerrifield法によって完
全なる合成によって調製することも可能である。
合には、例えば固相を使用するMerrifield法によって完
全なる合成によって調製することも可能である。
本発明のワクチンは、F11フィムブリエ若しくはその
免疫原性セクションの産生及び／又は分泌をコードする
遺伝物質を含む有機体を含有することもできる。
免疫原性セクションの産生及び／又は分泌をコードする
遺伝物質を含む有機体を含有することもできる。
これは非病原性の有機体であれば好ましい。
上記有機体は生来前記抗原物質を産生したり、所望の
抗原物質をコードする組換えポリヌクレチドを有するこ
とができる。
抗原物質をコードする組換えポリヌクレチドを有するこ
とができる。
このような組換え有機体としてはとりわけウィルス若
しくは細菌を使用することができる。前記組換え有機体
は所望の抗原物質を産生することができるし、必要であ
ればそれを分泌することができる。
しくは細菌を使用することができる。前記組換え有機体
は所望の抗原物質を産生することができるし、必要であ
ればそれを分泌することができる。
本発明のワクチンは、非経口投与、例えば皮下若しく
は筋肉内投与するのが好ましい。この方法でワクチン
は、ワクチンを投与された鳥類の能動免疫感作のため及
び妊鳥に投与してそと生まれて来る雛の受動免疫感作の
ために投与することができる。免疫感作された妊鳥にお
いては、その個体内に作られた抗体が当然卵黄中に入
り、従って孵化した雛にも抗体がある。
は筋肉内投与するのが好ましい。この方法でワクチン
は、ワクチンを投与された鳥類の能動免疫感作のため及
び妊鳥に投与してそと生まれて来る雛の受動免疫感作の
ために投与することができる。免疫感作された妊鳥にお
いては、その個体内に作られた抗体が当然卵黄中に入
り、従って孵化した雛にも抗体がある。
本発明のワクチンは経口若しくは鼻孔を通しても、又
はエーロゾルを吸収させることによっても投与すること
ができるが、この場合にはワクチンは、F11フィムブリ
エ若しくはその免疫原生セクションの産生及び分泌をコ
ードする遺伝物質を含む非病原性有機体の生体を含有す
るのが好ましい。
はエーロゾルを吸収させることによっても投与すること
ができるが、この場合にはワクチンは、F11フィムブリ
エ若しくはその免疫原生セクションの産生及び分泌をコ
ードする遺伝物質を含む非病原性有機体の生体を含有す
るのが好ましい。
本発明のワクチンは、まず、タンパク質若しくはタン
パク質から誘導されるポリペプチドを準備するか、或い
はF11フィムブリエ又は上記F11フィムブリエ、タンパク
質若しくはポリペプチドを含有する有機体の製造によっ
て調製することができる。
パク質から誘導されるポリペプチドを準備するか、或い
はF11フィムブリエ又は上記F11フィムブリエ、タンパク
質若しくはポリペプチドを含有する有機体の製造によっ
て調製することができる。
フィムブリエをE.coliから得る後者の場合が最も好ま
しい態様である。通常、F11フィムブリエを有するE.col
iを培養した後に、例えば機械的にかき取り（剪断）及
び／又は加熱し、（遠心分離及び／又は（限外）過に
よって）細胞を除去することによって細菌からF11フィ
ムブリエを分離し、続いて、限外過、カラムクロマト
グラフィー又は（硫酸アンモニウム若しくはその他の塩
を使用するか又はpHをフィムブリエの等電点に変えるこ
とによる）特定の沈澱法によって培地及び／又は細菌の
膜に由来する夾雑物を除去してフィムブリエを更に精製
することができる。
しい態様である。通常、F11フィムブリエを有するE.col
iを培養した後に、例えば機械的にかき取り（剪断）及
び／又は加熱し、（遠心分離及び／又は（限外）過に
よって）細胞を除去することによって細菌からF11フィ
ムブリエを分離し、続いて、限外過、カラムクロマト
グラフィー又は（硫酸アンモニウム若しくはその他の塩
を使用するか又はpHをフィムブリエの等電点に変えるこ
とによる）特定の沈澱法によって培地及び／又は細菌の
膜に由来する夾雑物を除去してフィムブリエを更に精製
することができる。
非経口的なワクチン投与のためには、活性成分は通
常、活性を高めたり保存機関を延長するために、塩、ホ
ルマリン、pH緩衝液、乳化剤及び免疫応答を向上させる
ための補助剤（アジュバンド）といったその他の成分を
混合してあることが多い水溶液若しくは懸濁液中に含有
される。適当な補助剤としては、例えば鉱油、ムラミル
