DK173361B1 - Isoleret proteinholdigt materiale, dræbte hele celler af Pasteurella hæmolytica, vaccine mod Pasteurella og fremgangsmåde t - Google Patents

Description

i DK 173361 B1

Opfindelsen angår et isoleret proteinholdigt materiale som angivet i krav 1-13 og 25, dræbte hele celler af Pasteu-rella hæmolytica som angivet i krav 14-19, en vaccine mod Pasteurella som angivet i krav 20-24 og 26-27, en fremgangs-5 måde til fremstilling deraf som angivet i krav 28 samt antistoffer med det proteinholdige materiale som angivet i krav 29-31.

Bakterier af slægten Pasteurella, især Pasteurella hæmolytica, er den organisme, der er ansvarlig for pasteurel-10 lose hos får og én af de organismer, der er ansvarlig for pasteurellose hos kvæg, og Pasteurella multocida er en anden organisme, der er ansvarlig for pasteurellose hos kvæg.

Pasteurellose er en almindelig respirationssygdom hos får og kvæg, som ofte kan føre til dødsfald, især i 15 tilfælde af unge dyr, og forebyggelse af og kontrol med denne sygdom er således af stor vigtighed for landmænd, der er beskæftiget inden for opdræt af får og kvæg. Hos får optræder sygdommen enten som en_ lungebetændelse eller som en septi-kæmisk tilstand, afhængigt af det inficerede dyrs alder og 2 0 den stamme, som infektionsorganismen tilhører, mens sygdommen hos kvæg primært træffes som en lungebetændelse i regioner med tempereret klima. Der er identificeret to biotyper af P. hæmolytica, hvor A-biotypen i almindelighed er associeret med septikæmia hos unge lam og lungebetændelser hos ældre 25 får, og T-biotypen, der i almindelighed er associeret med septikæmia hos voksne får, og inden for disse to biotyper er der identificeret 15.„forskeHige serotyper (11 "A"- og 4 "T"-serotyper) . Serotype A2 er især vigtig med hensyn til får og Al med hensyn til kvæg.

30 Det har været et problem at forbedre kommercielle vacciners antigen-virkning mod pasteurellose. Vacciner til får indeholder forskellige stammer af P. hæmolytica, der repræsenterer de vigtigere biotyper og subtyper heraf. Vacciner til kvæg indeholder også P. multocida.

35 I EP-A-36.995 (Norden Labs.) beskrives en levende vaccine af Pasteurella hæmolytica og multocida, der er svæk- DK 173361 B1 2 kede for at gøre dem mindre patogene ved, at de er dyrket i et næringsmedium, der indeholder acriflavin-hydrochlorid, som er et velkendt mutagen.

I GB-A-2.023.420 (Hoechst UK) beskrives en vaccine 5 mod Pateurella hæmolytica, der indeholder antigener, der angives at være associerede med bakteriens kapsel. En ekstrakt af sådanne antigener fremstilles ved opvarmning og centrifugering af kulturen, hvorefter supernatanten opsamles. De bundfældede celler steriliseres og vaskes. Både 10 supernatanten og de vaskede celler er indeholdt i vaccinen.

FR-A-2.182.909 (Wellcome) eller det tilsvarende GB

1.441.098 beskriver en vaccinekomponent, der er fremstillet ud fra P. hæmolytica eller multocida ved ekstraktion af en hel cellestruktur, lysat, eller cellefrit kulturmedium 15 med en lavere alkanol eller lavere alkylketon eller ved "udsaltning" med et salt, såsom ammoniumsulfat, til udfældning af endotoxin. Endotoxin er en lipopolysaccharid-kom-ponent, der er til stede i organismens kapsel. Den endotoxin-frie supernatant behandles igen med opløsningsmidlet eller 20 salt (som før) ved en høj koncentration til udfældning af det antigene materiale til anvendelse som en vaccinekomponent.

Et andet forsøg på forbedring er beskrevet i US patentskrift nr. 4.346.074 eller dettes europæiske ækvivalent nr. 20.356 B (National Research Development Corporation).

25 Disse patenter angår en vaccine, der som væsentlige komponenter indeholder kapselekstrakt, især natriumsalicylateks-trakten af Al-serotypen, i kombination med varme-dræbte celler af A2-serotypen. Ved ekstraktionsprocessen centrifugeres bakteriecellerne, hvorefter de rystes i en natrium-30 salicylat-opløsning og igen centrifugeres, og supernatanten koncentreres ved dialyse.

M.J. Corbett et al., Abstract of the Annual Meeting of the American Society for Microbiology 8£, 204, Abstract K 194 (1985) og en plakat fremvist ved dette møde rapporte-35 rer, at visse nye ydre membranproteiner kan detekteres, når Pasteurella multocida dyrkes i EDTA. Når forsøgsvacciner

s I

DK 173361 B1 3 af ydre membranekstrakter af EDTA-dyrket P. multocida afprøves på mus in vitro, detekteres der ingen forbedring af immunogen virkning. Der er ikke fremført noget bevis (f.eks. immunoblotting) for, at der er nogen immunogene proteiner 5 til stede i de afprøvede ekstrakter, som synes at give anledning til stammespecifik beskyttelse. Eftersøgninger har ikke afsløret noget tilsvarende, fuldstændigt litteraturdokument .

For en nyere oversigt over vaccinering mod pasteurel-10 lose, se N. Gilmour and W. Donachie i "Science and Quality Lamb Production" (Agricultural and Food Research Council, UK, 1986), siderne 22, 23 og 28.

Yderligere kendt teknik er anført i det følgende, uden hvilken opfindelsens baggrund ikke vil fremgå klart.

15 Det har nu vist sig, at når Pasteurella-organismer dyrkes under jern-begrænsede betingelser, dvs. betingelser, hvor tilgængeligheden til jern for organismen er begrænset til mindre end der er krævet til normal vækst in vitro, giver ekstraktion af den ydre membran eller af lysat af 20 hele celler anledning til en proteinprofil, der er forskellig fra den, der opnås under normale vækstbetingelser in vitro, og man har endvidere fundet, at en sådan ekstrakt er mere immunogen end en tilsvarende ekstrakt af den ydre membran af organismen, der er dyrket under de førnævnte normale 25 vækstbetingelser, og man har fundet at denne forbedrede immunogenitet er associeret med proteinmateriale, der tilvejebringes under jern-begrænsede betingelser, men ikke under normale vækstbetingelser. Dette proteinmateriale og cellemateriale, der indeholder det, har vist sig at være værdi-30 fuldt ved vaccination af dyr mod Pasteurella, især Pasteurel-la hæmolytica, i det mindste af samme serotype. Det hidtil ukendte proteinmateriale er nyt i den forstand, at det kan påvises, når organismen dyrkes under jern-begrænsede betingelser, men ikke, når den dyrkes under normale betingelser 35 in vitro, dvs. hvor. der er tilstrækkeligt jern tilgængeligt.

