NO175735B - Fremgangsmåte ved fremstilling av Pasteurella-vaksine - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse omhandler en fremgangsmåte ved fremstilling av en vaksine mot bakterier av familien Pasteurella. spesielt Pasteurelle heamolytica, som er organismen som er ansvarlig for pasteurellosis hos får og som er en av dem som er ansvarlig for pasteurellosis i kyr, samt Pasteurella multocjLda, som er en annen organisme som er ansvarlig for pasteurellosis hos storfe.

Pasteurellosis er en vanlig respiratorisk sykdom hos får og kyr som ofte kan føre til døden, spesielt hos unge dyr, og forhindring og kontroll av denne sykdommen er således av stor viktighet for bønder som driver med får og kyr. Hos får opptrer sykdommen enten som lungebetennelse eller som en septiakemisk tilstand, avhengig av alderen til det angrepne dyr og stammen til den infiserende organisme, mens sykdommen hos kyr påtreffes i hovedsak som lungebetennelse i områder med temperert klima. To biotyper av P. haemol<y>tica har blitt identifisert, hvor biotype A generelt er assosiert med septiakemia hos unge lam og med lungebetennelse hos eldre sauer, og T biotypen er generelt assosiert med septiakemia hos voksne sauer, og innen disse to biotyper har femten forskjellige serotyper (elleve "A" og fire "T" serotyper) blitt identifisert. Serotype A2 er spesielt viktig i forbindelse med sauer og Al i forbindelse med kyr.

Det har vært et problem å forbedre antigenisiteten av kommersielt tilgjengelige vaksiner mot pasteurellosis. Sauevaksiner består av forskjellige stammer P. haemol<y>tica. som representerer de viktigere biotyper og subtyper derav. Vaksiner for kyr omfatter også Pj. multocida.

Europeisk patent nr. 36995A (Norden Labs.) beskriver en levende vaksine av Pasteurelle haemol<y>tica og multocida. forbedret for å gjøre disse mindre patogene ved å dyrke dem i buljong inneholdende en acridinforbindelse.

I GB patent 2023420A (Hoechst UK) beskrives en vaksine mot Pasteurella haemolytica antigener som hevdes å være assosiert med bakteriekapselen. Et ekstrakt av slike antigener fremstilles ved å oppvarme og sentrifugere kulturen og samle opp supernatanten. De utfelte celler sterilseres og vaskes. Både supernatanten og de vaskede celler blir innbefattet i vaksinen.

Fransk patent nr. 2182909A (Wellcome) eller tilsvarende GB patent nr. 1441098 beskriver en vaksinekomponent fremstilt fra P. haemolytica eller multocida ved å ekstrahere en fullstendig cellekultur, lysat, eller cellefri kulturmedium med en lavere alkanol eller et lavere alkylketon eller "utsalting" med et salt, så som ammoniumsulfat for å utfelle endotoksin. Endotoksin er en lipopolysaccaridkom-ponent som er tilstede i kapselen til organismen. Den endotoksinfrie supernatanten behandles på nytt med opp-løsingsmidlet eller saltet (som tidligere) ved høy konsentrasjon for å utfelle den antigene substans for bruk som en vaksinekomponent.

Et annet forsøk til forbedring er beskrevet i US-patent

nr. 4.346.074 eller tilsvarende Europeisk Patent nr. 20356B (National Research Development Corporation). Disse patenter omhandler en vaksine omfattende som essensielle komponenter kapselekstrakt, spesielt natriumsalicylatekstrakt av Al

serotypen i kombinasjon med varmeavlivede celler av A2 serotype. I ekstraksjonsprosessen blir de bakterielle celler sentrifugert, ristet i natriumsalicylatoppløsning og så sentrifugert på nytt, og supernatanten blir konsentrert ved dialyse.

For en nylig oversikt over vaksinering mot pasteurellosis se N. Gilmour og W. Donachie i "Science and Quality Lamb Production" (Agricultural and Food Research Council, UK, 1986), sidene 22, 23 og 28.

Det har nå blitt funnet at når pasteurellaorganismer dyrkes under jernbegrensende betingelser, dvs. betingelser som be-grenser tilgjengeligheten av jern for organismen til mindre enn denne krever for normal vekst in vitro, gir ekstraksjon av yttermembranen eller av helcellelysatet opphav til en forskjellig proteinprofil i forhold til hva som erholdes under normale vekstbetingelser in vitro, idet et slikt ekstrakt er mer immunogent enn et tilsvarende yttermembran-ekstrakt av organismen dyrket under nevnte normale vekstfor-hold, og hvor denne forbedrede immunogenisitet er assosiert med proteinholdig mteriale dannet under jernbegrensende betingelser, men ikke under nevnte normale vekstbetingelser. Dette proteinholdige materialet og cellematerialet inneholdende dette har blitt funnet å være verdifullt ved vaksinering av dyr mot Pasteurella. spesielt P. heamolyticaf i det minste av samme serotype. Det nye proteinholdige materialet er nytt med hensyn til at det kan påvises når organismen dyrkes under jernbegrensende betingelser, men ikke når den dyrkes under normale, dvs. tilstrekkelig jerninneholdende betingelser in vitro. Det er immunogent i den forstand at det reagerer i en immunblottingtest mot serum fra et konvalesent dyr som har kommet seg av en infeksjon av Pasteurella av samme serotype.

