ES2271987T3 - Proteina de 74 kilodalton de la membrana externa de moraxella catarrhalis. - Google Patents
Proteina de 74 kilodalton de la membrana externa de moraxella catarrhalis. Download PDFInfo
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Abstract
Proteína de M. catarrhalis de 74 kD aislada y purificada de la cepa O35E o TTA24 de M. catarrhalis, para la generación de antisueros que presentan actividad bactericida frente a una cepa heteróloga de M. catarrhalis en un hospedador mamífero, en la que la proteína de 74 kD presenta: (a) un peso molecular de aproximadamente 74 kD como se ha medido por espectrometría de masas; y (b) la secuencia aminoácida amino-terminal: Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala Pro Thr (SEC ID nº: 1), en la que el primer residuo no está identificado.
Description
Proteína de 74 kilodalton de la membrana externa
de Moraxella catarrhalis.
La presente invención se refiere a una proteína
de la membrana externa, de aproximadamente 74.000 daltons (74 kD),
purificada a partir de Moraxella catarrhalis.
Moraxella (Branhamella) catarrhalis es
uno de los principales patógenos bacterianos que causa otitis media
en niños (citas bibliográficas 1, 2, 3, 4). También causa sinusitis,
laringitis, traqueitis, neumonía y otras enfermedades respiratorias
en niños y adultos (5, 6, 7). Está claro que se necesita una vacuna
profiláctica, ya que casi todas las cepas clínicas aisladas son
resistentes a los antibióticos \beta-lactámicos
(8, 9).
Las proteínas de la membrana externa (PME) de
M. catarrhalis están siendo investigadas como posibles
candidatas a vacunas debido a que son de fácil acceso para los
anticuerpos. De hecho, los anticuerpos generados en ratones contra
ciertas PME, incluidas UspA y CopB, han demostrado tener actividad
biológica, tal como actividad bactericida, actividad bloqueante de
la adhesión y mayor eliminación pulmonar de las bacterias en un
modelo animal (10, 11, 12, 13). Los datos serológicos de seres
humanos que han sufrido recientemente una infección por M.
catarrhalis indican que las personas generan anticuerpos contra
las PME tras la infección natural (14, 15, 16, 17, 18). Este hecho
apunta a que las PME constituyen dianas para los mecanismos de
defensa del hospedador. El suero humano normal contiene anticuerpos
específicos contra UspA, y dichos anticuerpos tienen actividad
bactericida. También se encuentran elevados niveles de anticuerpos
contra PME de aproximadamente 80 kD en el suero tanto de personas
normales como de pacientes que se están recuperando de infecciones
recientes por M. catarrhalis (16). Varias proteínas de M.
catarrhalis migran en este intervalo de tamaño. Entre ellas se
encuentran CopB (12), la proteína B1 (18), una proteína que se une a
la transferrina (TbpB) y una proteína que se une a la lactoferrina
(LbpB) (19). Todavía no se ha determinado si estas proteínas son
idénticas o diferentes. No obstante, ninguna de ellas ha sido
evaluada en forma purificada para su utilización en vacunas.
Una vacuna eficaz que ofrezca protección contra
enfermedades causadas por M. catarrhalis debería conferir
protección en todas las etapas de la enfermedad. Estas etapas
incluyen la colonización bacteriana de las superficies de las
mucosas, la multiplicación, extensión e invasión bacterianas, y el
desarrollo de la respuesta inflamatoria. Pueden ser necesarios
múltiples componentes bacterianos para formular una vacuna eficaz.
Aunque hay datos preclínicos que indican que algunos componentes de
la superficie de M. catarrhalis son posibles antígenos para
vacunas, no está todavía claro si estos componentes conferirán
suficiente inmunidad protectora en los seres humanos. Por tanto, es
importante identificar y evaluar nuevos antígenos bacterianos para
su utilización en vacunas.
Por consiguiente, un objetivo de la presente
invención consiste en aislar, purificar y caracterizar una proteína
adicional de M. catarrhalis. Otro objetivo de la presente
invención consiste en verificar si dicha proteína es un candidato
viable para vacunas en sistemas modelo adecuados.
Éstos y otros objetivos de la invención se
consiguen, tal como se explica a continuación, mediante el
aislamiento y la purificación de una proteína de la cepa O35E o
TTA24 de M. catarrhalis que se denomina proteína de 74 kD,
sobre la base del peso molecular aproximado medido por
espectrometría de masas. La proteína de 74 kD aislada y purificada
de M. catarrhalis tiene una secuencia aminoácida
amino-terminal que está conservada en varias cepas
de M. catarrhalis. Esta secuencia aminoácida
amino-terminal comprende la secuencia Xaa Gly Gly
Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala Pro Thr (SEC ID nº: 1), en la que el
primer residuo no está identificado. La proteína de la presente
invención tiene un peso molecular, medido por espectrometría de
masas, de aproximadamente 74 kD.