Det er immunogent på den måde, at det reagerer ved en im- DK 173361 B1 4 munoblotting-analyse mod serum fra et rekonvalescent-dyr, der er kommet sig over en infektion med Pasteurella af den samme serotype.

Det hidtil ukendte proteinmateriale kan indeholde 5 ét eller flere individuelle molekyler, og det kan være et frit protein eller et bundet protein, såsom et glycoprotein, og den her anvendte betegnelse "proteinmateriale" eller "proteinholdigt materiale" skal forstås bredt som et hvilket som helst materiale, der vil give anledning til peptid-10 bånd ved gelelektroforese af det hele cellelysat eller af ekstrakten af den ydre membran, der indeholder det. Der henvises bekvemt til det hidtil ukendte proteinmateriale som det "jern-begrænsede protein" eller "IRP".

I overensstemmelse med et vigtigt aspekt af opfindel-15 sen er der derfor tilvejebragt et proteinholdigt materiale i form af et frit eller glycosyleret protein, der kan isoleres fra Pasteurella dyrket under jern-begrænsede betingelser og er synligt ved SDS-PAGE på hele cellelysater eller ydre membranekstrakter deraf, men ikke kan isoleres fra Pasteu-20 rella dyrket under normale betingelser in vitro og ikke er synligt ved SDS-PAGE på tilsvarende hele cellelysater eller ydre membranekstrakter deraf, hvilket proteinholdigt materiale reagerer ved en immunoblot-analyse mod serum fra et rekonvalescerende dyr, der er kommet sig over en infektion med 25 Pasteurella af samme serotype, til anvendelse i en vaccine mod Pasteurella. Dette proteinholdige materiale er genstand for krav 1-13 og 25.

Dræbte (inaktiverede) hele celler af Pasteurella hæmolytica eler piscicida, der er dyrket under jern-begræn-30 sede betingelser, herunder "bacterin", fortrinsvis til fremstilling af en vaccine, er omfattet af opfindelsen og er genstand for krav 14-19.

Opfindelsen angår endvidere en vaccine mod Pasteurella hæmolytica eller piscicida indeholdende dræbte hele celler 35 som ovenfor defineret og et hjælpestof, jf. krav 20-24 og 26-27.

I » DK 173361 B1 5

Opfindelsen angår også en vaccine mod Pasteurella indeholdende et proteinholdigt materiale, som ovenfor defineret sammen med et hjælpestof, jf. krav 20-24 og 26-27.

Antistoffer mod et proteinholdigt materiale som oven-5 for defineret, især monoklonale antistoffer, herunder antiidiotype antistoffer, til anvendelse ved passiv indgivelse til dyr mod Pasteurella, er også omfattet af opfindelsen, j f. krav 29-31. ™'"=a==^'

Opfindelsen angår'også en fremgangsmåde til fremstil-10 ling af en vaccine, omfattende dyrkning af celler af Pasteurella multocida under jern-begrænsede betingelser i et ikke-plasma-dyrkningsmedium, indhøstning af cellerne, dræb-ning deraf og formulering deraf med et hjælpestof, som en vaccine til anvendelse ved behandling af kvæg mod Pasteurel-15 la, jf. krav 28.

Det er kendt, at bakterien Escherichia coli sekreterer proteiner, der forekommer i en ekstrakt af den ydre membran af E.coli, der er dyrket under jern-begrænsede betingelser, men ikke under normale betingelser in vitro,

20 hvor jern er tilgængeligt i rigelig mængde. Under jern-begrænsede betingelser synes organismen at skifte til et gen (de-repress) , der normalt hæmmes, som udtrykker et protein i den ydre membran af organismen, der hjælper til ved binding af jern. Udtrykt enkelt tager bakteriecellen, når den suites 25 med hensyn til sit egentlige jernbehov, trin til at forsøge at forøge forsyningen ved at fremstille et protein, der virker som en receptor for et jern-bindemiddel (kendt som en "siderophor") , såsom enterochelin. Jern-begrænsede betingelser kan skabes kunstigt ved at tilsætte et godt jern-30 chelateringsmiddel, såsom a,α-bipyridyl (også kaldet a,a-dipyridyl), til cellens vækstmedium, hvorved cellen stimuleres til at fremstille det jern-optagende protein, jf. f.eks. E. Griffiths et al, FEMS Microbiology Letter 16, 95-99 (1983) og Infection and Immunity 47, 808-813 (1985) . I

35 indledningen i FEMS-referencen nævnes nogle andre mekanismer, der har vist sig at secernere enterochelin under jern-begræn- DK 173361 B1 6 sede betingelser, herunder en Salmonella-art, der danner nye proteiner i den ydre membran. Det overvejes i FEMS-re-ferencen, om jern-receptorproteinerne i den ydre membran kan virke som "virulensfaktorer" på den måde, at de hjælper 5 en patogen bakterie, der kræver jern, således at den vil overleve i længere tid i værten og derved forlænge infektionen. Patogen E.coli, der er isoleret fra letalt inficerede marsvin, har vist sig at indeholde to jern-begrænsede proteiner som hovedkomponenter i ekstrakten af den ydre 10 membran. Det antydes imidlertid ikke, at andre bakterier danner nye ydre membranproteiner (YMP'er) som reaktion på jern-begrænsning, eller at sådanne proteiner ville have nogen værdi som vaccinekomponenter.

Ifølge C.A. Bolin et al., Infection and Immunity 55, 15 (nr. 5), 1239-1242 (maj 1987), er rollen af jern-regulerede YMP'er fra E.coli som beskyttende antigener hidtil ikke bestemt. Disse forfattere rapporterer, at passiv immunisering med antistoffer mod jern-regulerede YMP'er beskytter kalkuner mod E.coli-septikæmia.

20 En oversigt over fremgangsmåder til fremstilling af jern-begrænsede bakterier er givet af P. Stevenson og E. Griffiths i metodologiafsnittet i "The virulence of Escherichia coli", Ed. M. Sussman, Society for General Microbiology Special Publication No. 13, Academic Press (1985), siderne 25 413-417.

A. Norqvist et al., FEMS Microbiol. Letters 4, 71-75 (1978) har beskrevet, at udsultning med hensyn til jern af Neisseria gonorrhoeae tilvejebringer nye proteinbånd ved gelelektroforese af en ekstrakt af den ydre membran.

30 I US patentskrift nr. 4.681.761 (Mietzner et al.) beskrives et hoved-jernreguleret protein fra N. gonorrhoeae og anvendelsen heraf som en vaccinekomponent. Molvægten heraf er ca. 37 kDal., og det tilvejebringes ved virkningen af den kationiske detergent cetyltrimethylammoniumbromid til 35 selektivt at opløseliggøre IRP fra gonococ-membranerne.

I en artikel i Zentralblatt Bakt. Hyg. A 258, 80-83 i I - DK 173361 B1 7 (1984) har K.-D. Flossmann et al. eksperimenteret ved injek- 1 tion af mus med ΊΓΓΊνΠ tocida, med og uden forudgående injek tion af jernforbindelser, og det hævdes, at indgivelsen af visse jernforbindelser forøger virulenser af P. multocida- 5 infektionen.