Det nye proteinholdige materiale kan omfatte én eller flere individuelle molekyler og kan være et fritt protein eller et bundet protein, så som et glykoprotein, og uttrykket "proteinholdig materiale" som brukt heri, er å betrakte i hovedsak som ethvert materiale som vil gi opphav til peptid-bånd ved gel-elektroforese av det ytre membranekstrakt inneholdende dette. Det nye proteinholdige materiale blir passende referert til heri som et "jernrestriksjonsprotein" eller "IRP".

I henhold til en viktg side av oppfinnelsen er det følgelig fremskaffet en fremgangsmåte for fremstilling av et jernrestriksjonsprotein av Pasteurella. spesielt P. haemolytica, som er et proteinholdig materiale tilstede i (og isolerbart fra) Pasteurella dyrket under jernbegrensende betingelser, men som ikke kan isoleres fra Pasteurella dyrket under normale (ikke-jernbegrensende) betingelser in vitro og som reagerer i en immunblottest mot serum fra et konvalesent dyr som har kommet seg fra en infeksjon med Pasteurella av samme serotype.

En fremgangsmåte som inkluderer inaktiverte hele celler av Pasteurella dyrket under jernbegrensende betingelser, innbefattende "bakterin", for det formål å fremstille en vaksine, er innbefattet i oppfinnelsen.

Oppfinnelsen fremskaffer videre en fremgangsmåte for fremstilling av en avlivet vaksine mot Pasteurella. spesielt P. heamolytica. omfattende et jernrestriksjonsprotein som definert ovenfor, samt et hjelpestoff.

I sin mest omfattende form angår foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte ved fremstilling av en vaksine mot Pasteurella. hvilken fremgangsmåte er særpreget av de trekk som er angitt i krav l's karakteriserende del. Det er kjent at den forskjellige bakterie Escherichia coli utskiller proteiner som opptrer i et ytremembranekstrakt av E. coli dyrket under jernbegrensende betingelser, men ikke under normale jernrike betigelser in vitro. Under jernbegrensede betingelser synes organismen å aktivere (oppheve hemningen av) et gen som vanligvis er undertrykket og som uttrykker et protein i ytremembranen som hjelper til med jernoppfanging. Enkelt sagt, når bakteriecellen ikke til-føres et passende jernbehov, igangsetter den tiltak for å forsøke å øke sin tilgang ved å danne protein som virker som en reseptor for en jernoppfanger (kjent som en "sideropor"), så som enterochelin. Jernbegrensende betingelser kan bli dannet kunstig ved tilsetning av en god jernchelator, så som alfa, alfa-bipyridyl (også kalt alfa, alfa-dipyridyl) til cellevekstmediet, hvorved cellen stimulers til å produsere jernreseptorproteinet. Se f.eks. E.Griffiths et al, FEMS Microbiology letter 16, s. 95-99 (1983) og "Infection and Immunity" 47, s. 808-813 (1985). Innledning i FEMS-referansen nevner enkelte andre organismer som er kjent for å utskille enterochelin under jernbegrensende betingelser, innbefattende en Salmonella-stamme som danner nye yttermembranproteiner. Det er i FEMS-referansen spekulert om yttermembran-jernreseptorproteiner kan virke som "viru-lensfaktorer" i den betydning at de hjelper et patogent bakterium med å skaffe jern, slik at det vil overleve lengre i vertsorganismen og derved forlenge infeksjonen. Patogent E. coli. gjenvunnet fra letalt infiserte marsvin, ble funnet å inneholde to jernrestriksjonsproteiner som hovedkompo-nenter av yttermembran-ekstrakten. Det er imidlertid intet som tyder på at andre bakterier danner nye yttermembranproteiner (OMP) som svar på jernrestriksjon eller at slike proteiner ville ha noen verdi som vaksinekomponenter.

Ifølge CA. Bolin et al., "Infection and Immunity" 55 (nr. 5) 1239-1242 (mai 1987) hadde rollen til jernregulert OMP hos E. coli som beskyttende antigener ikke tidligere blitt bestemt. Disse forfattere angir at passiv immunisering med antistoffer mot jernregulert OMP beskyttet kalkuner mot E. coli septicemia.

En oversikt over metoder for å danne jernbegrensede bakterier har blitt gitt av P. Stevenson og E. Griffiths i metodologiavsnittet i "The Virulence of Escherichia coli". Ed. M. Sussman, Society for General Microbiology Special Publication No. 13, Academic Press (1985), på side 413 til 417.

A. Nordquist et al. FEMS Microbiol. Letters 4, 71-75 (1978) har rapportert at ingen tilførsel av jern til Neisseria <g>onorrhoeae danner nye proteinbånd ved gel-elektroforese av et ytremembranekstrakt.

US-patent 4.681.761 (Mietzner et al) utgitt 21. juli 1987 beskriver et vesentlig jernregulert protein til N. <g>onorrhoeae og dets bruk som en vaksinekomponent. Dets molekylvekt er ca. 37 KDal. og det dannes ved virkningen av den kationiske detergent cetyltrimetylammoniumbromid for selektivt å oppløse IRP fra de gonokokke membraner.

Når Pasteurella multocida ble passert flere ganger (opptil 200) i et jernfattig medium, ble det rapportert å ha minket virulens (faktisk), som målt ved LD50 i mus, og i ett tilfelle også en minkning i immunogenisitet, se K.-D. Floss-mann et al., Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie 24, 231-237 (1984). Denne referanse synes derfor å vise bort fra oppfinnelsen. I alle tilfelle er oppfinnelsen ikke opptatt av økning ved gjentatte passasjer.