En otra forma de realización de la presente
invención, la proteína de 74 kD aislada y purificada se utiliza para
preparar una composición de vacuna que genera una respuesta
inmunitaria protectora en un hospedador mamífero. La composición de
vacuna puede comprender además un adyuvante, diluyente o excipiente.
Los ejemplos de dichos adyuvantes incluyen hidróxido de aluminio,
fosfato de aluminio, MPL™, Stimulon™ QS-21, e
IL-12. La composición de vacuna se administra a un
hospedador mamífero en una cantidad inmunógena suficiente para
proteger al hospedador contra la enfermedad causada por M.
catarrhalis.
La Figura 1 presenta la caracterización de la
proteína de 74 kD purificada a partir de la cepa O35E por
SDS-PAGE e inmunoelectrotransferencias. La Figura 1A
presenta un gel de SDS-PAGE al 4-15%
teñido con azul de Coomassie, que muestra el enriquecimiento de la
proteína de 74 kD eluida de la columna S (calle 2) y de la columna
de hidroxiapatito (calle 3). Los patrones de peso molecular (calle
1: 200 (miosina); 160 (\beta-galactosidasa); 97
(fosforilasa); 66 (seroalbúmina); 45 (ovoalbúmina); 31 (anhidrasa
carbónica); 21 (inhibidor de tripsina); 14 (lisozima)) se expresan
en miles. La Figura 1B presenta la proteína de 74 kD purificada por
tinción con plata; la carga fue 3 \mug (calle 1), 15 \mug (calle
2) y 30 \mug (calle 3). La Figura 1C presenta
inmunoelectrotransferencias detectadas con antisuero de ratón contra
la proteína de 74 kD purificada (calle 1) o con MAb
72-32 (calle 2).
La Figura 2 presenta el nivel de expresión de la
proteína de 74 kD por la cepa O35E en diferentes condiciones de
cultivo. Las bacterias se cultivaron en infusión normal de corazón y
cerebro (BHI), BHI enriquecida con etilendiaminodiacetato (EDDA) 10
mM o hierro 100 \muM. Los lisados bacterianos aplicados a la
membrana fueron detectados con MAb 72-32 en ensayos
de transferencia de puntos e inmunoelectrotransferencias.
La Figura 3 presenta la expresión de proteínas
que se unen a la transferrina por la cepa O35E en diferentes
condiciones de cultivo. Las muestras de la membrana correspondían a
lisados bacterianos, tal como se describe en el caso de la Figura 2.
La unión a la transferrina por la proteína de 74 kD purificada se
muestra en la cuarta columna.
La Figura 4 presenta la variación en el nivel de
expresión de la proteína de 74 kD por las cepas de M.
catarrhalis. Se titularon lisados bacterianos procedentes de
siete cepas de M. catarrhalis en diluciones de 3 veces en una
prueba de transferencia de puntos, y se detectaron con anticuerpos
policlonales de ratón contra la proteína de 74 kD purificada a
partir de la cepa O35E (1:200).
La Figura 5 presenta la reactividad del suero de
ratón anti-74 kD dirigido contra cepas heterólogas
de M. catarrhalis. Los lisados bacterianos que contenían 10
\mug de proteína total se resolvieron en SDS-PAGE
al 4-15% y se analizaron en una
inmunoelectrotransferencia con antisuero de ratón contra la proteína
de 74 kD purificada a partir de la cepa O35E (1:5.000). Las calles
2-10 corresponden a las cepas O35E, TTA24,
ATCC25238, 324-171, 128-179,
430-345, 111-210,
219-96 y 1230-359, respectivamente.
Los patrones de peso molecular (calle 1) son 133 kD
(\beta-galactosidasa) y 71 kD (seroalbúmina
bovina).
La Figura 6 presenta el análisis por
inmunoelectrotransferencia de antisueros de ratón dirigidos contra
la proteína de 74 kD de la cepa TTA24 (zona inferior) o proteínas de
74 kD mezcladas procedentes de las cepas TTA24 y
430-345 (zona superior). Cada calle se cargó con 10
\mug de lisados bacterianos completos, o con 1,5 \mug de la
proteína de 74 kD purificada. Los antisueros procedían de la
extracción de sangre de la semana 6, diluida 1:1.000.
La Figura 7 ilustra la presencia de anticuerpos
contra la proteína de 74 kD en sueros humanos normales. La proteína
de 74 kD purificada a partir de la cepa O35E se hizo reaccionar con
cinco muestras de suero (calles 2-6) procedentes de
adultos sanos en una prueba de inmunoelectrotransferencia. Los
patrones de peso molecular mostrados en la calle 1 son los mismos
que los descritos en la Figura 5.
