HU211827A9 - Escherichia coli vaccine - Google Patents
Escherichia coli vaccine Download PDFInfo
- Publication number
- HU211827A9 HU211827A9 HU95P/P00573P HU9500573P HU211827A9 HU 211827 A9 HU211827 A9 HU 211827A9 HU 9500573 P HU9500573 P HU 9500573P HU 211827 A9 HU211827 A9 HU 211827A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- toxin
- coli
- strains
- vaccine
- flagella
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 70
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 80
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 80
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 claims abstract description 27
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 21
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 28
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 25
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 16
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 9
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 claims description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 2
- 206010061126 Escherichia infection Diseases 0.000 claims 3
- 208000020612 escherichia coli infection Diseases 0.000 claims 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 abstract description 68
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 11
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 34
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 29
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 15
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 5
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 4
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 4
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 3
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 3
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 2
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 2
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 1,1,2-Trichlorotrifluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(Cl)Cl AJDIZQLSFPQPEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 3 Isobutyl 1 methylxanthine Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(CC(C)C)C2=C1N=CN2 APIXJSLKIYYUKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWZKAVBSQAVFI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-isothiocyanatophenyl)diazenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(N=C=S)C=C1 OSWZKAVBSQAVFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- -1 DABTH amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 101710205597 Flagellin 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000767160 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Intracellular protein transport protein USO1 Proteins 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N molecular hydrogen;sodium Chemical compound [Na].[H][H] XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;trioxotungsten Chemical compound O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.O=[W](=O)=O.OP(O)(O)=O IYDGMDWEHDFVQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 210000003456 pulmonary alveoli Anatomy 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- WXKPPMQZRGORPB-UHFFFAOYSA-M sodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O WXKPPMQZRGORPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012421 spiking Methods 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000008542 thermal sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002723 toxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0258—Escherichia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Description
A találmány Escherichia coli (E. coli) fertőzések ellen védő vakcinára és a vakcinában alkalmazott toxinra, valamint a toxin tisztítására szolgáló eljárásra vonatkozik.
Az E. coli igen elteijedt baktérium, amely a legtöbb állat emésztőrendszerében megtelepedik. A baktérium jelenléte általában komoly káros hatásoktól mentes - a legtöbb esetben a baktérium még részt is vesz a gazdaszervezet számára kedvező folyamatokban. Egyes esetekben azonban az E. coli komoly betegségeket okozhat, különösen fiatal állatokban. Ez madaraknál is előfordulhat, és a nagyüzemi baromfitenyésztésben az ilyen fertőzés járványossá válhat, ami a fiatal szárnyasok komoly legyengüléséhez és még nagymértékű pusztulásához is vezethet.
Természetesen vakcinálási programokkal megkísérelték a szárnyasok ilyen E. coli fertőzéseit kézbentartani. Eme a célra kifejlett csirkéket bakterinekkel inaktivált E. coli baktéri umoxkal - vakcináltak [Avian Diseases 29 (4), 1108-1117 (1985)]. A bakterin vakcinák hátránya, hogy komoly mellékreakciókkal járnak. Ezenkívül, a bakterin vakcinálás elsősorban lipopoliszacharidok elleni antitesteket eredményez, amelyek csak bizonyos 0 szerotípusú E. colira specifikusak, így a többi E. coli szerotípus ellen nem nyújtanak védelmet.
Az E. coli fertőzések elleni küzdelemben gyakran használnak ezekből a baktériumokból származó pilusokat tartalmazó vakcinákat is. Azonban ezek a vakcinák csak korlátozott védőhatást fejtenek ki, legfeljebb a vakcináit egyedek 80%-a válik védetté. Ezért az E. coli vakcinák gyakran egy másik virulencia faktort - inaktivált E. coli toxint - is tartalmaznak komponensként.
Az E. coli több típusa tartalmaz flagellumokat, amelyeknek a mozgásban van szerepük. Az E. coli flagellumokat nem tekintették virulencia faktornak, így ezeket eddig az E. coli vakcinák nem tartalmazták.
A találmány azon a felismerésen alapul, hogy az E. coli flagellumai kapcsolatban vannak a Verő sejtekkel szembeni erős toxikus aktivitással, amelyet eddig nem ismertek fel. és hogy ezek a flagelláris toxinok egy fontos virulencia faktort jelentenek.
A fenti felismerés alapján vakcinákat készítettünk, amelyek E. coli flagellumaiból származtak. Az tapasztaltuk, hogy mind a teljes E. coli flagellumok, mind az azokat alkotó részstruktúrák, például flagellinek vagy azok fragmentumai vagy aggregátumai használhatók a vakcináit egyedeket E. coli fertőzések ellen védő vakcina előállítására.
Nagyszámú, főleg csirkéből, de egyéb állatból és emberből is izolált E. coli törzzsel végzett kísérletek szerint a flagellumok kapcsolatban vannak a Verő sejtekkel szembeni toxicitással; ezt a toxikus aktivitást a flagellumok elleni antitestek semlegesítik. Azt is felismertük, hogy az összes vizsgált E. coli törzs flagellumainak toxieitása semlegesíthető a törzsek egyikének flagellumai ellen termelődött egyetlen antiszérummal.
Ezen megfigyelés alapján feltételeztük, hogy egyetlen E. coli törzsből kapott flagellumokka! végzett vakcinálás védelmet nyújt majd a flagellummal rendelkező összes E. coli törzzsel szemben.
A fenti megfontolásokat tekintve a találmány szerinti vakcina E. coli flagellumokból származó új toxinokon alapul, amelyek jellemzője, hogy protein jellegűek, flagellumokban és/vagy flagellumokkal kapcsolódva fordulnak elő, és móltömegük 30-100 kD, SDSPAGE mérés alapján, nem tartalmaznak kötött szénhidrát-maradékokat, Verő sejtekkel és naposcsibékkel szemben toxikusak, és ezt a toxicitást még 100 °C-on 1 órán át tartó melegítés után is megtartják.
A fenti jellemzők összessége megkülönbözteti ezeket az új toxinokat az E. coli ismert toxinjaitól.
A fenti új toxinok számos E. coli törzsben megtalálhatók, és ezeket flagelláris toxinoknak (FT) nevezzük a leírásban, mivel jellegzetes módon flagelláris szerkezetekben fordulnak elő. Ezek a flagellumok általában lényegesen nagyobbak, mint a normális fimbriák (amelyek rendszerint mintegy 7 nm átmérőjűek, és legfeljebb mintegy 1 pm hosszúságúak), vastagságuk még 25 nm, hosszúságuk még 7 pm is lehet.
A találmány szerinti toxinok egyik képviselőjét csirke E. coli CH7 törzsből izoláltuk (015:KI4:HI0), az 1. példában ismertetett eljárással. Ez a CH7-FT különféle formákban izolálható: vagy asszociálódva mint natív, H10 típusú flagellum, vagy mint szabad toxin, vagy a szabad toxinból kapott apró, tűszerű filamentumokkal reasszociálódva. A fenti CH7-FT jellemzi a fent említeti általános jellemzőkön kívül az, hogy van egy mintegy 47 kD móltömegű alegysége, SDSPAGE mérés szerint, izoelektromos pH-ja mintegy 4,8, és amino-terminálisának részleges aminosav-szekvenciája Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu(?)-Thr-Gln. (A CH7-FT jellemzését a 2. példában ismertetjük.)
A CH7-FT ellen termelődött antiszérum kísérletei szerint keresztreakciól ad minden vizsgált E. coli törzs FT-jával (3. példa). Ennek megfelelően, az ilyen CH7FT elleni antiszérumot használhatjuk az összes többi találmány szerinti FT jellemzésére. Ezenkívül, a monoklonálás antitestek vagy specifikusak voltak, vagy keresztreakciót adtak az összes többi vizsgált E. coli törzs FT-jével.
A találmány E. coli fertőzés ellen immunizáló aktivitású olyan vakcinákra is vonatkozik, amelyek hatóanyagát egy találmány szerinti inaktivált toxin képezi.