M.J. Gentry et al., Amer. J. Vet. Res., 47, 1919-1923

(1986) undersøkte produksjonen av cytotoksin av P. haemolytica Al i forskjellige medier inneholdende jerninneholdende og jernbindende forbindelser, og konkluderte med at en viss minimumskonsentrasjon av jern såvel som tilstedevæ-relsen av et passende bæremolekyl (sideropor) kunne være kritisk for effektiv produksjon av cytotoksin av P. haemol<y>tica.

G. H. Shand et al., Infection and Immunity 48., 35-39 (1985) dyrket enkelte gram-negative bakterier isolert fra human urin under jernrike og jernfattige betingelser, ekstraherte yttermembranproteiner (OMP) og sammenlignet deres profiler ved gel-elektroforese. Enkelte høymolekylvekts-OMP var tilstede kun når jernbegrensende betingelser hadde blitt brukt. Disse var svakt immunogene når de ble immunoblottet mot pasientens serum. For to av organismene, Klebsiella pneumoniae og Proteus mirabilis ble disse OMP, som var unike for jernbegrensende betingelser, også funnet i de samme bakterier som fikk vokse i urin fra pasienter som led av urinveisinfeksjoner.

H. Anwar et al., FEMS Microbiology Letters 29., 225-230

(1985) viste at når Pseudomonas aeruginosa dyrkes under jernfattige betingelser, blir minst seks høymolkylvekt-proteiner funnet i PMP-profilen som ikke vanligvis er tilstede. En pasient som led av brannskader og følgelig akutt infeksjon av P. aeruginosa dannet antistoff mot OMP, innbefattende ett av disse jernberensende membranproteiner. Artiklen nevner at dersom disse funn ble bekreftet ved ytterligere undersøkelser, kan de ha betydning for utførel-sen av beskyttende proteinvaksiner og immunoterapi av brann-skadepasienter infisert av P. aeruginosa.

Kort beskrivelse av de medfølgende tegninger.

Fig. 1 viser snitt gjennom en celleveggstruktur av P. haemolytica som viser yttermembranen. Fig. 2 viser fargede gel-elektrofereseprofiler av proteiner erholdt fra yttermembranekstrakter av P. heamolvtica serotype A2 dyrket under normale og jernbegrensende betingelser. Fig. 3 viser et immunoblot av P. haemolytica A2-proteiner fra en gel lik fig. 2 mot serum fra konvalesente lam infisert med P. haemolytica A2. Fig. 4 viser fargede gel-elektroforeseprofiler av proteiner erholdt fra yttermembranekstrakter fra 5 forskjellige serotyper av P. haemolytica. Fig. 5 og 6 er henholdsvis analoge til figurene 2 og 3, men angår P. multocida. og Fig. 7 er et immunoblot av en IRP ifølge oppfinnelsen mot serum fra konvalesente, ikke-infiserte og vaksinerte lam.

Beskrivelse av foretrukket utførelsesform

Materialet fremstilt ifølge oppfinnelsen er anvendelig mot P. haemolvtica-organismer av biotyper A eller T, men biotype A er viktigere epidemiologisk. Innen biotype A er serotype A2 den viktigste ved vaksinering av får og Al ved vaksinering av kyr. For tiden foreslås det å danne vaksinen for homolog serotypebruk, dvs. en IRP avledet fra serotype A2 ville bli brukt for å beskytte mot infeksjon med A2. Det blir bestemt antatt at innen en gitt serotype vil en IRP avledet fra en stamme beskytte mot infeksjon fra en annen stamme. Således innbefatter oppfinnelsen fremstilling av en polyvalent vaksine inneholdende IRP fra alle patologisk viktige Pasteurella serotyper. For får innbefatter dette minst serotype A2 og fortrinnsvis Al, A6, A7 og A9. For kyr innbefatter dette minst serotype Al og fortrinnsvis også minst A2 og P. multocida.

Den viktigste IRP for P. haemol<y>tica serotype A2 har en molekylvekt på ca 70.000 Dalton, som bestemt ved gel-elektroforese. Molekylvekten for de viktigste IRP for andre A serotyper av P. haemol<y>tica og av P. multicoda synes å være av samme størrelsesorden.

En annen IRP har en molekylvekt på ca 30 - 35 kilo Dalton og vil nedenfor for korthets skyld bli angitt som "35kDal protein". Det finnes også mindre IRP med andre molekylvekter.

Hovedkravet for vaksinen er at den inneholder minst én IRP fra en Pasteurella organisme. Denne IRP kan foreligge i mange forskjellige former. F.eks. kan en helcellevaksine dannes, hvori Pasteurella-cellene dyrket under jernbegrensende betingelser er drept ved behandling med formalin (vandig formaldehyd) eller varme, f.eks. ved 60°C i 20 minutter eller (som en forsiktighetsregel) begge metoder. Spesielt foretrukket er fremstilling av et bakterinpreparat.

(Bakteriner er formalin-avlivede hele celler sammen med assosierte toksoider). Alternativt kan enhver ekstraksjons-metode hvorved yttermembranproteiner blir utvunnet, bli brukt. En enkel metode er å ekstrahere cellekapper som inneholder yttermembranen. Disse kapper kan fremstilles ved å ultralydbehandle cellene. En foretrukket ekstraksjonsme-tode er kapsulær ekstraksjon, som ekstraherer kapselen til organismen innbefattende yttermembranen. En anvendelig

metode for kapsulær ekstraksjon er hvor det anvendes natriumsalicylat: se US patent 4.346.074 eller Europeisk patent 20356B nevnt ovenfor.

