KR0177510B1 - 에스케리키아 콜리 백신 - Google Patents

에스케리키아 콜리 백신 Download PDF

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에프. 지. 엠. 헤르만스; 피.씨. 샬크비크
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Abstract

내용 없음.

Description

에스케리키아 콜리 백신.
제1도는 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색된, 분자량 표지가 적재된 겔을 통과한후의 스캔을 나타낸 것이고,
제2도 및 제3도는 각각 실시예1의 단계 A 및 B로부터 수득한 생성물의 스캔을 나타낸 것이다.
본 발명은 개체를 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 감염으로부터 보호하기 위한 백신, 이러한 백신에 사용되는 독소(toxin) 및 상기 독소의 정제 방법에 관한 것이다.
에스케리키아 콜리는 대부분의 동물의 소화관에서 증식하는 광범위하게 분포되어 있는 세균이다. 일반적으로, 이와 같은 세균의 증식은 심각한 부작용 없이 진전된다. 심지어 대부분의 경우 세균은 그의 숙주를 유리하게 한다. 그러나, 경우에 따라 에스케리키아 콜리는 특히 어린 동물에 있어서 심각한 질환을 유발한다. 또한, 이와 같은 질환은 조류 및 상업적으로 사육하는 가금류에서 일어날 수 있으며, 이와 같은 감염은 전염성이 되어 어린 조류 사이에 심각한 쇠약 또는 집단 폐사 상황을 초래할 수 있다.
자연적으로, 이와 같은 가금류의 에스케리키아 콜리 감염을 백신 접종 프로그램에 의해 제어하려는 시도가 있었다. 이를 위하여 성숙한 병아리에게 세균 백신(bacterin)-불활성화된 에스케리키아 콜리 세균을 백신 접종하였다(참조 : Avian Diseases 29(4), 1108-17(1985)). 세균 백신의 단점은 부수적인 부반응이 심각하다는 것이다. 더욱, 세균 백신 접종은 주로, 특정의 에스케리키아 콜리 O 혈청형에만 존재하는 리포다당류에 대한 항체만 형성할 뿐이어서, 다른 에스케리키아 콜리 혈청형에 대해서는 보호를 발휘할 수 없게 된다.
에스케리키아 콜리 감염에 대처하기 위하여, 이들 세균으로부터 수득한 필리(pili)에 기초한 백신도 자주 사용되고 있다. 그러나, 이들 백신은 백신 접종된 개체중 약 80% 이하만을 제한적으로 보호한다. 이 때문에 에스케리키아 콜리 백신은 흔히 또 다른 독성 인자, 즉 에스케리키아 콜리의 불활성화된 독소(toxin)를 구성 성분으로서 함유한다.
여러 형태의 에스케리키아 콜리는 운동 작용을 지닌 편모를 함유한다. 에스케리키아 콜리에 있어서, 편모는 독성 인자로 간주되지 않았으므로, 에스케리키아 콜리 백신에 포함되지 않았다.
본 발명에 따르면 에스케리키아 콜리의 편모가 베로(Vero) 세포에 대한 강한 독성 활성에 관련되어 있으며, 이들 편모의 독소가 중요한 독성 인자라는 것이 밝혀지게 되었는데, 이것은 지금까지는 인식되지 않았다.
이와 같은 발견을 기초로 하여, 에스케리키아 콜리의 편모로부터 유도된 백신이 조제되었다. 본 발명에 따라서, 에스케리키아 콜리의 전체 편모 뿐만 아니라, 이들 편모를 구성하는 기초 구성분, 예컨대 플라제린(flagellin) 또는 플라제린의 단편이나 집합체를 사용하여 백신 접종된 개체를 에스케리키아 콜리 감염으로부터 보호할 수 있다.
주로 병아리로부터 분리되지만 다른 동물 및 사람에서도 분리되는 다수의 에스케리키아 콜리 균주를 사용한 실험에서, 편모는 베로 세포에 대한 독성에 관여하는 것으로 밝혀졌으며; 이와 같은 독성 활성은 편모에 대한 항체에 의해 중화되는 것으로 밝혀졌다. 또한 연구된 모든 에스케리키아 콜리 균주의 편모의 독성은 균주중 어느 하나의 편모에 의해 야기된 단일의 항혈청에 의해 중화될 수 있는 것으로 판명되었다.
이와 같은 발견으로 미루어 볼 때, 단일의 에스케리키아 콜리 균주로부터 수득한 편모로 백신 접종하면 모든 편모를 함유한 에스케리키아 콜리 균주에 의한 감염에 대하여 보호를 제공할 수 있는 것으로 기대된다.
상기 고찰에 있어서, 본 발명에 따른 백신은 에스케리키아 콜리에서 발견된 새로운 유형의 독소를 기초로 하는데, 이들 독소는 단백질의 성질을 갖는 것을 특징으로 하고, 편모중에 결합되고 및/또는 편모와 결합되는 것으로 밝혀졌으며, SDS-PAGE로 측정시 30-100kD의 분자량을 지니고, 결합된 탄수화물 잔기를 갖지 않으며, 베로 세포 및 생후 1 일 이상된 병아리에 대해 독성이 있고, 이와 같은 독성은 100℃에서 1시간 동안 가열하여도 보존된다.
이들 신규의 독소는 상기와 같은 복합된 특성면에서 당업계에서 공지된 에스케리키아 콜리 독소와 구별된다.