Når Pasteurella multocida anvendes mange gange i passage (op til 200 gange) i et medium med mangelfuldt jernindhold, beskrives bakterien at have formindsket virulens (sic) som målt ved LD50-værdien i mus, og i ét tilfælde også 10 en formindsket immunogenitet, jf. K.-D. Flossmann et al., Zeitschrift ftir Allgemeine Mikrobiologie 24, 231-237 (1984) .

Denne reference synes derfor at tilvejebringe en viden, der står i modsætning til opfindelsen. Under alle omstændigheder angår opfindelsen ikke svækkelse ved gentagen passage.

15 M. J. Gentry et al., Amer. J. Vet. Res. 47, 1919- 1923 (1986) har undersøgt P. hæmolytica Al's dannelse af cytotoxin i forskellige medier, der indeholder forbindelser, der indeholder jern, og forbindelser, der binder jern, og det blev konkluderet, at en vis minimumkoncentration af 2 0 jern samt tilstedeværelsen af et egnet bærermolekyle (siderophor) kan være kritisk for en effektiv produktion af cytotoxin fra P. hæmolytica.

G. H. Shand et al., Infection and Immunity 48., 35-39 (1985) har dyrket nogle gram-negative bakterier, der er 25 isoleret fra human urin, under betingelser med tilstrækkeligt jernindhold og med begrænset jernindhold, hvorefter proteinerne i den ydre membran (YMP'er) ekstraheres, og deres profiler sammenlignes ved hjælp af gelelektroforese. Nogle YMP'er med høj molvægt var kun til stede, når der var anvendt 30 jern-begrænsede betingelser. De er svagt immunogene, når de immunoblottes mod serum fra patienterne. For to af disse organismer, Klebsiella pneumoniae og Proteus mirabilis, fandt man også disse YMP'er, der er unikke for jern-begrænsede betingelser, i den samme bakterie, som fik lov at vokse i 35 urin fra patienter, der lider af infektioner i urinvejen.

H. Anwar et al., FEMS Microbiology Letters 2£, 225- DK 173361 B1 8 230 (1985) har vist, at når Pseudomonas aeruginosa dyrkes under betingelser, hvor jern er opbrugt, findes der mindst seks proteiner med høj mol vægt i YMP-profilen, som i almindelighed ikke er til stede. En patient, der lider af brandsår 5 og deraf følgende akut infektion med P. aeruginosa, danner antistoffer mod YMP'er, herunder et af disse jern-begrænsede membranproteiner. Det fremgår af denne publikation, at hvis disse resultater bekræftes ved yderligere undersøgelser, kan de have betydning ved udformningen af beskyttende proteinvac-10 ciner og immunterapi af brandsårspatienter, der er inficeret med P. aeruginosa.

Kort beskrivelse af tegningerne: fig. 1 er et snit gennem P. hæmolytica's cellevægsstruktur, der viser den ydre membran; 15 fig. 2 viser farvede gelelektroforeseprofiler for pro teiner, der er opnået fra ekstrakter af den ydre membran fra P. hæmolytica serotype A2, der er dyrket under normale og jern-begrænsede betingelser; fig. 3 viser et immunoblot af P. hæmolytica A2-pro-20 teiner fra en gel som i fig. 2 mod serum fra rekonvalescerende lam, der er inficeret med P. hæmolytica A2; fig. 4 viser farvede gelelektroforeseprofiler for proteiner, der er opnået fra ekstrakter af den ydre membran fra fem forskellige serotyper af P. hæmolytica; 2 5 figurerne 5 og 6 er analoge med figurerne hhv. 2 og 3, men vedrører P. multocida; og fig. 7 er et immunoblot af et IRP ifølge opfindelsen mod sera fra rekonvalescerende, ikke inficerede og vaccinerede lam.

30 Opfindelsen kan anvendes i forbindelse med P. hæmoly- tica-organismer af biotype A eller T, men biotype A er mere epidemiologisk vigtig. Inden for biotype A er serotype A2 vigtigst ved vaccination af får og Al ved vaccination af kvæg. For nærværende foreslås det at formulere vaccinen til 35 homolog serotypeanvendelse, dvs. et IRP, der er opnået fra serotype A2, anvendes til at beskytte mod infektion med A2.

DK 173361 B1 9

Det menes med sikkerhed, at inden for en vis serotype vil et IRP, der er opnået ud fra én stamme, beskytte mod infektion af en anden stamme. Opfindelsen omfatter således en polyvalent vaccine, der indeholder IRP'er fra alle de pato-5 logisk vigtige Pasteurella-serotyper. Til får indeholder den mindst serotype A2 og fortrinsvis også mindst Al, A6, A7 og A9. Til kvæg indeholder den mindst serotype Al og fortrinsvis også mindst A2 og P. multocida.

Hoved-IRP'et for P. hæmolytica af serotype A2 har en 10 molvægt på ca. 70.000 Dalton, bestemt ved gelelektroforese.

Mol vægten af hoved IRP1 et for andre A-serotyper af P. hæmolytica og P. multocida synes at være af samme størrelsesorden .

Et andet IRP har en molvægt på ca. 30 til 35 kg kilo-15 Dalton og der henføres hertil for kortheds skyld som "35 kDal-proteinet".

IRP'et kan tilvejebringes i mange forskellige formuleringer som angivet ovenfor. F.eks. kan der formuleres en vaccine med hele celler, i hvilken cellerne af P. hæmolytica 20 eller P. piscicida, der er dyrket under jern-begrænsede betingelser, er dræbt ved behandling med formalin (vandigt formaldehyd) eller varme, f.eks. ved 60eC i 20 minutter, eller (af forsigtighedshensyn) ved begge metoder. Især foretrækkes et bacterin-præpart. (Bacteriner er formalin-dræbte 25 hele celler sammen med tilknyttede toxoider).

For at forklare den terminologi, der anvendes ved beskrivelsen af Pasteurella-organismen, henvises der til fig. 1 på tegningerne, der viser et skematisk tværsnit gennem organismens cellevæg. Med hensyn til tegningen betyder 30 "1" polysaccharidkapslen, "2" den ydre membran indeholdende lipopolysaccharid ("LPS") "3" laget af stive peptidoglycaner, der er forbundet med den ydre membran ved hjælp af lipoprotein ("LP") og protein ("P"); 35 "4" den indre membran indeholdende phospholipid ("PL"); "5" indhylningen; DK 173361 B1 10 " 6" cytoplasma.

Et "kapselekstrakt" vil i praksis indeholde mere end kapslen 1. Således ekstraherer f.eks. en natriumsalicylateks-trakt (NSE) kapslen 1, den ydre membran 2 og peptidoglycan-5 laget 3.