La Figura 8 presenta la reactividad de
anticuerpos contra la proteína de 74 kD purificados a partir de
suero de adultos dirigido contra lisados bacterianos completos. Los
lisados de la cepa O35E que contenían 10 \mug de proteína se
hicieron reaccionar con anticuerpos humanos, purificados por
afinidad, dirigidos contra la proteína de 74 kD en una prueba de
inmunoelectrotransferencia (calle 2). Los patrones de peso molecular
mostrados en la calle 1 son los mismos que los descritos en la
Figura 5,
La Figura 9 presenta la inhibición de la unión a
la transferrina por anticuerpos contra la proteína de 74 kD. Se
transfirieron diversas cantidades de lisado de O35E a una membrana
de nitrocelulosa. La membrana se incubó con PBS (panel A); suero
normal de ratón diluido 1:100 (panel B); antisuero contra la
proteína de 74 kDa de la cepa O35E (panel C); o antisuero testigo
contra la UspA (panel D). A continuación se hicieron reaccionar las
membranas con transferrina marcada con biotina.
La presente invención se refiere a una proteína
de M. catarrhalis aislada y purificada, denominada proteína
de 74 kD. Esta proteína de 74 kD tiene una secuencia aminoácida
amino-terminal que está conservada en las tres cepas
de M. catarrhalis analizadas. La proteína de la presente
invención tiene un peso molecular de aproximadamente 74,9 kD medido
en un gel de SDS-PAGE al 10%, mientras que su peso
molecular medido por espectrometría de masas es aproximadamente 74
kD. Se ha determinado asimismo la composición aminoácida de la
proteína.
Inicialmente, la proteína de 74 kD se purificó a
partir de vesículas de lavado salino preparadas a partir de la cepa
O35E, y se evaluó en ratones. Los resultados preliminares indicaron
que la proteína de 74 kD está expuesta en la superficie, debido a
que los antisueros de conejo presentaban actividad bactericida, y
los ratones inmunizados presentaban un aumento de la eliminación de
M. catarrhalis en un modelo murino de exposición. Sin
embargo, esta preparación particular de la proteína de 74 kD estaba
contaminada con lipooligosacárido (LOS), que generaba asimismo una
respuesta con anticuerpos en ratones. Posteriormente, la proteína de
74 kD se purificó a partir de tres cepas de M. catarrhalis
utilizando un procedimiento modificado. Estas preparaciones carecían
de contaminación detectable por LOS u otras proteínas. El Ejemplo 1
presentado a continuación describe el nuevo método de purificación,
que implica la extracción directa de la proteína a partir de células
bacterianas completas obtenidas de las cepas de M.
catarrhalis O35E y 430-345, seguido por una
serie de etapas de cromatografía en columna. Se utilizó también una
versión modificada de este método para purificar la proteína de 74
kD de la cepa TTA24.
\newpage
La proteína de 74 kD migra algo más lentamente
que CopB, otra proteína de M. catarrhalis, en un gradiente de
SDS-PAGE al 4-15% (datos no
mostrados). El análisis por SDS-PAGE utilizando un
gel de poliacrilamida al 10% p/v arrojó un peso molecular estimado
para esta proteína de aproximadamente 74,9 kD (véase el Ejemplo 4).
La masa molecular real determinada por espectrometría de masas fue
aproximadamente 74 kD (véase el Ejemplo 4). Las secuencias del
extremo N-terminal de las cepas O35E, TTA24 y
430-345 resultaron idénticas hasta donde se llevó a
cabo la secuenciación de estas cepas, es decir, para el caso de los
primeros 18 residuos (véanse los Ejemplos 6 y 7).
También se emplearon dos métodos alternativos
para la purificación de la proteína de 74 kD. En ambos métodos, las
vesículas de lavado salino, preparadas como se ha descrito
anteriormente (11), fueron suspendidas en Triton
X-100™ al 0,5% y tampón
N-[hidroxietil]piperazina-N'-[2-ácido
etanosulfónico] (HEPES) 10 mM, e incubadas durante una hora a
temperatura ambiente. La suspensión se centrifugó a baja velocidad
(10.000 x g durante 20 minutos) a 4ºC para eliminar el material
particulado. En el primer método se hizo pasar el sobrenadante a
través de una columna de DEAE Sepharose® (Pharmacia, Piscataway, NJ)
equilibrada con el mismo tampón. Una sola banda de la proteína de 74
kD, determinada por SDS-PAGE, eluyó en el volumen
muerto y en el lavado con tampón, mientras que los contaminantes se
eluyeron al aumentar la concentración de sal (NaCl). En el segundo
método se hizo pasar el sobrenadante a través de una columna de CM
Sepharose® equilibrada con el mismo tampón Triton
X-100™-HEPES. Las proteínas en esta columna fueron
eluidas después con un gradiente por etapas con concentraciones
crecientes de sal. La proteína de 74 kD, que eluía a 200 mM de NaCl,
migraba como una sola banda. Sólo dos proteínas principales de la
membrana externa procedentes de las vesículas de lavado salino, la
proteína de 74 kD y la proteína CopB, migran a aproximadamente este
tamaño en SDS-PAGE. La proteína de 74 kD no
reaccionó por inmunoelectrotransferencia con un anticuerpo
monoclonal 10F3 especifico para la proteína CopB. Las pequeñas
cantidades presentes de la proteína C/D pueden eliminarse utilizando
una columna adicional de intercambio iónico.
