PT1005487E - A proteína de membrana externa de 74 kilodalton de moraxella catarrhalis - Google Patents
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Description
ΡΕ1005487 1 DESCRIÇÃO "A PROTEÍNA DE MEMBRANA EXTERNA DE 74 KILODALTON DE MORAXELLA CATARRHALIS"
Campo da Invenção
Esta invenção refere-se a uma proteína de membrana externa de aproximadamente 74,000 Dalton (74 kD) purificada a partir de Moraxella catarrhalis.
Antecedentes da Invenção A Moraxella (Branhamella) catarrhalis é um dos principais patogenes bacterianos que causa a otite média em crianças (Entradas Bibliográficas 1, 2, 3, 4). Causa também sinusite, laringite, traqueíte, pneumonia, e outras doenças respiratórias em crianças e adultos (5, 6, 7) . Uma vacina profilática é claramente necessária devido à quase totalidade dos isolados clínicos serem resistentes aos antibióticos β-lactâmicos (8, 9).
As proteínas de membrana externa (OMPs) de M. catarrhalis estão a ser investigadas como candidatas a uma potencial vacina porque estão facilmente acessíveis aos anticorpos. De facto, os anticorpos elicitados em ratos direccionados para certas OMP's incluindo a UspA e a CopB 2 ΡΕ1005487 já demonstraram possuir actividade biológica, tal como actividade bactericida, actividade de bloqueio de adesão e desobstrução pulmonar aumentada da bactéria num modelo animal (10, 11, 12, 13) . Os dados serológicos de humanos que sofreram uma infecção recente por M. catarrhalis indicam que os humanos desenvolvem anticorpos direccionados para as OMP's seguidamente à infecção natural (14, 15, 16, 17, 18) . Isto sugere que as OMP' s são os alvos dos mecanismos de defesa do hospedeiro. Os anticorpos específicos de UspA estão presentes num soro humano normal e estes anticorpos possuem actividade bactericida. Existem também níveis elevados de anticorpos direccionados para as OMPs de 80 kD no soro tanto de humanos saudáveis como de pacientes a recuperar de infecções recentes por M. catarrhalis (16). Diversas proteínas de M. catarrhalis migraram dentro deste intervalo de tamanhos. De entre elas estão a CopB (12), a proteína BI (18), uma proteína de ligação à transferrina (TbpB) e uma proteína de ligação à lactoferrina (LbpB) (19) . Está para ser determinado ainda se estas proteínas são iguais ou se são diferentes umas das outras. Nenhuma delas, no entanto, foi avaliada numa forma purifica para a utilização como vacina.
Uma vacina eficaz para a protecçao contra as doenças causadas por M. catarrhalis deve conferir protecção em todos os estádios da doença. Estes estágios incluem a colonização bacteriana em superfícies mucosas, a multiplicação bacteriana, a disseminação e a invasão, e o desenvolvimento de resposta inflamatória. Podem ser necessários 3 ΡΕ1005487 múltiplos componentes bacterianos para produzir uma vacina eficaz. Apesar de existirem dados pré-clinicos que sugerem que alguns componentes da superfície de M. catarrhalis são antigénios de vacina potenciais, é ainda pouco claro se estes componentes poderão conferir imunidade protectora suficiente em humanos. Assim, é importante identificar e avaliar novos antigénios bacterianos para a utilização como vacina.
Sumário da Invenção
Por conseguinte, um dos objectivos desta invenção é isolar, purificar e caracterizar uma proteína suplementar a partir de M. catarrhalis. Outro dos objectivos desta invenção é o de testar se esta proteína é uma vacina candidata viável em sistemas modelo apropriados.
Estes e outros objectivos da invenção como discutido em baixo são alcançados pelo isolamento e purificação de uma proteína a partir da estirpe de M. catarrhalis 035E ou TTA24 a qual é designada por proteína de 74 kD, com base no peso molecular aproximado medido por espectrometria de massa. A proteína de 74 kD isolada e purificada a partir de M. catarrhalis possui uma sequência de aminoácidos amino-terminal que é conservada entre várias estirpes de M. catarrhalis. Esta sequência de aminoácidos amino-terminal compreende a sequência Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tir (SEQ ID NO: 1), onde o primeiro resíduo não está identificado. A proteína desta invenção possui um peso 4 ΡΕ1005487 molecular medido por espectrometria de massa de aproximadamente 74 kD.
Noutra versão desta invenção, a proteína de 74 kD isolada e purificada, é utilizada para preparar uma vacina que elicita uma resposta imune protectora num hospedeiro mamífero. A vacina pode conter adicionalmente um adjuvante, um diluente ou um veículo de transporte. Exemplos de tais adjuvantes incluem o hidróxido de alumínio, o fosfato de alumínio, o MPL™, o Stimulon™ QS-21, e a IL-12. A vacina é administrada a um hospedeiro mamífero numa quantidade imunogénica suficiente para proteger o hospedeiro contra a doença causada por M. catarrhalis.
Breve Descrição das Figuras A Figura 1 descreve a caracterização por SDS-PAGE e transferência Westerns da proteína de 74 kD purificada a partir da estirpe 035E. A Figura IA ilustra uma banda azul de Coomassie em SDS-PAGE a 4-15% apresentando a proteína de 74 kD enriquecida eluída a partir da coluna S (poço 2) e da coluna de hidroxiapatite (poço 3) . Os marcadores de peso molecular (poço 1: 200 (miosina); 160 (β-galactosidase); 97 (fosforilase); 66 (albumina sérica); 45 (ovalbumina); 31 (anidrase carbónica); 21 (inibidor da tripsina); 14 (lisozima)) estão em milhares. A Figura 1B ilustra a proteína de 74 kD purificada, com coloração com prata; o depósito foi de 3 yg (poço 1), 15 yg (poço 2) e 30 yg (poço 3) . A Figura 1C ilustra as transferências Western 5 ΡΕ1005487 detectadas quer com soro anti-rato contra a proteína de 74 kD purificada (poço 1) quer com o MAb 72-32 (poço 2). A Figura 2 ilustra o nível de expressão da proteína de 74 kD pela estirpe 035E sob diferentes condições de cultura. A bactéria foi cultivada em infusão normal de cérebro-coração (BHI), o BHI foi suplementado com ácido etilenodiamino diacético a 10 mM (EDDA) ou com ferro a 100 μΜ. Os lisados bacterianos aplicados à membrana foram detectados pelo MAb 72-32 em ensaios por tranferência pontual ("dot blot") e transferência western. A Figura 3 ilustra a expressão das proteínas de ligação à transferrina pela estirpe 035E sob diferentes condições de cultura. As amostras na membrana eram lisados bacterianos como os descrito para a Figura 2. A ligação à transferrina pela proteína de 74 kD purificada é apresentada na quarta coluna. A Figura 4 ilustra a variação no nível de expressão da proteína de 74 kD pelas estirpes de M. catarrhalis. Os lisados bacterianos de sete estirpes de M. catarrhalis foram titulados em 3 diluições diferentes numa tranferência pontual ("dot blot") e detectados com anticorpos policlonais de rato contra a proteína de 74 kD purificada a partir da estirpe 035E (1:200). A Figura 5 ilustra a reactividade do soro de rato anti-74 kD para as estirpes heterólogas de M. catarrhalis. 6 ΡΕ1005487
Os lisados bacterianos contendo 10 yg de proteína total foram avaliados em SDS-PAGE a 4-15% e testados por transferência Western com anti-soro de rato contra a proteína de 74 kD purificada a partir da estirpe 035E (1:5,000). Os poços 2-10 são as estirpes 035E, TTA24, ATCC 25238, 324-171, 128-179, 430-345, 111-210, 219-96, e 1230-359, respectivamente. Os marcadores de peso molecular (poço 1) são de 133 kD (β-galactosidase) e de 71 kD (albumina de soro bovino). A Figura 6 ilustra a análise por transferência Western do anti-soro de rato produzidos contra a proteína de 74 kD a partir da estirpe TTA24 (em baixo) ou contra o conjunto das proteínas de 74 kD das estirpes TTA24 e 430-345 (em cima) . Cada poço foi carregado com 10 yg da totalidade dos lisados bacterianos ou com 1,5 yg da proteína de 74 kD purificada. O anti-soro foi desde a sangria da semana 6 diluído de 1:1,000. A Figura 7 ilustra a presença de anticorpos para a proteína de 74 kD em soro humano normal. A proteína de 74 kD purificada a partir da estirpe 035E reagiu com cinco amostras de soro (poços 2-6) de adultos saudáveis num transferência Western. Os marcadores de peso molecular apresentados no poço 1 são os mesmos que os descritos para a Figura 5. A Figura 8 ilustra a reactividade dos anticorpos anti-proteína de 74 kD purificados a partir do soro de adulto 7 ΡΕ1005487 para a totalidade dos lisados bacterianos. Os lisados da estirpe 035E contendo 10 pg de proteína reagiram com anticorpos humanos purificados por afinidade contra a proteína de 74 kD num transferência Western (poço 2) . Os marcadores de peso molecular apresentados no poço 1 são os mesmos que os descritos para a Figura 5. A figura 9 ilustra a inibição da ligação à transferrina por anticorpos da proteína de 74 kD. Diversas quantidades do lisado de 035E foram depositadas numa membrana de nitrocelulose. A membrana foi incubada com PBS (coluna A); soro normal de rato diluído de 1:100 (coluna B) ; anti-soro para a proteína de 74 kDa da estirpe 035E (coluna C) ; ou anti-soro de controlo para a UspA (coluna D) . As membrana foram depois marcadas com transferrina marcada com biotina.
Descrição Detalhada da Invenção
Esta invenção refere-se a uma proteína isolada e purificada de M. catarrhalis designada por proteína de 74 kD. Esta proteína de 74 kD possuí uma sequência de aminoácidos amino-terminal que se encontra conservada entre as três estirpes examinadas de M. catarrhalis. A proteína desta invenção possui um peso molecular de aproximadamente 74,9 kD quando avaliada num gel SDS-PAGE a 10%, enquanto que o seu peso molecular quando avaliada por espectrometria de massa é de aproximadamente 7 4 kD. A composição de aminoácidos da proteína está também determinada. ΡΕ1005487
Inicialmente, a proteína de 74 kD foi purificada a partir da estirpe 035E em vesículas lavadas com sal e avaliada em ratos. Os resultados preliminares indicaram que a proteína de 74 kD está exposta à superfície, que o anti-soro de rato possui actividade bactericida, e que o rato imunizado exibe aumento da desobstrução da M. catarrhalis num modelo de teste de murino. No entanto, esta preparação particular de 74 kD foi contaminada com lipo-oligossacárido (LOS) que induz também uma resposta do anticorpo no rato. Subsequentemente, a proteína de 74 kD foi purificada a partir de três estirpes de M. catarrhalis por um procedimento modificado. Estas preparações não tinham LOS detectável ou outras contaminações de proteína. O Exemplo 1 em baixo descreve o novo método de purificação que envolve a extracção da proteína directamente da totalidade das células bacterianas das estirpes 035E e 430-345 de M. catarrhalis, seguido por uma série de passos de cromato-grafia em coluna. Uma versão modificada deste método foi também utilizada para purificar a proteína de 74 kD a partir da estirpe TTA24. A proteína de 74 kD migra ligeiramente mais devagar num SDS-PAGE de gradiente 4-15% do que a CopB, outra proteína de M. catarrhalis (dados não apresentados). Análises de SDS-PAGE utilizando um gel de acrilamida a 10% p/v fornecem um peso molecular estimado para esta proteína de aproximadamente 74,9 kD (ver Exemplo 4) . A massa molecular actual determinada por espectrometria de massa é de 9 ΡΕ1005487 aproximadamente 74 kD (ver Exemplo 4). Veio a saber-se que as sequências N-terminais das estirpes 035E, TTA24 e 430-345 são idênticas à extensão da sequenciação dessas estirpes, isto é, para os primeiros 18 residuos (ver Exemplo 6 e 7) .