Det er naturligvis muligt at isolere IRP'et og anvende det som sådant, f.eks. ved fremstilling af et monoklonalt antistof (MCA) mod det, ved hjælp af gængs hybridomateknologi, f.eks. under anvendelse af musemilt-musemyeloma-cel-10 lefusion, og derefter anvende MCA (immobiliseret på en søjle) til isolering af IRP'et fra celleekstrakter, hvorefter IRP'et genvindes fra søjlen.

En enkel fremgangsmåde er at ekstrahere celleindhyl-ningerne, som indeholder den ydre membran. Disse indhylnin-15 ger kan fås ved lydbølgebehandling af cellerne. En anvendelig fremgangsmåde til ekstraktion er kapselekstraktion, hvor organismens kapsel, der indeholder den ydre membran, ekstra-heres. En anvendelig metode til ekstraktion af kapslen er den, hvor natriumsalicylat anvendes, jf. US patentskrift 20 nr. 4.346.074 eller europæisk patentskrift nr. 20.356 B som ovenfor nævnt.

Der kan også frembringes antistoffer mod de mono-klonale eller polyklonale antistoffer mod IRP'et, og sådanne frembragte antistoffer kendes som anti-idiotypen af antistof-2 5 fer, og de kan i sig selv være monoklonale eller polyklonale. Anti-idiotypen af antistoffer vælges at have immunogene egenskaber, der ligner egenskaberne for ét eller flere af de or-ginale IRP'er.

Ved formuleringen af vaccinen kan proteinmaterialet 30 kombineres med et hvilket som helst af de gængse hjælpestoffer inden for veterinære vacciner, typisk de, der er baseret på aluminiumforbindelser. Aluminiumhydroxidgelhjælpestoffet "AlhydrogelA" er især egnet. Foretrukne antigene materialer absorberes på "AlhydrogelA", og den fremkomne suspension 35 emulgeres eventuelt med en egnet olie, såsom "BayolA F", der fortrinsvis indeholder 10% "ArlacelA A". Vaccinen kan også

I I

DK 173361 B1 11 omfatte andre komponenter, f.eks. et konserveringsstof.

Koncentrationen af antigent materiale i vaccinen kan varieres som ønsket, f.eks. i overensstemmelse med vaccinens dosisrate, og i dette tilfælde er den normalt anvendte dosis 5 i almindelighed ca. 1-2 ml. I almindelighed omfatter hver dosis vaccine 0,1 til 20 mg antigent materiale, især fra 0,5 mg op til 10 mg, f.eks. ca. 5 mg, antigent materiale af hver serotype, der er indeholdt i vaccinen.

Til forebyggelse af og kontrol med pasteurellose, 10 f.eks. til anvendelse inden for landbrugets husdyrhold, indgives vaccinerne ifølge opfindelsen til voksne eller unge dyr, f.eks. får eller kvæg, sædvanligvis i form af en subcutan injektion. Dyrene kan vaccineres straks efter fødslen til tilvejebringelse af dyr med beskyttelse mod pasteu-15 rellose på et tidligt tidspunkt i deres liv. Vaccination kan også udføres på særlige tidspunkter af året til tilvejebringelse af beskyttelse mod almindelige sæson-udbrud af pasteurellose, F.eks. kan fåreflokke vaccineres i det sene forår eller deromkring med vacciner ifølge opfindelsen, 20 der indeholder P. hæmolytica, A-serotype-antigent materiale til tilvejebringelse af beskyttelse mod udbrud af pasteurellose - lungebetændéTse^der'"i almindelighed forekommer i fåreflokke i løbet af sommeren. Gravide hundyr kan også vaccineres .

25 Passiv immunisering med antistoffer mod IRP'er er også mulig, specielt når et udbrud af sygdommen forekommer eller er forventet.

En fremgangsmåde til fremstilling af en vaccinekomponent, der består af eller omfatter et IRP, omfatter dyrkning 30 af Pasteurella i et næringsmedium, der er mangelfuldt med hensyn til tilgængeligt jern, hvorved bakterien har en væksthastighed, der er langsommere end normalt, og eventuelt inaktiveres bakterien, eller der ekstraheres fra det cellemateriale, der omfatter proteiner fra den ydre membran.

35 7 0 KDal proteinet kan også isoleres fra lysater af hele celler eller fra ekstrakter af den ydre membran. 35 DK 173361 B1 12 KDal-proteinet er hidtil kun isoleret fra hele celler, men det vil være muligt at isolere det fra en egnet ekstrakt.

Det vil også være muligt at fremstille disse proteiner ved hjælp af en rekombinant DNA-fremgangsmåde under anvendelse 5 af monoklonale antistoffer til påvisning af deres translation fra mRNA og derved at identificere cDNA-kloner. Opfindelsen omfatter disse proteiner som sådanne, uanset hvordan de er fremstillet eller syntetiseret, kemisk eller bioteknologisk, alene eller fusioneret med, konjugeret til eller i kompleks 10 med andre forenelige proteiner, og hvordan de end er isoleret, men fortrinsvis således, at de er fri for tilknytning til levende cellemateriale.

Cellerne kan dyrkes i et hvilket som helst medium, der er egnet til normal vækst af Pasteurella, men som er 15 gjort mangelfuldt med hensyn til jern. Eksempler på sådanne normale vækstmedier er næringsmedier baseret på fordøjelse af kød, såsom GIBC0 nr. 2 OXOID, Brain Heart Infusion- eller trypticase-sojanæringsmediet. For at gøre medierne mangelfulde med hensyn til jern kan der anvendes et hvilket som 20 helst jern-chelateringsmiddel eller -bindemiddel, så længe det er foreneligt med vækst af Pasteurellabakterien ved dyrkning. Eksempler på egnede jern-celateringsmidler er a,a-bipyridyl med formlen “ CK3 nitrilotrieddikesyre med formlen 30 HOOC-CH2-N-CH2-COOH CH2-COOH 1

I I

visse ethylendiamin-eddikesyreforbindelser, såsom diethylen-triaminpentaeddikesyre (DETPA) med formlen DK 173361 B1 13 hoocch2 ch2cooh n-ch2ch2-n-ch2ch2 -n 5 hoocch2 ch2cooh ch2cooh og desferrioxamin med formlen: NH2 (CH2) 5N - C (CH2) 2 CNH (CH2) cN-C (CH2) 2 CNH (CH2) =N - CCH3

10 III III II

HO O O HO O O HO O

{og salte eller derivater af en hvilken som helst af disse forbindelser, der ikke interfererer med deres chelaterende virkning), Desferrioxamin-methansulfonat er kommercielt til-15 gængeligt som "DesferalA" fra Ciba-Geigy AG, som en modgift mod jernforgiftning.

Der skal imidlertid udvises forsigtighed med ikke at anvende et chelateringsmiddel, der binder andre elementer, der er essentielle for bakteriens overlevelse, frem for jern.