Az ilyen vakcinák célszerűen a fenti toxikus flagellumokat tartalmazzák, mivel ezek a flagellumok egyszerűen előállíthatók olyan módon, hogy az E. coli baktériumokat flagellum-képződést elősegítő körülmények között tenyésztjük, és a baktériumokból a flagellumokat vagy a sejtmentes felülúszót elválasztjuk. Az FT-t tovább tisztíthatjuk a felülúszó kismóltömegű komponenseinek eltávolításával, ultraszűrést és/vagy molekulaszűrő-kromatográfiás eljárást alkalmazva.
A fenti tisztítási eljárás során az FT-ben feldúsult frakciót CH7-FT ellen termelődött monoklonális antitestekkel való reaktivitása alapján ismerhetjük fel.
A találmány szerinti eljárással előállított vakcinák az FT egy fragmentumai is tartalmazhatják, amely az azzal vakcináit egyedeknek védelmet nyújt E. coli fertőzések ellen.
HU 211 827 A9
A találmány szerinti vakcinában használható FT kémiai szintézissel, E. coli sejttenyészetből tisztítással vagy rekombináns DNS eljárással állítható elő.
Az utóbbi esetben a fent említett proteint vagy annak fragmentumát kódoló nukleinsav-szekvenciákat például úgy ismerhetjük fel, hogy egy E. coli DNS génbankot a fenti szekvenciákat tartalmazó egyedi kiónokra szűrünk, például FT ellen termelődött monoklonális vagy poliklonális antitestekkel adott specifikus reakció felhasználásával. A nukleinsav-szekvenciákat különféle, expresszálásra alkalmas vektor DNS-szekvenciákkal kapcsolhatjuk, és az így kapott ún. rekombináns nukleinsav-molekulát egy megfelelő gazdaszervezet transzformálására használhatjuk. A fenti hibrid DNS-molekulák például plazmidokból, fágokból vagy vírusokban jelenlévő nukleinsavmolekulákból származhatnak. A gazdasejt prokariota eredetű, például baktériumsejt, vagy eukarióta eredetű, például emlős sejt lehet. A transzformált gazdasejteket az FT termelésére használhatjuk, majd a proteint izolálhatjuk és ezt követően beépíthetjük a találmány szerinti eljárással előállított vakcinába.
Másik megvalósítási mód szerint élő vektor vakcinát állíthatunk elő, amelyek nempatogén mikroorganizmusokat, például az FT-t kódoló gént tartalmazó vírusokat vagy baktériumokat tartalmaznak.
Atalálmány szerinti vakcinák az FT-n kívül vizes közeget vagy víztartalmú szuszpenziót és/vagy egyéb komponenseket is tartalmazhatnak, például az aktivitás és/vagy a tárolhatóság növelésére. Ezek a komponensek például sók, az FT toxikus aktivitását az immunológiai tulajdonságok megmaradása mellett inaktiváló anyagok (például formaim), pH-pufferek, emulgeátorok és az immunválaszt fokozó adjuvánsok (így ásványolajok, muramil-dipeptid, alumínium-hidroxid, szaponin, polianionok és amfipatikus anyagok) lehetnek.
A vakcina melegvérű állatok (köztűk az ember) E. coli fertőzések elleni immunizálására, különösen madarak E. coli fertőzéseinek leküzdésére használható.
E célra a vakcina előnyösen parenterálisan, például szubkután módon vagy intramuszkulárisan adagolható. A fenti módon a vakcinát mind a vakcináit szárnyasok aktív immunizálására, mind a tojóknak, az utódok passzív immunizálására adhatjuk. Az immunizált tojókban a bennük termelődött antitestek természetesen tojásaik sárgájába, és ennek következtében a kikelt csirkébe is bejutnak.
Mind a vakcina összetétele, mind a vakcinálási rendszer változtatható a védendő állat fajtájától, az állat korától és testtömegétől, a védelem kívánt időtartamától, az adagolás módjától és attól függően, hogy aktív vagy az anyai antitestek segítségével passzív immunizálást kívánunk elérni. A vakcinában a hatóanyag optimális hatékony mennyisége közelítőleg 10-100 gg dózisonként, szárnyasok parenterális vakcinálására. A vakcinát egyéb megfelelő vakcinákkal is kombinálhatjuk.
1. példa
E. coli CH7 törzs flagelláris toxinának izolálása
A. Flagelláris toxin előállítása
E. coli CH7 törzset (O15:K14:H10) egy éjszakán keresztül Biostat E fermentorban (Braun) tenyésztünk, 12 1 Trypticase-szója tápközegben (Β. B. L.), 14%-ra beállított pO2 mellett, 100-500 fordulat/perc keveréssel. A tenyészetet Pellicon szűrőrendszerben (Millipore) HVLP szűrővel mintegy 1 literre koncentráljuk. A baktériumokat 10 000 fordulat/perccel 30 percen keresztül centrifugáljuk (GSA rotor, Sorvall), a felülúszót 0,45 pm-es szűrőn keresztülszűrjük, és a HVLP-szűrlethez adjuk.
A szűrletet mintegy 1 literre koncentráljuk és háromszor mossuk 1-1 liter 0,2 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferrel, PTTK szűrő alkalmazásával.
A PTTK-val kapott koncentrátumot ismételten, mintegy 110-160 ml-es részletekben eluáljuk 10 cm magas és 154 cm2 felületű oszlopon (Amicon model Pl 40x250), töltetként 0,1% NaN3 konzerválószert tartalmazó, 50 mmól/1 koncentrációjú foszfát-pufferrel (pH 7,2) (PB) ekvilibrált Sepharose 4B-C1-1 (Pharmacia, Uppsala, Svédország) használva. Az oszlopot PBvel addig eluáljuk, míg a regisztrálószerkezet alapvonala ismét 0 lesz.
A nagy móltömegű molekulákat tartalmazó, első csúcshoz tartozó frakciókat egyesítjük, és YM-100 ultraszűrőn (062 mm Amicon, Amicon UF model 202 berendezéssel) koncentráljuk, 2-3 mg/ml protein-koncentráció eléréséig. A koncentrátumot kétszer 5 liter 20 mmól/1 koncentrációjú, 0.1% NaN3 konzerválószert tartalmazó Tris-HCl-pufferrel (pH 7,5) szemben dializáljuk.
B. Szabad toxin előállítása
A koncentrátumot preparatív elektroforézisnek vetjük alá, Laemmli módszere szerint (Natúré 227, 680684 (1970)]. 20 ml glicerinből, 20 ml 0,5 mól/1 koncentrációjú Tris-HCl-pufferből (pH 6,8), 20 ml 10%-os SDS-ből, 5 ml 2-merkapto-etanolból (ME) és 2 ml 0,05%-os brómfenolkékből álló mintapufferrel 1:1,67 arányban hígítjuk.
Ezután mintegy 5 percen keresztül vízben forraljuk, lehűtjük és 12% (akril-amid:bis = 30:0,8) preparatív poli(akril-amid) géllemezen (16x0,6 cm) elektroforetizáljuk. A minták gélenként rendszerint 15-23 mg proteint tartalmaznak (7,5 ml koncentrátum és 5,0 ml minta puffer). Az elektroforézist Protean cell model 1423 (Bio-Rad, Richmond, USA) vagy model SE60O (Hoefer, San Francisco, USA) készülékben végezzük. A front gélből való eluálódása után az elektroforézist még 1 órán keresztül folytatjuk 200 V-tal. A gélt ezután közelítőleg 1,5-2 mm-es szeletekre vágjuk.
A proteineket 0,1% NaN3-ot tartalmazó 10 ml 0,89%-os nátrium-klorid-oldattal szobahőmérsékleten 3 órán keresztül, majd 4 °C-on egy éjszakán át, állandó keverés mellett eluáljuk. A szeleteket eltávolítjuk, és az oldatokat 0,45 pm-es szűrőn keresztülszűrjük. A tiszta toxin-alegységeket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és -20 °C-on tároljuk.
A minták protein-tartalmát módosított Folin-Ciocalteu módszerrel mérjük [J. Bioi. Chem. 73, 627, (1927)], a poliszacharidokat fenol-kénsav módszerrel határozzuk meg, Dubois módszere szerint [Anal. Chem. 25,350-356(1956)].