상기 독소는 대다수의 에스케리키아 콜리 균주 사이에서 발견되며, 편모 구조에서 두드러지게 나타나기 때문에 본 명세서에서는 편모상 독소(flageellar toxin)(FT)라고 명명한다. 이들 편모는 일반적으로 통상의 핌브리에(fimbriae)(전형적으로 직경 약 7㎚및 길이 약 1㎛ 이하)보다 훨씬 더 큰데, 두께 약 25㎚ 이하 및 길이 7 ㎛ 이하이다.
본 발명에 따른 독소 중 1종은 실시예 1에 개시한 공정에 따라서 병아리 에스케리키아 콜리 균주 CH7(015 :H14 :H10)로부터 분리되었다. 이와 같은 CH 7-FT는 여러 형태로 분리될 수 있는데; H10형의 천연 편모로서 또는 유리(free) 편모로서 결합되거나, 유리 독소로부터 수득된 작은 침상(針狀) 필라멘트에 재결합될 수 있다. SDS-PAGE로 측정시 약 47kD의 서브유니트 분자량, 약4.8의 등전 pH, 및 부분 아미노-말단 아미노산 서열(Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-(?)-Thr-Gln)이, 상기 일반 특성중 전반부에 기재된 CH7-FT의 전형적인 특성들이다(CH7-FT의 특성은 실시예 2에 기재되어 있다).
상기 CH7-FT에 의하여 야기된 항혈청은 시험된 다른 모든 에스케리키아 콜리 균주의 FT와 교차 반응하는 것으로 밝혀졌다(실시예3). 따라서, 이와 같은 CH7-FT에 대한 항혈청은 본 발명에 따른 다른 모든 FT를 특정화하는 데 사용될 수 있다. 더욱, 모노클로날 항체는 시험된 다른 모든 에스케리키아 콜리 균주의 FT에 특이성이 있거나 또는 교차 반응하였다.
본 발명은 또한 에스케리키아 콜리 감염에 대한 면역활성을 지닌 백신에 관한 것으로 그 활성 성분이 본 발명에 따른 불활성화 독소이다.
이와 같은 백신은 적합하게는 상기 독성 편모를 함유하는데, 편모의 형성을 촉진하는 조건하에서 에스케리키아 콜리 세균을 배양하고, 세균으로부터 편모 또는 세포 유리 상층액을 분리함으로써 이들 편모를 용이하게 수득할 수 있다. FT는 한외 여과 및/또는 분자 체(sieve) 크로마토그래피를 사용하여 상층액 중의 저분자량 성분을 제거함으로써 추가로 정제될 수 있다.
상기의 정제 공정동안, CH7-FT에 의해 야기된 모노클로날 항체와의 반응성에 의해, FT가 풍부한 분획을 모니터할 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 또한 FT의 단편을 함유할 수 있는데, FT의 단편은 그것으로 백신 접종된 개체를 에스케리키아 콜리 감염에 대하여 보호한다.
본 발명에 따른 백신에 혼입되는 FT는 화학합성, 에스케리키아 콜리 세포 배양액으로부터의 정제 또는 DNA 재조합 기술에 의해 수득할 수 있다.
DNA 재조합 기술의 경우에, 상기 단백질 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산 서열은 게놈성 에스케리키아 콜리 DNA 뱅크(bank)를 상기 서열을 함유하는 각 클론에 대해서 스크리닝함으로써 동정할 있는데, 예를 들어 FT에 의해서 야기된 폴리클로날 또는 모노클로날 항체와의 특이적인 반응을 이용한다. 핵산 서열은 각종 발현 관련 DNA 서열에 결찰될 수 있으며, 그것에 의하여 적절한 숙주의 형질 전환에 사용될 수 있는 이른바 재조합 핵산 분자가 생성된다. 이러한 혼성(hybrid) DNA 분자는 예를 들어 플라스미드, 파아지, 또는 비루스 중에 존재하는 핵산 서열로부터 유도될 수 있다. 숙주 세포는 원핵 세포(예, 세균) 또는 포유 동물 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 형질 전환된 숙주 세포는 FT를 생산하는데 사용될 수 있으며, 그후 단백질을 분리한 다음 본 발명에 따른 백신 중에 혼입시킬 수 있다.
다른 구체예로서, 비-병원성 미생물, 예를 들어 FT를 암호화하는 유전자를 포함하는 비루스 또는 세균을 함유하는 생 벡터(live vector) 백신이 제조될 수 있다.
FT와는 별도로, 본 발명에 따른 백신은 또한 활성 및/또는 저장 수명을 증가시키기 위하여 수성매질이나 물을 함유하는 현탄액, 및/또는 기타 성분들을 함유할 수 있다. 이들 성분들은 염, FT의 면역 특성을 유지하면서 독성 활성을 불활성화시키는 물질(예 : 포르말린), pH 완충액, 유화제 및 면역 반응을 향상시키는 보조제(예 : 광유, 무라밀 디펩티드, 수산화 알루미늄, 사포닌, 다가 음이온 및 양쪽친매성(amphiphatic) 물질)일 수 있다.
이 백신은 에스케리키아 콜리 감염에 대하여 온혈동물(인간을 포함함)을 면역화시키는 데 유용하며, 특히 조류에서 에스케리키아 콜리 감염에 대처하는데 사용될 수 있다.
상기 목적으로는, 백신을 비경구적으로, 예를 들어, 피하내 또는 근육내 주사 투여하는 것이 바람직하다. 백신은 상기와 같은 방식으로 백신 접종된 조류의 능동면역을 위해, 그리고 그의 자손의 수동 면역을 위해 산란 조류에서 투여될 수 있다. 면역 접종된 산란 조류의 경우, 그것들에서 생성된 항체는 물론 난황에 도입되어, 이후에 부화된 병아리에 도입된다.