20 EDTA er f.eks. uegnet ud fra dette synspunkt. Det for tiden foretrukne chelateringsmiddel er a,a-bipyridyl.

Mængden af chelateringsmiddel, der skal anvendes, skal styres omhyggeligt. For stor en koncentration efterlader bakterierne med så lidt tilgængeligt jern, at de ikke har 25 vækst overhovedet. En utilstrækkelig mængde vil blot tillade normal vækst. I almindelighed er den optimale væksthastighed, mod hvilken der sigtes, en sådan, ved hvilken der er en opformering af bakteriekulturen på mindst 100 gange den oprindelige koncentration inden for 6 timer, når kulturen 30 inkuberes ved 37°C på et rysteapparat. I fraværelse af det jern-begrænsede middel er en typisk opformering under disse betingelser ca. 1000 gange. Den optimale koncentration af chelateringsmiddel kan let findes ved simple forsøg, der er baseret på disse kriterier. For a,α-bipyridyl er koncentra-35 tionen mellem 80_og 200, fortrinsvis mellem 100 og 200 mikro-molær. For DEPTA er den mellem ca. 25 og 500, fortrinsvis 50 til 200 μπιοΐ3ΒΓ.

Der kan naturligvis anvendes et hvilket som helst DK 173361 B1 14 andet middel, der giver mangel på jern, idet det ikke er nødvendigt at anvende et chelateringsmiddel i mediet, i hvilket bakterierne dyrkes. F.eks. kan mediet være forbehandlet til fjernelse af jern ved hjælp af en ionbytter, f.eks.

5 "ChelexA 100" fra Biorad, og en defineret lille koncentration af jern sættes til mediet.

En anden mulighed er at anvende et naturligt bakterievækstmedium, der allerede indeholder jern-bindende proteiner. Således kan serum fra pattedyr anvendes, såsom heste-10 serum, om nødvendigt i passende fortynding.

Cellerne kan dyrkes på anden måde under de normale betingelser, der kan anvendes til Pasteurella, f.eks. i luft, uden omrystning, ved en temperatur på fra 25 til 41°C, fortrinsvis ca. 37°C.

15 Opfindelsen kan anvendes i forbindelse med mange for skellige arter af Pasteurella, herunder P. hæmolytica, P. multicida, P. piscicida og P. anatipestifer. Vaccinen kan anvendes til forebyggelse af en hvilken som helst af de sygdomme, der er associeret med Pasteurella, f.eks. en hvil-20 ken som helst af de følgende sygdomme, der er forårsaget af P. hæmolytica: lungebetændelse hos får, kvæg, hjorte eller geder, septikæmier hos mange dyrearter; en hvilken som helst af de følgende sygdomme, der forårsages af P. multicida: lungebetændelse hos svin og kvæg; atrophisk rhinitis hos 25 svin, hønsekolera hos kyllinger, kalkuner og ænder, encephalomyelitis hos bøfler, og snøften og lungebetændelser hos små pattedyr, såsom hamstere, kaniner og mink; samt sygdomme hos ænder forårsaget af P. anatipestifer, og hos fisk, der er forårsaget af P. piscicida. I hvert tilfælde vil der nor-30 malt anvendes et IRP af den homologe dyreart og type.

De følgende eksempler illustrerer opfindelsen.

Eksempel 1

Fremstilling af natriumsalicvlatekstrakter.

35 P. hæmolytica A2 dyrkes i stationær kultur i 6 timer ved 37°C i GIBCO-næringsmedium nr. 2 (en trypsinfordøjelse

? I

DK 173361 B1 15

af oksehjerte) med og uden tilsætning af a,α-bipyridyl til en koncentration på 150 //molær. Den endelige koncentration af cellerne er ca. 109 celler pr. ml i tilfældet med normal vækst og 107 celler pr. ml i tilfældet med vækst ved begræn-5 set jernindhold i det medium, der indeholder a,α-bipyridyl. Cellerne hostes ved centrifugering, og supernatant-væsken bortskaffes. Cellerne vaskes i phosphat-pufret saltvand, pH

7,4 ("PBS"), hvorefter der igen suspenderes i 1/10 af rum fanget af 1M vandigt natriumsalicylat, og der omrystes kraf-10 tigt i 3 timer ved 37°C, hvorefter der centrifugeres, og cellematerialet fjernes. Den resulterende natriumsalicylat-ekstrakt ("SSE") koncentreres ved ultrafiltrering gennem en udelukkelsesmembran, der tillader materiale med lav molvægt at passere igennem (molvægte på 100.000 Dalton eller min-15 dre) . På dette trin er IRP'et i form af aggregater, der tilbageholdes af membranen. Det tilbageholdte materiale koncentreres 10 gange, f.eks. fra 300 ml til 30 ml. Det dialyseres herefter mod PBS og derefter mod destilleret vand ved 4 °C. Produktet frysetørres til dannelse af et hvidt 20 fnugget fast stof.

Fremstilling af vaccine og afprøvning heraf.

Vacciner fremstilles som følger. Det frysetørrede SSE fra P. hæmolytica, der er dyrket med eller uden jern-25 -begrænsning og fremstillet som ovenfor, homogeniseres med en lige så stor vægtdel "AlhydrogelA”-hjælpemiddel og med destilleret vand til en koncentration på 2,5 mg SSE/ml vaccine. 3 uger gamle specifikt patogenfrie (SPF) lam vaccineres på dag 0 og igen på dag 28, hver gang med en vaccinedosis på 30 1 ml, hvorefter de inficeres intratrachealt og intranasalt med parainfluenza virustype 3 (PI3) (106 TCIDso/ml) på dag 35 og en aerosol af P. hæmolytica A2-stamme x 205A (ca. 4 x 107 cfu/liter) på dag 42. Andre 3 uger gamle SPF-lam anvendes som uvaccinerede kontroller. (PI3 er en velkendt eksperimen-35 tel fremkalder af P. hæmolytica).

Lammene iagttages i 6 dage (dagene 43-48) efter at I -«Kgs S f DK 173361 B1 16 dyrene er udsat for P. hæmolytica-aerosol, og det kliniekse antal af graden af sygdoms lidel se optegnes. 13 ud af 28 lam, heraf 6 i gruppen med SSE uden jern-begrænsning og 7 uvac-cinerede døde eller blev dræbt på grund af kraftig sygdom 5 inden for 6 dage efter behandlingen med sygdomsfremkaldende middel. De tilbageværende lam blev dræbt i vilkårlig rækkefølge på dag 49, og alle lammenes lunger blev undersøgt.

De opnåede resultater er anført nedenfor i tabel I.

Som det kan ses, var resultaterne fremragende, idet vaccinen 10 ifølge opfindelsen giver lammene en bemærkelsesværdig grad af beskyttelse.

Tabel I

15 Antal lam Antal lam

Antal Antal dø- med lunge- med infice-Gruppe lam de lam læsioner rede lunger 20 SSE IRP 800 0 (ifølge opfindelsen) SSE 13 6 9 8 25 (sammenligning)

Ikke-vacci- 7 7 7 7 nerede kon-30 troldyr.