HU 211 827 A9
2. példa
E. coli CH7 törzs toxinjának jellemzése
A. Halálozási arány 1 napos csirkék esetén
Első kísérletben a különböző E. coli toxin-készítményekből 0,2 és 0,5 ml-t injektáltunk i.p. 1 napos SPF broiler csirkékbe (GVP, Doorn). Második kísérletben 0,5 ml toxin-készítményeket injektáltunk i.v. 3 hetes broiler csirkékbe. A pusztulást az injektálást követő 7 napon keresztül feljegyeztük.
Eredmények
Az 1. táblázatból látható, hogy mindkét csirke E. coli CH2 és CH7 törzsből származó toxin-készítmény halálos 1 napos csirkékre, i.p. injekciót követően. A CH7 törzs esetén mind a felülúszó, mind a lizátum toxikus, míg a CH2 törzs esetén különösen a lizátum bizonyult toxikusnak.
7. táblázat
Halálozási arány E. coli törzsek felülúszójának és lizátumának i.p. injektálását követően I napos csirkékbe
| Injektált készítmény* | Dózis (ml) | Elpusztult csirke/összes beoltott csirke | ||
| l. napon | 4. napon | 7. napon | ||
| steril TSB | 0,5 | 1/10 | ||
| ZF24 fel ül úszó | 0,2 | 1/10 | ||
| fel ül úszó | 0,5 | 1/10 | ||
| lizátum | 0.2 | 1/10 | ||
| lizálum | 0,5 | 1/10 | ||
| CH2 felülúszó | 0.2 | 1/10 | 1/10 | |
| felülúszó | 0,5 | 1/10 | 1/10 | |
| lizátum | 0.2 | 9/10 | 9/10 | 9/10 |
| lizátum | 0.5 | 6/10 | 7/10 | 8/10 |
| CH7 felülúszó | 0,2 | 2/10 | 4/10 | 5/10 |
| felülúszó | 0,5 | 4/10 | 5/10 | 5/10 |
| lizátum | 0,2 | 4/10 | 4/10 | 4/10 |
| lizátum | 0,5 | 7/10 | 7/10 | 7/10 |
* a CH2 és CH7 törzsek csirkéből izolált E. coli törzsek a ZF24 törzs emberi ürülékből izolált, nem virulens E coli törzs
Ugyanezen készítményeket i.v. injektálva 3 hetes csirkékbe, semmiféle hatás nem észlelhető (adatokat nem közöltük).
B. Vero-teszt
A Verő sejteket 37 °C-on. 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában tenyésztettük 6-os tápközegben (összetétele: literenként 85 ml MÉM Eagle tápközeg, 100 ml triptóz-foszfát tápközeg, 50 ml 4,4%-os nátrium-hidrogén-karbonát). amelyet 5% magzati borjúszérummal (FCS), 200 egység/ml penicillinnel és 200 pg/ml sztreptomicinnel egészítettünk ki, és sterilre szűrés után 2 pg/ml fungizont adtunk hozzá. Tripszinezés után a sejteket 96-lyukú laposfenekű polisztirol tenyésztőlemezre (Greiner) oltottuk, 2xl05 sejt/ml komplett 6-os tápközegből 200 pl-t mértünk minden egyes lyukba. Egy éjszakán keresztül tartó inkubálás után kialakult az egysejtréteg. A tápközeget eltávolítottuk, és lyukanként 200 pl FCS nélküli, 10 pg/ml xantinnal (3-izobutil-l-metil-xantin, Sigma) kiegészített 6os tápközeggel helyettesítettük. Ezt követően a toxinkészítmények sorozathígításos oldataiból lyukanként 20 pl-t mértünk a lemez lyukaiba. 5 napos inkubálás után leolvastuk a citopatológiás hatást (CPE).
A toxin-termelő törzsek szűrővizsgálatára először hígítatlan és 1:2 hígítású felülúszókból mértünk be 20 pl-t lyukanként. Ezt kővetően azokat a törzseket, amelyek felülúszói a Vero-tesztben negatívnak mutatkoztak, intracelluláris toxin-termelés szempontjából vizsgáltuk úgy, hogy hígítatlan és 1:2 arányban hígított baktérium-lizátumokból mértünk be 50 μΙ-t lyukanként.
Eredmények
Elsőként a 2. táblázatban felsorolt törzseket vizsgáltuk toxin-termelés szempontjából. Bizonyos törzsek a felülúszóba ürítették a toxint, míg más törzsekben a toxin intracelluláris volt, és/vagy csak a sejtek ultrahangos feltárása után lehetett kimutatni. A citopatológiás hatás a Verő sejtek kigömbölyödésében és zsugorodásában nyilvánult meg, míg az egysejtréteg érintetlen maradt az esetek többségében.
2. táblázat
Különféle E. coli törzsek toxicitása Verő sejteken
| Törzs* | Szerotípus | Toxin titere ** | |
| felülúszóban | lizálumban | ||
| JA221 | - | - | - |
| ZF24 | 023:K?:H- | - | - |
| CH1 | O78:K8O | - | - |
| CH2 | 078:K80:H4 | - | 8 |
| CH3 | 045:K-:H9 | 32 | 64 |
| CH4 | O2:K1:H- | - | 8 |
| CH5 | 02:Kl:H5 | 32 | 512 |
| CH6 | O1:K1:H- | - | 4 |
| CH7 | 015:K14:H10 | 128 | 1024 |
| CH8 | 0115:K? | - | 16 |
| CH13 | O35:K- | 32 |
* a JA221 egy E. coli K12 törzs: a ZF24-et lásd I táblázatban: a CH törzseket csirkéből izoláltuk a toxin litere definíció szerint a még toxikus hatást mulató legutolsó hígítás reciproka
C. Toxin stabilitása
A kimutatott toxin előzetes jellemzésére a toxin-készítmények különböző kezelésekkel szembeni érzékenységét vizsgáltuk. A pH-érzékenységet úgy vizsgáltuk, hogy a toxin pH-ját 3-10 értékre állítottuk, majd
HU 211 827 A9 szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül inkubáltuk, semlegesítettük, és meghatároztuk a toxicitást.
A toxin-készítmények hőérzékenységének vizsgálatára a toxin-készítményeket különböző hőmérsékleteken melegítettük. Az SDS és ME hatásának vizsgálatára a toxint 1% SDS és 1% SDS+2,5% ME jelenlétében melegítettük, majd sóoldattal szemben dializáltuk. A karbamiddal szembeni stabilitás vizsgálatára a toxinkészítményekhez 6 mól/1 koncentrációban karbamidot adtunk, majd 1 óra elteltével sóoldattal szemben dializáltuk.
A formaiinnal szembeni érzékenységet különböző koncentrációkban formaiin hozzáadásával vizsgáltuk, majd egy éjszakán keresztül különböző hőmérsékleten inkubáltuk, és a Verő sejtekkel szembeni loxicitási vizsgálat előtt dializáltuk. Atripszinnel szembeni érzékenység vizsgálatára a toxicitás vizsgálata előtt IOOgg/ml tripszint (marha pankreász, Millipore) adtunk hozzá, 37 ’C-on 4 órán keresztül inkubáltuk, hozzáadtunk 150 pg/ml tripszin-inhibitort (szójabab, Sigma) és 37 ‘C-on 30 percen keresztül inkubáltuk.
Eredmények
Mivel a pontos csirke-toxin titer-meghatározások Verő sejtek elleni toxicitási vizsgálattal nem jól reprodukálhatók a Verő sejtek különböző napokon mutatott állapotában bekövetkező változások miatt, az alábbi eredmények csak tájékoztató jellegűek.
A CHS és CH7 törzsek felülúszójának pH 3 és pH 10 közötti kezelése nem befolyásolta a toxicitást, a toxin titerek változatlanul 32-64. illetve 128-256 voltak.
A hőérzékenységet és az SDS. illetve SDS+ME kezeléssel szembeni érzékenységet a 3. táblázatban ismertetjük.