Som forklaring for terminologien brukt for å beskrive Pasteurella-organismen. se fig. 1 i de medfølgende tegninger, som viser et skjematisk tverrsnitt gjennom celleveg-gen til organismen. Under referanse til tegningen indikerer:

1 polysakkaridkapselen,

2 yttermembranen, innbefattende lipopolysakkarid ("LPS"),

3 laget av stive peptidoglykaner tilkoblet yttermembranen via lipoprotein ("LP") og protein ("P"),

4 indremembranen innbefattende fosfolipid ("PL"),

5 kappen,

6 cytoplasmaet.

Et "kapsulært ekstrakt" vil i praksis inneholde mer enn kapselen 1. Således ekstraherer et natriumsalicylatekstrakt (SSE) kapselen 1, yttermembranen 2 og peptidogly-kanlaget 3.

Det er selvfølgelig mulig å isolere IRP og bruke dette som sådant, f.eks. ved å fremstille monoklonale antistoff (MCA) mot dette ved konvensjonell hybridomteknikk, f.eks. ved å bruke musemilt - musemyelomcellefusjon, og etterfølgende å bruke MCA (immobilisert på en kolonne) for å isolere IRP fra cellulære ekstrakter og så gjenvinne IRP fra kolonnen.

Antistoff kan også fremstilles mot de monoklonale eller polyklonale antistoff mot IRP og således fremstilte antistoff er kjent som anti-idiotyp antistoff og kan i seg selv være monoklonale eller polyklonale. Anti-idiotyp antistoffene utvelges forå ha immunolegene egenskaper lik de til en eller flere av de opprinnelige IRP.

Ved fremstillingen av vaksinen kan det proteinholdige materi-ale kombineres med ethvert av vanlige hjelpestoff i veterinærvaksiner, typisk er de basert på aluminiumforbin-delser. Aluminiumhydroksyd geltilsetningsmidlet 11 Alhydrogel" (antatt å være et registrert varemerke i enkelte land) er spesielt anvendelig. Fortrinnsvis absorberes antigenisk materiale på "Alhydrogel" og den resulterende suspensjon emulsifiseres eventuelt med en passende olje, såsom "Bayol F", fortrinnsvis inneholdende 10% "Arlacel A". Ordene "Bayol" og "Arlacel" er antatt å være registrerte varemerker. I vaksinen kan det også innbefattes andre komponenter, f.eks. et preserveringsmiddel.

Konsentrasjonen av antigenisk materiale i vaksinen kan om ønsket varieres, f.eks. i samsvar med doseringsgraden til vaksinen, og i dette henseende er den normalt anvendte dose generelt 1-2 ml. Generelt omfatter hver vaksinedose 0,1-2 0 ml antigenisk materiale, spesielt fra 0,1 - 10 mg, f.eks. ca. 5 mg av antigenisk materiale av hver serotype innbefattet i vaksinen.

For forhindring og kontroll av pasteurellosis, f.eks. for bruk i jordbruksmessig dyreavl, tilføres vaksinene fremstilt ifølge oppfinnelsen voksne eller unge dyr, f.eks. sauer eller kyr, vanligvis i form av en subkutan injeksjon. Dyrene kan vaksineres like etter fødselen for å gi dem beskyttelse mot pasteurellosis på et tidlig stadium i deres liv. Vaksinering kan også utføres på spesielle perioder av året for å gi beskyttelse mot vanlige årstidmessige utbrudd av pasteurellosis. F.eks. kan saueflokker vaksineres sent på våren eller deromkring med vaksinen fremstilt ifølge oppfinnelsen, bestående av P. haemol<y>tica A serotype antigent materiale for å gi beskyttelse mot utbrudd av lungebetennelse-pasteurellosis, som vanligvis inntreffer i saueflokker i løpet av sommeren. Drektige søyer kan også vaksineres.

Passiv immunisering med antistoff til IRP er også mulig, spesielt når et sykdomsutbrudd inntreffer eller er ventet.

70 kDal-proteinet kan isoleres fra helcellelysater eller fra yttermembranekstrakter. 35 kDal-proteinet har foreløbig blitt isolert kun fra hele celler, men det ville være mulig å isolere dette fra et passende ekstrakt. Cellen kan dyrkes i ethvert medium som er passende for normal veks av Pasteurella. men som har blitt gjort jerndefisient. Eksempler på slike vanlige vekstmedier er buljonger basert på kjøttkraft, så som GIBCO nr. 2, OXOID, hjerne-hjerteinfusjon, eller trypticase-soyabuljong. For å gjøre mediene jerndefisiente, kan enhver jernchelator eller bindemiddel bli brukt så lenge det er kompatibelt med vekst av Pasteurella-bakterier i kultur. Eksempler på egnede jernchelatorer er alfa, alfa-bipyridyl av formel nitrilotrieddiksyre av formel visse etylendiamineddiksyre-forbindelser så som dietylentriaminpentaeddiksyre (DETPA) av formel og desferrioksamin av formel

(samt salter eller derivater av enhver av disse forbindelser som ikke innvirker med deres chelaterende virkning).

Desferrioksamin-metansulfonat er kommersielt tilgjengelig som "Desferal" (antatt å være et registrert varemerke) fra Ciba-Geigy AG som en motgift mot jernforgiftning.