백신의 조성 및 백신 접종 시스템은, 보호하려는 동물의 종류, 연령 및 중량, 필요한 보호기간, 투여방법, 및 능동면역 또는 모체의 항체에 의한 수동면역의 필요여부에 따라 다를 수 있다. 백신내 활성 성분의 최적 유효량은, 가금을 비경구적으로 백신 접종시켰을 때 1회 투여당 약 10-100㎍ 이다. 백신은 다른 관련 백신들과 조합될 수도 있다.
[실시예 1]
에스케리키아 콜리 균주 CH7의 편모상 독소(flagellar toxin)의 분리
A. 편모상 독소의 제조
14%의 산소 분압(pO2)고정 및 100-500rpm의 다양한 교반하에 12ℓ트립티카아제 소이 브로스(Trypticase Soy Broth)(B. B. L)중의 바이오스타트(Biostat) E 발효조(Braun)에서 에스케리키아 콜리 균주 CH7(015:K14:H10)를 하룻밤동안 배양하였다. HVLP 필터를 지닌 펠리컨(Pellicon) 필터 시스템(Millipore)중에서 배양액을 약 1ℓ로 농축시켰다. 10,000rpm(GSA rotor, Sorvall)에서 30분간 세균을 원심분리하고; 상층액을 0.45㎛ 필터로 여과한 다음 HVLP 여과액에 가하였다.
여과액을 약 1ℓ로 농축하고, PTTK필터를 사용하여 0.2mol/ℓ트리스 HCL 완충액 1ℓ로 3회 세척하였다.
방부제로서 0.1% NaN3를 함유하는 50mmol/ℓ, pH 7.2의 인산염 완충액(PB)으로 평형화시킨, 높이 10㎝ 및 면적 154㎠(Amicon model P140 X 250)의 세파로스 4B-C1 컬럼(Pharmacia, Uppsala Sweden)으로 PTTK 농축액을 약 110~160㎖ 씩 되풀이하여 용출시켰다. 기록기의 기저선이 다시 0이 될 때까지 PB로 컬럼을 용출시켰다.
고분자량 분자를 포함하는 제 1 피이크의 분획을 푸울(pool)하여, 단백질 농도가 약 2-3㎎/㎖이 될 때까지 YM-100 한외여과 필터 (φ62mm Amicon, Amicon UF model 202 장착함)상에서 농축시켰다. 방부제로서 0.1% NaN3를 함유하는 200mmol/ℓ, pH 7.5의 트리스 HCL 완충액 5ℓ로 농축액을 2회 투석하였다.
B. 유리 독소의 제조
농축액을 라엠리(Laem㎖i)의 방법(Nature 227, 680-4:1970)에 의해 분리용 전기영동(preparative electrophoresis)시켰다. 전기영동한 것을 20㎖ 글리세롤, 20㎖ 트리스-HCL 완충액(0.5mol/ℓpH 6.8), 20㎖ 10% SDS, 5㎖ 2- 메르캅토에탄올(ME) 및 2㎖ 0.05% 브로모페놀 블루로 구성된 샘플 완충액으로 1 :1.67로 희석하였다.
이어서, 그것을 수중에서 약 5분간 비등시키고, 냉각한 다음, 16 x 0.6㎝의 12%(아크릴아미드 :비스 30 : 0.8) 폴리아크릴아미드 슬랩 겔상에서 분리용 전기영동하였다. 샘플 로딩(loading)양은 통상적으로 겔(7.5㎖ 농축액 및 5.0㎖ 샘플 완충액)당 약 15-23㎎ 단백질이었다. 전기영동은 프로테안(Protean) 셀 모델 1423(Bop-Rad, Richmond USA) 또는 모델 SE 600 (Hoefer, San Francisco, USA)상에서 수행하였다. 전반부를 겔로부터 용출시킨 후, 200V에서 추가로 계속 전기영동시켰다. 겔을 약 1.5-2mm의 슬라이스 형태로 절단하였다.
연속적으로 교반시키면서 실온에서 3시간 동안, 그리고 4℃에서 밤새도록 10㎖의 0.89% 염화나트륨 용액 + 0.1% NaN3중에서 단백질을 용출시켰다. 슬라이스를 제거하고 용액을 0.45μ 필터로 여과시켰다. 순수한 독소 서브유니트를 함유하는 분획을 푸울하여 -20℃에서 저장하였다.
샘플 내 단백질 함량을 개량된 폴린-시오칼테우(Folin-Ciocalteu) 분석법 (J.Biol. Chem. 73, 627;1927)에 의해 측정하고, 다당류를 뒤부와(Dubois)에 따른 페놀-황산 분석법(Amal. Chem,. 28, 350-6;1956)에 의해 측정하였다.
[실시예 2]
에스케리키아 콜리 균주 CH7 독소의 특정화
A. 생후1일된 병아리의 치사율
첫번째 실험에서 0.2 및 0.5㎖의 여러 에스케리키아 콜리 독소 제제를 생후 1일된 SPF 브로일러(broiler) 병아리(GVP, Doorn)에서 복강내(IP) 주사하였다. 두번째 실험에서는 0.5㎖의 독소 제제를 생후 3주된 병아리에 정맥내(IV) 주사하였다. 주사 후 7일 동안의 치사를 기록하였다.
(결과)
표 1에서 나타난 바와 같이, 병아리 에스케리키아 콜리 균주 CH2 및 CH7의 독소 제제를 복강내 주사하면 생후 1일된 병아리에게 치명적이었다. 균주 CH7의 경우에는 상충액 및 용해액 모두 독성이 있었지만, 균주 CH2의 경우에는 특히 용해액이 독성이 있었다.