3. táblázat
Hőkezelés hatása csirke E. coli toxin titerekre SDS vagy SDS+ME távollétében, illetve jelenlétében
| Kezelés | CH2 lizá- tum | CH5 felülúszó | CH7 felülúszó |
| kontroll | 8 | 32 | 128 |
| 80’C(l óra) | 4 | 8 | 64 |
| 100 C (1 óra) | 4 | 8 | 16 |
| 120 ’C (20 perc) | 0 | 0 | 0 |
| 65 ’C (10 perc) | 16 | 64 | |
| SDS, 65 “C (10 perc) | 32 | 64 | |
| SDS+ME, 65 ’C (10 perc) | 32 | 64 | |
| 100 ’C (10 perc) | 8 | 64 | |
| SDS, 100 ’C (10 perc) | 32 | 128 | |
| SDS+ME, 100 ’C (10 perc) | 16 | 128 |
Noha a CH2 lizátumának és a CHS és CH7 felülúszóinak toxicitása némileg csökkent magasabb hőmérsékleten, hosszabb időn át tartó kezelés hatására, és teljesen megszűnt 120 ’C-on melegítve, a toxint viszonylag hőstabilnak kell tekinteni. 10 perces melegítés SDS, sőt még SDS+ME jelenlétében sem befolyásolta a CH5 és CH7 felülúszók toxicitását.
A CH2 lizátumának és a CH5 és CH7 felülúszóinak 6 mól/1 karbamiddal való kezelése egyáltalán nem változtatta meg a megfelelő Vero-teszt (VT) titereket.
A 4. táblázat adatai szerint a CH7 felülúszó toxicitását a fozmalin szobahőmérsékleten és 37 ’C-on teljesen inaktiválta.
Mind a CH5, mind a CH7 felülúszóinak toxicitása teljesen megszűnt tripszines kezelés után, míg az ál-kezelés, és tripszin-inhibitorral végzett kezelés maga nem befolyásolta a toxicitást.
4. táblázat
CH7 felülúszó toxicitásának inaktiválása különböző formalin-koncentrációk mellett egy éjszakán keresztüli inkubálással
| Formaim koncenlráció (%) | Toxin titer inkubálás után | |
| szobahőmérsékle- ten | 37 ’C-on | |
| 0 | 64 | 64 |
| 0,2 | 32 | 16 |
| 0,5 | 16 | 4 |
| 1,0 | 8 | 2 |
| 2.0 | 1 | 0 |
D. Móltömeg meghatározása
A CH7 törzs toxinjának móltömegét analitikai gélelektroforézissel határoztuk meg, 12%-os gélben (akril-amid:bis = 30:0,8), Laemmli módszere szerint, standard mintákkal összehasonlítva.
A géleket coomassie-brilliant blue (CBB) festékkel festettük meg. A kiértékelést CS-930 gélscannerrel és DR-2 regisztrálóval (Shimadzu, Kyoto, Japán) végeztük.
Az 1. ábrán látható az ismert móltömegű markereket tartalmazó, CBB-vel festett gél futtatása utáni kiértékelés. Az 1-6. csúcsoknak megfelelő standardok móltömege 78 000, 66 000, 45 000, 30 000, 17 200 és 12 300 D (LKB 1860-12 Bromma, Svédország).
A 2. és 3. ábrán látható az 1. példa A, illetve B lépésében kapott termék kiértékelése.
Az E. coli CH7 törzs toxin-alegysége e kísérletek szerint mintegy 47 000 D móltömegű.
E. Izoelektromos pont meghatározása
A toxin izoelektromos pontját úgy határoztuk meg, hogy az 1. példa A lépése szerint előállított E. coli CH7 törzs toxinjának 3 ml-ét 0,5 ml Servalytes pH 3-7 (analitikai tisztaságú, Serva, Heidelberg, NSZK) és 46,5 ml desztillált víz elegyével együtt 12 W teljesítménnyel 5 órán keresztül fókuszáltuk (Rotofor, BioRad, Richmond, USA). Atoxin-tartalmat analitikai gélelektroforézissel detektáltuk.
Az eredményeket az 5. táblázatban foglaljuk össze.
Az eredményekből látható, hogy az E. coli CH7 toxinjának izoelektromos pontja mintegy 4,8.
I
HU 21) 827 A9
5. táblázat ml Seph 4B-CI minta fokuszálásával kapott pH és toxin értékek
| Frakciőszám | pH | Toxin* |
| 1. | 2,68 | + |
| 2. | 3,26 | + |
| 3. | 3,50 | - |
| 4. | 3,73 | - |
| 5. | 4,18 | - |
| 6. | 4,38 | + |
| 7. | 4,55 | ++ |
| 8. | 4,80 | ++++ |
| 9. | 5,09 | +4- |
| 10. | 5,32 | + |
| 11. | 5,50 | - |
| 12. | 5,82 | - |
| 13. | 6,23 | - |
| 14. | 6,57 | - |
| 15. | 6,85 | - |
| 16. | 7,14 | - |
| 17 | 7,47 | - |
| 18. | 7.97 | - |
| 19. | 8,41 | - |
| 20. | 8.75 |
’ nincs látható toxin ± éppen látható + látható —t·. +++. ++++ növekvő mennyiségű toxin
F. Szacharid-tartalom
Az E. coli CH7 törzsből az 1. példa B lépése szerint előállított toxin sem poliszacharidot, sem egyéb más cukrot nem tartalmazott, Dubois és munkatársai szerinti fenol-kénsav meghatározás szerint [Analytical Chemistry 28. 350-356 (1956)]. Ltmulus Amoebocyta lizátum teszttel (Pyrotell. MA. USA) nem mulattunk ki jelentős mértékű LPS (endotoxin) aktivitást.
G. Aminosav-analízis
Az N-terminális aminosav-szekvenciát folyadékfázisú DABITC eljárással határoztuk meg, Chang (Methods Enzymology 91, 455^466 (1983)] szerint.
A DABTH-aminosavakat vékonyréteg-kromatográfiás eljárással azonosítottuk. Az aminosav-összetételt PTC eljárással határoztuk meg, Janssen és munkatársai [Chromatographia 22. 345-358 (1986)) módszere szerint, feltételezve, hogy a 47 k D móltömegű CH7-FT alegység összesen 446 aminosavnak fel meg.
Eredmények
Az I. példa A lépésében és B lépésében kapott E. coli CH7 toxin N-terminális aminosav-szekvenciája az alábbi: Ala-Gln-Vla-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-SerLeu-(?)-Thr-Gln.
Ez a szekvencia azonos az E. coli K-12 flagellin N-terminális aminosav-szekvenciájával, amelyet Kuwajima és munkatársai ismertettek [Journal of Bacteriology 168, 1479-1483 (1986)].
A toxin aminosav-összetételét a 6. táblázatban ismertetjük, ez is nagymértékű homológiát mutat az E. coli K-12 flagellinnel.
6. táblázat
E. coli CH7-ETaminosav-összetétele és összehasonlítása az E. coli K-12 flagellin aminosav-összetételével
| Aminosav | Aminosavak száma (%-a) alegységenként | |
| CH7-FT11 | E. coli K-12 flagellin2) | |
| Alá | 50(11,2) | 59(11,9) |
| Arg | 12(2,7) | 11 (2,2) |
| Asn Ί Asp J | 52(11,7) | 48 1(17,5) 39 f |
| Cys | 4 (0,9) | 0(0) |
| Gin 1 Glu J | 43 (9,6) | S}“ |
| Gly | 37 (8.3) | 44(8,9) |
| His | 0(0) | 0(0) |
| Ile | 24 (5.4) | 28 (5,6) |
| Leu | 32 (7,2) | 37 (7.4) |
| Lys | 28 (6.3) | 25 (5.0) |
| Met | 2 (0.4) | 3 (0,6) |
| Phe | 9 (2,0) | 5(1,0) |
| Pro | 8(1,7) | 6(1.2) |
| Ser | 58 (13.0) | 43 (8,7) |
| Thr | 48 (10.8) | 65 (13,1) |
| Trp | 0(0) | 0(0) |
| Tyr | 11 (2.5) | 10(2,0) |
| Val | 28(6,3) | 33 (6,6) |
| Összesen | 446 | 497 |
1. PTC eljárássá! meghatározva (Chromatographia 22. 345 (1986)1
2. DNS-szekvencia alapján számolva [Journal of Bacteriology J68. 1479-14X3 (1986)]
3. példa
Csirke E. coli törzsek szűrővizsgálata FT expreszszió szempontjából és az FT szerológiai jellemzése A világ különböző tájairól összegyűjtött, összesen
124, csirkéből izolált E. coli törzset vizsgáltunk toxicitásuk, mozgékonyságuk és a baktérium felületén az FT antigén kifejeződése szempontjából. Az FT kimutatására és a keresztreakciók vizsgálatára poliklonális és monoklonális antitesteket használtunk.