Foram também empregues dois métodos alternativos para a purificação da proteína de 74 kD. Para ambos os métodos, as vesículas lavadas com sal, preparadas como previamente descrito (11), foram suspensas num tampão com Triton X-100™ a 0,5% e N-[hidroxietil]piperazina-N'-[2-ácido etanosulfónico] (HEPES) a 10 mM e incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. A suspensão foi centri-fugada a baixa velocidade (10,000 x g durante 20 minutos) a 4°C para remover as partículas. Para o primeiro método, o sobrenadante foi passado através de uma coluna DEAE Sepharose® (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada com o mesmo tampão. Foi eluída uma única banda da proteína de 74 kD, observada por SDS-PAGE, através do fluxo e no tampão de lavagem, enquanto que os contaminantes foram eluídos após o aumento da concentração de sal (NaCl) . Para o segundo método, o sobrenadante foi passado através de uma coluna CM Sepharose® equilibrada com o mesmo tampão Triton X-100™ -HEPES. As proteínas desta coluna foram então eluídas com um passo de aumento do gradiente da concentração de sal. A proteína de 74 kD, que elui a 200 mM de NaCl, migra como uma única banda. Apenas as duas proteínas de membrana externa maiores das vesículas lavadas com sal, a proteína de 74 kD e a proteína CopB migram aproximadamente neste 10 ΡΕ1005487 tamanho em SDS-PAGE. A proteína de 74 kD falhou na reacção por transferência Westernting com um anticorpo monoclonal 10F3 específico para a proteína CopB. Quantidades menores da proteína C/D presente podem ser removidas utilizando uma coluna de troca iónica adicional. O N-terminal da estirpe 035E e dois peptídeos internos de uma digestão com quimotripsina da mesma proteína foram determinados e mostraram não possuir homologia com qualquer outra proteína conhecida de M. catarrhalis nas pesquisas em base de dados do GenBank CDS de traduções, PDS, SwissProt, Spupdate e PIR com Ferramenta Básica de Pesquisa de Alinhamento Local ("Basic Local Alignment Search Tool") (BLAST) (20). No entanto, os dois peptídeos internos possuem uma homologia da sequência significativa com a proteína de ligação à transferrina de N. meningitidis e de H. influenzae (ver Exemplo 8). A composição de amino-ácidos da proteína de 74 kD está descrita no Exemplo 5.
As proteínas de 74 kD purificadas das estirpes 035E e 430-345 são imunogénicas em ratos e os seus anticorpos reagem com a estirpe homóloga por ELISA de célula total; no entanto os títulos de célula total em relação às estirpes heterólogas variam consideravelmente (ver Exemplo 12) . A proteína de 74 kD da estirpe TTA24 parece estar melhor conservada, devido aos anticorpos estabelecidos para esta proteína exibirem moderadamente reactividade elevada para estirpes heterólogas por ELISA de célula total (Exemplo 12). O anti-soro contra as proteínas purificadas 11 ΡΕ1005487 da totalidade das três estirpes possui actividade bacteri-cida dependente do complemento em relação a todas as estirpes heterólogas (ver Exemplo 9) . Isto sugere que os anticorpos referentes aos epitopos conservados são importantes . O nivel de anticorpos reactivos a estirpes homólogas e os titulos dos anticorpos bactericidas oram melhorados pela utilização de alguns adjuvantes tais como o Stimulon™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, MA) ou uma mistura de MPL™ (3-O-monofosforil desacilado-lipido A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, Montana) e fosfato de aluminio (ver Exemplo 10 e 11). Os ratos imunizados com as proteínas de 74 kD purificadas a partir das estirpes 035E e 430-345 exibem elevada desobstrução pulmonar da estirpe 035E para a qual os anticorpos reagem com títulos elevados (P<0,01), mas não com a estirpe TTA24 para a qual o soro reage debilmente (ver Exemplo 13) . Adicionalmente, o soro humano normal contém anticorpos adquiridos naturalmente contra o serotipo conservados nas proteínas de 74 kD de ambas as estirpes 035E e TTA24 (Exemplo 14). Isto sugere que a M. catarrhalis expressa esta proteína in vivo e que a proteína de 74 kD é um alvo da resposta imune após a infecção natural. Estes anticorpos humanos reagem melhor à proteína de 74 kD purificada a partir da estirpe TTA24 do que à proteína da estirpe 035E (ver Exemplo 15) . Isto sugere que a proteína de 74 kD da estirpe TTA24 esta conservada. 12 ΡΕ1005487 A relação da proteína de 74 kD com outras proteínas será descrita seguidamente. Oito proteínas de membrana externa maiores de M. catarrhalis foram descritas inicialmente por Bartos e Murphy, que designaram estas OMPs como A-H por ordem decrescente em relação ao seu peso molecular (21) . Duas proteínas de membrana externa adicionais, designadas UspA (13) e BI (18), são descritas mais tarde. A OMP B foi renomeada B2 após a descoberta da BI (18). Excepto pela sua similaridade na sua massa molécula, as proteínas BI e B2 não se encontram relacionadas. A OMP B2 é provavelmente a mesma proteína do que a CopB descrita por Helminen et al. (12) . Esta proteína possui uma massa molecular de 82 kD, e parece desempenhar um papel na aquisição de ferro (22). A proteína de 74 kD descrita nesta aplicação é distinta da proteína CopB em dois aspectos. Primeiro, um anticorpo monoclonal (MAb) designado por 72-32, que reage com a proteína de 74 kD, não reage com uma CopB recombi-nante produzida em E. coli por transferência Western (dados não apresentados) . Nem um MAb específico da CopB, o 10F3, reage com a proteína de 74 kD purificada no mesmo ensaio. Segundo, a sequência de aminoácidos N-terminal e duas sequências de peptídeos internos da proteína de 74 kD não foram encontradas na sequência da proteína predita deduzida a partir da sequência publicada do gene da CopB (12). A proteína de 74 kD desta invenção é mais similar à proteína BI em termos de tamanho e do grau de conservação 13 ΡΕ1005487 antigénica. A OMP Bl foi descrita inicialmente por Sethi et al. (18), que não isolou ou purificou a proteina. Sethi et al. observou a presença consistente de anticorpos poli-clonais contra uma proteína de 74 kD menor no soro de pacientes com bronquiectasia. Eles reportaram também que a proteína Bl possui epítopos expostos à superfície e parece ser variável antigenicamente entre as estirpes de M. catarrhalis. O nível de expressão de Bl foi regulada a montante sob condições de cultura limitantes em ferro para alguns isolados (23) . Foi também reportado que a proteína Bl se liga à transferrina (24). Estes relatos sugerem que a proteína Bl pode estar envolvida na aquisição e utilização do ferro. A utilidade da proteína Bl como um antigénio de vacina não foi investigada nestas pesquisas. Em contraste, os dados apresentados nesta aplicação não apresentam alterações significativas nos niveis de expressão da proteína de 74 kD quer pela ausência ou pelo suplemento de ferro no meio de cultura (ver Exemplo 3).
Tal como a proteina Bl, a proteina de 74 kD liga-se à transferrina (ver Exemplo 3). As proteínas de ligação à transferrina foram detectadas em várias espécies bacte-rianas, incluindo em M. catarrhalis. Utilizando colunas de afinidade de transferrina e de lactoferrina, Bonnah et al. identificou duas proteínas receptoras distintas de M. catarrhalis com pesos moleculares de aproximadamente 80 kD (19). Este é o mesmo intervalo das proteínas designadas por Bl e CopB. Infelizmente, estas pesquisas não fornecem informação suficiente na perspectiva bioquímica, imuno- 14 ΡΕ1005487 lógica e molecular destas proteínas para permitir a identificação quer da proteina de 74 kD quer destas proteínas. No entanto, muitas das propriedades da TbpB proveniente da família Neisseria e de Haemophilus influenzae são similares ás da proteína de 74 kD de M. catarrhalis. Isto inclui a capacidade de se ligar à transferrina tanto na forma nativa como na forma desnaturada e a heterogeneidade antigénica.
No entanto, a proteína de 74 kD de M. catarrhalis difere da proteína TbpB de Neisseria em vários aspectos. Primeiro, o peso molecular da proteína de 74 kD é relativamente bem conservado de estirpe para estirpe, enquanto que o peso molecular da TbpB em Neisseria varia de estirpe para estirpe (25) . Segundo, os anticorpos de rato produzidos contra a proteína de 74 kD da estirpe TTA24 reagem com todas as estirpes de M. catarrhalis por ELISA de célula total, e são bactericidas para todas as estirpes analisadas. Em contrapartida, os anticorpos de TbpB de Neisseria reagem apenas com uma fracção de estirpes por ELISA e são apenas bactericidas para as estirpes para as quais os anticorpos se ligam (26). Finalmente, o nível de expressão da proteína de 74 kD aparenta ser constitutivo, enquanto que o TbpB (tanto de Neisseria como de Haemophilus) , tal como a proteína Bl, é reprimida pelo ferro. Por conseguinte, sem informação adicional, não é claro se a proteína de 74 kD, a proteína Bl e a proteína TbpB são todas a mesma proteína.
Tendo isolado e caracterizado a proteína de 74 kD, o próximo passo é avaliar o seu potencial como um 15 ΡΕ1005487 antigénio de vacina. Várias linhas de evidência apresentadas nesta aplicação indicam que a proteina de 74 kD é uma candidata potencial ao antigénio de vacina. Primeiro, como descrito no Exemplo 2 em baixo, contém epítopos expostos à superfície. Isto é importante, porque apenas os epitopos expostos à superfícies estão acessíveis aos anticorpos. O epitopo reconhecido pelo MAb 72-32 apesar de não se encontrar conservado entre todos os isolados, está exposto à superfície. Adicionalmente, tanto os anticorpos contra a proteina de 74 kD purificados a partir do soro humano como os anticorpos produzidos para a proteina purificada em ratos reagem com várias estirpes de M. catarrhalis por ELISA de célula total. Alguns dos epitopos são claramente conformacionais, visto que muitos dos anticorpos monoclo-nais reagem com a proteina de 74 kD purificada e com todas as células bacterianas por ELISA, mas não reagem com a proteina de 74 kD desnaturada em transferência Western. Isto sugere também que a proteina purificada retém pelo menos alguns epitopos conformacionais.
Segundo, alguns epitopos expostos à superfície da proteina de 74 kD estão conservados entre estirpes de M. catarrhalis. Uma vacina eficaz necessita de conferir imunidade protectora contra a maioria, se não a totalidade das estirpes. Devido à expressão da proteina in vitro aparentar variar de isolado para isolado (ver Exemplo 3), o grau de variação antigénica da proteina de 74 kD entre as estirpes de M. catarrhalis tem sido de dificil avaliação. Não obstante, é evidente que a proteina de 74 kD contém 16 ΡΕ1005487 epitopos conservados. Os anticorpos da proteína de 74 kD, quer produzidos em ratos ou desenvolvidos em humanos seguidamente à infecção natural, estão ligados pela totalidade das células bacterianas das estirpes heterólogas. A proteína de 74 kD da estirpe TTA24 está razoavelmente conservada, considerando que a proteína de 74 kD de duas outras estirpes estudadas está quer menos conservada quer os epitopos específicos da estirpe são mais imunogénicos do que os epitopos conservados. Os dados presentes parecem sugerir que a proteína de 74 kD da estirpe TTA24 pode possuir maior potencial como antigénio de vacina porque elicita anticorpos cruzados altamente reactivos contra as estirpes heterólogas (ver Exemplo 12, Tabela 9).