Det må imidlertid bli utvist forsiktighet for ikke å bruke et chelaterende middel som binder andre elementer som er essensielle for bakterienes overlevelse som er avhengige av jern. EDTA f. eks. er uegnet ut fra dette synspunkt. Det for tiden foretrukne chelaterende middel er alfa, alfa-bipyridyl.

Mengdene av chelaterende middel som skal brukes, må kontrol-leres nøyaktig. For stor konsentasjon gjør at bakteeriene mangler så mye jern at de ikke vokser i det hele tatt. En utilstrekkelig mengde vil kun tillate normal vekst. Generelt er den optimale vekstgrad å sikte mot én hvor bakteriekulturens formering til minst 100 ganger den opprinnelige konsentrasjon foregår på 6 timer når det inkuberes ved 37<*>C i en rister. I fravær av jernbegrensende middel ville en typisk formering ved disse betingelser være ca. 1000 ganger. Den optimale konsentrasjon av chelaterende middel kan lett finnes ved enkle forsøk basert på disse kri-terier. For alfa, alfa-bipyridyl ligger dette mellom 80 og 200, fortrinnsvis mellom 100 og 200 jamol. For DEPTA er den mellom 25 og 500, fortrnnsvis 50 - 200 jjmol.

Selvfølgelig kan enhver annen metode å fjerne jern på anvendes, idet det ikke er nødvendig å bruke et chelaterende middel i mediet hvori bakteriene dyrkes. F.eks. kunne mediet forbehandles for å fjerne jern med en ionebytter, f.eks. "Chelex 100" fra Biorad, og en definert lavkonsentra-sjon av jern tilsettes mediet.

En annen mulighet er å bruke et naturlig bakterielt vekst-medium som allerede inneholder jernbindende proteiner. Således kunne et pattedyrserum, såsom hesteserum, passende fortynnet, om nødvendig bli brukt.

Cellen kan ellers dyrkes under vanlige betingelser som er anvendelige for Pasteurella. f.eks. i luft, uten risting, ved en temperatur på 25-41°C, fortrinnsvis ca. 31°C.

Oppfinnelsen kan anvendes med mange forskjellige arter Pasteurella. innbefattet P. haemolytica. P. multocida.

P. piscicida og P. anatipestifer. Den fremstilte vaksinen kan brukes for profylakse av enhver av sykdommene assosiert med Pasteurella. f.eks. enhver av de følgende sykdommer forårsaket av P. haemolytica: Lungebetennelse i får, kyr, rådyr og geiter, septicaemia i mange arter dyr; enhver av de følgende sykdommer forårsaketav P. multocida: Lungebetennelse i griser og kyr; atropisk rhinitis i griser, fjærkrekolera i høns, kalkuner og ender, encefalomyelitt i bøffel, og forkjølelse og lungebetennelse hos små dyr, så som hamster, kanin og mink; såvel som sykdommer i ender forårsaket av P. anatipestifer og i fisk forårsaket av P. piscicida. I hvert tilfelle vil en IRP av homologe arter og typer normalt bli brukt.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Fremstiling; av natriumsalicylatekstrakter

P. haemol<y>tica A2 ble dyrket i stasjonær kultur i 6 timer ved 37°C i GIBCI næringsbuljong nr. 2 (et trypsinutdrag av oksehjerte), med og uten tilsetning av alfa, alfa-bipyridyl til en konsentrasjon på 150 jjmol. Den endelige konsentrasjon av celler var ca. IO<9> celler pr. ml i tilfeller med normal vekst og IO<7> celler pr. ml i tilfelle jernbegrenset vekst i mediet inneholdende alfa, alfa-bipyridyl. Cellene ble høstet ved sentrifugering og supernatantvæsken kastet. Cellene ble vasket i fosfatbufret saltvann, pH 7,4 (<H>PBS), resuspendert i en tiendedel av volumet i IM vandig natriumsalicylat, ristet kraftig i 3 timer ved 37°C, sentrifugert og celleavfallet ble fjernet. Det resterende natriumsalicylatekstrakt ("SSE") ble konsentrert ved sentrifugering gjennom en eksklusjonsmembran som tillot lavmolekylmateria-let (på m.w. 100.000 Dalton eller mindre) å passere gjennom. Ved dette trinn var IRP i form av aggregater som ble holdt tilbake av membranen. Det tilbakeholdte materiale ble konsentrert 10 ganger, dvs. fra 300 ml til 30 ml. Det ble så dialysert mot PBS og derpå mot destillert vann ved 4°C. Produktet ble frysetørket til et porøst fast stoff.

Vaksinefremstilling og utprøving

Vaksiner ble fremstilt som følger:

Det frysetørkede SSE av P. haemolytica dyrket med og uten jernbegrensing, fremstilt som ovenfor, ble homogenisert med en lik vektmengde av "Alhydrogel" hjelpestoff og med destillert vann til en konsentrasjon på 2,5 mg SSE pr. ml vaksine. Tre uker gamle spesielt patogen-frie (SPF) lam ble vaksinert på dag 0 og vaksinert på nytt på dag 28, hver gang med en ml vaksinedose, så infisert intratrachealt og intranasalt med parainfluensa virus type 3 (PI3) (IO<6> TCID50/ml) på dag 35 og en aerosol av P. haemol<y>tica A2 stamme x 205A (ca. 4 x IO<7> cfu/1) på dag 42. Andre 3 ukers gamle SPF-lam ble brukt som uvaksinerte kontroller. (PI3 er en velkjent inducer av P. haemolytica eksperimentelt). Lammene ble observert i 6 dager (dg 43-48) etter eksponering til P. haemolytica aerosol og kliniske poeng angående graden av sykdom som oppsto ble nedtegnet. 13 av 28 lam, 6 i SSE uten jernbegrensende gruppe og 7 uvaksinerte, døde eller ble avlivet på grunn av alvorlig sykdom innen 6 dager fra tilføring. De gjenværende lam ble avlivet i tilfeldig rekkefølge på dag 49 og lunger fra alle lam ble undersøkt.