Eksempel 2

Virkningen af jern-begrænsning på P. hæmolytica A2's antigenicitet undersøges ved hjælp af SDS-PAGE og inmunoblot-35 ting. P. hæmolytica (stamme x 205)-celler dyrkes i GIBCO-næringsmedium nr. 2 (Nb), der indehodler "DesferalA", i Nb, der indeholder α,α-bipyridyl (AABP) og i 80% hesteserum/20% PBS som beskrevet i eksempel 1. Indhylninger (cellevægsmateriale, der indeholder proteiner fra den ydre membran) 40 fremstilles fra bakteriecellerne ved igen at suspendere dem i destilleret vand hvorefter de lydbølgebehandles i 6 x 30 sekunder i et MSE-lydbølgebehandlingsapparat. De ubrudte celler fjernes ved centrifugering ved 3000 g i 20 minutter.

DK 173361 B1 17

Supernatanten centrifugeres ved 40.000 g i 45 minutter til sammenpresning af indhylningen til små kugler, som herefter vaskes to gange i destilleret vand.

Til sammenligning fås celler af den samme P. hæmo-5 lytica A2-stamme, der er dyrket "in vivo", fra lungehinde-væsken fra specifikt patogenfrie (SPF) -lam, som har været udsat for en aerosol af den samme A2-stamme, og som har udviklet lungebetændelse med lungehindeexudat. Lungehindevæ-sken fjernes fra den åbnede thorax med en steril 25 ml' s 10 pipette, og der kan opnås mellem 100 og 1000 ml væske. Denne væske centrifugeres herefter ved 1000 g i 10 minutter til fjernelse af røde blodlegemer og andre uønskede partikler i væsken. Bakterieceller sammenpresses til små kugler ved centrifugering ved 3000 g i 20 minutter. Disse celler vaskes 15 3 gange i isotonisk saltvand, hvorefter de opbevares ved- 20°C.

De forskellige præparater underkastes SDS-PAGE under anvendelse af en 3%'s acrylamidsorteringsgel "stackinggel" og en 12¾%1s acrylamidadskillelsesgel. Gelen farves med 20 Coomassie Blue-farvestof.

Idet der nu henvises til tegningernes fig. 2, der visér gelen, indikerer pilen det hidtil ukendte IRP ifølge opfindelsen. Banerne er som følger: 1. A2-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket in 25 vivo.

2. A2-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næringsmedium (sammenlignende).

3. A2-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i 80% hesteserum.

30 4. A2-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næringsmedium + AABP (200 μτηοίχτ) .

5. A2-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næringsmedium + "DesferalA" (2 mg pr. ml).

6. Molvægtsmærker er anført nedenfor.

35 Molvægtsmarkører er som følger: DK 173361 B1 18

Nummer Komponent Molvægt 1 Beta-galactosidase 116.000 2 Phosphorylase b 97.000 3 Ovotransferrin 76-80.000 (bredt bånd) 5 4 Albumin 66.250 5 Ovalbumin 45.000 6 Chymotrypsinogen A 25.700 7 Myoglobin 17.200 8 Cytochrom C 12.300 10 Det ses, at IRP forekommer i banerne 3, 4 og 5, hvor cellerne er dyrket under jern-begrænsede betingelser, og at der er et svagt bånd i bane 1. (bemærk: båndet ved ca. 30.000 Dalton i banerne 1-5 er naturligvis ikke 35 kDal-IRP, som er omtalt ovenfor og i eksemplerne 5 og 6).

15 Til immunoblotting fås sera fra rekonvalescerende SPF-lam, som har været udsat for 2 aerosolbehandlinger af den samme A2-stamme med et mellemrum på 4 uger mellem disse behandlinger. Sera tages én uge efter den anden behandling.

De viste sig at have høje titerværdier for antistof mod P.

20 hæmolytica A2 ved en ELISA.

Gelbåndene som ovenfor for fig. 2 overføres til en nitrocellulosemembran ved elektro-blotting. Nitrocellulose-membranfilteret, hvortil proteinerne er bundne, skæres i strimler og får lov at reagere med serum fra rekonvalesce-25 rende dyr, hvilket serum er fortyndet 1 til 40 i blot-va-skepuffer (PBS/TWEENA 80/EDTA/NaCl) . Antigen-antistof interak-tionen påvises ved at vaske strimlerne i pufferen, hvorefter de gennemblødes i kanin-anti-fåre-IgG mærket med 125I, hvorefter der vaskes i blot-vaskepuffer, hvorefter der udføres 30 autoradiografi. Idet der nu henvises til fig. 3, i hvilken banerne svarer til banerne 1-5 i fig. 2, ses det, at IRP reagerer positivt i alle de relevante baner (1, 3, 4 og 5), men de reagerer ikke i den sammenlignende bane 2. Dette antyder, at IRP er associeret med høj antigenicitet for 35 præparaterne ifølge opfindelsen.

I I

DK 173361 B1 19

Eksempel 3.

Under anvendelse af fremgangsmåden i eksempel 2 tilvejebringes celleindhylninger fra P. hæmolytica af seroty-perne Al, A2, A6, A7 og A9, der er dyrket i næringsmedium, 5 med eller uden a,a-bipyridyl (AABP). En A2 "in vivo"-prøve, der er fremstillet som i eksempel 2 medtages igen. SDS-PAGE udføres som i eksempel 2 til fremstilling af de i fig. 4 viste geler. Pilen antyder hoved-IRP-båndet, og identifika-s tionen af banerne 'er som følger: 10 1. Molvægtmarkører som i eksempel 2.

2. A2-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket in vivo.

3. A9-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næringsmedium + AABP.

4. A9-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næ- 15 ringsmedium.

5. A7-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næringsmedium + AABP.

6. A7-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næringsmedium.

20 7. A6-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næ ringsmedium + AABP.

8. A6-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næringsmedium.

9. A2-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næ- 25 ringsmedium + AABP.

10. A2-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næringsmedium.

11. Al-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næringsmedium + AABP.

30 12. Al-celleindhylninger, hvor organismen er dyrket i næ ringsmedium.

13. Molvægtmarkører som i eksempel 2.

Det ses, at molvægten af IRP er ca. den samme i alle 35 de baner, der repræsenterer celler, der er dyrket under jem--begrænsning (banerne 3, 5, 7, 9 og 11) , og som også forekom- DK 173361 B1 20 mer i "in vivo"-A2 baner 2.

Immunoblotting ved hjælp af fremgangsmåden i eksempel 2, men mod serum fra rekonvalescerende dyr, hvor serum kun er af A2-serotypen, viser, at kun A2-IRP reagerer. Dette 5 antyder, at om end hoved-IRP'er har ca. samme molvægt, er de serotype-specifikke.

Eksempel 4.

Eksemplet viser at IRP'er også tilvejebringes af to 10 P. hæmolytica T-serotyper.

Celleindhylninger tilvejebringes ved hjælp af fremgangsmåden ifølge eksempel 2 fra P. hæmolytica T10, der er dyrket i 80% hesteserum/20% PBS og i GIBCO-næringsmedium nr.

2 (Nb), der indeholder 2 mg "DesferalA" pr. ml, og ud fra P.