ジペプチド（muramyl dipeptide）、水酸化アルミニウ
ム、サポニン、ポリアニオン及び両親媒性物質を挙げる
ことができる。
常、活性を高めたり保存機関を延長するために、塩、ホ
ルマリン、pH緩衝液、乳化剤及び免疫応答を向上させる
ための補助剤（アジュバンド）といったその他の成分を
混合してあることが多い水溶液若しくは懸濁液中に含有
される。適当な補助剤としては、例えば鉱油、ムラミル
ジペプチド（muramyl dipeptide）、水酸化アルミニウ
ム、サポニン、ポリアニオン及び両親媒性物質を挙げる
ことができる。
ワクチンの組成及びワクチ投与系は、防御するべき鳥
の種類、鳥の年齢及び体重、所望する防御の期間、投与
方法、並びに能動免疫感作及び母児移行の受動免疫感作
のいずれを所望かに従って変えることができる。ワクチ
ン中の活性成分の有効量は、非経口のワクチン投与では
１回の投与当たり約10〜100μｇである。
の種類、鳥の年齢及び体重、所望する防御の期間、投与
方法、並びに能動免疫感作及び母児移行の受動免疫感作
のいずれを所望かに従って変えることができる。ワクチ
ン中の活性成分の有効量は、非経口のワクチン投与では
１回の投与当たり約10〜100μｇである。
F11フィムブリエを有するE.coliに対する上記能動免
疫感作は主に健康な鳥における予防措置として使用され
る。F11フィムブリエを有するE.coliに既に感染してし
まった鳥を、F11フィムブリエに又はそのセクション若
しくは集合体に対する抗体を用いて処置できることは言
うまでもない。
疫感作は主に健康な鳥における予防措置として使用され
る。F11フィムブリエを有するE.coliに既に感染してし
まった鳥を、F11フィムブリエに又はそのセクション若
しくは集合体に対する抗体を用いて処置できることは言
うまでもない。
実施例１ フィムブリエの精製 フィムブリエを精製するために、３種類の野生E.coli
株を37℃の血液寒天ベース（Oxoid(R)）プレート上で一
晩培養した。このためには、大腸菌症に冒されたニワト
リの心臓から単離したCH2（078:K80:H4）、CH4（02:K1:
H−）及びCH6（01:K1:H−）E.coli株を使用した。F11フ
ィムブリエクローンAM1727−pPIL291−15（de Ree et a
l.,1985）も、Biostat(R)発酵器（Braun）内に入れた50
μg/mlアンピシリンを含有する“Brain Heart Infusio
n"ブイヨン中で、一定温度37℃、pH7.4及び酸素飽和約4
0％として16時間培養した。
株を37℃の血液寒天ベース（Oxoid(R)）プレート上で一
晩培養した。このためには、大腸菌症に冒されたニワト
リの心臓から単離したCH2（078:K80:H4）、CH4（02:K1:
H−）及びCH6（01:K1:H−）E.coli株を使用した。F11フ
ィムブリエクローンAM1727−pPIL291−15（de Ree et a
l.,1985）も、Biostat(R)発酵器（Braun）内に入れた50
μg/mlアンピシリンを含有する“Brain Heart Infusio
n"ブイヨン中で、一定温度37℃、pH7.4及び酸素飽和約4
0％として16時間培養した。
pH7.5の10mM Tris−HCl緩衝液中で細菌を採取した。
氷上に置いたSorval Omnimixer中で１分間ずつ、合計
15回連続的に細菌を処理するか、又は細菌を65℃で15分
間加熱するか、又は前記２種類の処理を組み合わせて細
菌を処理するかのいずれかによって細菌からフィムブリ
エを遊離した。
15回連続的に細菌を処理するか、又は細菌を65℃で15分
間加熱するか、又は前記２種類の処理を組み合わせて細
菌を処理するかのいずれかによって細菌からフィムブリ
エを遊離した。
次いで細菌を遠心分離及び過によって除去し、粗フ
ィムブリエ溶液を濃縮し、YM100フィルタを備えたAmico
nセル中でフィムブリエをよく洗浄した。
ィムブリエ溶液を濃縮し、YM100フィルタを備えたAmico
nセル中でフィムブリエをよく洗浄した。
続いて例えばKorhonen et al.によって記述された方
法（Iinfect.Immun.27,568−575,1980）を幾らか変更し
た方法によってフィムブリエを精製した。即ち、硫酸ア
ンモニウムを用いてフィムブリエを沈澱させ、デオキシ
コール酸ナトリウムを用いて沈澱物を溶解し、更にスク