Figure kpo00002
* 균주 CH2 및 CH7은 병아리 에스케리키아 콜리 분리물이고;
균주 ZF24는 사람 배설물의 무독성 에스케리키아 콜리 분리물이다.
생후 3주된 병아리에 유사 제제를 정맥내 주사한 경우 전혀 영향이 없었다. (데이타를 나타내지 않음).
B. 베로 시험
5% 송아지 태아 혈정(FCS), 200U/㎖ 페니실린 및 200㎍/㎖ 스트렙토마신을 보충하여 여과 멸균 후 2㎍/㎖ 푼지존(fungizone)을 보충한 배지 6(1ℓ 당 85㎖ MEM Eagle, 100㎖ 트립토스 포스페이트 브로스, 50㎖ 4.4% NaHCO3함유)내에서 베로 세포를 5% CO2대기하에 37%에서 배양하였다. 트립신 처리 후, 세포를 1개웰(well)당 200㎍의 완전 배지 6(1㎖당 2 x 105세포함유)으로 바닥이 판판한 96-웰 폴리스티렌 배양판(Greiner)중에 접종하였다. 하룻밤 배양하면, 단일충(monolayer)이 구성된다. 배지를 버리고, 웰 당 200㎍의 FCS가 없는 배지 6으로 교환하였는데, 이 배지는 10㎍/㎖ 크산틴 (3-이소부틸-1-메틸-크산틴 : Sigma)이 보충된 것이다. 이어서, 웰당 20㎍의 독소 제제(일련의 희석액)을 첨가하였다. 배양 5일후 세포 병리효과(cytopathological effect)(CPE)를 기록하였다.
먼저 웰 당 20㎍의 희석하지 않은 상충액과 1:2 희석한 상충액을 가하여 균주가 독소를 생상하였는지를 스크리닝하였다. 이어서, 상충액이 베로시험에서 음성이었던 균주가 세포내 독소를 생산하였는지 시험하기 위해서 웰당 50㎍의 희석하지 않은 세균 용해액 및 1:2 희석한 세균 용해액을 가하였다.
(결과)
처음에 표 2에 도시한 균주를 독소 생성에 대하여 시험하였다. 어떤 균주들은 상충액내에서 독소를 분비한 반면, 다른 균주들에서는 독소가 세포내에 존재하고 및/또는 세균 세포의 초음파 파괴후에 검출될 수 있을 뿐이었다. 세포 병리효과는 베로 세포가 만곡되거나 수축되는 것인데, 단일층은 대부분의 경우 완전한 형태로 남아 있었다.
Figure kpo00003
* JA221은 에스케리키아 콜리 K-12 균주이며; ZF24는 표 1에서 언급한 바와 같고; CH 균주는 병아리 분리물이다.
** 독소 역가는 독성 효과를 제공하는 최후 희석도의 역수로 정의한다.
C. 독소의 안정성
각종 처리에 대한 독소 제제의 감응도(sensitivity)를 시험함으로써 동정한 독소의 예비적인 특정화를 수행하였다. 독성 시험에 앞서, 실온에서 하룻밤 배양한 후, 독소를 pH 3 내지 10으로 조정하고 중화시켜 pH 감응도를 시험하였다.
열 감응도 시험을 위하여 독소 제제를 여러 온도로 가열하였다. 1% SDS의 존재하에 그리고 1% SDS와 2.5% ME의 존재하에 독소를 가열한 후 염수에 대해 투석시켜서 SDS 및 ME의 영향을 시험하였다. 우레움에 대한 감응도 시험을 위하여 6M 우레움을 독소 제제에 1시간동안 가하고 염수에 대해 투석하였다.
베로 세포 분석의 독성시험에 앞서 다양한 농도의 포르말린을 가하여 다양한 온도에서 하룻밤 배양한 후 투석하여, 포르말린 감응도를 시험하였다. 독성 시험전에 100㎍/㎖ 트립신(소 췌장;Millipore)을 가하고, 37℃에서 4시간 동안 배양한 후, 37℃에서 30분간 150㎍/㎖ 트립신 억제제 ( 콩 ; Sigma)를 가함으로써 트립신에 대한 감응도를 시험하였다.
(결과)
서로 다른 날짜의 베로 세포의 조건이 다른 점으로 인하여 베로 세포 독성 분석법에서 병아리 독소 역가의 측정이 재현성이 없었기 때문에, 여기에서의 결과는 대표적인 실험의 예로서만 제시될 뿐이다.
CH5 및 CH7 상충액을 pH 3 내지 10으로 처리하는 것은 독성에 영향을 미치지 않았으며, 독소 역가는 각각 32-64 및 128-256으로 일정하였다.
열 감응도와 SDS 또는 SDS+ME 처리에 대한 감응도를 표 3에 나타냈다.
Figure kpo00004
비록 CH2 용해액 및 CH5 와 CH7 상충액의 독성이 고온에서 장시간 노출된 후에는 어느 정도 감소하고 120℃에서 가열되는 후에는 완전히 사라졌지만, 독소는 비교적 열에 안정한 것으로 여겨진다. SDS 또는 SDS+ME 존재하에 10분 동안 가열했을 때 CH5 와CH7 상충액의 독성에는 아무런 영향이 없었다.
6M 우레움으로 CH2 용해액 및 CH5 및 CH7 상충액을 처리하였을 때 각 VT 역가에 전혀 영향이 없었다.