Terceiro, os anticorpos contra os epitopos de superfície conservados produzidos pela proteína purificada são bactericidas (ver Exemplo 9). Apesar de ser pouco claro de como os anticorpos regulam a protecção contra infecções por M. catarrhalis, eles podem desempenhar um papel num número de vias. Isto inclui a inibição da aderência bacte-riana, a interferência na absorção de nutriente, fagocitose opsónica e morte dependente do complemento. Foi observado que os adultos, uma população normalmente resistente a infecções por M. catarrhalis, possuíam um nível significativamente mais elevado de actividade bactericida para a M. catarrhalis no soro do que as crianças, uma população susceptível a infecções por M. catarrhalis (dados não apresentados). A descoberta de que o anti-soro de rato para a proteína de 74 kD exibe actividade bactericida contra 17 ΡΕ1005487 estirpes heterólogas de uma forma dependente da concentração do anticorpo sugere que esta proteína é um antigénio de protecção. Claramente, o epítopo conservado da proteína de 74 kD é um alvo importante dos anticorpos bactericidas.
Finalmente, os ratos imunizados com a proteína de 74 kD exibem aumento da desobstrução pulmonar da bactéria num modelo de teste de murino (ver Exemplo 13) . Apesar dos mecanismos da desobstrução bacteriana serem desconhecidos neste modelo, os anticorpos desempenham claramente um papel importante neste modelo (27) . Adicionalmente à proteína de 74 kD descrita nesta aplicação, a UspA e a CopB demonstraram promover o aumento da desobstrução neste modelo (11, 12, 13). Adicionalmente, apenas os anticorpos para certos epítopos destas proteínas parecem aumentar a desobstrução bacteriana. Assim, o modelo tem sido útil para seleccionar candidatos a vacina que podem elicitar anticorpos com actividade biológica in vivo. Duas estirpes da bactéria são adequadas para avaliação no modelo de pulmonar de murino, e ambas foram testadas. A desobstrução bacteriana aumentada foi verificada para a estirpe 035E que exibe forte reacti-vidade com os anticorpos contra a proteína de 74 kD preparada a partir de duas estirpes diferente. A desobstrução homóloga da estirpe TTA24 foi verificada; no entanto, a desobstrução homóloga não foi observada. Isto deve-se provavelmente à fraca reactividade do anticorpo para com este isolado produzido pela proteína purificada. Está ainda por determinar se a proteína de 74 kD da estirpe TTA24 promove o aumento da desobstrução de estirpes heterólogas neste modelo de teste. 18 ΡΕ1005487
Outro mecanismo potencial pelo qual a proteína de 74 kD pode conferir protecção em humanos é pela produção de anticorpos que bloqueiam a absorção de ferro pela M. catarrhalis. O ferro é um elemento essencial para a bactéria crescer e causar patoqénese in vivo. No entanto, a concentração de ferro livre no ambiente extracelular é muito baixa para manter o crescimento bacteriano. 0 ferro extracelular é virtualmente sequestrado na totalidade nas proteínas hospedeiras tais como a lactoferrina na superfície mucosa e a transferrina no soro. Várias espécies bacterianas incluindo a M. catarrhalis podem obter ferro a partir das proteínas através dos seus receptores de superfície especializados, tais como as proteínas de ligação à transferrina (TbpA e B) e as proteínas de ligação à lactoferrina (Lbp A e B) . Para obter ferro, a TbpB, uma lipoproteína que é uma proteína de membrana externa, funciona como um receptor para a transferrina em fluídos corporais.
Tem sido demonstrado que a M. catarrhalis pode utilizar a transferrina como a única fonte de ferro para o crescimento in vitro (19), e isto pode ser um mecanismo importante para a aquisição de ferro in vivo. 0 mecanismo pelo qual a M. catarrhalis obtém o ferro a partir da transferrina não é claro, no entanto, requer muito provavelmente a interacção directa da Tbp com a transferrina. O Exemplo 16 indica que os anticorpos para a proteína de 74 kD de M. catarrhalis são capazes de bloquear especi- 19 ΡΕ1005487 ficamente a ligação à transferrina pelos lisados bacte-rianos. Isto é consistente com descobertas anteriores segundo as quais os anticorpos para a TbpB meningocócica são capazes de baixar a taxa de crescimento de meningococos quando a transferrina humana é a única fonte de ferro (28).
As proteinas de ligação à transferrina de outras espécies estão descritas como sendo lipoproteinas (29, 30). Isto bloqueia normalmente o N-terminal da proteína, impedindo a determinação da sequência N-terminal (31). Devido a uma sequência N-terminal poder ser determinada para a proteína de 74 kD a partir de três estirpes, isto representa outra possível diferença entre a proteína de ligação à transferrina e a proteína de 74 kD de M. catarrhalis.
Assim, a proteína de 74 kD é útil na preparação de vacinas que conferirem protecção a humanos contra a otite média e outras doenças causadas por M. catarrhalis.
Estas composições de vacina compreendem a proteína de 74 kD isolada e purificada a partir das estirpes de M. catarrhalis 035E ou TTA24, em que a composição de vacina produz uma resposta imune de protecção num hospedeiro mamífero.
As vacinas contendo a proteína de 74 kD podem ser misturadas com diluentes ou veículos imunologicamente aceitáveis de uma forma convencional para preparara solu- 20 ΡΕ1005487 ções ou suspensões líquidas injectáveis. Adicionalmente, as vacinas podem incluir hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio (alum) ou outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, tais como Stimulon™ QS-21 (Aquila Biopharma-ceuticals, Inc., Worcester, MA), MPL™, e IL-12 (Genetics Institute Cambridge, MA).
As vacinas desta invenção podem incluir também proteínas de M. catarrhalis adicionais que são conhecidas na técnica. Exemplos de tais proteínas são aquelas designadas por CopB, UspA, C/D e E.
As vacinas desta invenção incluem adicionalmente outros agentes de protecção que são acoplados à proteína de 74 kD, tal que a proteína de 74 kD funcione como uma molécula transportadora. Por exemplo, os agentes que protegem contra outros organismos patogénicos, tais como bactérias, vírus ou parasitas, são acoplados à proteína de 74 kD para produzir uma vacina multivalente útil na prevenção tanto da infecção por M. catarrhalis como de outras infecções patogénicas. Particularmente, a proteína de 74 kD pode servir como veículo imunogénico sendo conjugada com Haemophilus, polissacáridos ou oligossa-cáridos meningocócicos ou pneumocócicos. Adicionalmente, a proteína de 74 kD é acoplada à outra parte antigénica de M. catarrhalis tal como os lipo-oligossacáridos.
As vacinas desta invenção são administradas por injecção de uma forma convencional, tal como uma injecção 21 ΡΕ1005487 subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular em humanos, bem como por administração oral e administração intranasal, para induzir uma resposta imune activa para protecção contra a otite média causada por M. catarrhalis. A dosagem a ser administrada é determinada por meios conhecidos por aqueles peritos na área. A protecção pode ser conferida por uma dose de vacina única ou pode requerer a administração de várias doses de reforço.
Normalmente, na ausência de dados clínicos humanos, a imunização num modelo animal reconhecido depende da predição da eficácia de uma vacina em humanos. Aqui, a desobstrução pulmonar é medida num modelo de teste de murino. 0 modelo de teste de murino permite uma avaliação da interacção de M. catarrhalis com o tracto respiratório inferior, bem como uma apreciação das alterações patológicas nos pulmões (32, 33). Este modelo reproduzível distribui um inoculo de bactéria para um segmento periférico localizado de um pulmão de murino. A bactéria multi-plica-se dentro do pulmão, mas está eventualmente desobstruído como um resultado de mecanismos de defesa do hospedeiro e do desenvolvimento de uma resposta imune específica.
Na presente invenção, a proteína de 74 kD é apresentada como uma candidata a uma vacina viável tanto porque os anticorpos elicitados pela proteína de 74 kD são bactericidas como porque os ratos imunizados com a proteína de 74 kD exibem desobstrução pulmonar aumentada de M. catarrhalis no modelo de teste de murino. 22 ΡΕ1005487 A proteína de 74 kD da invenção é também útil na produção de anticorpos policlonais para a utilização em imunização passiva contra a M. catarrhalis. 0 soro policlonal é produzido a partir de animais imunizados com a proteína de 74 kD ou dos seus peptídeos. A proteína de 74 kD é utilizada também para produzir anticorpos monoclonais que podem ser utilizados para diagnosticar a presença de M. catarrhalis numa amostra clinica ou numa estirpe de laboratório. Os anticorpos monoclonais reagem com M. catarrhalis, mas não com outras bactérias.
Por forma a esta invenção ser melhor compreendida, os seguintes exemplos são aqui apresentados. Os exemplos estão apenas com o propósito de ilustrar e não são construídos por forma a limitar o âmbito da invenção.
Exemplos
Exemplo 1
Purificação E Caracterização Da Proteína De 74 kD
Purificação A proteína de 74 kD foi purificada a partir das estirpes 035E e 430-345 utilizando o mesmo procedimento. As 23 ΡΕ1005487 bactérias cresceram em frascos Fernbach contendo 1,3 litros de meio CY (10 g de ácido casamino, 15 g de extracto de levedura por litro de água destilada) a 37°C durante 22 horas com agitação a 200 rpm. As bactérias foram recolhidas por centrifugação (10,000 x g durante 20 minutos), ressuspensas em 50 ml de tampão fosfato (10 mm, pH 6,0) contendo Triton X-100™ a 0,1% (J. T. Baker Inc.,
Philipsburg, NJ), e agitado durante uma hora à temperatura ambiente (RT) . As partículas foram removidas por centrifugação (10, 000 x g, 60 minutos) e o extracto solúvel foi carregado numa coluna de volume do leito de 5 ml de S Sepharose® (Pharmacia, Piscataway, NJ). A coluna foi eluida com um passo de gradiente de NaCl em tampão fosfato a 10 mM (pH 6,0) contendo Triton X-100™ a 0,1%. A proteína de 74 kD foi detectada por tranferência pontual ("dot blotting") utilizando o MAb 72-32. As fracções enriquecidas da proteína de 74 kD (que eluem entre 70-210 mm de NaCl) foram colectadas, e aplicadas a uma coluna de volume do leito de 3 ml de hidroxiapatite (BIO-RAD Laboratories). A coluna foi lavada com tampão fosfato a 10 mM (pH 6,0) e eluida utilizando um passo de gradiente de tampão fosfato (pH 6,0). As fracções enriquecidas de 74 kD foram colectadas, concentradas utilizando um Centriprep®-30 (Amicon, Beverly, MA), e passadas através de uma coluna (2,6 x 100 cm) de Ultrogel AcA 44 (BioSepra Inc., Marlborough, MA) a uma taxa de fluxo de 1,0 ml per minuto em PBS (pH 7,4). A concentração da proteína foi determinada por um micro ensaio de ácido bicinconínico (Micro-BCA) (Pierce, Rockford, IL). 24 ΡΕ1005487 A proteína de 74 kD foi purificada a partir da estirpe de TTA24 por um procedimento ligeiramente diferente. A tentativa inicial de putrificar a proteína de 74 kD a partir da estirpe TTA24 cultivada em meio CY pelo método acima não continha nenhuma proteína. Foi então observado que a TTA24 cultivada em placas de ágar Mueller-Hinton expressa um nível mais elevado da proteína de 74 kD. Assim, a bactéria crescida nestas placas foi utilizada como o material inicial para a purificação. A proteína não se liga à coluna de S Sepharose® sob as condições utilizadas para a proteína de 74 kD de 035E. Em vez disso, foi purificada por passagem sequencial primeiro através de uma coluna de hidroxiapatite, seguida de uma coluna Q High Performance (Pharmacia) e finalmente através de uma coluna de Ultrogel AcA44.