ロース勾配中で遠心分離した。
法（Iinfect.Immun.27,568−575,1980）を幾らか変更し
た方法によってフィムブリエを精製した。即ち、硫酸ア
ンモニウムを用いてフィムブリエを沈澱させ、デオキシ
コール酸ナトリウムを用いて沈澱物を溶解し、更にスク
ロース勾配中で遠心分離した。
このように精製されたフィムブリエ調製物は、（Van
den Bosch,J.F.et al.によってInfect.Immun.29,226−2
33,1980に記述されたように）電子顕微鏡で見ると同一
のフィムブリエ構造を示した。全てのフィムブリエ調製
物は、（Lugtenberg,B.et al.によってFEBS Lett.58,25
4−258,1975に記述されているような）SDS−PAGEで18kD
に単一のバンドを示し、また種々のフィムブリエに対し
て生成した全ての抗血清を用いた（Muilerman,H.G.et a
l.によってAnal.Biochem.120,46−51,1982に記述されて
いるような）ウェスタンブロッティングにおいて同様の
反応を示した。
den Bosch,J.F.et al.によってInfect.Immun.29,226−2
33,1980に記述されたように）電子顕微鏡で見ると同一
のフィムブリエ構造を示した。全てのフィムブリエ調製
物は、（Lugtenberg,B.et al.によってFEBS Lett.58,25
4−258,1975に記述されているような）SDS−PAGEで18kD
に単一のバンドを示し、また種々のフィムブリエに対し
て生成した全ての抗血清を用いた（Muilerman,H.G.et a
l.によってAnal.Biochem.120,46−51,1982に記述されて
いるような）ウェスタンブロッティングにおいて同様の
反応を示した。
実施例２ A.本発明のフィムブリエを含有するワクチンを、乳化剤
としてポリソルベート80及びソルビタンモノオレートを
用いて鉱油（低粘度パラフィン）をベースにした油中水
型エマルジョンとして調製した。
としてポリソルベート80及びソルビタンモノオレートを
用いて鉱油（低粘度パラフィン）をベースにした油中水
型エマルジョンとして調製した。
B.CH4（02:K1:H−）野生E.coli株から精製したF11フィ
ムブリエ50μg/mlを含有するワクチを実施例2Aと同様に
調製した。
ムブリエ50μg/mlを含有するワクチを実施例2Aと同様に
調製した。
C.クローンAM1727−pPIL291−15から精製したF11フィム
ブリエ50μg/mlを含有するワクチンを実施例2Aと同様に
調製した。このクローンのサンプルは1987年10月19日付
でパリのthe Collection Nationale de Cultures de Mi
croorganismes of the Pasteur Instituteに番号Ｉ−70
9で寄託した。
ブリエ50μg/mlを含有するワクチンを実施例2Aと同様に
調製した。このクローンのサンプルは1987年10月19日付
でパリのthe Collection Nationale de Cultures de Mi
croorganismes of the Pasteur Instituteに番号Ｉ−70
9で寄託した。
実施例３ 能動免疫感作 能動免疫感作実験のために、ワクチンを実施例２と同
様に調製し、調査対象の鳥に筋肉内注射し、特異的な抗
フィムブリエ血清抗体力価の出現及び上昇をELISAによ
って測定した。
様に調製し、調査対象の鳥に筋肉内注射し、特異的な抗
フィムブリエ血清抗体力価の出現及び上昇をELISAによ
って測定した。
A.ELISA ELISAのために、0.04M PBS（pH7.2）1ml当たりフィム
ブリエ2.5μｇを含有する実施例１と同様に調製した精
製フィムブリエ溶液10μをPVCマイクロタイタープレ
ートの各ウェルに入れ、室温で一晩インキュベートし
た。
ブリエ2.5μｇを含有する実施例１と同様に調製した精
製フィムブリエ溶液10μをPVCマイクロタイタープレ
ートの各ウェルに入れ、室温で一晩インキュベートし
た。
次いで、各ウェルに５％BSAのPBS溶液200μを入れ
てプレートを37℃で20分間インキュベートし、それらを
水で洗浄し、空気中で乾燥させた。緩衝液（pH7.4、0.2
M Na2HPO4、0.2M NaCl、0.1％BSA及び0.05％Tween80）
中に血清を順次希釈した液100μを各ウェルに入れて3