Se determinó el extremo
N-terminal de la cepa O35E y dos péptidos internos
obtenidos por digestión de la misma proteína con quimotripsina, y se
comprobó que no presentaban homología con ninguna otra proteína
conocida de M. catarrhalis después de realizar búsquedas en
las bases de datos de GenBank CDS traducciones, PDB, SwissProt,
Spupdate y PIR utilizando la Herramienta de Búsqueda de Alineaciones
Locales Básicas (BLAST) (20). Sin embargo, los dos péptidos internos
presentaban una significativa homología de secuencia con la proteína
que se une a la transferrina de procedente de N. meningitidis
y de H. influenzae (véase el Ejemplo 8). La composición
aminoácida de la proteína de 74 kD se presenta en el Ejemplo 5.
Las proteínas de 74 kD purificadas a partir de
las cepas O35E y 430-345 resultaron inmunógenas en
ratones, y sus anticuerpos reaccionaron con la cepa homóloga en la
prueba de ELISA de células enteras; no obstante, los títulos de
células enteras contra las cepas heterólogas variaban
considerablemente (véase el Ejemplo 12). La proteína de 74 kD de la
cepa TTA24 parece estar mejor conservada, ya que los anticuerpos
dirigidos contra esta proteína presentaban una reactividad
moderadamente elevada contra las cepas heterólogas en la prueba de
ELISA de células enteras (Ejemplo 12). Los antisueros contra las
proteínas purificadas a partir de las tres cepas presentaban
actividad bactericida dependiente del complemento dirigida contra
todas las cepas heterólogas (véase el Ejemplo 9). Esto indica que
los anticuerpos dirigidos contra los epítopos conservados son
importantes.
El nivel de anticuerpos reactivos contra las
cepas heterólogas y los títulos de anticuerpos bactericidas fueron
mejorados utilizando ciertos adyuvantes tales como Stimulon™
QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Worcester,
MA) o una mezcla de MPL™ (monofosforil-lípido A
3-O-desacilado; RIBI ImmunoChem
Research, Inc., Hamilton, Montana) y fosfato de aluminio (véanse los
Ejemplos 10 y 11). Los ratones inmunizados con las proteínas de 74
kD purificadas a partir de las cepas O35E y 430-345
presentaron una potente eliminación pulmonar de la cepa O35E, contra
la que los anticuerpos reaccionaron con elevados títulos (P <
0,01), pero no contra la cepa TTA24, contra la que los sueros
presentaban escasa reacción (véase el Ejemplo 13). Además, los
sueros humanos normales contienen anticuerpos adquiridos de forma
natural y dirigidos contra los epítopos conservados en las proteínas
de 74 kD de ambas cepas O35E y TTA24 (Ejemplo 14). Esto indica que
M. catarrhalis expresa esta proteína in vivo, y que la
proteína de 74 kD es una diana de la respuesta inmunitaria tras la
infección natural. Estos anticuerpos humanos reaccionaban mejor
contra la proteína de 74 kD purificada de la cepa TTA24 que contra
la proteína de la cepa O35E (véase el Ejemplo 15), lo que indica que
la proteína de 74 kD de la cepa TTA24 está conservada.
A continuación se describe la relación de la
proteína de 74 kD con otras proteínas. Ocho proteínas principales de
la membrana externa de M. catarrhalis fueron descritas
inicialmente por Bartos y Murphy, quienes denominaron estas PME
A-H, en orden decreciente de peso molecular (21).
Después fueron descritas dos proteínas adicionales de la membrana
externa, denominadas UspA (13) y B1 (18). La PME B se denominó B2
tras el descubrimiento de B1 (18). Aparte de su similitud en masa
molecular, las proteínas B1 y B2 no están relacionadas. La PME B2 es
probablemente la proteína descrita como CopB por Helminen et
al. (12). Esta proteína tiene una más molecular de 82 kD, y
parece ser que participa en la adquisición de hierro (22).