Caracterização A proteína de 74 kD foi associada com células bacterianas cultivadas em meio CY. Foi imediatamente extraída em tampão fosfato (10 mM, pH 6,0) contendo Triton X-100™ a 0,1% após 1 h de agitação à RT. As proteínas de 74 kD das estirpes 035E e 430-345 foram de entre as poucas proteínas de todo o extracto celular as que se ligaram à coluna S, e calculadas para 50-70% da proteína total nas fracções que eram eluídas com tampão fosfato a 10 mM (pH 6,0) contendo 70-210 mM de NaCl. Elas exibem forte ligação com uma coluna de hidroxiapatite e eluem com tampão fosfato 25 ΡΕ1005487 a 500 mM não contendo detergente. O tamanho dos contami-nantes estava na fracção do fluxo que não passou através desta coluna. O maior pico eluído da coluna de exclusão por tamanhos AcA44 contendo uma única banda homóloga com uma massa molecular de 74 kD num SDS-PAGE de gradiente de acrilamida 4-15% corado com azul de Coomassie. A proteína de 74 kD da estirpe TTA24 foi enriquecida pela coluna HÁ. Está entre as poucas proteínas que não se ligam à coluna Q e foi finalmente purificada pela coluna de exclusão por tamanhos. O rendimento das proteínas purificadas, como apresentado na Tabela 1 em baixo são de aproximadamente 1-3 mg a partir de 1,3 litros de meio de cultura.
Tabela 1
Purificação da proteína de 74 kD
Estirpe bacteriana Volume de cultura Rendimento final (mg) 035E 15 L 24 035E 20 L 52 430-345 4 L 4,48 TTA24 20 placas (15 cm de diâmetro) (2 L) 6, 3
As proteínas de 74 kD purificadas foram analisadas por SDS-PAGE de gradiente 4-15% corado com azul de Coomassie e com coloração com prata. A reactividade aos 26 ΡΕ1005487 anticorpos monoclonal e policlonal do soro de rato foi determinada por transferência Western (Fig. 1).
Exemplo 2
Anticorpos Monoclonais
Os MAbs contra a proteína de 74 kD foram produzidos utilizado o procedimento de Chen et al. (11). Em resumo, os ratos (BALB/c) utilizados para a fusão foram imunizados com vesículas de membrana externa produzidas a partir da estirpe 035E de M. catarrhalis. Os hibridomas foram primeiramente rastreados por ELISA contra a totalidade das células bacterianas de 035E. Aqueles que reconheceram a totalidade das células de 035E foram seguidamente testados relativamente à reactividade com a proteína de 74 kD da estirpe 035E purificada tanto por ELISA como por transferência Westernting. A reactividade com respeito às estirpes heterólogas foi determinada por ELISA de célula total. Os hibridomas seleccionados foram clonados por diluição limitante.
Dois dos MAbs reconhecem a proteína de 74 kD purificada tanto por ELISA como por transferência Western. Eles não reagem com a proteína CopB. Quando os MAbs designados por 72-32 e por 81-8 foram testados contra seis outras estirpes de M. catarrhalis por análise de transferência Western, eles reagiram apenas com o isolado homólogo de 035E. Assim, estes dois MAbs reconhecem epítopos específicos de estirpes. A falta de reactividade 27 ΡΕ1005487 para as estirpes heterólogas foi confirmada por ELISA de célula total.
Por conseguinte, todos os clones derivados dessa fusão foram rastreados por ELISA. Uma dúzia de clones possuía reactividade tanto para a proteína de 74 kD purificada como para a totalidade das células bacterianas de 035E, mas nenhum reagiu com as 11 estirpes heterólogas. Apenas cinco dos 12 clones derivados exibiu reactividade à proteína de 74 kD em transferência Western. Os que não reagiram estão provavelmente direccionados contra os epítopos conformacionais.
Estes dados indicam que a proteína de 74 kD possuí epítopos expostos à superfície, e alguns deles podem ser conformacionais. Indicam também que a proteína de 74 kD da estirpe 035E é tanto antigenicamente heterogénea como os epítopos específicos de estirpes são mais imunogénicos do que os epítopos conservados.
Exemplo 3
Nivel De Expressão E Ensaio De Ligação À Transferrina
Existem indicações de que a proteína BI (18) se liga à transferrina e pode ser a proteína B de ligação à transferrina (TbpB) (19). A proteína de 74 kD aqui descrita parece possuir massa molecular similar bem como a heterogeneidade antigénica típica de TbpB. 28 ΡΕ1005487
Foi efectuado um teste inicial para determinar se a proteina de 74 kD purificada se pode ligar à trans-ferrina. Isto foi determinado pela utilização da proteina de 74 kD purificada a partir da estirpe 035E como sonda que foi fixada numa membrana de nitrocelulose com transferrina marcada com biotina. Foi detectada forte reactividade (ver Figura 3) . Assim, a ligação à transferrina é uma propriedade comum da proteina de 74 kD, da BI e da TbpB. Visto que o nivel de expressão das proteínas de ligação à transferrina BI e TbpB de M. catarrhalis está descrito como sendo dependente do conteúdo em ferro do meio de cultura (18, 19) , o próximo passo é determinar se o nível de expressão da 74 kD pode ser aumentado retirando o ferro do meio de cultura. Os métodos utilizados para retirar o ferro incluem tanto a precipitação com fosfato e a quelação com EDDA. A proteína de 74 kD dos lisados de célula total foi quantificada por transferência pontual ("dot blot") e por transferência Western utilizando MAbs. Parece não haver alteração apreciável no nível de expressão na proteína de 74 kD na cultura onde o ferro foi removido (ver Figura 2). No entanto, o nível das proteínas de ligação à transferrina como determinado pela sondagem com transferrina marcada com biotina num ensaio de transferência pontual ("dot blot") é significativamente aumentado na cultura onde o ferro foi removido (ver figura 3). É desconhecido se este aumento se reflecte em alterações no nível de expressão de TbpA ou de TbpB. No entanto, estes resultados preliminares do nivel de expressão da 74 kD sob condições de ferro limitantes não são consistentes com os resultados publicados para a BI e para a TbpB. 29 ΡΕ1005487
Enquanto que o nível de ferro não afecta apreciavelmente a expressão, o crescimento em meios diferentes afecta-a. Os lisados de bactéria ajustados para a mesma absorvância a 550 nm produzidos a partir de diversas estirpes de M. catarrhalis cultivadas em meio ou em placas de ágar foram sondados com anticorpos policlonais contra a proteína de 74 kD purificada num transferência Western. Os anticorpos policlonais foram criados imunizando ratos com a proteína de 74 kD que foi purificada a partir da estirpe 035E. 0 nível de expressão da 74 kD parece ser maior quando a bactéria é cultivada numa placa de ágar Mueller-Hinton do que quando cultivada num meio de cultura (dados não apresentados) . O nível de expressão da proteína de 74 kD parece ser dependente da estirpe. Quando uma baixa diluição do anti-soro contra a proteína de 74 kD da estirpe 035E (1:200) foi utilizada num ensaio por transferência pontual ("dot blot") para reagir com lisados de célula total diluídos seriadamente a partir de sete estirpes de M. catarrhalis, a reactividade mais forte foi observada para as estirpes 035E, 120-345 e 430-345. A reactividade para as outras quatro estirpes foi três a nove vezes menor (ver Figura 4) . Foram efectuadas diversas tentativas para purificar a proteína de 74 kD a partir das estirpes que exibem baixa reactividade, e apenas pequenas quantidades da proteína pareceram estar presentes nestas estirpes. 30 ΡΕ1005487
Exemplo 4
Peso Molecular Da Proteína De 74 kD Determinação do peso molecular por Análise em SDS-PAGE A proteína de 74 kD purificada de 035E de M. catarrhalis foi sujeita a análise em SDS-PAGE (10%, p/v, acrilamida) (34) juntamente com um intervalo vasto de proteínas padrão (Marcador 12: pesos moleculares aparente de 200; 116,3; 97,4; 66,3; 55,4; 36,5; 31; 21,5; 14,4; 6; 3,5 e 2,5 kD) obtido a partir da Novel Experimental Technology, San Diego, CA. O gel foi corado com azul brilhante de Coomassie R-250. O gel descorado foi analisado utilizando um Densitómetro Pessoal SI (Molecular Dynamics Inc., Sunnyvale, CA) . O peso molecular da proteína purificada, estimado utilizando o software de análise FragmeNT (versão 1,1; Molecular Dynamics), foi de aproximadamente 74,9 kD com base nos padrões de peso molecular.
Determinação do Peso Molecular Por Análise por Espectral de Massa MALDI-TOF
Medições adequadas do peso molecular da proteína de 74 kD foram efectuadas por espectrometria de massa de Tempo de Voo (MALDI-TOF) com Dessorção/Ionização de Laser Assistida por Matriz utilizando um analisador de massa linear Lasermat™ 2000 (Finnigan Mat Limited). O Lasermat™ 31 ΡΕ1005487 utiliza a técnica da dessorção de laser assistida por matriz (35) para ionizar a amostra e tempo de voo para analisar os iões produzidos. A amostra foi embutida numa matriz de ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxi-cinâmico (ácido sinapinico) para aumentar a ionização da amostra. Um micro-litro da amostra contendo 5-10 pmol da proteína de 74 kD purificada foi misturado com 1 μΐ da matriz (10 mg/ml) dissolvida em acetonitrilo aquoso a 70% (v/v) contendo ácido trifluoroacético a 0,1% (v/v). Um microlitro desta amostra e a matriz de mistura foram carregadas numa lâmina de amostra, permitiu-se que secassem e foram irradiadas por um por uma rápida luz de UV pulsante a partir de um laser. As amostras de proteínas originam um espectro relativamente simples neste método, desde que os iões relativos à proteína produzida sejam predominantemente de estados de carga Z = +1 [M+H]+ e Z = +2 [M+2H]2+. Foi utilizada a albumina do soro bovino (catálogo no. A0281, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) de peso molecular 66,430,0 para a calibração externa. O peso molecular da proteína de 74 kD na amostra utilizada para a análise de SDS-PAGE acima foi determinado como sendo de 73,987,7, enquanto que o da proteína de 74 kD purificada a partir de TTA24 de M. catarrhalis foi de 73,793,6. Adicionalmente ao [M+H]+ esperado, foram observados também os iões moleculares [M+2H]2+ e ο [M+3H]3+ da proteína de 74 kD. Consequentemente, é razoável concluir que o peso molecular da proteína de 74 kD é de facto de 32 ΡΕ1005487 aproximadamente de 74 kD, dentro dos limites do erro experimental.