15 hæmolytica T15, der er dyrket i 80% hesteserum/20% PBS og i Nb, der indeholder AABP i en koncentration på 200 μιπ. SDS-PAGE og farvning udføres som i eksempel 2 sammen med et A2-celleindhylningspræparat fra eksempel 2. T-typeprøverne udviste nye eller signifikant tættere bånd i 70 kDAl-mol-20 vægtregionen.

Eksempel 5.

Pasteurella multocida, type A-stamme dyrkes i 50 ml næringsmedium med og uden 150 μιηοΐ36Γ AABP i 18 timer ved 25 37°C. Cellerne høstes ved centrifugering, hvorefter de vaskes én gang i PBS, pH 7,4, hvorefter de igen suspenderes i destilleret vand og lydbehandles. De hele celler, der er tilbage efter lydbehandlingen, sammenpresses til små kugler ved centrifugering ved 2800 g, og supernatanten centrifugeres 30 ved 40.000 g til sammenpressede små kugler af celleindhylninger. Cplleindhylningerne reguleres til 1 mg protein pr. ml, og de adskilles ved hjælp af SDS-PAGE i 12,5% acryl-amid-fordelingsgeler. Efter elektroforese farves en portion af gelen med Coomassie Blue, mens den anden portion underkas-35 tes Western-blotting til overførsel af proteinerne til nitrocellulosepapir. Det blottede materiale omsættes med sera

! I

DK 173361 B1 21 fra mus, der har kapsler, der indeholder levende P. multo-cida type A, implanteret i deres peritoneal-huler for at stimulere antistoffer mod P. multocida-celler, der er dyrket in vivo.

5 Fig. 5 viser elektroforesegelerne for molvægtmarkører {som anført i eksempel 2) i bane 1, præparatet af P. multi-cida, der er dyrket i næringsmedium (dyrket uden AABP) i bane 2 og præparatet af P. multicida, der er dyrket med AABP, i bane 3. Bane 3 viser et svagt farvet bånd i området 10 for 70 KDal i banen for celleindhylninger, hvor der er dyrket med AABP, men det er ikke til stede i samme grad i banen for celleindhylninger, der er dyrket i næringsmedium. Imnunoblot-tet af AABP-dyrkede indhylninger som vist i fig. 6, hvor banerne 2 og 3 svarer til 2 og 3 i fig. 5 og forskellige mol-15 vægtmarkører i bane__l, giver en stærk immuno-reagerende doublet inden for den samme molvægtregion, ca. 70 kDal, der ikke forekommer i banen for indhylninger, der er dyrket i næringsmediet. Disse tilskrives IRP'er. Dette ligner de resultater, der er opnået for P. hæmolytica A2.

2 0

Eksempel 6.

Dette eksempel angår identifikationen, ekstraktionen og den antigene analyse af 35 kDal-proteinet i P. hæmolytica-celler, der er dyrket under jern-begrænsede betingelser.

25 Celler af P. hæmolytica A2 {stamme Y510) dyrkes i

GIBCO næringsmediuTTL nr.___2 med og uden tilsætning af AABP

(150 //molær) . Disse celler høstes ved centrifugering, hvorefter de vaskes i PBS_(pH 7,4) før de anvendes til vaccination.

30 lodering af hele celler med radioaktivt iod udføres under betingelser, der favoriserer iodering af overfladeproteiner, dvs. lav temperatur, kort reaktionstid og anvendelse af intakte celler, der er i den logaritmiske vækstfase. Således omsættes en JPierce Iodobead" (chloramin T, der er 35 immobiliseret på en fast fase), 1 ml P. hæmolytica-celler , og 2 milliCurie I125 i 5 minutter ved stuetemperatur, hvor- DK 173361 B1 22 efter væsken fjernes, og der tilsættes 250 μΙ^βΓ 50 nano-raolær 2-mercaptomethanol, og efter 1 minuts ventetid tilsættes en 1%'s w/v kaliumiodid-opløsning og PBS. Det fremkomne proteinmateriale vaskes tre gange med PBS.

5 Lysater af hele celler, der er adskilte ved SDS-PAGE

og farvede for samlet proteinindhold med Coomassie Blue, viser et karakteristisk komplekst farvemønster, der er ens i celler, der er dyrket ved betingelser med højt eller lavt jernindhold. Autoradiografi af ioderede celleproteiner, der 10 er adskilt ved hjælp af SDS-PAGE, identificerer reproducerbart en delmængde af ca. 20 proteiner, der muligvis er associerede med celleoverfladen.

Autoradiografiske mønstre af celler, der er dyrket under betingelser med tilstrækkeligt jern eller med begræns-15 ning af tilgangen til jern adskiller sig klart ved deres bånd-mønstre. De celler, der er dyrket med begrænset adgang til jern, har yderligere bånd ved ca. 35, 70 og 100 kDal.

Til oprensning af disse proteiner til anvendelse ved vaccination fraktioneres lysater af hele celler, der er 20 opløseliggjort i 6 M guanidin-hydrochlorid, ved 30ec ved omvendt fase-HPLC. Den anvendte kolonne er en Polypore PLRP-ε-100-5μ. Opløsningsmidlerne er 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) i vand og 0,1% TFA i acetonitril. Der anvendes en opløsningsmiddelgradient, der starter med 99% 0,1% TFA i 25 vand/l% 0,1%'s TFA i acetonitril i de første 5 minutter, derefter 95% 0,1%'s TFA i vand/5% 0,1%'s TFA i acetonitril i de næste 5 minutter og gradvist formindskede andele (95-5%) af 0,1% TFA i vand og øgede andele af 0,1% TFA i acetonitril i de resterende 160 minutter. Strømhastigheden er 1 30 ml pr. minut. Chromatografien følges spektroskopisk med reference til UV-absorptionsspektret ved 280 nm. Sammenligning mellem A280-elutionsprofilerne viser en klar forskel i en enkelt spids, der forøges kraftigt i celler, der er dyrket under jern-begrænsede betingelser. Analyse af frak-35 tioner, der svarer til denne spids, ved hjælp af SDS-PAGE og ved hjælp af todimensional elektroforese viser, at hoved- ! 1 DK 173361 B1 23 komponenten i denne spids er et 34 kDal-protein med et lille antal forurenende proteiner. Signifikante mængder af dette rå oprensede 35 kDal-protein er isoleret. Da de mindre væsentlige forurenende proteiner i dette materiale er let 5 skelnelige fra hoved-35 kDal-proteinet med hensyn til mol-vægt, kan 35 kDal-proteinet oprenses til i det væsentlige homogenitet ved hjælp af gelfiltrering.