7℃で１時間インキューベートすることによって抗フィ
ムブリエ血清を調査した。
てプレートを37℃で20分間インキュベートし、それらを
水で洗浄し、空気中で乾燥させた。緩衝液（pH7.4、0.2
M Na2HPO4、0.2M NaCl、0.1％BSA及び0.05％Tween80）
中に血清を順次希釈した液100μを各ウェルに入れて3
7℃で１時間インキューベートすることによって抗フィ
ムブリエ血清を調査した。
洗浄後、希釈抱合体（ウサギ抗ニワトリIgG/PO（Ｈ＋
Ｌ）,Nordic）100μをプレートの各ウェルに入れて30
分間インキューベートし、それを再び洗浄した。
Ｌ）,Nordic）100μをプレートの各ウェルに入れて30
分間インキューベートし、それを再び洗浄した。
（蒸留水15ml、0.14％過酸化尿素の酢酸ナトリウム／
クエン酸緩衝液（pH5.5）溶液1.5ml及び0.6％TMBのDMSO
溶液0.2mlを含有する）酵素基質溶液100μを各ウェル
に加えることによって比色分析を行なって抗体の活性を
測定した。
クエン酸緩衝液（pH5.5）溶液1.5ml及び0.6％TMBのDMSO
溶液0.2mlを含有する）酵素基質溶液100μを各ウェル
に加えることによって比色分析を行なって抗体の活性を
測定した。
暗室内で酵素反応を実施し、10分後にウェル毎に4N H
2SO4 50μを加えることによって反応を停止させ、Mic
roelisa(R)読取り機（Organon Teknika）において450nm
での吸収（A450）を測定した。
2SO4 50μを加えることによって反応を停止させ、Mic
roelisa(R)読取り機（Organon Teknika）において450nm
での吸収（A450）を測定した。
第一の血清希釈度は1:50であった。
ワクチン投与前に得た血清を1:50に希釈して少なくと
も８個のウェルに入れることによって、各プレートにお
けるバックグラウンド値を測定した。A450バックグラウ
ンドの平均値の少なくとも1.15倍のA450を生じた最大血
清希釈度を抗体力価と定義した。
も８個のウェルに入れることによって、各プレートにお
けるバックグラウンド値を測定した。A450バックグラウ
ンドの平均値の少なくとも1.15倍のA450を生じた最大血
清希釈度を抗体力価と定義した。
B.SPFブロイラーのワクチン投与 生後６週間のSPFブロイラー（Gezondheidsdienst voo
r Pluimvee（Poultry Health Service）,Doorn,オラン
ダ）に、実施例2Bと同様に調製したワクチン1mlを筋肉
内注射した。４週間後、同じワクチンを使用して二次免
疫注射を与えた。その結果を表３に示す。
r Pluimvee（Poultry Health Service）,Doorn,オラン
ダ）に、実施例2Bと同様に調製したワクチン1mlを筋肉
内注射した。４週間後、同じワクチンを使用して二次免
疫注射を与えた。その結果を表３に示す。
C.ブロイラー生殖雌ニワトリへのワクチン投与 各々が生後20週間のブロイラー生殖雌ニワトリ（bree
ding hen）８羽からなる２群の雌ニワトリ（Euribrid,B
oxmeer,オランダ）にそれぞれ実施例2B及び2Cで調製し
たワクチン1mlを筋肉内注射した。
ding hen）８羽からなる２群の雌ニワトリ（Euribrid,B
oxmeer,オランダ）にそれぞれ実施例2B及び2Cで調製し
たワクチン1mlを筋肉内注射した。
最初の注射から６週間後にそれぞれ同じワクチンを使
用して二次免疫注射を与えた。
用して二次免疫注射を与えた。
表４から明らかなように、ブロイラー生殖雌ニワトリ
の血清中には抗体が大量に産生され、抗体が卵黄及び孵
化した雛の血清に移行したことが分かる。
の血清中には抗体が大量に産生され、抗体が卵黄及び孵
化した雛の血清に移行したことが分かる。
CH4株のF11フィムブリエを用いたワクチン投与とクロ
ーンAM1727−pPIL291−15のF11フィムブリエを用いたワ
クチン投与とで同一の結果が得られた。ELISAにおいて
は２種類の調製物間に完全な交差反応が見られた。
ーンAM1727−pPIL291−15のF11フィムブリエを用いたワ
クチン投与とで同一の結果が得られた。ELISAにおいて
は２種類の調製物間に完全な交差反応が見られた。
実施例４ 生殖雌ニワトリへのワクチン投与によるブロイラーの防