Resultatene som ble erholdt er gitt nedenfor i tabell 1. Som det kan observeres, var resultatene utmerket, en bemer-kelsesverdig grad av beskyttelse ble gitt til lammene fra vaksinen fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 2

Effekten av jernbegrensning på antigenisiteten av P. haemol<y>tica A2 ble undersøkt med SDS-PAGE og immunoblotting. Celler av P. haemol<y>tica (Stamme x 205) ble dyrket i GIBCO næringsbuljong nr. 2 (Nb) inneholdende "Desferal", i Nb inneholdende alfa, alfa-bipyridyl (AABP) og i 80% hesteserum/20% PBS, som beskrevet i eksempel 1. Kapper (celleveggmateriale inneholdende yttermembranproteiner) ble fremstilt fra bakteriecellen ved å resuspendere dem i destillert vann og ultralydbehandle dem i 6 x 30 sek. i en MSE sonikator. De ubrutte celler ble fjernet ved sentr i fuger ing ved 3000 g. i 20 minutter. Supernatanten ble sentrifugert ved 40.000 g i 45 minutter for å pelletere kappene, som så ble vasket to ganger i destillert vann.

For sammenligningsformål ble celler av samme P. haemolytica A2 stamme dyrket in vivo erholdt fra pleuralvæske fra spesielle patongenfrie (SPF) lam som hadde blitt eksponert til en aerosol av samme A2 stamme og hadde utviklet lungebetennelse med pleuralt ekstrudat. Pleuralvæsken ble fjernet fra den åpnede torax med en steril 25 ml pipette og mellom 100 og 1000 ml væske kunne erholdes. Væsken ble så sentrifugert ved 1000 g_ i 10 minutter for å fjerne røde blodlegemer og andre uønskede partikler i væsken. Bak-terieceller ble pelletert ved sentrifugering ved 3000 g i 20 minutter. Disse celler ble vasket 3 ganger i isotont saltvann og lagret ved -20°C.

De forskjellige preparater ble underkastet SDS-PAGE ved å bruke en 3% akrylamid konsentrerende gel og en 12 1/2% akryl-amid separerende gel. Gelen ble farget med Coomassie Blue fargestoff.

Under referanse til fig. 2 i tegningene som viser gelen, indikerer pilen den nye IRP fremstilt ifølge oppfinnelsen. Brønnene er som følger:

1. A2 cellekapper dyrket in vivo.

2. A2 cellekapper dyrket i næringsbuljong (sammenligning)

3. A2 cellekapper dyrket i 80% hesteserum.

4. A2 cellekapper dyrket i næringsbuljong + AABP (200 mikromolar). 5. A2 cellekapper dyrket i næringsbuljong + "Desferal" (2 mg/ml).

6. Molekylvektsmarkører som angitt nedenfor.

Det vil observeres at IRP opptrer i brønn 3, 4 og 5, hvor cellene ble dyrket under jernbegrensede betingelser, og at det er et svakt bånd i brønn 1. (NB: båndet ved ca. 30.000 Dalton i brønn 1 - 5 er selvfølgelg ikke det "35 kDal" IRP referert til ovenfor i eksempel 5 og 6).

For immunoblotting ble konvalesent serum erholdt fra SPF-lam som hadde blitt eksponert til to aerosoler av samme A2 stamme med 4 ukers mellomrom mellom disse tilførsler. Serumene ble tatt én uke etter andre eksponering. De ble vist å ha høye titere av antistoff mot P. haemolytica A2 i spesille enzymtilknyttede immunosorbent-assay (ELISA).

Gelbåndene som ovenfor for fig. 2, ble overført til nitrocellulosemembran ved elektroblotting. Nitrocel-lulosemembranfilteret med proteinet bundet til dette, ble skåret i strimler og tillatt å reagere med det konvalesente serum fortynnet 1 til 40 i blot-vaskebuffer (PBS/TWEEN 80/EDTA/NaCl). Antigen-antistoff-interaksjonen ble påvist ved å vaske strimlene i bufferen, bløte dem i kanin-antifår IgG merket med <125>I, vasking i vaskebuffer for blotet og autoradiografi. Nå under referanse til fig. 3, hvor brønnene tilsvarer brønnene 1 - 5 i fig. 2, vil det observeres at IRP reagerte positivt i alle de relevante brønner (1, 3, 4 og 5), men reagerte ikke i sammenligningsbrønn 2. Dette indikerer at IRP er assosiert med den høye antigenisi-tet av preparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 3

Ved å bruke fremgangsmåten fra eksempel 2, ble cellekapper fremstilt fra P. haemolytica serotyper Al, A2, A6, A7 og A9 dyrket i næringsbuljong med og uten alfa, alfa-bipyridyl (AABP). En A2 "in vivo" prøve fremstilt som i eksempel 2 ble igjen innbefattet. SDS-PAGE ble utført som i eksempel 2 for å danne gelen vist i fig. 4. Pilen viser hoved-IRP-båndet og identifiseringen av brønnene er som følger:

1. Molekylvekt- markører som i eksempel 2.

2. A2 cellekapper dyrket in vivo.

3. A9 cellekapper dyrket i næringsbuljong + AABP.

4. A9 cellekapper dyrket i næringsbuljong.

5. A7 cellekapper dyrket i næringsbuljong.

6. A7 cellekapper dyrket i næringsbuljong.

7. A6 cellekapper dyrket i næringsbuljong + AABP.

8. A6 cellekapper dyrket i næringsbuljong.

9. A2 cellekapper dyrket i næringsbuljong + AABP.

10. A2 cellekapper dyrket i næringsbuljong.

11. Al cellekapper dyrket i næringsbuljong + AABP.

12. Al cellekapper dyrket i næringsbuljong.

13. Molekylvektmarkører som i eksempel 2.

Det vil observeres at molekylvekten til IRP er omtrent den samme i alle brønnene som representerer celler dyrket under jernbegrensning (brønner 3, 5, 7, 9 og 11) og opptrer også i in vivo A2 brønn 2.

Immunoblotting ved fremgangsmåten ifølge eksempel 2, men mot konvalesent serum til kun A2 serotypen, viste at bare A2 IRP reagerte. Dette antyder at selv om hoved IRPene har omtrent samme molekylvekt, er de serotype-spesifikke.

Eksempel 4

Eksempelet viser at IRP også dannes av to P. haemol<y>tica T serotyper.

Cellekapper ble fremstilt ved fremgangsmåten til eksempel 2 fra P. haemol<y>tica T10 dyrket i 80% hesteserum/20% PBS og i GIBCO næringsbuljong nr. 2 /Nb) inneholdende 2 mg/ml. "Desferal" og P. haemol<y>tica T15 dyrket i 80% hesteserum/20% PBS og i Nb-inneholdende AABP ved 200 jjM konsentrasjon. SDS-PAGE og farging ble utført som i eksempel 2 sammen med et A2 cellekappepreparat fra eksempel 2. T type-prøvene oppviser nye eller tydelig tettere bånd i området rundt 70 kDal molekylvekt.

Eksempel 5

Pasteurella multocida type A stamme ble dyrket i 50 ml næringsbuljong, med og uten 150 jjmol AABP i 18 timer ved 37°C. Cellene ble høstet ved sentrifugering, vasket en gang 1 PBS, pH 7,4, resuspendert i destillert vann og ultralyd-behandlet. Hele celler som var tilbake etter ultralyd-behandlingen, ble pelletert ved sentrifugering ved 2.800 g og supernatanten ble sentrifugert vd 40.000 g for å pelletere cellekappene. Cellelekappene ble justert til 1 mg/ml protein og separert med SDS-PAGE i 12 1/2 % akrylamid-oppløsende geler. Etter elektroforese ble én del av gelen farget med Coomassie Blue, mens den andre delen ble Western-blottet for å overføre proteiner til nitrocellulosepapir. Det blotede materialet ble reagert med serum fra mus som hadde kapsler inneholdende levende P. multocida type A implantert i sine bukhuler for å stimulere antistoff mot in vivo dyrkede P. multocida celler.

Figur 5 viser elektroforesegelene for molekylvektsmarkører (som angitt i eksempel 2) i brønn 1, preparatet fra næringsbuljongdyrket P. multocida (dyrket uten AABP) i brønn 2 og preparatet fra P. multocida dyrket med AABP i brønn 3.

Brønn 3 viser et svakt farget bånd i 70 kDal-området tilstede i brønnen med AABP-dyrkede cellekapper, men som ikke er tilstede i samme grad i den til næringsbuljongdyrkede cellekapper. Immunoblottet av AABP-dyrkede kapper som vist i fig. 6 med brønnene tilsvarende 2 og 3 fra fig. 5, og forskjellige molekylvektsmarkører i brønn 1 , ga en sterkt immunoreagerende dublett i samme molekylvektområde omkring 70kDal som ikke var tilstede i den til næringsbuljongdyrkede kapper. Disse tilskrives IRP. Dette ligner resultatene erholdt for P. haemol<y>tica A2. Et mindre bånd ved omkring 35 kDal er også unikt for immuniblottet til AABP-dyrkede kapper, dvs. er ikke tilstede i profilen til næringsbuljongdyrkede kapper. Dette betraktes som å være den mindre IRP fremstiltt ifølge oppfinnelsen, som er beskrevet å ha en molekylvekt omkring 30 til 35 kDal.

Eksempel 6

Dette eksempel omhandler identifikasjonen, ekstraksjonen og antigenisk analyse av 35 kDal proteinet i P. haemolytica celler dyrket under jernbegrensende betingelser.

Celler av P. haemol<y>tica A2 (stamme Y510) ble dyrket i GIBCO næringsbuljong nr. 2, med og uten tilsetning av AABP (150 pmol). Cellene ble høstet ved sentrifugering og vasket i PBS (pH 7,4) før bruk i vaksinering.

Iodinering av hele celler med radioaktivt jod ble utført under betingelser som favoriserer iodinering av overflate-proteiner, dvs. lav temperatur, kort reaksjonstid og bruk av intakte celler i logaritmisk fase. Således ble en Pierce Iodobead (kloramin T immobilisert på fast fase), 1 ml P. haemolytica celler og 2 milliCurie jod-125 reagert i 5 minutter ved romtemperatur, væsken ble fjernet, 250 jjI

av 50 nanomolar 2-merkaptoetanol ble tilsatt og etter 1 minutts ventetid ble 1% w/v kaliumiodidoppløsning og PBS tilsatt. Det resulterende proteinmateriale ble vasket 3 ganger med PBS.