La proteína de 74 kD descrita en la presente
solicitud es diferente de la proteína CopB en dos aspectos. En
primer lugar, un anticuerpo monoclonal (MAb) denominado
72-32, que reacciona con la proteína de 74 kD, no
reaccionó con una CopB recombinante preparada en E. coli en
la prueba de inmunoelectrotransferencia (datos no mostrados).
Tampoco hubo reacción de un MAb específico de CopB, 10F3, con la
proteína de 74 kD purificada en el mismo ensayo. En segundo lugar,
la secuencia aminoácida N-terminal y las secuencias
de dos péptidos internos de la proteína de 74 kD no fueron halladas
en la secuencia proteica predicha deducida a partir de la secuencia
publicada del gen CopB (12).
La proteína de 74 kD de la presente invención es
muy similar a la proteína B1 en lo relativo a tamaño y grado de
conservación antigénica. La PME B1 fue descrita inicialmente por
Sethi et al. (18), aunque estos autores no aislaron ni
purificaron la proteína. Sethi et al. señalaron la presencia
constante de anticuerpos policlonales dirigidos contra una proteína
secundaria de 74 kD en el suero de pacientes con bronquiectasia.
También notificaron que la B1 presentaba epítopos expuestos en la
superficie y parecía ser antigénicamente variable entre las cepas de
M. catarrhalis. El nivel de expresión de B1 aumentaba en
condiciones de cultivo con escaso hierro en algunas cepas aisladas
(23). También se ha descrito que la proteína B1 se une a la
transferrina (24). Estos informes indican que la proteína B1 puede
estar involucrada en la adquisición y utilización de hierro. La
utilidad de la proteína B1 como antígeno para vacunas no fue
investigada en dichos informes. En contraposición, los datos
expuestos en la presente solicitud no muestran cambios
significativos en los niveles de expresión de la proteína de 74 kD
al disminuir o aumentar la concentración de hierro en el caldo de
cultivo (véase el Ejemplo 3).
Al igual que la proteína B1, la proteína de 74
kD se une a la transferrina (véase el Ejemplo 3). Se han detectado
proteínas que se unen a la transferrina en varias especies
bacterianas, incluida M. catarrhalis. Utilizando columnas de
afinidad con transferrina y lactoferrina, Bonnah et al.
identificaron dos proteínas receptoras de M. catarrhalis
distintas, con masas moleculares de aproximadamente 80 kD (19). Éste
es el mismo intervalo que el de las proteínas denominadas B1 y CopB.
Por desgracia, estos informes no proporcionaron suficiente
información sobre los aspectos bioquímicos, inmunológicos y
moleculares de dichas proteínas como para permitir la identificación
de la proteína de 74 kD con una de estas proteínas. Sin embargo,
muchas de las propiedades de la TbpB de la familia Neisseria
y de Haemophilus influenzae son similares a las de la
proteína de 74 kD de M. catarrhalis, incluidas la capacidad
de unirse a transferrina tanto en forma nativa como desnaturalizada,
y la heterogeneidad antigénica.
No obstante, la proteína de 74 kD de M.
catarrhalis difiere de la proteína TbpB de Neisseria en
varios aspectos. En primer lugar, el peso molecular de la proteína
de 74 kD está relativamente bien conservado entre cepas, mientras
que el peso molecular de TbpB en Neisseria varía de cepa a
cepa (25). En segundo lugar, los anticuerpos de ratón dirigidos
contra la proteína de 74 kD de la cepa TTA24 reaccionaron con todas
las cepas de M. catarrhalis en la prueba de ELISA de células
enteras, y resultaron bactericidas contra todas las cepas
analizadas. En contraposición, los anticuerpos contra la TbpB de
Neisseria reaccionaron sólo con algunas de las cepas en la
prueba de ELISA, y resultaron bactericidas sólo contra las cepas a
las que se unían los anticuerpos (26). Finalmente, el nivel de
expresión de la proteína de 74 kD parece ser constitutivo, mientras
que el nivel de TbpB (tanto de Neisseria como de
Haemophilus), al igual que el de la proteína B1, es reprimido
por hierro. Por consiguiente, a falta de información adicional, no
está claro si la proteína de 74 kD, la proteína B1 y la proteína
TbpB son todas las mismas proteínas.