Exemplo 5
Análise Da Composição De Aminoácidos
Uma amostra da proteína de 74 kD para a análise de aminoácidos foi hidrolisada em tubos de vidro utilizando 100 μΐ de HC1 a 6 N contendo fenol a 5% e 2-mercaptoetanol a 1 % sob vácuo durante 22 horas a 110°C. As amostras foram subsequentemente secas sob vácuo seguido pela resso-lubilização no tampão de diluição da amostra Na-S (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA, U.S.A.)· A composição de aminoácidos foi determinada num analisador de Aminoácidos 6300 modelo Beckman (36) utilizando um gradiente de Na-citrato de três passos de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados foram expressos em mol de resíduos por mol da proteína de 74 kD com base num peso molecular da proteína de 74 kD de 74, 000. Os resíduos de cisteína e de triptofano não foram determinados. Os resíduos de treonina e serina não foram corrigidos para a destruição causada pelo método de análise utilizado. Nove microlitros de amostra (purificado a partir de 035E de M. catarrhalis - vesículas lavadas com sal) foram secas e sujeitas a hidrólise ácida e subsequente análise de aminoácidos. Os resultados apresentados na Tabela 2 representam o significado da duplicação das determinações. ΡΕ1005487 33
Tabela 2
Composição de Aminoácidos da Proteína de 74 kD
Aminoácido Resíduos por mol Asp + Asn 104 Tre 58 Ser 44 Glu + Gin 67 Pro 27 Gli 77 Ala 56 Vai 35 Met 6 Ile 21 Leu 40 Tir 25 Fen 28 His 8 Lis 72 Arg 21
Exemplo 6
Análise Da Sequência De Aminoácidos Amino-Terminal (N-)
As preparações da proteína de 74 kD purificada foram sujeitas a SDS-PAGE (34) para determinar a homoge- 34 ΡΕ1005487 neidade. As amostras que continham traços de impurezas foram subsequentemente sujeitas a transferência electrofo-rética para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (membrana ProBlott, Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando ácido 3-[ciclohexilamino]-1-propanosulfónico a 10 mM (CAPS), metanol a 10% (pH 11,0) como o tampão de transferência (37). A membrana foi corada com azul brilhante de Coomassie R-250 e a banda principal que corresponde à proteína de 74 kD foi cortada. Foi efectuada a análise da sequência amino-terminal da proteína utilizando um Sequenciador de Proteína/Peptídeo Modelo 477A da Applied Biosystems equipado com um Analisador PTH Modelo 120A Online (Applied Biosystems). Após a clivagem de cada amino-terminal sucessivo, o derivado da anilinotiazolinona formado é convertido na feniltiohidantoina (PTH) derivada mais estável pelo tratamento com ácido trifluoroacético a 25% a 64°C durante 20 minutos. Os derivados da PTH foram separados e identificados no analisador de PTH por HPLC de fase reversa utilizando uma coluna PTH C-18 Brownlee (tamanho da partícula de 5 ym, 2,1 mm i.d. x 22 cm 1.; Applied Biosystems) com um sistema de gradiente de dois solventes modificado desenvolvido pelo fabricante (35). Sumarizam-se seguidamente os resultados da análise da sequência N-terminal de diferentes preparações da proteína de 74 kD:
Para a proteína de 74 kD purificada a partir de 35 ΡΕ1005487 vesículas lavadas com sal da estirpe 035E de M. catar-rhalis, aproximadamente 18,7 μΐ de amostra contendo 20 yg da proteína purificada foram sujeitos a SDS-PAGE seguido por electrotranferência e 20 ciclos da análise da sequência N-terminal da proteína. Os primeiros 13 resíduos foram determinados excepto para um pico não identificado no resíduo 1 (SEQ ID NO: 1):
Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre 15 10
Para a proteína de 74 kD purificada a partir de um extracto de célula total da estirpe 035E de M. catarrhalis, aproximadamente 7,41 μΐ de amostra contendo 20 yg da proteína purificada foram sujeitos a SDS-PAGE seguido por electrotransferência e 25 ciclos da análise da sequência N-terminal da proteína. Os primeiros 17 resíduos foram determinados excepto para um pico não identificado no resíduo 1 (SEQ ID NO: 2):
Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre Pro Ile 15 10 15
Pro Asn
Para a proteína de 74 kD purificada a partir de um extracto de célula total da estirpe TTA24 de M. 36 ΡΕ1005487 catarrhalis, aproximadamente 14,3 μΐ de amostra contendo 74,4 yg da proteína purificada foram directamente depositados no sequenciador e foram efectuados 30 ciclos da análise da sequência N-terminal da proteína. Os primeiros 20 resíduos foram determinados excepto para um pico não identificado no resíduo 1 (SEQ ID NO: 3):
Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre Pro Ile 15 10 15
Pro Asn Ala Ser Gli 20 O pico não identificado no resíduo 1 para cada uma das amostras anteriores era idêntico e seguia o pico PTH-Glu por aproximadamente 0,2 minutos.
Exemplo 7
Análise Da Extensão Da Sequência De Aminoácidos N-Terminal
Durante a análise da sequência N-terminal da proteína de 74 kD, a abundância de resíduos de prolina (Pro) foi reconhecida por causar a terminação prematura da leitura da sequência. Os resíduos de Pro são libertados parcialmente durante o passo de clivagem ácida Standard da sequenciação. A libertação da Pro restante com os resíduos subsequentes causa dificuldade na identificação da sequência. De forma a garantir sequências N-terminais mais 37 ΡΕ1005487 longas da proteína de 74 kD, foi efectuada a extensão da clivagem ácida nos resíduos de Pro. Isto produz melhores resultados, mas provoca um aumento do ruído de fundo dos aminoácidos que parece acontecer devido à sequenciação simultânea de produtos induzidos pela clivagem ácida não específica da proteína de 74 kD. A redução química do ruído de fundo dos aminoácidos efectuada durante a análise da sequência foi levada a cabo em alguns dos ciclos onde os resíduos de prolina ocorrem. Isto foi conseguido introduzindo 0-ftalaldeído, um reagente que reage especificamente com grupos amina de todos os aminoácidos N-terminais primários, sem afectar os resíduos prolil correspondentes, bloqueando assim as cadeias de proteína/peptídeos residuais (ruído de fundo) da sequenciação subsequente (39, 40) .
Vinte miligramas de O-ftalaldeído foram dissolvidos em 50 μΐ de 2-mercaptoetanol em 10 ml de acetonitrilo e colocados no recipiente XI no sequenciador. Vinte e seis microlitros da proteína de 74 kD (quantidade purificada a partir de 035E de M. catarrhalis - extracto de célula total) contendo 80,6 pg de proteína foram colocados no sequenciador. Durante a sequenciação foi efectuada a clivagem extensa do ácido trifluoroacético para os resíduos de Pro em 9, 10, 12, 14 e 16, enquanto que o tratamento com O-f talaldeído foi efectuado para os resíduos de Pro em 9 e 16. Isto conduz a uma redução efectiva do ruído de fundo e resulta na determinação da extensão da sequência N-terminal (os primeiros 27 resíduos) da proteína de 74 kD (SEQ ID NO: 4): 38 ΡΕ1005487
Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre Pro Ile 15 10 15
Pro Asn Ala Ser Gli Ser Gli Asn Tre Gli Asn Tre 20 25
Esta sequência foi analisada utilizando o programa de alinhamento BLAST para pesquisar homologia com outras proteínas. Não foi observada homologia significativa com quaisquer proteínas bacterianas nas bases de dados listadas anteriormente.
Foi utilizado um procedimento similar para obter uma sequência N-terminal para a proteína de 74 kD da estirpe 430-345 de M. catarrhalis. Uma nmol e meia da proteína de 74 kD da estirpe 430-345 de M. catarrhalis foi sujeita a análise da sequência N-terminal da proteína utilizando um Sequenciador Proteína/Peptídeo Modelo 477A da Applied Biosystems equipado com um Analisador PTH Modelo 120A on-line (Applied Biosystems), como descrito em cima. Durante a sequenciação, foi efectuada a clivagem extensa do ácido trifluoroacético para o resíduo de Pro em 14, enquanto que o tratamento com O-ftalaldeído foi efectuado para os resíduos de Pro em 10 e 16. Os primeiros dezoito resíduos N-terminais foram determinados, novamente com o primeiro resíduo a não ser determinado (SEQ ID NO: 5): 39 ΡΕ1005487
Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre Pro Ile 15 10 15
Pro Asn Ala
Exemplo 8
Análise Da Sequência De Aminoácidos Dos Peptídeos Internos
Uma amostra da proteína de 74 kD (1,5 mg de uma quantidade purificada a partir de 035E de M. catarrhalis -extracto de célula total) foi digerida durante a noite a 37°C em PBS com quimotripsina (Boehringer Mannheim Bio-chemicals, Indianapolis, IN) utilizando uma razão de substrato:enzima de 1:60 (p/p). A digestão foi completa como confirmado pela análise por SDS-PAGE. A digestão foi purificada por HPLC de fase reversa utilizando uma coluna Vydac de proteína C4 (tamanho de partícula 5 pm, 0,46 cm i.d. x 25 cm 1; The Separations Group, Hesperia, CA) . As condições da HPLC foram as seguintes: taxa de fluxo 1,0 ml/min; Solvente A = 0,1% de ácido trifluoroacético aquoso; Solvente B = acetonitrilo : água, 80:20 (v/v) contendo ácido trifluoroacético a 0,1% (v/v); gradiente linear de Solvente B de 0-100% durante 45 minutos. Os picos eluídos foram detectados pela sua absorvância a 220 nm e as fracções foram colectadas. As fracções foram secas e cada uma delas foi ressuspensa em 50 μΐ de água As fracções 40 ΡΕ1005487 adequadas foram agrupadas e as alíquotas foram sujeitas a SDS-PAGE de tricina (41) utilizando géis de gradiente 10-18% (v/v, acrilamida) . Os géis foram corados com Azul Brilhante de Coomassie R-250 seguido da transferência para membrana de polivinilideno difluoreto como descrito em cima. Quatro bandas diferentes foram cortadas e sujeitas a análise da sequência de aminoácidos N-terminal. Dois dos peptideos, 'fragmento 1' (SEQ ID NO: 6) e 'fragmento 3' (SEQ ID NO: 8), originaram sequências de 14 resíduos essencialmente idênticas; a única diferença foi que o resíduo N-terminal foi a Tre para o primeiro enquanto que a Gli foi o resíduos correspondente predominante para o último, apesar de poder ser detectada uma pequena quantidade de Tre. Ambas as sequências sobrepõem-se em quatro resíduos com a sequência N-terminal de outro peptídeo 'fragmento 2' (SEQ ID NO: 7) para originar uma cadeia contínua de 25 resíduos de aminoácidos. Visto que a quimotripsina cliva proteínas normalmente no lado carboxi-terminal dos resíduos de Tre, Tir, Fen, Leu e Met, é evidente que a clivagem parcial da ligação de Tir10 - Asn 11 em qualquer dos peptideos 'fragmento 1' ou 'fragmento 3' dá origem ao peptídeo 'fragmento 2'. Por outro lado, a clivagem parcial da ligação Tir4 - Gli5 no 'fragmento 2' permitiu a informação da sequência para lá deste ponto para ser obtida. Também, é evidente que ambos os peptideos 'fragmento 1 ' e 'fragmento 3' foram sequenciados na sua totalidade. - 41 - ΡΕ1005487
Tre Asp Glu Lis Asn Lis Pro Asp Gli Tir Asn Gli Glu Tir 1 5 10 (fragmento 1; SEQ ID NO: 0)
Asn Gli Glu Tir Gli His Ser Ser Glu Fen Tre Vai Asn Fen Lis 15 10 15 (fragmento 2; SEQ ID NO: 7)
Gli Asp Glu Lis Asn Lis Pro Asp Gli Tir Asn Gli Glu Tir (Tre) 1 5 10 (fragmento 3; SEQ ID NO: 8) 25 42 ΡΕ1005487
Em adição ao anteriormente descrito, um quarto peptideo quimotriptico ('fragmento 4' (SEQ ID NO: 9)) originou a seguinte sequência sobre vinte dos seus residuos N-terminais. A Tre no resíduo 20 pode não ser determinada com certeza.