御 ブロイラー生殖雌ニワトリに、クローンAM1727−pPIL
291−15から精製したF11フィムブリエをワクチン投与し
た（実施例3C参照）。
御 ブロイラー生殖雌ニワトリに、クローンAM1727−pPIL
291−15から精製したF11フィムブリエをワクチン投与し
た（実施例3C参照）。
上記ワクチンを投与した生殖雌ニワトリ及びワクチン
を投与しないコントロール雌ニワトリから孵化したブロ
イラー雛に、生後３週間のとき胸部右後方に気嚢に細菌
懸濁液0.2mlを注射することによって細菌を投与した
（感染させた）。使用した細菌株は全て、大腸菌症に感
染したニワトリの心臓から単離し、PBS中に適当な濃度
に懸濁させて血液寒天ベースプレート（Oxoid(R)）上で
一晩培養したものである。ブロイラー雛は飼料及び水を
任意に与えて減圧された隔離室内に収容した。
を投与しないコントロール雌ニワトリから孵化したブロ
イラー雛に、生後３週間のとき胸部右後方に気嚢に細菌
懸濁液0.2mlを注射することによって細菌を投与した
（感染させた）。使用した細菌株は全て、大腸菌症に感
染したニワトリの心臓から単離し、PBS中に適当な濃度
に懸濁させて血液寒天ベースプレート（Oxoid(R)）上で
一晩培養したものである。ブロイラー雛は飼料及び水を
任意に与えて減圧された隔離室内に収容した。
表５から分かるように、ワクチンを投与した生殖雌ニ
ワトリから孵化したブロイラー雛へは優れた感染防御が
移行した。ワクチンを投与しないコントロールニワトリ
と比較すると、全体では、F11フィムブリエを用いたワ
クチン投与による感染防御の効能は85％であった。
ワトリから孵化したブロイラー雛へは優れた感染防御が
移行した。ワクチンを投与しないコントロールニワトリ
と比較すると、全体では、F11フィムブリエを用いたワ
クチン投与による感染防御の効能は85％であった。
外見ではF11フィムブリエをin vitro発現しない株CH7
を用いた細菌感染に対しても防御が与えられたことは驚
くべきことである。この株は実際にはフィムブリエをin
vito発現するが、そのin vitro発現が使用した検出方
法の限界以下であった可能性がある。
を用いた細菌感染に対しても防御が与えられたことは驚
くべきことである。この株は実際にはフィムブリエをin
vito発現するが、そのin vitro発現が使用した検出方
法の限界以下であった可能性がある。
実施例５ 受動免疫感作によるブロイラーの防御 ウサギに精製F11フィムブリエを接種することによっ
て抗血清を調製し、次いで58℃で30分間不活化した。
て抗血清を調製し、次いで58℃で30分間不活化した。
この未希釈のF11抗血清1mlを生後３週間のブロイラー
（Euribrid,Boxmeer,オランダ）に静脈注射した。
（Euribrid,Boxmeer,オランダ）に静脈注射した。
抗血清を静脈注射してから１時間以内に、ニワトリの
胸部右後方の気嚢に細菌懸濁液0.2mlを注射して感染さ
せた。コントロールとして、抗血清を投与していない雛
も同量の細菌に感染させた。使用した細菌株は全て、大
腸菌症に感染したニワトリの心臓から単離し、PBS中に
適当な濃度に懸濁させて血液寒天ベースプレート（Oxoi
d(R)）上で一晩培養したものである。
胸部右後方の気嚢に細菌懸濁液0.2mlを注射して感染さ
せた。コントロールとして、抗血清を投与していない雛
も同量の細菌に感染させた。使用した細菌株は全て、大
腸菌症に感染したニワトリの心臓から単離し、PBS中に
適当な濃度に懸濁させて血液寒天ベースプレート（Oxoi
d(R)）上で一晩培養したものである。
ニワトリは飼料及び水を任意に与えて減圧された隔離
室内に収容した。
室内に収容した。
上記実験から、F11フィムブリエ抗血清が、感染に使
用した６首里のE.coli株の内の５種類に対して優れた防
御をブロイラーに与えたことが明らかであった（表
６）。CH6株はF11フィムブリエを生産するけれども、こ
の株による感染に対する防御はかなり低かった。恐らく
この株はF11フィムブリエに加えて１種以上の強力なビ
ルレンス因子も生産するが、抗体レベルがこの細菌株に
対する防御を与えるには低すぎた可能性がある。
用した６首里のE.coli株の内の５種類に対して優れた防
御をブロイラーに与えたことが明らかであった（表
６）。CH6株はF11フィムブリエを生産するけれども、こ
の株による感染に対する防御はかなり低かった。恐らく