HU 211 827 A9
Módszerek
Toxicitás vizsgálata és toxin semlegesítése
A törzsek toxicitását Verő sejteken vizsgáltuk, a 2. példa B lépésében leírtak szerint. Semlegesítés céljából a toxin-készítményeket az antiszérum-hígításokkal 2 órán keresztül 37 *C-on inkubáltuk a toxicitási vizsgálatot megelőzően.
Mozgékonyság vizsgálata
A törzsek mozgékonyságát alacsony (0,25%) agarkoncentrációjú tápközeget tartalmazó U-alakú csövekben vizsgáltuk. Az U-csöveket egyik végükön beoltottuk egy E. coli törzzsel, és a csöveket egy éjszakán keresztül 37 “C-on inkubálva regisztráltuk a baktérium vándorlását a cső másik vége felé.
Antiszérum-termelés
Az E. coli CH7 törzs 1. példa A lépése szerint előállított FT-ja ellen nyulakban és csirkékben termelődött antiszérum. Az 1. példa B lépése szerint előállított CH5 és CH7 toxinokat használtuk monoklonális antitestek (MoAb) termelésére. MoAb termelés céljából az immunizált egérből származó lépsejteket myelomasejtekkel fuzionáltuk, és a kapott hibridomákat ELISA módszerrel szűrtük anti-toxin antitest szekrécióra. A pozitív hibridomákat határhígításos módszerrel klónoztuk. A klónozott hibridomákat intraperitoneálisan egerekbe injektálva állítottuk elő az aszcitesz-folyadékot. Az aszciteszi 56 C-on 10 percen keresztül kezelve inaktiváltuk, a lipideket 1,1,2-triklór-trifluor-etánnal (Merck) extraháltuk, és az MoAb-ket 50%-os telített ammónium-szulfát-oldattal kicsaptuk.
FT antigén expressziója E. coli törzsekben
A CH7 tdrzs (015:K14:H10) FT-ja ellen termelődött nyúl antiszérumot szobahőmérsékleten 24 órán keresztül abszorbeáltuk a nem-toxigén E. coli RDEC-1 törzzsel (015:K14). Az így abszorbeált antiszérumot használtuk az FT-t kifejező törzsek kiszűrésére, az alábbiak szerint teljes baktériumokban kivitelezett ELISA módszerrel.
A baktériumokat keverés nélkül, 6 órán keresztül TSB-ben tenyésztettük, majd 15 percen keresztül 3000 fordulat/perccel centrifugáltuk (Sorvall RT6000) és CBB-pufferben (1,59 g/1 nátrium-karbonát, 2,93 g/1 nátrium-hidrogén-karbonát, 0,2 g/1 nátrium-azid, pH 9,6) újra szuszpendáltuk, 660 nm-en 0,140-0,180 O. D.-nek megfelelő koncentrációban. Az így kapott baktérium-szuszpenziókból lyukanként 100 μΙ-t mértünk laposfenekű polisztirol mikrotitráló lemezekbe (Greiner), és 50 “C-on egy éjszakán keresztül száradni hagytuk. A lemezeket csapvízzel mostuk és szobahőmérsékleten I órán keresztül lyukanként ΙΙΟμΙ PBS-T-N-nel (0,04 mól/1 PBS, pH 7,2, 0,5% Tween 80, 15% újszülött borjú szérum) blokkoltuk. Ezután hozzáadtunk lyukanként 100 μΐ-ι az abszorbeált szérum sorozathígításaiból. a kiindulási hígítás 1:100 volt, a hígítást PBST-N-nel végeztük. Háttér-kontrollként törzsenként két lyukba csak PBS-T-N-t mértünk. A lemezeket 37 “Con 1 órán keresztül inkubáltuk, mostuk, majd minden lyukba 100 g peroxidázzal konjugált kecske-anti-nyúl IgG(H+L)-t adtunk, PBS-T-N-nel megfelelően hígítva. A lemezeket 37 ’C-on 30 percen keresztül inkubáltuk, majd ismét mostuk. Az antitest-megkötést kolorimetriásan detektáltuk, lyukanként 100 μΐ, karbamidperoxidot (Organon Teknika, Oss, Hollandia) és nátrium-acetát-citromsav-pufferben (pH 5,5) 3,3',5,5'-tetrametil-benzidint tartalmazó TMB-puffer hozzáadásával. A reakciót sötétben 10 percen keresztül hagytuk lejátszódni, majd 50 μΐ 4 n kénsav hozzáadásával leállítottuk, és Microelisa leolvasó készülékkel 450 nm-en elvégeztük a mérést. A titert azzal a legnagyobb antiszérum hígítással definiáltuk, amelynek A450 értéke a háttér A45o értékének legalább kétszerese volt.
Minden egyes vizsgálatban a CH7 és RDEC-1 törzseket pozitív, illetve negatív kontrollként alkalmaztuk.
Western blotting módszer
Az immunnoblotting vagy Western blotting eljárást Muilerman és munkatársai módszere szerint végeztük [Anal. Biochem. 720, 46-51 (1982)]. A törzsekből nyers FT-preparátumokat készítettünk úgy, hogy a baktériumokat Trypticase-szója tápközegen tenyésztettük 6 órán keresztül, keverés közben. A baktériumokat erőteljes keverés után centrifugálással eltávolítottuk, és a felülúszót körülbelül 40-szeresre koncentráltuk etanolos kicsapással (1 rész felülúszóhoz 2 rész 96%-os etanolt adtunk, egy éjszakán keresztül 4 “C-on inkubáltuk, centrifugáltuk és a csapadékot 0,04 mól/1 koncentrációjú PBS-ben (pH 7,2) oldottuk. Az így kapott nyers FT-preparátumot SDS-PAGE lemezen futtattuk és cellulóz-nitrát membránszűrőre átvittük (blotting). Az antigéneket úgy tettük láthatóvá, hogy egymást követően inkubáltuk az antitesttel, a megfelelő, peroxidázzal konjugált antispecies IgG(H+L)-lel és karbamid-peroxiddal együtt 3,3'-diamino-benzidin -4HCl-dal.
immuno-arany-elektronmikroszkópia (IG-EM)
Az IG-EM-et lényegében Alphen és munkatársai módszere szerint végeztük [Infect. Immun. 56, 18001806 (1988)]. Röviden, a Trypticase-szója tápközegben tenyésztett baktériumokat 1% BSA-t és 0,05% Tween 20-at tartalmazó PBS-sel (PBS-B-T) készült antitest-hígításokkal inkubáltuk, PBS-sel háromszor mostuk és PBS-B-T-ben arany gömbökkel jelzett protein A-val inkubáltuk. A baktériumokat PBS-sel még háromszor mostuk, majd Formvar-bevonatú rácsra vittük át és 1%-os uranil-acetáttal vagy foszfo-volfrámsavval negatívan megfestettük.
Eredmények
A világ különböző részeiről származó, 124, csirkéből izolált E. coli törzsből 73 törzs (59%) választott ki mérhető mennyiségű, Verő sejtekre ható toxint. További 37 törzs (30%) toxikusnak bizonyult Verő sejtekre a baktériumok lízise után. Teljes baktériummal végzett ELISA módszerrel 52 törzs (42%) reagált CH7-FT ellen termelt antiszérummal. Az ELISA szerint pozitív összes törzs extracelluláris Verő toxint is termelt (7. táblázat).
HU 211 827 A9
7. táblázat
Összefüggés a Verő sejtekkel szembeni toxicitás és a CH7-FT ellen termelődött antiszérummal való reaktivitás közölt (törzsek száma)
| Verő sejtek elleni toxicitás21 | |||
| + | |||
| reaktivitás | + | 52 | 0 |
| anti-CH7-FT- vel11 | - | 21 | 51 |
1. CH7-FT antiszérummal adott reakció teljes baktériummal végzett ELISA módszerrel
2. Bakténumtenyészet felülúszójának toxicitása Vera sejtekre
Szoros összefüggést találtunk a törzsek Verő toxin ürítése és mozgékonysága között is (8. táblázat).