표4에서 표여지는 바와 같이, CH7 상층액의 독성은 실온 및 37℃에서 포르말린에 의해 불활성화되었다.
CH5와 CH7 상충액 모두의 독성은 트립신 처리 후에 완전히 사라졌지만, 모조처리한 경우 및 트립신 억제제만 처리한 경우에는 독성에 전혀 영향이 없었다.
Figure kpo00005
D. 분자량 측정
라엠리(Laemmli)의 방법에 의하여 12% 겔(아크릴아미드 : 비스 = 30 : 0.8)에서의 분석용 겔 전기영동에 의해 표준물과 비교하여 균주 CH7의 독소의 분자량을 측정하였다.
겔을 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB)로 염색하였다. 겔 스캐너 모델 CS-930 및 기록기 DR-2(Shimadzu, Kyoto Japan)를 사용하여 스캔(scan)을 만들었다.
제1도는 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색된, 분자량 표지(marker)가 적재된 겔을 전개시킨 후의 스캔을 나타낸 것이다. 피이크 1 내지 6에 상응하는 표준물은 각각 78000, 66000, 45000, 30000, 17200 및 12300 D의 분자량을 갖는다. (LKB 1860-12, Bromma, Sweden).
제2도 및 제3도에는 각각 실시예 1의 단계 A 및 단계 B 로부터 수득한 생성물의 스캔을 나타내었다.
에스케리키아 콜리 균주 CH7의 독소 서브유니트의 분자량은 상기 실험에서 약 47kD인 것으로 밝혀졌다.
E. 등전점 측정
0.5㎖ 세르발라이트(Servalytes) pH 3-7(분석용 등급, Serva Heidelberg Germany) 및 46.5㎖ 아쿠아 데스트(aqua dest)의 혼합물과 함께, 실시예 1의 단계 A로부터 수득한 에스케리키아 콜리 균주 CH7의 3㎖ 독소를 5시간 동안 12W(Rotofor, Bio-Rad Richmond USA)에서 포커싱(focussing)시켜서, 독소의 등전점을 측정하였다. 독소함량을 분석용 겔 전기영동에 의해 검출하였다.
상기 실험의 결과를 표 5에 요약했다.
이들 결과로부터 에스케리키아 콜리 균주 CH7의 독소가 약 pH 4.8의 등전점을 갖는다는 것이 밝혀졌다.
(결과)
Figure kpo00006
* - = 독소 관찰불가능
± = 약간 관찰가능
+ = 관찰가능
++, +++, ++++ = 독소량 증가
F. 당류(saccharide) 함량
실시예 1의 단계 B로부터 수득한 에스케리키아 콜리 균주 CH7의 독소는 뒤부와(Dubois) 등의 페놀-황산 분석법(Analytical Chemistry, 28, 350-365, ; 1956)으로 측정하였을 때 다당류나 어떠한 당(sugar)을 함유하지 않았다. 리뮬러스 아메보사이트 용해액 시험(Limulus Amoebocyte Lysate test) (Pyrotell, MA, USA)에서는, 두드러진 LPS(엔도톡신) 활성이 검출되지 않았다.
G. 아미노산 분석
창(Chang)에 따른 액상 DABITC 공정(Methods Enzymology 91, 455-466; 1983)에 의해 N-말단 아미노산 서열을 측정하였다. DABTH-아미노산의 동정은 박층 크로마토그래피에 의해 수행하였다. CH7-FT에 대한 47kD의 서브유니트 분자량이 총 446개의 아미노산에 해당한다는 가정하에, 잔센(Janssen) 등이 기재한 PTC기법(Chromatorgraphia 22, 345-358;1986)에 의해, 아미노산 조성을 결정하였다.
결과.
실시예 1의 단계 A 및 단계 B로부터 수득한 에스케리키아 콜리 균주 CH7의 독소는 하기 N-말단 아미노산 서열을 갖고있다.Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-
Ser-Leu-Ser-Leu-(?)-Thr-Gln
상기 서열은 구와지마(Kuwajima) 등에 의해 밝혀진 에스케리키아 콜리 K-12 플라제린의 N-말단 아미노산 서열(Journal of Bacteriology 168,1479-1483;1986
)과 일치한다.
독소의 아미노산 조성을 표 6에 나타냈는데, 이것도 또한 에스케리키아 콜리 균주 K-12 플라제린과 상당히 유사하다.
Figure kpo00007
1)PTC 기법(Chromatographia 22, 345-358;1986)에 의해 평가함.
2DNA 서열 (Journal of Bacteriology 168, 1479-1483;1986)에 계산함.
[실시예 3]
FT 발현에 대한 병아리 에스케리키아 콜리 균주의 스크리닝 및 FT의 혈청학적 특정화.
독성, 운동성 및 세균 표면상의 FT 항원 발현에 대하여, 전 세계로부터 얻은 총 124개의 병아리 에스케리키아 콜리 분리물을 스크리닝하였다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 FT의 가시화 및 교차반응 연구에 사용하였다.
(방법)
독성 시험 및 독소 중화.
실시예 2B에 기재한 바와 같이, 베로 세포에 대한 균주의 독성을 시험하였다. 중화를 위하여, 독성 시험에 앞서 독소 제제를 37℃에서 2시간 동안 항혈청 희석액과 함께 배양하였다.
(운동성 시험)
낮은 한천 농도(0.25%)를 가진 영양 배양액을 함유하는 U-형 튜브내에서 균주의 운동성을 시험하였다. 이들 U-튜브의 한쪽 끝에 에스케리키아 콜리 균주를 접종하고 37℃에서 하룻밤 배양한 후 튜브의 다른쪽으로 운동한 것을 기록하였다.