Una vez aislada y caracterizada la proteína de
74 kD, la siguiente etapa es evaluar su capacidad como antígeno para
vacunas. Varios grupos de pruebas expuestas en la presente solicitud
indican que la proteína de 74 kD es un posible candidato a antígeno
para vacunas. En primer lugar, como se detalla más adelante en el
Ejemplo 2, contiene epítopos expuestos en la superficie. Éste es un
dato importante debido a que los anticuerpos sólo tienen acceso a
los epítopos expuestos en la superficie. El epítopo reconocido por
el MAb 72-32, aunque no está conservado en todas las
cepas aisladas, está expuesto en la superficie. Además, tanto los
anticuerpos dirigidos contra la proteína de 74 kD purificados a
partir de sueros humanos, como los anticuerpos generados en ratones
y dirigidos contra la proteína purificada, reaccionaron con varias
cepas de M. catarrhalis en la prueba de ELISA de células
enteras. Algunos de los epítopos tienen carácter claramente
conformacional, debido a que muchos de los anticuerpos monoclonales
reaccionan con la proteína de 74 kD purificada y contra células
bacterianas enteras en la prueba de ELISA, pero no reaccionan con la
proteína desnaturalizada de 74 kD en pruebas de
inmunoelectrotransferencia. Este dato indica también que la proteína
purificada retiene por lo menos algunos epítopos
conformacionales.
En segundo lugar, algunos epítopos de la
proteína de 74 kD expuestos en la superficie están conservados entre
cepas de M. catarrhalis. Una vacuna eficaz necesita conferir
inmunidad protectora contra la mayoría de las cepas, si no contra
todas. Debido a que la expresión de la proteína parece variar entre
las distintas cepas aisladas in vitro (véase el Ejemplo 3),
ha sido difícil determinar el grado de variación antigénica de la
proteína de 74 kD entre las cepas de M. catarrhalis. No
obstante, es evidente que la proteína de 74 kD contiene epítopos
conservados. Los anticuerpos contra la proteína de 74 kD, bien
producidos en ratones o generados en seres humanos tras la infección
natural, se unieron a células bacterianas enteras de las cepas
heterólogas. La proteína de 74 kD de la cepa TTA24 está bastante
conservada, mientras que la proteína de 74 kD procedente de otras
cepas estudiadas está menos conservada o los epítopos específicos de
la cepa son más inmunógenos que los epítopos conservados. Los datos
actuales parecen indicar que la proteína de 74 kD de la cepa TTA24
puede tener más posibilidades como antígeno para vacunas debido a
que genera anticuerpos que presentan una elevada reactividad cruzada
contra cepas heterólogas (véase el Ejemplo 12, Tabla 9).
En tercer lugar, los anticuerpos dirigidos
contra epítopos de superficie conservados generados por la proteína
purificada resultaron bactericidas (véase el Ejemplo 9). Aunque no
está claro cómo participan los anticuerpos en la protección contra
las infecciones por M. catarrhalis, podrían desempeñar un
papel en diversas rutas, incluidas la adherencia bacteriana, la
interferencia con la captación de nutrientes, la fagocitosis
opsónica y la destrucción celular dependiente del complemento. Se ha
observado que los adultos, una población generalmente resistente a
las infecciones por M. catarrhalis, tienen un nivel
significativamente más elevado de actividad bactericida del suero
contra M. catarrhalis que el observado en los niños, una
población susceptible a las infecciones por M. catarrhalis
(datos no mostrados). La observación de que los antisueros de ratón
dirigidos contra la proteína de 74 kD presentan actividad
bactericida contra cepas heterólogas de forma dependiente de la
concentración de anticuerpos indica que esta proteína es un antígeno
protector. Está claro que el epítopo conservado de la proteína de 74
kD es una diana importante para los anticuerpos bactericidas.
Finalmente, los ratones inmunizados con la
proteína de 74 kD presentaron un aumento en la eliminación pulmonar
de las bacterias en el modelo murino de exposición (véase el Ejemplo
13). Aunque los mecanismos de eliminación bacteriana en este modelo
son desconocidos, está claro que los anticuerpos desempeñan un papel
importante en este modelo (27). Además de la proteína de 74 kD
descrita en la presente solicitud, se ha demostrado que UspA y CopB
provocan un aumento de la eliminación en este modelo (11, 12, 13).
Es más, parece que sólo los anticuerpos contra ciertos epítopos de
estas proteínas aumentan la eliminación de las bacterias. Así, el
modelo ha sido útil para seleccionar candidatos a vacunas que puedan
generar anticuerpos con actividad biológica in vivo. Dos
cepas de las bacterias son adecuadas para la exposición en el modelo
pulmonar murino, y ambas fueron analizadas. Se observó aumento en la
eliminación de las bacterias en el caso de la cepa O35E, que
presentaba una elevada reactividad con los anticuerpos contra la
proteína de 74 kD preparada a partir de dos cepas diferentes. Se
observó eliminación homóloga de la cepa TTA24; no obstante, no se
observó eliminación heteróloga, debido probablemente a la escasa
reactividad de los anticuerpos contra esta cepa aislada generados
por la proteína purificada. Aún no se ha determinado si la proteína
de 74 kD de la cepa TTA24 provoca un aumento de la eliminación de
cepas heterólogas en este modelo de exposición.