8. táblázat
Összefüggés a Verő sejtekkel szembeni toxicitás és a mozgékonyság között (törzsek száma)
| | i i | Verő sejtek elleni toxicitás21 | ||
| + | - | ||
| j Mozgékony- | + | 69 | 10 |
| ! ság11 | - | 4 | 41 |
I. Mozgékonyság U-csÓben
Bakténumtenyészet felülúszójának toxicitása Verő sejtekre
A fenti eredmények további bizonyítékot adtak arra vonatkozóan, hogy a Verő sejtekkel szembeni toxicitást a flagellumok hordozzák. Azt is kimutattuk, hogy a Verő sejtekkel szembeni toxicitás növekedik a baktériumok U-csövön való áthaladása után. Ezenkívül ezek az eredmények azt mutatják, hogy a különböző törzsek toxinjai szerológiailag keresztreakciót adnak.
A különböző törzsek toxinjai közötti keresztreakciói közelebbről is megvizsgáltuk. A 9. táblázatból látható. hogy a CH7 törzs FT-ja ellen termelődött nyúl és csirke antiszérum az összes többi toxikus vizsgált törzs Verő sejtekkel szembeni toxicitását semlegesítette. A CH5 és CH7 törzs FT-ja ellen termelődött MoAb-ok egyáltalán nem semlegesítették a toxicitást.
9. táblázat
Verő toxicitás semlegesítése tenyészet felülúszójában a CH7-FT ellen termelődött antiszérumokkal
| Törzs | Szerotípus | Verő toxin titer11 | ||
| Kont- roll21 | KO75773 '(1:10) | BB1- 24|) (1:10) | ||
| CH3 | 045:K-:H9 | 8 | - | - |
| CH5 | 02:Kl:H5 | 16 | - | - |
| CH7 | 015:K14:H10 | 32 | - | - |
| CH125 | 01:KI:H7 | 32 | 4 | |
| CH135 | O2:K1:H4 | 64 | 4 | Ξ |
1. lásd 2. táblázatot
2. ál-kezelt, vagy pre-immunszérummal kezelt felülúszó 3 nyúl anti-CH7-FT antiszérum, 1:10 hígítás
4. csirke anti-CH7-FT antiszérum, 1:10 hígítás
A különböző törzsekből preparált nyers FT-k különböző antiszérumokkal végzett Western blotting analízisének eredményeit a 10. táblázat tartalmazza.
10. táblázat
Különböző törzsekből nyert nyers FT-preparátumok antiszérumokkal végzett Western blotting analízise és összehasonlítása a megfelelőflagellin-móltömegekkel
| Törzs | Szerotípus | Antitestek11 | Fla- gel- lin mól- tö- meg | ||||
| KO 7577 | BB 1-2 | aHIO | Int 1-7 | Int 12- 13 | |||
| CH3 | O45:K-: H9 | 7O21 | 70 | 70 | - | 70 | 6931 |
| CHS | 02:Kl:H5 | 43 | 43 | 43 | - | 43 | 4631 |
| CH7 | 015-.K14: H10 | 47 | 47 | 47 | 47 | 47 | 45- 474> |
| CHJ 25 | OI:K1:H7 | 60 | 60 | 60 | - | 60 | 61031 |
| CHI35 | 02:Kl:H4 | 35 | 35 | 35 | - | 35 | 3731 |
1) KO7577: CH7-FT ellen termelődött nyúl antiszérum
BB1-2: CH7-FT ellen termelődön csirke antiszérum aHIO: agglutináló antiszérum H10 flagellumok tipizálására, gyártja a RIVM (Bilthoven, Hollandia)
Ini 17 CH7-FT ellen termelődött MoAb Int 12-13: CH5-FT ellen termelődött MoAb
2) Az adatok a bioiban lévő egyetlen sáv vagy fő sávok közelítő látszólagos mól tömegét jelentik. kD-ban
3) A. M. Laun [J. Gén. Microbiol. 101. 112-130 (1977)]
4) Sajál meghatározásunk HI0 flagellumos referenciatörzsekkel
A CH7-FT ellen termelődött nyúl és csirke antiszérum (KO7577 és BB1-2) az összes többi vizsgált FT-preparátummal reagált, annak ellenére, hogy a sávok móltömeg-értékei az egyes törzseknél különbözőek. Azonos eredményeket kaptunk akkor is, ha anti-HIO-flagellumokat agglutináló antiszérumot használtunk. A CH5-FT ellen termelődött MoAb Int 1213 is hasonló mintát mutatott Western blotting analízissel. A CH7-FT ellen termelődött MoAb Int 1-7 azonban csak a CH7-FT 47 kD-os sávjával lépett reakcióba. Meglepő módon a különböző törzsek H típusainak megfelelő flagellin-móltömegek majdnem azonosak a megfelelő FT-k látszólagos móltömegével. Számos, az RIVM-lől (Bilthoven) kapott, H10 típusú flagellumot tartalmazó törzs poliklonális antiszérumokkal végzett Western blotting analízissel vagy 45 kD-nál, vagy 47 kD-nál mutatott sávokat. Az MoAb Inti-7 a H10 flagellumos törzseknek csak a 47 kD-os sávjával reagált. A sávok intenzitása a Western blotting analízisben megnövekedett, ha a törzseket a nyers FT preparálása előtt átvezettük egy U-csövön.
Az IG-EM vizsgálat során a CH5 és CH7 baktériumok flagellum-szerű szálait aranygömbökkel jeleztük, CH7-FT ellen termelődött poliklonális antiszéru1
HU 211 827 A9 mókát használva. A CH7-FT ellen termelődött MoAb Int 1 -7-tel csak a CH7-en lévő flagellum-szerű szálakat lehetett arany gömbökkel jelezni, a CH5 baktériumét nem. Az 1. példa B lépése szerint preparatív SDS-PAGE alkalmazásával elállított CH5-FT preparátummal szemben termelődött MoAb Intl2-13-mal a flagellumszerű szálak nem jelölődtek jelentős mértékben; csak néhány aranygömböt észleltünk a CHS és CH7 baktériumok felületén. Valójában az MoAb Intl2—13 csak a disszociált FT-nal reagált (Western Blotting, ELISA), az érintetlen FT-nal nem (IG-EM, ELISA).
Az összes fenti eredmény azt mutatja, hogy a Verő sejtekkel szembeni toxikus aktivitás a flagellumokban lokalizálódik, illetve az FT azonos a flagellummal. Kimutattuk továbbá, hogy a különböző törzsek FT-jai szerológiailag erősen keresztreaktívak, és kereszt-semlegesítők.
4. példa
Broilerek védése passzív immunizálással
Az 1. példa A lépésében leírtak szerint előállított CH7-FT-nal csirkéket vakcináivá CH7-FT elleni antiszérumol termeltünk. A különböző csirkékből származó antiszérumokal összegyűjtött, és 56 °C-on 10 percen keresztül inaktiváltuk.
Az így kapott CH7-FT antiszérum 1 ml-ét intravénásán 3 hetes brojlerekbe (Euribrid, Boxmeer, Hollandia) injektáltuk. Az antiszérum beadása után 1 órával a csirkéket a jobb hátsó tüdőalveolumba 0,2 ml baktérium-szuszpenzió injektálásával megfertőztük. A szuszpenziót úgy állítottuk elő, hogy a baktériumokat egy éjszakán keresztül véres agarlemezen (Oxoid) tenyésztettük, PBS-ben szuszpendáltuk és a megfelelő koncentrációra hígítottuk. A felhasznált E. coli törzseket colibacillosisos csirkék szívéből izoláltuk. A kontroll csirkéket - amelyeknek nem adtunk antiszérumot, vagy csak negatív kontroll szérumot adtunk - azonos dózisú baktériummal fertőztük. A csirkéket a fertőzés után csökkentett nyomású izolátorokban tartottuk, élelmet és vizet ad libitum kaptak. A pusztulást a fertőzés után 7 napon keresztül feljegyeztük.