(항혈청 제조)
실시예 1A에 기재한바와 같이 제조한 에스케리키아 콜리 균주 CH7의 FT에 대한 항혈청을 토끼 및 병아리 중에서 생성시켰다. 실시예 1B에 기재한 바와 같이 제조한 균주 CH5 및 CH7의 독소를 모노클로날 항체(MoAb)의 생산에 사용하였다. MoAb 생산을 위하여, 면역화시킨 마우스의 비장 세포를 골수종 세포와 융합시키고, 생성된 하이브리도마를 ELISA 방법으로 항독소 항체 분비에 대하여 스크리닝하였다. 양성 하이브리도마를 제한 희석에 의해 클로닝하였다. 클로닝된 하이브리도마를 마우스에 복강내 주사하여 복수액(Ascitic fluid)를 조제하였다. 복수액을 56℃에서 10분간 불활성화시키고, 지질은 1,1,2-트리클로로트리플루오로에탄(Merck)으로 추출하고, MoAb를 50% 포화 황산암모늄으로 침전시켰다.
(에스케리키아 콜리 균주에 희한 FT 항원 발현)
균주 CH7(015 ; K14 ; H10)의 FT에 대하여 생성된 토끼 항혈청을, 독소를 생성하지 않는 무독성 에스케리키아 콜리 균주 RDEC-1(015 : K14)로 실온에서 24시간 동안 흡수시켰다. 이와 같이 흡수된 항혈청을 아래와 같이 수행한 총 세균 ELISA에 의해 FT 발현에 대하여 균주를 스크리닝하는 데 사용하였다.
세균을 교반없이 TSB 중에서 6시간 동안 생장시키고, 15분간 3,000rpm으로 회전 (Sorvall RT6000)시킨 후, CBB 완충액(1.59g/ℓNa2CO3; 2.93g/ℓNaHCO3;0
.2g/ℓNaN3; pH9.6)에 660nm에서 0.140-0.180의 O.D.로 재현탁시켰다. 편평한 바닥의 포리스티렌 마이크로타이터 플레이트(Greiner)에 웰당 100㎕의 이들 세균 현탁액을 접종하고, 50℃에서 하룻밤 건조시켰다. 플레이트를 수도물로 세척하고, 웰당 110㎕의 PBS-T-N(0.04M PBS ; pH 7.2; 0.5% Tween 80 ; 15% 새로 태어난 송아지 혈청)으로 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다. 이어서, 웰당 100㎕의 흡수 혈청의 일련의 희석액을 가하고, PBS-T-N으로 희석시켰는데, 1;100 희석으로부터 시작하였다. PBS-T-N을 갖는 균주당 2개 웰을 백그라운드 컨트롤로 이용하였다. 37℃에서 1시간 배양 후, 플레이트를 세척하고 웰당 100㎕의 퍼옥시다아제-접합된 엽소-항-토끼 IgG(H+L)을 각 웰에 가하여 PBS-T-N으로 적절히 희석하였다. 37℃에서 30분간 배양한 후, 플레이트를 다시 세척하였다. 아세트산 나트륨-시트르산 완충액(pH 5.5)중의 3.3′,5.5′-테트라메틸벤지딘 및 우레움-퍼옥사이드(Organon Trknika, Oss)를 함유하는 TMB-기질 완충액을 웰당 100㎕ 가함으로써 항체 결합을 비색 분석에 의해 검출하였다. 반응을 10분간 암실에서 전개시키고, 50㎕의 4NH2SO4를 가하여 중지시킨 후, 450nm에서 마이크로엘리사(Microelisa) 리더(reader)로 측정하였다. 백그라운드 A450의 2배 이상인 A450을 제공하는 최고 항혈청 희석도로서 역가를 측정하였다.
각 분석법에서 균주 CH7 및 RDEC-1을 각각 양성 및 음성 컨트롤로서 포함시켰다.
(웨스턴 블로팅)
면역 블로팅 또는 웨스턴 블로팅을 뮐러만(Muilerman) 등이 기재한 바와 같이 수행하였다.(Anal. Biochem. 120.46-51;1982). 교반하에 6시간 동안 세균을 트립티카아제 소이 브로스 중에서 배양하여 균주의 조(crude) FT 제제를 제조하였다. 세균을 격력히 혼합한 후 원심 분리하여 제거하고, 상충액을 에탄올 침전에 의해 약 40배 농축하였다.(1부 상충액 : 2부 96% 에탄올, 4℃에서 하룻밤 배양, 원심분리 및 침전물을 0.04mol;/ℓPBS, pH7.2중에 용해시킴). 이들 조 FT 제제를 SDS-PAGE로 전개시키고 셀룰로오스 나이트레이트 막(membrane) 필터에 트랜스 블로팅하였다.항체, 적합한 퍼옥시디아제-접합된 항-종(species) IgG(H+L) 및 우레움 퍼옥시다아제를 3.3′-디아미노벤지딘-4HCL과 함께 연속 배양하여 항원을 가시화하였다.
면역골드(immunogold)-전자 현미경 분석(IG-EM).
IG-EM을 반 알펜(van Alphen) 등에 의해 기재된 바와 같이 수행하였다.(Infe
ct, Immun 56, 1800-6;1988.) 개략하면, 트립티카아제 소이 브로스에서 배양한 세균을 PBS + 1% BSA + 0.05% Tween 20(PBS-B-T)내 항체 희석액으로 배양한 후, PBS 로 3회 세척하고, PBS-B-T 내 골드 구형체로 표지화시킨 단백질 A로 배양하였다. PBS로 3회 더 세척한 후, 세균을 포름바-피복된(Formvar-coated) 격자로 이송하여 1% 우라닐 아세테이트 또는 포스포텅스텐산으로 음성 염색시켰다.