Lis Ser Ile Vai Ile Arg Asp Ala Asp Vai Tre Gli Gli Fen Tir 15 10 15
Tir Pro Asn Ala (Tre) 20 (fragmento 4/ SEQ ID NO: 9)
Estas sequências foram analisadas utilizando o programa de alinhamento BLAST para comparação com outras proteínas nas bases de dados apresentadas anteriormente. O peptideo de 25 aminoácidos criado pela sobreposição dos fragmentos 1 até ao 3 possuía homologia com uma porção conservada da proteína TbpB de Neisseria meningitidis, bem como com uma sequência similar de Haemophilus influenzae. O fragmento 4 apresentou homologia com uma sequência repetitiva na proteína TbpB de Neisseria meningitidis.
Exemplo 9
Actividade Bactericida Do Anti-soro Para A Proteína De 74
kD
Foi efectuado um ensaio bactericida como descrito anteriormente (11). Resumidamente, 50 μΐ de suspensão 43 ΡΕ1005487 bacteriana (aproximadamente 1,200 unidades formadoras de colónias (CFUs) em PBS contendo CaCl2 a 1 mM e MgCl2 a 0,2 mM) foram misturados, e incubados com 25 μΐ do anti-soro contra a proteina de 74 kD (a mesma utilizada na Tabela 1) durante 30 minutos a 4°C. O anti-soro foi testado em diluições de 3 vezes começando a partir de 1:50. Vinte e cinco μΐ de soro humano sem imunoglobulina foram então adicionados como a fonte complementar, e a mistura incubou durante 30 minutos adicionais a 35°C. O número da bactéria viável restante foi determinado colocando 50 μΐ da mistura do ensaio em placas de ágar Mueller-Hinton. O controlo constituído por bactéria, soro de teste e soro complementar que foi inactivado ao calor a 55°C durante 30 minutos. A ELISA de célula total e os títulos bacterianos foram determinados com base nas amostras de soro agrupadas. A percentagem de morte da bactéria foi calculada com a seguinte fórmula: % morte = 100 X (CFU do controlo - CFU da amostra)/(CFU do controlo). A actividade bacteriana do anti-soro foi expressa como um título bacteriano, i. e., a maior diluição de soro que resulta na morte de 50% ou mais da bactéria. O anti-soro de rato criado contra as proteínas de 74 kD em diversos estudos foram testados num ensaio bacteriano contra sete estirpes de M. catarrhalis. Os ratos BALB/c (10 animais/grupo, fêmea, 6-8 semanas de idade no início dos estudo) foram imunizados à seis semanas com 1 pg de antigénios misturados com 25 pg de Stimulon™. Os resultados estão apresentados na Tabela 3: 44 ΡΕ1005487
Tabela 3
Actividade bactericida (BC) do soro anti-74 kD
Estirpe do ensaio Titulo BC do soro 74 da semana 6 para a proteína de kD da estirpe 035E 430- -345 Estudo 1 Estudo 2 Estudo 3 Estudo 2* Estudo 3 035E < 50 < 50 < 50 450 < 50 TTA24 400 50 50 150 150 430-345 ND** 4 050 4 050 4 050 12 150 ATCC25238 400 150 50 450 < 50 125-114 1000 150 150 1 350 450 216-96 1000 50 150 1 350 150 1230-359 < 50 450 ND 1 350 ND * Estirpe 430-345 não foi testada no Estudo 1. ** ND = não efectuado. O soro contra a proteína de 74 kD purificada a partir das estirpes 035E ou 430-345 exibiu a morte da maioria das estirpes (Tabela 3). A estirpe 035E parece ser resistente a efeitos bactericidas elicitados pela proteína de 74 kD dessa estirpe. Os títulos bactericidas variam de estirpe para estirpe e parecem estar correlacionados com os títulos de ELISA de célula total (dados não apresentados). Para quase todas as estirpes ensaiadas, os títulos bactericidas eram maiores para o anti-soro contra a proteína de 74 kD da estirpe 430-345 do que aquele contra a estirpe 035E. Isto é consistente com os títulos de ELISA de célula total. 45 ΡΕ1005487 O soro pré-imune dos mesmos animais não são bactericidas. Assim, os anticorpos para a proteína de 74 kD exibem consistentemente actividades bactericidas contra estirpes heterólogas de M. catarrhalis em vez de baixos títulos de anticorpo por ELISA de célula total. Isto sugere que os anticorpos bactericidas estão direccionados contra os epítopos conservados da proteína de 74 kD.
Os anticorpos contra a proteína de 74 kD da estirpe TTA24 são bactericidas contra as seis estirpes ensaiadas e os títulos são > 500. Estes resultados estão apresentados na Tabela 4:
Tabela 4
Os títulos bactericidas do soro da semana 6 de ratos imunizados com a proteina de 74 kD da estirpe TTA24 ou com uma mistura da proteina de 74 kD das estirpes TTA24 e 430-345
Estirpe do ensaio Anti-soro da Proteina de 74 kD a partir das Estirpes TTA24 TTA24 + 430-345 035E 1 163 948 TTA24 > 6 400 > 6 400 125-114 1 011 1 452 430-345 1 303 > 12 800 216-96 587 326 1230-359 555 1 181 46 ΡΕ1005487 O anti-soro da mistura das proteínas de 74 kD a partir das estirpes TTA24 e 430-345 exibiu títulos bactericidas equivalentes contra as estirpes heterólogas.
Exemplo 10
Efeito Dos Adjuvantes Nos Títulos De ELISA De Célula Total Vários adjuvantes foram comparados para determinar se a selecção do adjuvante pode aumentar a resposta do anticorpo aos epítopos conservados da proteína de 74 kD da estirpe 035E. O soro originado contra a proteína de 74 kD da estirpe 035E foram testados contra sete estirpes de M. catarrhalis por ELISA de célula total. Neste ensaio, os ratos BALB/c (10 animais/grupo, fêmeas, 6-8 semanas de idade no início do estudo) foram imunizados nas semanas 0 e 4 com 1 pg da proteína de 74 kD. As doses dos adjuvantes foram: 25 pg para o Stimulon™ QS-21, 50 pg para o MPL™ , e 100 o fosfato de alumínio (alum) . O soro imune foi produzido em proteínas purificadas da estirpe 035E. Os títulos de ELISA de célula total foram determinados no soro da semana 6 acumulado.
Os resultados estão apresentados na Tabela 5: - 47 - ΡΕ1005487
Tabela 5
Reactividade dos anticorpos elicitados pela proteína de 74 kD utilizando diferentes adjuvantes adjuvante título de ELISA de célula total para a estirpe de M, catarrhalis 035E 430:345 TTA24 ÂTCC 125-114 216-96 1230 solução salina 102 274 17 023 195 160 2 271 270 1 091 QS-21 1 910 012 789 405 1 058 1 083 18 368 5 313 6 061 MPL 1 193 747 213 435 349 769 1 255 122 1 639 Alum 235 736 33 117 484 300 1 488 2 643 1 185 MPL + Alum 2 443 332 138 246 5 380 6 292 14 889 11 205 4 283 48 ΡΕ1005487
Com base nos títulos das estirpes homólogas, dá a impressão que os adjuvantes Stimulon™ QS-21, MPL™, e a mistura MPL™- alum potenciam todos a imunogenicidade da proteína de 74 kD a um grau similar, enquanto que os fosfato de alumínio não parece actuar como um adjuvante. Quando os títulos de ELISA de célula total contra as estirpes heterólogas foram examinados, apenas a proteína de 74 kD adjuvada com o Stimulon™ QS-21 ou com o MPL™-alum elicitou títulos de anticorpos significativos. Os ratos imunizados com a proteína de 74 kD e MPL™ pareciam apresentar títulos de anticorpos mais baixos os quais eram equivalentes àqueles do grupo não adjuvado.
Exemplo 11
Efeito Dos Adjuvantes Nos Títulos Na Actividade Bactericida
Os títulos dos anticorpos foram testados com o soro originado contra a proteína de 74 kD da estirpe 035E utilizando diferentes adjuvantes. Os resultados estão apresentados na Tabela 6:
Tabela 6 A actividade bactericida dos anticorpos elicitados pela proteína de 74 kD utilizando diferentes adjuvantes 49 ΡΕ1005487 adj uvante Títulos BC testados contra 035E 430:345 TTA24 125-114 216-96 1230 solução < 100 891 < 100 < 100 < 100 < 100 salina QS-21 < 100 > 6 400 147 374 180 500 MPL < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 113 Alum < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 < 100 MPL + < 100 443 151 354 216 275 Alum
Apenas o soro criado para a proteína de 74 kD utilizando o Stimulon™ QS-21 ou o adjuvante misturado exibiu actividade bactericida contra as estirpes heteró-logas. Assim, os adjuvantes Stimulon™ QS-21 e o adjuvante misturado parecem aumentar a resposta do anticorpo para os epitopos conservados da proteina de 74 kD.
Exemplo 12
Imunogenicidade Da Proteína De 74 kD Purificada
Ratos BALB/c fêmeas (Taconic Farms, Germantown, NY) , com 6-8 semanas de idade, foram imunizados subcuta-neamente nas semanas o e 4 com 1 yg da proteína de 74 kD purificada formulada com 25 yg do adjuvante Stimulon™ QS-21 salvo indicação em contrário. Os ratos controlo foram injectados com 1 yg de CRMi97 (uma variante não tóxica da toxina da difteria) e com Stimulon™ QS-21. As amostras de soro foram recolhidas nas semanas 0 e 6. Os ratos foram incitados intratraquealmente com 3,5 x 105 CFUs da bactéria cinco dias após a sangria final na semana 7. 50 ΡΕ1005487
A imunogenicidade da proteína de 74 kD purificada foi avaliada nestes ratos em diversos estudos que originaram resultados similares. É apresentado um estudo representativo na Tabela 7. Os títulos de ELISA foram determinados em amostras de soro recolhidas de dez ratos utilizando a proteína purificada como o antigénio de detecção. Como apresentado na Tabela 7 em baixo, a proteína de 74 kD purificada era imunogénica em ratos. A imunização com duas doses de 1 yg de antigénio quatro semanas de diferença elicitou títulos elevados do anticorpo contra a proteína purificada por ELISA (Tabela 7) . Os anticorpos elicitados pelo antigénio da 74 kD purificada quer da estirpe 035E quer da 430-345 reagem fortemente contra o antigénio da 74 kD purificada de ambas as estirpes, sugerindo que as proteínas de 74 kD destas duas estirpes eram antigenicamente similares. Quando este soro foi testado contra a proteína de 74 kD purificada a partir da estirpe TTA24 por ELISA, foram detectados baixos títulos (Tabela 7). Assim, a proteína de 74 kD da estirpe TTA24 parece diferir antigenicamente das proteínas de 74 kD das estirpes 035E ou 430-345. No entanto, quando os anticorpos produzidos contra a proteína de 74 kD da estirpe TTA24 foram testados contra a proteína da estirpe 035E, foi detectado um título moderado. Isto sugere que existe alguma conservação entre as proteínas de 74 kD da estirpe TTA24 e 035E, e os epítopos específicos da estirpe podem ser mais imunogénicos do que os epítopos conservados na proteína de 74 kD da estirpe 035E. O anti-soro não reagiu com outras proteínas de M. catarrhalis testadas, nomeadamente CopB recombinante, C/D 51 ΡΕ1005487 recombinante, ou UspA purificada, como avaliado por ELISA ou por transferência Western (dados não apresentados).