A 11. táblázat adataiból látható, hogy a csirkék CH7-FT antiszérummal való passzív immunizálása jelentős védelmet nyújtott a vizsgált 5 E. coli törzs közül 3 esetén. A fenti 3 törzs közül 2 törzs a tenyészet felülúszójába ürítette a toxint, míg egy törzs esetén csak a baktérium lizátuma volt toxikus Verő sejtek ellen. Az a két törzs, amelyek ellen nem tapasztaltunk szignifikáns védelmet, szintén csak a baktériumlizátumban rendelkezett toxicitással. Igen figyelemreméltó. hogy csak a mozgékony törzsekkel való fertőzés ellen tapasztaltunk szignifikáns védőhatást.
11. táblázat
Broilerek védése E. coli fertőzés ellen CH7-FT antiszérummal végzett passzív immunizálással
| Fertőzésre használt törzs | CH7-FT antiszérum adagolás | Pusztulás3’ <etpusztult/ösz szes). | — p<0 | ||||
| Szám | Szerotípus | Toxin11 | Mozgékony- ság2’ | Dózis | |||
| CH2 | 078:K80:H4 | liz. | + | 5xl06 | 7/17 | ||
| CH2 | O78:K8O:H4 | liz. | + | 5xl06 | - | 14/16 | + |
| CH5 | O2:K1:H5 | fu. | + | lxlO6 | + | 3/16 | |
| CH5 | 02:Kl:H5 | fu. | + | lxlO6 | - | 6/9 | + |
| CH6 | 01 :KI:H- | liz. | - | lxlO7 | + | 15/33 | |
| CH6 | 01 :K1 :H- | Hz. | - | lxlO7 | - | 21/36 | - |
| CH7 | 0l5:K14;H10 | fu. | + | 2xl06 | + | 3/32 | |
| CH7 | 015:K14:H10 | fu. | + | 2xl06 | - | 18/29 | + |
| CH245 | 035:K-:H- | liz. | - | 5xl06 | + | 6/17 | |
| CH245 | O35:K-:H- | liz. | - | 5xl06 | - | 7/19 | - |
1) Tenyészel felül úszójának (fu) vagy a baktériumsejtek lizátumának (lizl toxicitása Verő sejteken
2) törzsek mozgékonysága U-alakú csőben
3) elpusztult óllatok/összes állat száma a fertőzés után 7 nappal
4) anliszérum védőhatásának sztgnifikanciája (Chi2-teszt)
Claims (8)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1 Vakcina egy egyed Escherichia coli fertőzése elleni védelmére, azzal jellemezve, hogy az E. coli 55 flagellumokból származik.
- 2. Az 1. igénypont szerinti vakcina, azzal jellemezve. hogy a flagellumok Verő sejtekkel szemben toxikus aktivitással rendelkeznek.
- 3. Toxin, amely E. coli fertőzések ellen immunizáló 60 aktivitással rendelkezik melegvérű állatokban, azzal jellemezve, hogy aza) egyetlen polipeptid láncból áll,b) móltömege 30-100 kD SDS-PAGE módszerrel meghatározva,c) szálas aggregátumokban és/vagy aggregátumokkal együtt fordul elő,d) kötött szénhidrát maradékokat természetes állapotban nem tartalmaz,HU 211 827 A9e) Verő sejtekkel és napos csibékkel szemben toxikus, ésf) toxicitását 100 “C-on 1 órán keresztüli melegítés után is megtartja, vagy egy, a fenti toxinból származó fragmentum.
- 4. A 3. igénypont szerinti toxin, amely H10 szerotípusba tartozó E. coli törzsekből állítható előa) a baktériumok Tripticase-szója tápközegben való tenyésztésével;b) a kapott tenyészet sejtmentes felülúszójának 30 kD vágási értékű szűrőn való koncentrálásával;c) a szűrőn maradt anyag 20 mmol/1 Tris-HCl pufferrel végzett mosásával;d) a mosott anyag szeparálásával Sepharose 4B oszlopon;e) a nagy móltömeg frakció összegyűjtésével ésf) a fenti frakció preparatív SDS-PA gélelektroforézisével, vagy egy, a fenti toxinból származó fragmentum.
- 5. A 4. igénypont szerinti toxin. amelynek móltömege mintegy 47 Kd SDS-PAGE módszerre] meghatározva, és izoelektromos pH-ja mintegy 4,8, és részleges amino-terminális aminosav-szekvenciája Ala-GlnVal-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-(?)-Thr-Gln, vagy egy, a fenti toxinból származó fragmentum.
- 6. Vakcina egy egyed Escherichia coli fertőzés elleni védelmére, azzal jellemezve, hogy az a 3-5. igénypontok bármelyike szerinti toxinból származik.
- 7. Vakcina egy egyed Escherichia coli fertőzés elleni védelmére, azzal jellemezve, hogy az egy transzformáit mikroorganizmust tartalmaz, amely képes a 3-5. igénypontok bármelyike szerinti toxint vagy a fenti toxin egy fragmentumát kódoló DNS-szekvencia expresszálására.
- 8. Eljárás a 3. igénypont szerinti toxin tisztítására, azzal jellemezve, hogy az E. coli egy sejtmentes frakcióját, amely a CH7 törzs toxinja ellen termelődött antitestekkel reaktív, megtisztítjuk a felülúszó kis móltömegű komponenseinek eltávolításával, például ultraszűrés, centrifugálás és/vagy molekulaszűrő kromatográfia alkalmazásával. ahol a toxin-tartalmú frakciókat a fenti antitestekkel szembeni reaktivitásuk alapján szelektáljuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89202110 | 1989-08-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU211827A9 true HU211827A9 (en) | 1995-12-28 |
Family
ID=8202455
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU905053A HU210965B (en) | 1989-08-18 | 1990-08-17 | Method for the preparation of a vaccine against escherichia coli infections and of a toxin bilding active ingredient thereof, as well as a method for the purification of such a toxin |
| HU95P/P00573P HU211827A9 (en) | 1989-08-18 | 1995-06-29 | Escherichia coli vaccine |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU905053A HU210965B (en) | 1989-08-18 | 1990-08-17 | Method for the preparation of a vaccine against escherichia coli infections and of a toxin bilding active ingredient thereof, as well as a method for the purification of such a toxin |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5750115A (hu) |
| EP (1) | EP0413378B1 (hu) |
| JP (1) | JP3031561B2 (hu) |
| KR (1) | KR0177510B1 (hu) |
| CN (1) | CN1062605C (hu) |
| AU (1) | AU635062B2 (hu) |
| CA (1) | CA2022420C (hu) |
| DE (1) | DE69016129T2 (hu) |
| DK (1) | DK0413378T3 (hu) |
| ES (1) | ES2070266T3 (hu) |
| GR (1) | GR3015782T3 (hu) |
| HU (2) | HU210965B (hu) |
| IL (1) | IL95175A (hu) |
| NZ (1) | NZ234933A (hu) |
| TW (1) | TW204353B (hu) |
| ZA (1) | ZA906100B (hu) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2042718T3 (es) * | 1987-10-26 | 1993-12-16 | Akzo Nv | Procedimiento para la preparacion de una vacuna para proteger aves de corral contra septicemia producida por e. coli. |
| US6749831B1 (en) * | 1997-05-16 | 2004-06-15 | Medical Defense Technology, Llc | Vaccine against lipopolysaccharide core |
| CA2289760A1 (en) * | 1997-05-16 | 1998-11-19 | Medical Defense Technologies, Llc. | Vaccine against lipopolysaccharide core |
| IL139538A0 (en) * | 1998-05-15 | 2004-02-08 | Mkb Invest Ltd Partnership | Compositions and method for immunizing poultry |
| US8828226B2 (en) | 2003-03-01 | 2014-09-09 | The Trustees Of Boston University | System for assessing the efficacy of stored red blood cells using microvascular networks |
| BRPI0615593A2 (pt) * | 2005-08-30 | 2011-05-24 | Commw Scient And Ind Reseaech Organisation | liberação bacteriana de polipeptìdeos biologicamente ativos |
| US9199016B2 (en) | 2009-10-12 | 2015-12-01 | New Health Sciences, Inc. | System for extended storage of red blood cells and methods of use |
| WO2011046963A1 (en) | 2009-10-12 | 2011-04-21 | New Health Sciences, Inc. | Oxygen depletion devices and methods for removing oxygen from red blood cells |