(결과)
전 세계로부터 얻은 124개 병아리 에스케리키아 콜리 균주의 수집물중, 73개 균주(59%)가 베로 세포에 활성이 있는 독소를 검출가능한 양으로 배출하였다. 추가로 37개 균주(30%)가 세균 용균 후 베로 세포에 대하여 독성이 있었다. 전체 세균 ELISA법에서, 52개 균주(42%)가 CH7-FT에 대하여 생성된 항혈청과 반응하였다. 또 한 ELISA에서 양성인 균주 모두가 세포의 베로 독소를 생성하였다(표 7).
Figure kpo00008
1)전체 세균 ELISA 중 CH7-FT 항혈청과의 반응.
2)세균 배양 상충액의 베로 세포에 대한 독성.
균주의 베로 독소 배출과 운동성 사이에 강한 상관 관계가 발견되었다(표8).
Figure kpo00009
1)U-튜브내 운동성.
2)세균 배양 상충액의 베로 세포에 대한 독성.
상기 결과로부터 베로 독성 활성이 편모에 존재하는 것이 추가적으로 입증된다. 또한, 베로 독성은 세균 U-튜브를 통과한 후 증가하는 것으로 밝혀졌다. 더욱, 상기 결과로부터 상이한 균주들의 독소가 혈청학적으로 교차 반응성을 갖는 것을 알 수 잇다.
상이한 균주의 독소들간의 교차반응을 추가로 조사하였다. 표 9에서 균주 CH7의 FT에 대하여 생성된 토끼 및 병아리 항혈청은, 시험된 다른 모든 독성 균주의 베로 독성을 중화시키는 것으로 나타났다. 균주 CH5 및 CH7의 FT에 대하여 생성된 MoAb는 독성을 전혀 중화시키지 않았다.
Figure kpo00010
1)표 2 참조.
2)모조처리된 상충액 또는 전-면역 혈청으로 처리됨.
3)토끼 항 CH7-FT 항혈청, 1:10 희석.
4)병아리 항 CH7-FT 항혈청, 1:10 희석.
Figure kpo00011
1)KO7577 = CH7-FT에 대한 토끼 항혈청;
BB1-2 = CH7-FT 에 대한 병아리 항혈청;
αH10 = H10 편모형에 대한 응집 항혈청, RIVM(Bilthoven) 판매;
Intl-7 = CH7-FT에 대한 MoAb;
Int2-13 = CH5-FT에 대한 MoAb.
2)데이타는 블로트내의 단일 또는 주 밴드의 대략적인 겉보기 분자량(kD 단위)을 나타낸다.
3)A. M Lawn(J. Gen. Microbiol, 101, 112-130;1977)
4)H10 편모 기준 균주를 사용한 고유 관찰.
여러 항혈청에 대한 조 FT 제제의 웨스텐 블로팅 결과를 표 10에 나타냈다. CH7-FT에 대한 토끼 및 병아리 항혈청(각각 K07577 및 BBI-2)은, 밴드의 분자량이 균주마다 다름에도 불구하고, 시험된 모든 FT 제제와 반응하였다. 항-H10-편모 응집 항혈청을 사용하였을 때 동일한 결과를 얻어졌다. 또한, CH5-FT에 대한 MoAb Int 12-13은 웨스턴 블로팅에서 동일한 패턴을 나타내었다. CH7-FT에 대한 MoAb Int 1-7 은 단지 CH7-FT의 47kD 밴드와 반응하였다. 놀랍게도, 여러 균주의 H형에 상응하는 플라제린 분자량은 각 FT의 겉보기 분자량과 거의 일치하였다. RIVM(Bilth
oven)으로부터 수득한 H10형 편모를 가진 다수의 균주는 폴리클로날 항혈청에 대한 웨스턴 블로팅에서 45kD 또는 47kD에서 밴드를 나타내었다. MoAb Int 1-7은 단지 H10형 편모 균주의 47kD 밴드와 반응하였다. 조 FT 제조에 앞서 균주를 U-튜브에 통과시켰을 때, 웨스턴 블로팅의 밴드 강도가 증가하였다.
IG-EM에서 CH5 및 CH7 세균상의 편모상 필라멘트를 CH7-FT에 대한 폴리클로날 항혈청을 사용하여 골드 구형체로 표지화하였다. CH7-FT에 대한 MoAb Int 1-7에 있어서, FT7 세균상의(CH5 세균은 제외) 편모상 필라멘트만이 골드 구형체로 표지화되었다. 분리용 SDS-PAGE를 사용하여 실시예 1B에 기재된 바와 같이 제조한 CH5-FT에 대한 MoAb Int 12-13으로는, 편모상 필라멘트가 두드러지게 표지화되지 않았으며; 단지 약간의 골드 구형체만이 CH5 및 CH7 세균 표면상에서 관찰되었다. 사실상, MoAb Int 12-13은 분리된 FT(웨스턴 블로트, ELISA)와만 반응하였고, 본래 그대로의 FT(IG-EM, Elisa)와는 반응하지 않았다.
상기 모든 결과는 베로 독성활성이 편모중에 존재하거나 또는 FT가 편모와 동일한 것이라는 점을 입증한다. 또한, 상이한 균주들이 FT는 혈청학적으로 높은 교차 반응성을 갖고, 또한 교차 중화성을 나타낸다.