Tabela 7
Imunogenicidade da Proteína de 74 kD de Várias Estirpes
Proteína de Título da IgG do soro da semana 6 elicitado 74 kD a par- pela proteína de 74 kD da estirpe tir da estirpe 035E 430-345 TTA24 035E 714 085 952 314 10 580 TTA24 144 520 6 856 399 430-345 364 620 2 328 895 ND O anti-soro produzido em ratos contra as proteínas de 74 kD das estirpes 035E e 430-345 foi testado num ELISA de célula total contra várias estirpes de M. catarrhalis. As doses na coluna 1, 3 e 5 da Tabela 8 em baixo eram de 2 x 1 pg de proteína/ as doses na coluna 2 e a eram de 2 x 5 pg de proteína. O adjuvante utilizado foi 25 pg de Stimulon™ QS-21. Este soro exibiu títulos elevados em ELISA de célula total contra as estirpes 035E e 430-345, mas os títulos para outras 5 estirpes eram muito mais baixas (Tabela 8). Quando os lisados de célula total de nove estirpes de M. catarrhalis foram determinados por SDS-PAGE a 4-15%, fixados numa membrana de nitrocelulose e sondados com o anti-soro contra a proteína de 74 kD, apenas uma única banda na região de 74 kD foi detectada para todos os isolados (ver Figura 5) . Isto indica que os títulos contra todas as células bacterianas se devem à reactividade específica para a proteína de 74 kD. ΡΕ1005487 - 52 -
Tabela 8
Imunogenicidade da Proteína de 74 kD das Estirpes 035E e 430-345: títulos de IgG por ELISA de célula total
Estirpe do Anti-soro de rato para a proteína de 74 kD da estirpe ensaio 035E 035E 035E 430-345 430-345 035E 407 052 615 078 443 282 1 155 447 2 338 191 430-345 145 084 160 387 170 075 724 369 591 861 TTA24 3 458 203 532 711 2 105 ATCC25238 7 203 618 659 2 542 2 028 125-114 3 990 174 899 4 488 3 042 218-98 7 163 593 394 3 518 12 576 1230-359 7 417 4 609 2 726 5 518 4 390 53 ΡΕ1005487 A proteína de 74 kD da estirpe TTA24: É óbvio que as proteínas de 74 kD das estirpes 035E e 430-345 são antigenicamente similares. Os anticorpos elicitados pela proteína de 74 kD destas duas estirpes reagem muito pouco com muitas outras estirpes de M. catarrhalis, incluindo a estirpe TTA24. Devido a esta observação, a proteína de 74 kD da estirpe TTA24 foi purificada e testada em ratos para determinar se exibia um padrão de conservação similar. Como parte desta experiência, foi também testada uma mistura das duas proteínas de 74 kD antigenicamente diferentes.
Ratos BALB/c (10 animais/grupo, fêmeas, 6-8 semanas de idade no início do estudo) foram imunizados nas semanas 0 e 4 com 5 pg da proteína de 74 kD (10 pg para o grupo da mistura das 74 kD) juntamente com 25 pg do Stimulon™ QS-21. Os títulos de ELISA de célula total foram determinados em amostras de soro acumuladas. O soro contra a 74 kD da estirpe 035E de um estudo prévio foi incluído no ensaio como referência. Os resultados estão apresentados na Tabela 9:
Tabela 9 A imunogenicidade da proteína de 74 kD da estirpes TTA24 e a reactividade do anticorpo a estirpes heterólogas 54 ΡΕ1005487
Estirpe do ensaio Título de IgG do soro produzido kD da estirpe contra a 74 TTA24 TTA24 + 430-345 035E 035E 26 448 568 446 958 469 430-345 51 460 731 124 376 289 1230-359 28 470 68 757 59 666 TTA24 1 832 305 1 386 747 659 125-114 44 838 24 971 777 216-96 97 751 86 375 4 202 ATCC25238 55 873 56 031 6 159 111-210 52 369 85 800 2 708 301-221 246 416 156 427 369 205-221 10 025 6 272 598 324-171 300 613 154 140 655
Os resultados da Tabela 9 indicam que os anticorpos elicitados pela proteína de 74 kD da estirpe TTA24 exibiram um título bastante elevado contra a estirpe homóloga e títulos moderadamente elevados contra 10 estirpes heterólogas por ELISA de célula total. Os títulos contra as estirpes heterólogas são significativamente mais elevados do que aqueles do soro elicitado pelas proteínas de 74 kD das estirpes 035E e 430-345. A reactividade específica do soro para a proteína de 74 kD foi confirmada por transferência Western (Fig. 6 em baixo).
Como esperado, um conjunto de proteínas de 74 kD das estirpes TTA24 e 430-345 elicitou um elevado nível de 55 ΡΕ1005487 anticorpos contra as estirpes homólogas e a estirpe 035E antigenicamente relacionada. Tanto os titulos dos anticorpos de ELISA como dos anticorpos bactericidas contra quaisquer outras estirpes eram praticamente os mesmos do que os títulos elicitados apenas pela proteína de 74 kD da estirpe TTA24 (Tabela 9) . A reactividade específica do anticorpo para a proteína de 74 kD foi confirmada por transferência Western (Fig. 6 em cima).
Em resumo, a proteína de 74 kD das estirpes de M. catarrhalis parece exibir variação antigénica. A estirpe TTA24 parece expressar uma forma da proteína de 74 kD que está mais bem conservada do que aquelas das estirpes 035E e 430-345. A proteina de 74 kD da estirpe TTA24 elicita anticorpos reactivos a todas as estirpes de M. catarrhalis ensaiadas. Parece também desnecessário utilizar uma mistura das proteínas de 74 kD para criar uma boa resposta.
Exemplo 13
Aumento Da Desobstrução Pulmonar De M. catarrhalis Em Ratos
Para determinar se a imunização com a proteína de 74 kD purificada pode aumentar a desobstrução pulmonar do depósito bacteriano intratraquealmente num modelo de murino, os ratos imunizados com a proteína de 74 kD preparada a partir das estirpes 035E e 430-345 foram incitados com as estirpes 035E ou TTA24 de M. catarrhalis. O incitamento foi efectuado utilizando um procedimento previamente descrito (11). Em resumo, 3,5 x 105 CFUs da bactéria de uma cultura semi-logarítmica foram introduzidos 56 ΡΕ1005487 lentamente intratraquealmente nos pulmões de ratos anestesiados por injecção intramuscular de uma mistura de 2 mg de Cetamina HC1 (Fort Dodge Lab., Ford Dodge, IA) e 0,2 mg de maleato de acepromazina (Butler Co., Columbus, OH) . Foi recolhida bactéria viável dos pulmões dos ratos seis horas após a incitação, e a percentagem de desobstrução bacte-riana em ratos imunizados foi determinada relativamente aos CFUs recolhidos dos animais de controlo. Os animais de controlo foram imunizados com CRM197 e Stimulon™ QS-21. Foi efectuada análise estatística utilizando teste de Wilcoxon rank sum (JMP Software, SAS Institute, Cary, NC) . Um valor de probabilidade (p) de menos do que 0,05 foi considerado significativo estatisticamente.
Oito grupos de ratos de diversos estudos que foram imunizados com a proteína de 74 kD purificada a partir da estirpe 035E foram incitados quer com a estirpe 035E quer com a TTA24. Os Grupos 9 e 10 foram imunizados com a proteína de 74 kD da estirpe 430-345 e incitados quer com a estirpe 035E (grupo 9) quer com a estirpe TTA24 (grupo 10) . Ratos BALB/c (fêmeas, 6-8 semanas de idade no início do estudo, 10 por grupo) foram imunizados nas semanas 0 e 4 com 1 yg de antigénios misturado com 25 yg do Stimulon™ QS-21. O soro recolhido 4 dias antes do incitamento, foi testado contra a estirpe de incitamento por ELISA de célula total. Os resultados estão expressos como títulos limite de IgG nas amostras recolhidas. O controlo CRM197 tinha os títulos de ELISA de menos de 100 no mesmo ensaio. OS ratos foram incitados intratraquealmente com 3,5 x 105 CFUs de bactéria e foi recolhida bactéria 57 ΡΕ1005487 viável dos pulmões 6 horas após a incitação. A percentagem de desobstrução é a é a percentagem da bactéria desobstruída dos ratos imunizados comparada com o controlo que foi imunizado com CRMi97 e Stimulon™ QS-21. Os resultados do estudo da desobstrução pulmonar são apresentados na Tabela 10:
Tabela 10
Desobstrução pulmonar de M. de murino após catarrhalis num modelo de teste a imunização activa
Grupo Fonte de 74 kD Estirpe incitada Titulo de % de ELISA desobstrução Valor p 1 035E 035E 407 000 68 0,0002 2 035E 035E 168 000 70 0,0006 3 035E 035E 102 274 63 0,0025 4 035E 035E 1 910 012 52 0,0004 5 035E 035E 1 193 747 57 0,0114 6 035E 035E 235 736 47 0,0047 7 035E 035E 2 443 332 56 0,0003 8 035E TTA24 140 - 35 LO \—1 O 9 430-345 035E 627 148 49 0,0043 10 430-345 TTA24 337 - 11 0,41 11 TTA24 035E 26 341 29 0,318 12 TTA24 TTA24 673 754 76 0,009 A desobstrução bacteriana relativa ao controlo para cada experiência foi considerada estatisticamente 58 ΡΕ1005487 significativa pelo teste Wilcoxon signed rank se p for menor do que 0,05.
Relativamente aos ratos controlo imunizados com CRM197, a desobstrução pulmonar aumentada da bactéria hete-róloga foi observada apenas para os ratos incitados com a estirpe 035E (Tabela 10). A falta de desobstrução aumentada de TTA24 foi consistente com a fraca reactividade do anticorpo contra esta estirpe na ELISA de célula total (ver Tabela 8) . A desobstrução aumentada de 035E, mas não da estirpe TTA24, foi também observada em ratos imunizados com a proteina de 74 kD purificada da estirpe 430-345 (Tabela 10) . Isto correlaciona-se de novo com a reactividade de célula total dos anticorpos. A proteina de 74 kD de TTA24 aparenta ser antigenicamente diferente das estirpes 035E ou 430-345. Isto pode explicar a incapacidade dos ratos imunizados com as proteínas de 74 kD para desobstruir esta estirpe. Os dados dos animais incitados sugere que a imunização com a proteína de 74 kD purificada irá induzir um aumento da desobstrução pulmonar das estirpes de M. catarrhalis na capacidade de produção de proteínas de 74 kD antigenicamente similares.