この株はF11フィムブリエに加えて１種以上の強力なビ
ルレンス因子も生産するが、抗体レベルがこの細菌株に
対する防御を与えるには低すぎた可能性がある。
驚くべき特徴は、F11フィムブリエ自体を生産するよ
うには見えないCH7株を用いてさえも感染に対してかな
りの防御が見られたことである。恐らくこの株は実際に
はF11フィムブリエをin vivo生産するが、そのF11フィ
ムブリエのin vitro生産が使用した検出方法に対して少
なすぎたのであろう。
うには見えないCH7株を用いてさえも感染に対してかな
りの防御が見られたことである。恐らくこの株は実際に
はF11フィムブリエをin vivo生産するが、そのF11フィ
ムブリエのin vitro生産が使用した検出方法に対して少
なすぎたのであろう。
第１図はF11フィムブリエのサブユニットのアミノ酸配
列を示す図、第２図はF11サブユニットのアミノ酸７個
毎のセグメントの平均親水性の測定値をプロットしたグ
ラフである。
列を示す図、第２図はF11サブユニットのアミノ酸７個
毎のセグメントの平均親水性の測定値をプロットしたグ
ラフである。
Claims (5)
- 【請求項１】大腸菌（E.coli）敗血症から家禽を防御す
るためのワクチンであって、F11型のフィムブリエ若し
くはその免疫原性セクションを含有することを特徴とす
るワクチン。 - 【請求項２】前記ワクチンが、前記免疫原性セクション
として、F11フィムブリエサブユニットタンパク質のア
ミノ酸配列の一部に対応するアミノ酸配列を有する免疫
原性ポリペプチドを含有することを特徴とする請求項１
に記載のワクチン。 - 【請求項３】前記ワクチンが補助剤も含有することを特
徴とする請求項１又は２に記載のワクチン。 - 【請求項４】大腸菌（E.coli）敗血症から家禽を防御す
るための組成物であって、F11型のフィムブリエ又はそ
のセクション若しくは集合体に対する抗体を含有するこ
とを特徴とする組成物。 - 【請求項５】請求項１〜３のいずれか一項に記載のワク
チン又は請求項４に記載の組成物を投与することを特徴
とする、大腸菌（E.coli）敗血症から家禽を防御する方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8702536 | 1987-10-26 | ||
| NL8702536 | 1987-10-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01149734A JPH01149734A (ja) | 1989-06-12 |
| JP2718523B2 true JP2718523B2 (ja) | 1998-02-25 |
Family
ID=19850813
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63270610A Expired - Lifetime JP2718523B2 (ja) | 1987-10-26 | 1988-10-26 | 家禽の大腸菌敗血症に対するワクチン |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0314224B1 (ja) |
| JP (1) | JP2718523B2 (ja) |
| KR (1) | KR970005333B1 (ja) |
| CN (1) | CN1038559C (ja) |
| AR (1) | AR241634A1 (ja) |
| AU (1) | AU610940B2 (ja) |
| CA (1) | CA1331445C (ja) |
| DD (1) | DD283331A5 (ja) |
| DE (1) | DE3871489D1 (ja) |
| DK (1) | DK175528B1 (ja) |
| ES (1) | ES2042718T3 (ja) |
| GR (1) | GR3005517T3 (ja) |
| HU (1) | HU203673B (ja) |
| IE (1) | IE60324B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ226677A (ja) |
| PT (1) | PT88850B (ja) |
| YU (1) | YU47473B (ja) |