[실시예 4]
수동 면역화에 의한 브로일러의 보호.
실시예 1A에 기재한 바와 같이 제조한 CH7-FT를 병아리에 백신 접종함으로써 CH7-FT에 대한 항혈청을 생성하였다. 상이한 병아리로부터의 항혈청을 모아서 56℃에서 10분간 불활성화시켰다.
생후 3주된 브로일러(Euribrid, Boxmeer, The Netherlands)에게 1㎖의 상기 CH7-FT 항혈청을 정맥내 주사하였다. 항혈청 주사후 1시간 내에, 우후방 흉곽 기낭중으로 0.2㎖의 세균 현탁액을 주사하여 병아리를 감염시켰다. 혈액 한천베이스판(Ox
oid)상에서 세균을 하룻밤 배양하고, PBS중에 현탁시킨 후, 적당한 농도로 희석하였다. 사용된 에스케리키아 콜리 균주는 모두 장내 세균으로 감염된 병아리의 심장으로부터 분리하였다. 항혈청을 투여하지 않거나 음성 대조군 혈청만을 투여한 대조군 병아리들, 동일한 투여량의 세균으로 감염시켰다. 감염 후, 병아리를 임의로 음식물 및 물을 갖춘 감압 분리실 내에 감금하여, 감염 후 7일동안의 치사율을 기록하였다.
표 11에 나타낸 바와 같이, CH7-FT 항혈청에 의한 병아리의 수동 면역화는 시험된 5개 에스케리키아 콜리 균주중 3개로 감염시켰을 때 상당한 보호를 제공하였다. 상당한 보호를 나타낸 3개 균주중 2개 균주는 배양 상충액에 독성 활성을 분비하였으
며, 1개 균주는 세균 용해액에서만 베로 세포에 대한 독성 활성을 가졌다. 두드러진 보호를 나타내지 않은 2개 균주는 모두 세균 용해액에서만 독성활성을 가졌다. 놀랍게도, 단지 운동성 균주에 의한 감염에 대해서만 두드러진 보호가 얻어졌다.
Figure kpo00012
1)배양 상충액 또는 세균용해액만의 베로 세포에 대한 독성 활성.
2)U-형 튜브내 균주의 운동성.
3)총 수에 대한 감염 후 7일 이내의 치사 병아리 수.
4)항혈청에 의한 상당한 보호의 카이-스퀘어(chi-square) 시험.

Claims (8)

  1. 에스케리키아 콜리의 편모로부터 유도된 것을 특징으로 하는, 에스케리키아 콜리 감염에 대한 개체 보호용 백신.
  2. 제1항에 있어서, 편모가 베로(Vero) 세포에 대한 독성 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 백신.
  3. a. 단일의 폴리펩티드 사슬로 이루어지고, b. SDS-PAGE로 측정시 30-100kD 사이의 분자량을 가지며; c. 필라멘트상 응집물 내에서 결합되거나 또는 필라멘트상 응집물과 결합되거나, 또는 필라멘트상 응집물 내에서 및 필라멘트상 응집물과 결합된 상태로 발견될 수 있고; e. 자연상태에서 결합된 탄수화물 잔기를 갖지 않으며; d. 베로 세포 및 생후 1일 이상된 병아리에 대하여 독성이 있고; f. 100℃에서 1시간 동안 가열시 독성을 유지하는 것을 특징으로 하는, 온혈동물의 에스케리키아 콜리 감염에 대해 면역활성을 지니는 독소 또는 이 독소로부터의 단편.
  4. 제3항에 있어서, a. H10 혈청형에 속하는 균주의 에스케리키아 콜리를 트립티카아제 소이브로스(Trypticase Soy Broth)에서 배양하고; b. 위에서 수득된 배양액의 세포 유리 상충액을 30kD의 차단값(cut-off value)을 지닌 필터상에서 농축하고; c. 상기 필터상의 물질을 20mmol/ℓ 트리스-HCL 완충액으로 세척하고; d. 세척된 물질을 세파로스 4B 컬럼상에 분리하고; e. 고분자량 분획을 수집하고; f. 이 분획을 분리용 SDS-PAGE 시킴으로써, HO 혈청형에 속하는 균주의 에스케리키아 콜리로부터 수득가능한 독소 또는 이 독소로부터의 단편.
  5. 제4항에 있어서 SDS-PAGE 시킨 경우 약 47kD의 분자량, 약 4. 8의 등전 pH 및 부분 아미노-말단 아미노산 서열 Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-(?)-Thr-Gln을 가짐을 특징으로 하는 독소 또는 이 독소로부터의 단편.
  6. 제3항 내지 제5항중 어느 한항에 따른 독소로부터 유도된 것임을 특징으로 하는, 에스케리키아 콜리 감염에 대한 개체 보호용 백신.
  7. 제3항 내지 제5항중 어느 한항에 따른 독소 또는 이 독소로부터의 단편을 암호화하는 DNA 서열을 발현할 수 있는 형질전환된 미생물을 함유하는 것을 특징으로 하는, 에스케리키아 콜리 감염에 대한 개체 보호용 백신.
  8. 한외여과, 원심분리 또는 분자 체(sieve) 크로마토그래피 또는 이들 모두를 사용하여 상충액의 저분자량 성분을 제거함으로써 균주 CH7의 독소에 대하여 생성된 항체와 반응성이 있는 에스케리키아 콜리의 세포-유리 분획이 정제되며, 여기서 독소 함유 분획은 상기 항체와의 반응성에 의해 선별되는 것을 특징으로 하는 제3항에 따른 독소의 정제 방법.
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