Otro posible mecanismo mediante el que la
proteína de 74 kD puede conferir protección a los seres humanos es
la generación de anticuerpos que bloquean la captación de hierro por
M. catarrhalis. El hierro es un elemento esencial para que
las bacterias crezcan y causen patogénesis in vivo. Sin
embargo, la concentración de hierro libre en el medio extracelular
es demasiado baja como para permitir el crecimiento bacteriano.
Prácticamente todo el hierro extracelular está secuestrado en
proteínas del hospedador tales como la lactoferrina de la superficie
de las mucosas y la transferrina del suero. Varias especies
bacterianas, incluida M. catarrhalis, pueden adquirir hierro
de las proteínas del hospedador por medio de receptores
superficiales especializados, tales como las proteínas que se unen a
la transferrina (TbpA y B) y las proteínas que se unen a la
lactoferrina (Lbp A y B). Para obtener hierro, la TbpB, una
lipoproteína que es una proteína de la membrana externa, funciona
como un receptor para la transferrina en los líquidos del
organismo.
Se ha demostrado que M. catarrhalis puede
utilizar la transferrina como fuente única de hierro para el
crecimiento in vitro (19), y éste puede ser un importante
mecanismo para la adquisición de hierro in vivo. El mecanismo
mediante el que M. catarrhalis adquiere hierro a partir de la
transferrina no está claro; no obstante, muy probablemente requiere
la interacción directa de Tbp con la transferrina. El Ejemplo 16
indica que los anticuerpos contra la proteína de 74 kD de M.
catarrhalis son capaces de bloquear específicamente la unión a
la transferrina por los lisados bacterianos. Este dato concuerda con
resultados previos que indicaban que los anticuerpos contra la TpbB
de meningococos eran capaces de disminuir la tasa de crecimiento de
los meningococos cuando la transferrina humana era la única fuente
de hierro (28).
Se ha descrito que las proteínas, procedentes de
otras especies, que se unen a la transferrina son lipoproteínas (29,
30). Esta condición bloquea generalmente el extremo
N-terminal de la proteína, impidiendo así la
determinación de la secuencia N-terminal (31).
Debido a que pudo determinarse una secuencia
N-terminal para la proteína de 74 kD de tres cepas,
ésta puede ser otra posible diferencia entre la proteína que se une
a la transferrina proteína y la proteína de 74 kD de M.
catarrhalis.
Por consiguiente, la proteína de 74 kD es útil
en la preparación de vacunas para conferir protección a los seres
humanos contra la otitis media y otras enfermedades causadas por
M. catarrhalis.
Estas composiciones de vacuna comprenden la
proteína de 74 kD aislada y purificada de la cepa O35E o TTA24 de
M. catarrhalis, en las que la composición de vacuna genera
una respuesta inmunitaria protectora en un hospedador mamífero.
Las vacunas que contienen la proteína de 74 kD
pueden mezclarse con diluyentes o excipientes aceptables desde el
punto de vista inmunológico de forma convencional para preparar
soluciones o suspensiones líquidas inyectables. Además, las vacunas
pueden incluir hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio (Alum) u
otros adyuvantes aceptables desde el punto de vista farmacéutico,
tales como Stimulon™ QS-21 (Aquila
Biopharmaceuticals, Inc., Worcester, MA), MPL™ e
IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA).
Las vacunas de la presente invención pueden
asimismo incluir otras proteínas de M. catarrhalis que son
conocidas en la técnica. Ejemplos de dichas proteínas son las
denominadas CopB, UspA, C/D y E.
Las vacunas de la presente invención incluyen,
además, otros agentes protectores que están acoplados a la proteína
de 74 kD, de manera que la proteína de 74 kD funciona como una
molécula portadora. Por ejemplo, agentes que protegen contra otros
organismos patógenos, tales como bacterias, virus o parásitos, se
acoplan a la proteína de 74 kD para producir una vacuna multivalente
útil en la prevención de la infección por M. catarrhalis y
las infecciones por otros patógenos. En particular, la 74 kD
proteína puede servir como portador inmunógeno mediante su
conjugación a polisacáridos u oligosacáridos de Haemophilus,
de meningococos o de pneumococos. Además, la proteína de 74 kD se
acopla a otra parte antigénica de M. catarrhalis tal como
lipooligosacáridos.
Las vacunas de la presente invención se
administran por inyección de forma convencional, tal como inyección
subcutánea, intraperitoneal o intramuscular en seres humanos, así
como por administración oral y administración intranasal, para
provocar una respuesta inmunitaria activa que proteja contra la
otitis media causada por M. catarrhalis. La dosis que se ha
de administrar se determina por métodos conocidos por los expertos
en la materia. La protección puede ser conferida por una sola dosis
de la vacuna, o puede ser necesaria la administración de varias
dosis de refuerzo.