| ZA (1) | ZA887694B (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| ZA934199B (en) * | 1992-06-18 | 1994-01-10 | Akzo Nv | Carrier system against gnrh |
| WO1994013811A1 (en) * | 1992-12-04 | 1994-06-23 | N.V. Innogenetics S.A. | New polypeptides, nucleic acid sequences encoding them, and their use to prevent the adhesion of f107-fimbriated bacteria |
| US5403582A (en) * | 1993-01-21 | 1995-04-04 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Vaccine comprising fowlpox virus recombinants expressing the envelope glycoprotein of an avian reticuloendotheliosis retrovirus |
| AU2816095A (en) * | 1994-06-24 | 1996-01-19 | Children's Hospital Medical Center | Escherichia coli o157:h7 epithelial adhesin |
| US5914114A (en) * | 1995-06-02 | 1999-06-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Method of raising antibodies against E. coli of the family CS4-CFA/I |
| US6399074B1 (en) | 1998-07-24 | 2002-06-04 | Megan Health, Inc. | Live attenuated salmonella vaccines to control avian pathogens |
| DE10203652B4 (de) * | 2002-01-30 | 2006-10-19 | Westfalia Separator Ag | Vollmantel-Schneckenzentrifuge mit einem Wehr |
| CN101948538A (zh) * | 2010-10-19 | 2011-01-19 | 郑州后羿制药有限公司 | 一种抗大肠杆菌的鸡卵黄抗体精制方法 |
| WO2013009843A1 (en) * | 2011-07-11 | 2013-01-17 | Camas Incorporated | Compositions against bacterial toxins |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ199866A (en) * | 1981-03-09 | 1984-11-09 | Cetus Corp | Vaccine for prevention of gastroenteric disease:non-pathogenic strain genetically engineered to comprise genes for adhesin and/or toxoids |
| JPS58131920A (ja) * | 1982-01-29 | 1983-08-06 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | 鶏の大腸菌症の予防法 |
| JPS58146596A (ja) * | 1982-02-25 | 1983-09-01 | Takeda Chem Ind Ltd | 組換えｄｎａ、それで形質転換させた微生物およびそれらの用途 |
| WO1984003506A1 (en) * | 1983-03-08 | 1984-09-13 | Commw Serum Lab Commission | Antigenically active amino acid sequences |
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