Helcellelysatet, adskilt på SDS PAGE og farget for totalt protein med Coomassie Blue, viste et karakteristisk komplekst fargemønster som er likt i celler dyrket under høy- og lav-jernbetingelser. Autoradiografi av iodinerte celleproteiner separert med SDS-PAGE identifiserer repro-userbart et subset av ca. 20 proteiner som muligens er assosiert med celleoverflaten.

Autioradiografimønstene av celler dyrket under betingelser med tilstrekkelig jern eller med jernmangel er klart forskjellige i sine båndmønstre. De som er dyrket under betingelser med begrenset jern viser ytterligere bånd ved ca. 35, 70 og 100 kDal.

For å rense disse proteiner for bruk i vaksinering ble helcellelysater gjort oppløselige i 6M guanidin-hydroklorid fraksjonert ved 30°C på revers fase HPLC. Kolonnen som ble brukt, var en Polypore PLRP-S-100A-5jj. Oppløsningsmidlene var 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) i vann, og 0,1% TFA i acetonitril. En oppløsningsmiddelgradient ble brukt, som startet med 99% av 0,1% TFA i vann/1% av 0,1% TFA i acetonitril i de første 5 minutter, deretter 95% av 0,1% TFA i vann/5% av 0,1% TFA i acetonitril i de neste 5 minutter og en gradvis minkende del (95 til 5%) av 0,1% TFA i vann og en økende del av 0,1% TFA i acetonitril i de gjenværende 60 minutter. Strømningshastigheten var 1 ml pr. minutt. Kromatograferingen ble fulgt spektroskopisk under referanse til UV-absorbsjonssprekteret ved 280 nm. Sammenligning med A280 elueringsprofiler viste en klar forskjell på en enkelt topp som var svært forstørret i celler dyrket under jernbegrensende betingelser. Analyse av fraksjoner som tilsvarte denne topp med SDS PAGE og med todimensjonal elektroforese, har vist at hovedkomponenten av denne topp er et 35 kDal protein med et lite antall forurensende proteiner. Signifikante mengder av dette grovt opprensede 35 kDal protein har blitt isolert. Siden de små forurensende proteiner i dette materiale er meget distinkte i forhold til hoved 35 kDal-proteinet i sine molekylvekter, kan 35 kDal-proteinet renses til hovedsakelig homogenitet ved gel-filtrering.

Western blotting ga bevis for at 35 kDal proteinet fremskaffer en immunrespons i en naturlig infeksjon hos sauer. Fig. 7 i tegningene er et fotografi av en gel (7a) og blot (7b) som er lik den til figurene 2 og 3 og erholdt på lignende måte. Helcellepreparater dyrket i jernrike og jernfattige medier ble separert med SDS-PAGE, overført til niotrocel-lulosepapir og undersøkt med serum fra SPF-lam som beskrevet i eksempel 2, bortsett fra et antistoff-antigen interaksjonen ble påvist ved pepperrot-peroksydase (HRP) konjugert esel anti-sau IgG i stedet for med <125>I-merket gris anti-sau IgG. Fig. 7a er en gel farget med Coomassie Blue for å gjøre antigenene synlige, mens fig. 7b er et Western blot av gelen fra fig. 7a med antiserum fra konvalesente lam. 35 kDal-båndet er angitt med pil i hver figur. Brønnene er: 1. Helceller av P. haemolytica A2 dyrket i næringsbuljong. 2. Helceller av P. haemolytica A2 dyrket i næringsbuljong + AABP (150 pmol).

Claims (9)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en vaksine mot Pasteurella, karakterisert ved at bakterier av slekten Pasteurella dyrkes i et næringsmedium omfattende et jern-chelaterende middel, hvor de bakterielle celler av Pasteurella gjenvinnes fra kulturen og hvor disse enten blir inaktivert for å fremstille et helcellepreparat eller hvor det fremstilles et ekstrakt fra cellene, hvilket ekstrakt omfatter et proteinholdig materiale i form av et fritt eller bundet protein som er påviselig i SDS-PAGE når Pasteurella dyrkes under jern-begrensende betingelser, men som ikke er påviselig når Pasteurella dyrkes under normale betingelser in vitro, hvilket proteinholdige materiale reagerer i et immunoblot-forsøk med serum fra et konvale-scent dyr som har vært gjenstand for en infeksjon av Pasteurella av samme serotype, og danne nevnte helcellepreparat eller ekstrakt til en vaksine, eventuelt sammen med en adjuvant.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 karakterisert ved at det jernchelate-rende middel er cx,oc-bipyridyl.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at konsentrasjonen av cx,oc-bipyridyl er fra 50 til 200 mikromolar.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det jernchelate-rende middel er dietylentriaminpentaeddiksyre, nitriltried-diksyre eller desferrioksamin.

5. Fremgangsmåte ifølge ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at det proteinholdige materiale er Pasteurella haemolytica av biotype A.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at Pasteurella haemolytica er av serotype Al eller A2.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1-4, karakterisert ved at det proteinholdige materiale er Pasteurella haemolytica av biotype T.

8. Fremgangsmåte ifølge ethver av kravene 1-4, karakterisert ved at det proteinholdige materiale er Pasteurella multicoda.

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 - 8, karakterisert ved at vaksinen blir for-mulert som et bakterin av avlivede hele celler.