| BR112012008683B8 (pt) | 2009-10-12 | 2022-11-08 | Hemanext Inc | dispositivo de armazenagem de sangue para armazenar sangue depletado de oxigênio e dióxido de carbono, dispositivo de depleção de oxigênio e dióxido de carbono, método para remover oxigênio e dióxido de carbono de hemácias, sistema de armazenagem de sangue, dispositivo de armazenagem de sangue, método para remover oxigênio de hemácias e método para aumentar os níveis de adenosina trifosfato (atp) nas hemácias |
| US11284616B2 (en) | 2010-05-05 | 2022-03-29 | Hemanext Inc. | Irradiation of red blood cells and anaerobic storage |
| WO2012027582A1 (en) | 2010-08-25 | 2012-03-01 | New Health Sciences | Method for enhancing red blood cell quality and survival during storage |
| PT2635114T (pt) | 2010-11-05 | 2020-06-16 | New Health Sciences Inc | Irradiação de glóbulos vermelhos e armazenamento anaeróbico |
| US9067004B2 (en) | 2011-03-28 | 2015-06-30 | New Health Sciences, Inc. | Method and system for removing oxygen and carbon dioxide during red cell blood processing using an inert carrier gas and manifold assembly |
| WO2013009843A1 (en) * | 2011-07-11 | 2013-01-17 | Camas Incorporated | Compositions against bacterial toxins |
| ES2923571T3 (es) | 2011-08-10 | 2022-09-28 | Hemanext Inc | Dispositivo integrado de filtrado de leucocitos, oxígeno y/o CO2 y separación de plasma |
| AU2014223165B2 (en) | 2013-02-28 | 2017-04-13 | Hemanext Inc. | Gas depletion and gas addition devices for blood treatment |
| KR20180012242A (ko) | 2015-03-10 | 2018-02-05 | 뉴 헬스 사이언시즈 인코포레이티드 | 산소 감소 1회용 키트, 장치 및 이의 사용 방법 |
| IL285359B2 (en) | 2015-04-23 | 2024-01-01 | Hemanext Inc | Anaerobic blood storage containers |
| CA2985799A1 (en) | 2015-05-18 | 2016-11-24 | New Health Sciences, Inc. | Methods for the storage of whole blood, and compositions thereof |
| EP3463466B1 (en) | 2016-05-27 | 2022-02-16 | Hemanext Inc. | Anaerobic blood storage and pathogen inactivation method |
| US11260119B2 (en) | 2018-08-24 | 2022-03-01 | Pfizer Inc. | Escherichia coli compositions and methods thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58135819A (ja) * | 1982-02-09 | 1983-08-12 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | 鶏の大腸菌症の予防法 |
| US4772464A (en) * | 1985-08-01 | 1988-09-20 | Miles Laboratories, Inc. | Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens |
| US4886748A (en) * | 1986-03-11 | 1989-12-12 | Shionogi & Co., Ltd. | DNA encoding flagellin and vector having the same |
-
1990
- 1990-07-23 DE DE69016129T patent/DE69016129T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-23 ES ES90201990T patent/ES2070266T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-23 EP EP90201990A patent/EP0413378B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-07-23 DK DK90201990.0T patent/DK0413378T3/da active
- 1990-07-24 IL IL9517590A patent/IL95175A/xx unknown
- 1990-07-25 TW TW079106165A patent/TW204353B/zh active
- 1990-08-01 CA CA002022420A patent/CA2022420C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-02 ZA ZA906100A patent/ZA906100B/xx unknown
- 1990-08-16 JP JP2216453A patent/JP3031561B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-16 NZ NZ234933A patent/NZ234933A/en unknown
- 1990-08-17 KR KR1019900012764A patent/KR0177510B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-08-17 AU AU61099/90A patent/AU635062B2/en not_active Expired
- 1990-08-17 HU HU905053A patent/HU210965B/hu unknown
- 1990-08-18 CN CN90107108A patent/CN1062605C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-10 US US08/420,454 patent/US5750115A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-04-13 GR GR950400912T patent/GR3015782T3/el unknown
- 1995-06-29 HU HU95P/P00573P patent/HU211827A9/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUT59612A (en) | 1992-06-29 |
| HU210965B (en) | 1995-09-28 |
| CN1049523A (zh) | 1991-02-27 |
| JPH03184996A (ja) | 1991-08-12 |
| DE69016129D1 (de) | 1995-03-02 |
| TW204353B (hu) | 1993-04-21 |
| IL95175A (en) | 1994-05-30 |
| EP0413378A1 (en) | 1991-02-20 |
| ZA906100B (en) | 1991-05-29 |
| KR910004209A (ko) | 1991-03-28 |
| CA2022420A1 (en) | 1991-02-19 |
| AU6109990A (en) | 1991-02-21 |
| CN1062605C (zh) | 2001-02-28 |
| NZ234933A (en) | 1992-06-25 |
| GR3015782T3 (en) | 1995-07-31 |
| JP3031561B2 (ja) | 2000-04-10 |
| EP0413378B1 (en) | 1995-01-18 |
| KR0177510B1 (ko) | 1999-03-20 |
| HU905053D0 (en) | 1991-01-28 |
| AU635062B2 (en) | 1993-03-11 |
| CA2022420C (en) | 2000-03-28 |
| DK0413378T3 (da) | 1995-05-15 |
| IL95175A0 (en) | 1991-06-10 |
| DE69016129T2 (de) | 1995-05-24 |
| US5750115A (en) | 1998-05-12 |
| ES2070266T3 (es) | 1995-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU211827A9 (en) | Escherichia coli vaccine | |
| Munson et al. | Purification and comparison of outer membrane protein P2 from Haemophilus influenzae type b isolates. | |
| JP4271231B2 (ja) | 髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のプロテイナーゼＫ抵抗性表面蛋白質 | |
| CA2040544C (en) | Actinobacillus pleuropneumoniae subunit vaccine | |
| DK173361B1 (da) | Isoleret proteinholdigt materiale, dræbte hele celler af Pasteurella hæmolytica, vaccine mod Pasteurella og fremgangsmåde t | |
| Lübke et al. | Isolation and partial characterization of the major protein of the outer membrane of Pasteurella haemolytica and Pasteurella multocida | |
| Bhattacharjee et al. | Affinity-purified Escherichia coli J5 lipopolysaccharide-specific IgG protects neutropenic rats against gram-negative bacterial sepsis | |
| JP4081140B2 (ja) | 非耐熱性エンテロトキシンとコレラトキシンｂサブユニットの雑種分子 | |
| USRE37741E1 (en) | Purified nontypable Haemophilus influenzae P5 protein as a vaccine for nontypable Haemophilus influenzae infection | |
| Cunningham et al. | Immunochemical properties of streptococcal M protein purified by isoelectric focusing | |
| KR0162488B1 (ko) | 혈호균속 인플루엔자용 백신과 진단검사법 | |
| US5593679A (en) | Poultry vaccine against E. coli air sac inflammation and septicaemia | |
| Tagawa et al. | Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Haemophilus somnus | |
| CA2516661C (en) | M. haemolytica outer membrane protein plpe as a vaccine or vaccine component against shipping fever | |
| PT1005487E (pt) | A proteína de membrana externa de 74 kilodalton de moraxella catarrhalis | |
| Wilson et al. | Characterisation and bilogical activity of monoclonal antibodies specific for Pasteurella haemolytica A1 capsule and lipopolysaccharide | |
| Türkmen | Development of an experimental recombinant vaccine formulation composed of LKTA from Mannheimia Haemolytica A1 and P31 and LPPB from Histophilus Somni 8025 against Hovine Respiratory Disease | |
| Kaca et al. | Serological Studies of an Acid‐Labile O‐Polysaccharide of Proteus vulgaris OX19 Lipopolysaccharide Using Human and Rabbit Antibodies | |
| Pal et al. | Electrophoretic mobility and immune response of outer membrane proteins of Vibrio cholerae O139 | |
| Ayalew et al. | Characterization of Immunodominant and |