Western-blotting tilvejebringer bevis for, at 35 kDal-proteinet fremkalder en immunreaktion ved en naturlig 10 infektion af får. Fig. 7 på tegningerne er et fotografi af en gel (7a) og et blot (7b) som det fra figurerne 2 og 3, og som er opnået på samme måde. Præparater med hele celler, der er dyrket i et medium med overskud eller stærkt underskud af jern adskilles ved hjælp af SDS-PAGE, hvorefter der over-15 føres til nitrocellulosepapir, og der foretages en undersøgelse med serum fra SPF-lam som beskrevet i eksempel 2, bortset fra, at antistof-antigen-interaktionen påvises med peberrodsperoxidase (PRP), der er konjugeret med æsel-anti-fåre-IgG i stedet for ved hjælp af 125I-mærket svine-anti-20 fåre-IgG. Fig. 7a er en gel, der er farvet med Coomassie Blue til synliggørelse af antigenerne, mens fig. 7b er et Western-blot af gelen fra fig. 7a med antisera fra rekonvalescerende lam. 35 kDal-båndet er vist med en pil i begge figurer. Banerne er: 25 1. Hele celler af P. hæmolytica A2, der er dyrket i et næ ringsmedium.

2. Hele celler af P. hæmolytica A2, der er dyrket i et næringsmedium + AABP (150 /molær) .

Claims (31)

1. Proteinholdigt materiale i form af et frit eller glycosyleret protein, der kan isoleres fra Pasteurella dyrket under jern-begrænsede betingelser og er synligt ved SDS-

5 PAGE på hele cellelysater eller ydre membranekstrakter deraf, men ikke kan isoleres fra Pasteurella dyrket under normale betingelser in vitro og ikke er synligt ved SDS-PAGE på tilsvarende hele cellelysater eller ydre membranekstrakter deraf, hvilket proteinholdigt materiale reagerer ved en 10 immunoblot-analyse mod serum fra et rekonvalescerende dyr, der er kommet sig over en infektion med Pasteurella af den samme serotype, til anvendelse i en vaccine mod Pasteurella.

2. Proteinholdigt materiale ifølge krav 1, der kan isoleres fra en ydre membranekstrakt af Pasteurella.

3. Proteinholdigt materiale ifølge krav 1, der kan isoleres fra et helt cellelysat af Pasteurella.

4. Proteinholdigt materiale ifølge ethvert af de foregående krav, hvor Pasteurella-organismen er Pasteurella hæmolytica.

5. Proteinholdigt materiale ifølge krav 4, hvor Pa steurella-organismen er Pasteurella hæmolytica af biotype A.

6. Proteinholdigt materiale ifølge krav 5, hvor Pasteurella hæmolytica er af serotype Al eller A2.

7. Proteinholdigt materiale ifølge krav 5 eller med 25 en molekylvægt som bestemt ved gelelektroforese på ca. 70 KiloDalton.

8. Proteinholdigt materiale ifølge krav 5 eller 5, der kan isoleres fra en hel celle og har en molekylvægt som bestemt ved gelelektroforese på fra ca. 30 til 3 5 KiloDalton. 3 0 9. Proteinholdigt materiale ifølge krav 1, 2 eller 3, hvor Pasteurella-organismen er Pasteurella multocida.

10. Proteinholdigt materiale ifølge ethvert af de foregående krav, hvor de jern-begrænsede betingelser er de, der opnås, når Pasteurella dyrkes i et næringsmedium 35 indeholdende et jernchelateringsmiddel foreneligt med vækst af Pasteurella-organismen under dyrkning. DK 173361 B1

11. Proteinholdigt materiale ifølge krav 10, hvor det jemchelaterende middel er or, α-bipyridyl.

12. Proteinholdigt materiale ifølge krav 11, hvor koncentrationen af a,a-bipyridyl er fra 50 til 200 mikromo- 5 lær.

13. Proteinholdigt materiale ifølge krav 10, hvor jernchelateringsmidlet er diethylentriaminpentaeddikesyre, nitrilotrieddikesyre eller desoxyferrioxamin.

14. Dræbte hele celler af Pasteurella hæmolytica, 10 der er dyrket under jern-begrænsede betingelser og kan anvendes til fremstilling af det proteinholdige materiale ifølge krav 1.

15. Dræbte hele celler af Pasteurella piscicida, der er dyrket under jern-begrænsede betingelser og kan anvendes 15 til fremstilling af det proteinholdige materiale ifølge krav 1.

16. Celler ifølge krav 14, hvor de jern-begrænsede betingelser er som defineret i krav 10, 11, 12 eller 13.

17. Celler ifølge krav 15, hvor de jern-begrænsede 20 betingelser er som defineret i krav 10, 11, 12 eller 13.

18. Celler ifølge krav 14 eller 16 til anvendelse i en vaccine mod Pasteurella hæmolytica.

19. Celler ifølge krav 15 eller 17 til anvendelse i en vaccine mod Pasteurella piscicida.

20. Vaccine mod Pasteurella indeholdende et protein holdigt materiale som defineret i ethvert af kravene 1-13 sammen med et hjælpestof.

21. Vaccine mod Pasteurella hæmolytica indeholdende dræbte hele celler af Pasteurella hæmolytica dyrket under 30 jern-begrænsede betingelser, som defineret i krav 14 eller 16, sammen med et hjælpestof.

22. Vaccine ifølge krav 21 indeholdende bacterin af celler dyrket under jern-begrænsede betingelser sammen med et hjælpestof. ______________

23. Vaccine med Pasteurella piscicida indeholdende dræbte hele celler af Pasteurella piscicida dyrket under DK 173361 B1 jern-begrænsede betingelser, som defineret i krav 15 eller 17, sammen med et hjælpestof.

24. Vaccine ifølge krav 23 indeholdende bacterin af celler dyrket under jern-begrænsede betingelser sammen med 5 et hjælpestof.

25. Proteinholdigt materiale ifølge ethvert af kravene 4-8 og 10-13, når disse refererer til krav 4-8, til anvendelse i en vaccine mod Pasteurella hæmolytica til behandling af får eller kvæg.

26. Vaccine mod Pasteurella hæmolytica til anvendelse ved behandling af får eller kvæg og indeholdende en ydre membranekstrakt af Pasteurella hæmolytica dyrket under jernbegrænsede betingelser sammen med et hjælpestof.

27. Vaccine mod Pasteurella piscicida til anvendelse 15 ved behandling af fisk og indeholdende en ydre membranekstrakt af Pasteurella piscicida dyrker under jern-begrænsede betingelser sammen med et hjælpestof.

28. Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine, omfattende dyrkning af celler af Pasteurella multocida under 20 jern-begrænsede betingelser i et ikke-plasma-dyrkningsmedium, indhøstning af cellerne, dræbning deraf og formulering deraf med et hjælpestof, som en vaccine til anvendelse ved behandling af kvæg mod Pasteurella.

29. Antistoffer mod et proteinholdigt materiale ifølge 25 ethvert af kravene 1-13 til anvendelse ved passiv indgivelse til dyr mod Pasteurella.

30. Antistoffer ifølge krav 29, der er monoklonale.

31. Antistoffer ifølge krav 29 eller 30 til anvendelse ved passiv indgivelse til får, kvæg eller fisk mod Pasteu- 30 rella. i I