Exemplo 14
Detecção Dos Anticorpos Do Soro Humano Para A Proteína De 74 kD
Estudos indicam que o soro de adultos saudáveis contém anticorpos adquiridos naturalmente específicos para a M. catarrhalis (dados não apresentados). Para determinar 59 ΡΕ1005487 se estes são direccionados contra a proteína de 74 kD, o soro de seis adultos saudáveis foi testado para reactivi-dade com a proteína de 74 kD purificada a partir das estirpes 035E e TTA24 por ELISA. Todos os seis soros possuíam títulos detectáveis, e os títulos para a proteína de 74 kD da estirpe TTA24 eram os maiores como apresentado na Tabela 11:
Tabela 11
Soro humano normal contendo anticorpos adquiridos naturalmente para a proteína de 74 kD
Soro humano Títulos de IgG por ELISA para 74 kD (035E) 74 kD (TTA24) 1 (H92-X) 213 2 928 2 (H89-M) 591 10 148 3 (H89-L) 1 203 5 944 4 (H89-D) 1 053 5 932 5 (Kaku) 1 361 9 415 6 (Kconv) 4 683 21 592 A reactividade específica para a proteína de 74 kD foi observada para todos os soros em transferência Western (ver Figura 7). Isto indica que a proteína de 74 kD é expressa pela M. catarrhalis in vivo e é um alvo da resposta do anticorpo. 60 ΡΕ1005487
Exemplo 15
Purificação De Anticorpos Específicos DA 74 kD A Partir De
Plasma Humano
Para determinar se os anticorpos humanos para a proteína de 74 kD reconhecem os epítopos na superfície bacteriana, os anticorpo específicos da 74 kD a partir do plasma recolhido de dois adultos saudáveis (American Red Cross, Rochester, N. Y.) foram purificados por afinidade. Os anticorpos foram precipitados adicionando sulfato de amónio a 50% da saturação, ressuspensos e dialisados contra PBS. Uma membrana de nitrocelulose (2x3 polegadas) foi incubada com a proteína de 74 kD purificada da estirpe 035E a 1,0 mg/ml em PBS durante uma hora à RT, lavada duas vezes com PBS e os sítios de ligação residuais na membrana foram bloqueados com leite em pó a 5% (p/v) em PBS durante duas horas à RT. A membrana foi seguidamente lavada duas vezes com PBS, glicina a 100 mM (pH 2,5) e finalmente com PBS antes da incubação com a preparação de anticorpos diali-sada. Após a incubação durante quatro horas a 4°C, a membrana foi lavada com PBS, e seguidamente com tampão tris a 10 mM (pH 8,0) contendo cloreto de sódio a 1 M para remover proteínas de ligação não específica. Os anticorpos de ligação foram eluídos incubando a membrana em 5 ml de glicina a 100 M (pH 2,5) durante dois minutos e agitando. Um mL de tris-HCl (1 M, pH 8,0) foi imediatamente adicionado ao eluído para neutralizar o pH. Os anticorpos eluídos foram dialisados contra PBS, aliquotados, e armazenados a -20 °C. 61 ΡΕ1005487
Como demonstrado na Figura 8, um transferência Western confirmou que o anticorpo purificado reage especi-ficamente com a proteína de 74 kD, mas não reage com outras proteínas de membrana externa dos lisados de célula total da estirpe 035E.
Os títulos limite de ELISA são as maiores diluições dos anticorpos originando uma A4i5 maior do que três vezes o ruído de fundo quando ensaiados contra a totalidade das células bacterianas. Como demonstrado na Tabela 12, apesar dos anticorpos serem preparados utilizando a proteína de 74 kD da estirpe 035E e da estirpe TTA24, cada uma reage com cinco outras estirpes por ELISA de célula total com títulos similares:
Tabela 12 A reactividade da totalidade das células dos anticorpos específicos da proteína de 74 kD purificados a partir de plasma humano adulto
Estirpe do Ensaio Títulos IgG de anticorpos utilizando 035E Purificados TTA24 035E 4 420 1 580 TTA24 504 1 164 ATCC25238 1 325 2 230 125:114 3 015 2 130 216:96 2 859 1 155 120-359 1 960 822 62 ΡΕ1005487
Os resultados apresentados na Tabela 12 indicam que os humanos desencadeiam uma resposta ao anticorpo para a os epitopos de superfície conservados da proteina de 74 kD após a infecção natural.
Exemplo 16
Inibição da Ligação À Transferrina
Devido à transferrina poder ser uma fonte de ferro in vivo para M. catarrhalis, a ligação de anticorpos à proteina de 74 kD na superfície bacteriana pode interromper o processo de aquisição de ferro. A transferência pontual ("dot blotting") foi utilizada para determinar se os anticorpos contra a proteina de 74 kD podem inibir a ligação à transferrina no lisado bacteriano. Três micro-litros de lisado de 035E foram aplicados a uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi bloqueada com PBS contendo leite em pó a 5%, seguida da incubação com anti-soro de rato (1:100 diluido em PBS contendo leite em pó a 5%) para a proteina de 74 kD da estirpe 035E durante duas horas à temperatura ambiente. O soro de rato normal e o anti-soro de rato para UspA foram incluídos como controlos. A membrana foi seguidamente incubada sequencialmente com transferrina marcada com biotina, estreptavidina - fosfa-tase alcalina e o substracto da enzima como descrito em cima. Como descrito na Figura 9, uma redução da ligação à transferrina foi observada com anticorpos para a proteina 63 ΡΕ1005487 de 74 kD. Em contraste, nem um soro de rato normal nem soro anti-UspA interferem com a ligação à transferrina. Isto sugere que os anticorpos para a proteína de 74 kD inibem especificamente a ligação à transferrina.
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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: American Cyanamid Company (B) RUA: Five Giralda Farras (C) CIDADE: Madison (D) ESTADO: New Jersey (E) PAÍS: Estados Unidos (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 07940 (G) TELEFONE: 973/683-2157 (H) TELEFAX: 973/683-4117 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: A Proteína de Membrana Externa de 74 Kilodalton a partir de Moraxella catarrhalis (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 9 (iv) SUPORTE INFORMÁTICO: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: PC IBM compatível
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0, Versão #1,30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID. NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:
Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID. NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:
Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre Pro Ile Pro 15 10 15
Asn 69 ΡΕ1005487 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID. NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:
Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre Pro Ile Pro 15 10 15
Asn Ala Ser Gli 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID. NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:
Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre Pro Ile Pro 15 10 15
Asn Ala Ser Gli Ser Gli Asn Tre Gli Asn Tre 20 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID. NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:
Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre Pro Ile Pro 15 10 15
Asn Ala 70 ΡΕ1005487 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID. NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:
Tre Asp Glu Lis Asn Lis Pro Asp Gli Tir Asn Gli Glu Tir 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID. NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:
Asn Gli Glu Tir Gli His Ser Ser Glu Fen Tre Vai Asn Fen Lis 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID. NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:
Tre Asp Glu Lis Asn Lis Pro Asp Gli Tir Asn Gli Glu Tir 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ. ID. NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: (D) TOPOLOGIA: linear 71 ΡΕ1005487 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: peptídeo (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:
Lis Ser Ile Vai Ile Arg Asp Ala Asp Vai Tre Gli Gli Fen Tir Tir 15 10 15
Pro Asn Ala Tre 20
Lisboa, 20 de Outubro de 2006
Claims (18)
- ΡΕ1005487 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteina de 74 kD de M. catarrhalis isolada e purificada a partir da estirpe 035E ou TTA24 de M. catarrhalis para elicitar anti-soro contendo uma actividade bactericida contra uma estirpe heteróloga de M. catarrhalis num hospedeiro mamífero, em que a proteína de 74 kD tem: (a) um peso molecular de aproximadamente 74 kD quando medido por espectrometria de massa; e (b) a sequência de aminoácidos amino-terminal: Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre (SEQ ID NO: 1), onde o primeiro resíduo não está identificado.
- 2. A proteína de 74 kD isolada e purificada a partir da estirpe 035E de M. catarrhalis de acordo com a reivindicação 1 contendo a sequência de aminoácidos amino-terminal : Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre Pro Ile Pro Asn (SEQ ID NO: 2).
- 3. A proteína de 74 kD isolada e purificada a partir da estirpe TTA24 de M. catarrhalis da reivindicação 1 contendo a sequência de aminoácidos amino-terminal: Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre Pro Ile Pro Asn Ala Ser Gli (SEQ ID NO: 3).
- 4. A proteína de 74 kD isolada e purificada a 2 ΡΕ1005487 partir da estirpe 035E de M. catarrhalis da reivindicação 1 contendo a sequência de aminoácidos amino-terminal: Xaa Gli Gli Ser Gli Gli Ser Asn Pro Pro Ala Pro Tre Pro Ile Pro Asn Ala Ser Gli Ser Gli Asn Tre Gli Asn Tre (SEQ ID NO: 4) .
- 5. A proteina de 74 kD isolada e purificada da reivindicação 1 possuindo um peso molecular de aproximada-mente 74,9 kD quando medido num gel SDS-PAGE a 10%.
- 6. A proteina de 74 kD isolada e purificada da reivindicação 1 contendo a composição de aminoácidos de resíduos por mol da proteína de 74 kD de aproximadamente Asp + Asn =104, Tre = 58, Ser = 44, Glu + Gin = 67, Pro = 27, Gli = 77, Ala = 56, Vai = 35, Met = 6, Ile = 21, Leu = 40, Tir = 25, Fen = 28, His = 8, Lis = 72, Arg = : 21, onde os resíduos de Cis e Trp não estão determinados.
- 7. Uma composição de vacina compreendendo uma proteína de 74 kD isolada e purificada a partir da estirpe 035E ou TTA24 de M. catarrhalis como definida em qualquer das reivindicações de 1 a 6.
- 8. A composição da vacina da reivindicação 7 que compreende adicionalmente um adjuvante, diluente ou veículo de transporte.
- 9. A composição da vacina da reivindicação 8 em que o adjuvante é seleccionado a partir do grupo consti- 3 ΡΕ1005487 tuído por hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, Stimulon™ QS-21, 3-0-monofosforil desacilado-lípido A e IL-12.
- 10. A composição da vacina da reivindicação 7 que compreende adicionalmente pelo menos um antigénio adicional de M. catarrhalis.
- 11. A composição da vacina da reivindicação 10, em que o antigénio adicional de M. catarrhalis é seleccio-nado a partir do grupo constituído pelas proteínas designadas por CopB, UspA, C/D e E.
- 12. A composição da vacina da reivindicação 7, em que a proteína de 74 kD é acoplada a um agente que protege contra outro organismo patogénico.
- 13. A composição da vacina da reivindicação 7, em que a proteína de 74 kD é acoplada à outra parte antigénica de M. catarrhalis.
- 14. Uma proteína de 74 kD isolada e purificada a partir de M. catarrhalis como definida em qualquer das reivindicações 1-6 para utilização em terapia.
- 15. Uma proteína de 74 kD isolada e purificada a partir de M. catarrhalis como definida na reivindicação 14 que está acoplada a um agente que protege contra outro organismo patogénico. 4 ΡΕ1005487
- 16. Uma proteína de 74 kD isolada e purificada a partir de M. catarrhalis como definida na reivindicação 14 que está acoplada à outra parte antigénica de M. catarrhalis .
- 17. A utilização de uma proteína de 74 kD isolada e purificada a partir de M. catarrhalis como definida, em qualquer das reivindicações 1 a 6 ou 14 a 16 para utilização na preparação de uma composição de vacina numa quantidade que elicite uma resposta imune protectora contra uma estirpe heteróloga de M. catarrhalis num hospedeiro mamífero .
- 18. Um método para a preparação de uma composição de vacina a qual compreende a inclusão da proteína de 74 kD isolada e purificada a partir de M. catarrhalis da reivindicação 1 numa quantidade suficiente tal que a dita composição de vacina elicite uma resposta imune protectora contra uma estirpe heteróloga de M. catarrhalis num hospedeiro mamífero. Lisboa, 20 de Outubro de 2006
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