Normalmente, en ausencia de datos clínicos en
seres humanos, se utiliza la inmunización activa en un modelo animal
reconocido para predecir la eficacia de una vacuna los seres
humanos. En la presente memoria se mide la eliminación pulmonar en
el modelo murino de exposición. El modelo murino de exposición
permite la evaluación de la interacción de M. catarrhalis con
las vías respiratorias inferiores, así como una valoración de los
cambios patológicos en los pulmones (32, 33). Este modelo suministra
de forma reproducible un inóculo de bacterias en un segmento
periférico localizado del pulmón murino. Las bacterias se
multiplican en el pulmón, pero son finalmente eliminadas como
resultado de los mecanismos de defensa del hospedador y del
desarrollo de una respuesta inmunitaria específica.
En la presente invención se demuestra que la
proteína de 74 kD es una candidata viable para vacunas debido tanto
a que los anticuerpos generados por la proteína de 74 kD resultaron
bactericidas como a que los ratones inmunizados con la proteína de
74 kD presentaron un aumento de la eliminación pulmonar de M.
catarrhalis en el modelo murino de exposición.
La proteína de 74 kD también es útil para
producir anticuerpos policlonales para su utilización en la
inmunización pasiva contra M. catarrhalis. Se generaron
antisueros policlonales a partir de animales inmunizados con la
proteína de 74 kD o con péptidos de la misma.
La proteína de 74 kD también se utiliza para
generar anticuerpos monoclonales que pueden utilizarse para el
diagnóstico de la presencia de M. catarrhalis en una muestra
clínica o en una cepa de laboratorio. Los anticuerpos monoclonales
reaccionan con M. catarrhalis, pero no con otras
bacterias.
Para facilitar la comprensión de la presente
invención se presentan a continuación los siguientes ejemplos. Los
ejemplos son proporcionados únicamente a título ilustrativo de la
invención y no limitativo del alcance de la misma.
La proteína de 74 kD se purificó a partir de las
cepas O35E y 430-345 utilizando el mismo
procedimiento. Las bacterias se cultivaron en matraces de Fernbach
que contenían 1,3 litros de caldo CY (10 g de casaminoácidos, 15 g
de extracto de levaduras por litro de agua destilada) a 37ºC durante
22 horas, agitando a 200 rpm. Las bacterias se recogieron por
centrifugación (10.000 x g durante 20 minutos), se resuspendieron en
50 ml de tampón fosfato (10 mM, pH 6,0) que contenía Triton
X-100™ al 0,1% (J.T. Baker Inc., Philipsburg, NJ), y
se agitaron durante una hora a temperatura ambiente (TA). El
material particulado se eliminó por centrifugación (10.000 x g, 60
minutos) y el extracto soluble se cargó en una columna con un
volumen de relleno de 5 ml de Sepharose® S (Pharmacia, Piscataway,
NJ). La columna se eluyó con un gradiente de etapas de NaCl en
tampón fosfato 10 mM (pH 6,0) que contenía Triton
X-100™ al 0,1%. La proteína de 74 kD se detectó por
transferencia de puntos utilizando el MAb 7232. Las fracciones
enriquecidas con la proteína de 74 kD (que eluía entre
70-210 mM de NaCl) se agruparon y se aplicaron a una
columna con un volumen de relleno de 3 ml de hidroxiapatito
(BIO-RAD Laboratories). La columna se lavó con
tampón fosfato 10 mM (pH 6,0) y se eluyó utilizando un gradiente de
etapas de tampón fosfato (pH 6,0). Las fracciones enriquecidas con
la proteína de 74 kD se agruparon y se concentraron utilizando un
aparato Centriprep®-30 (Amicon, Beverly, MA), y se hicieron pasar a
través de una columna (2,6 x 100 cm) de Ultrogel AcA 44 (BioSepra
Inc., Marlborough, MA) a un caudal de 1,0 ml por minuto en PBS (pH
7,4). La concentración de proteínas se determinó utilizando un
microensayo con ácido bicinconínico (Micro BCA) (Pierce, Rockford,
IL).
La proteína de 74 kD se purificó a partir de la
cepa TTA24 utilizando un procedimiento ligeramente distinto. Los
intentos iniciales de purificar la proteína de 74 kD de la cepa
TTA24 cultivada en caldo CY siguiendo el método anterior no dieron
lugar a la producción de la proteína. A continuación se observó que
la cepa TTA24 cultivada en placas de agar de
Mueller-Hinton expresaba un nivel más elevado de la
proteína de 74 kD. Por tanto, se utilizaron las bacterias cultivadas
en dichas placas como material de partida para la purificación. La
proteína no se unía a la columna de Sepharose® S en las condiciones
utilizadas para el caso de la proteína de 74 kD de la cepa O35E. En
su lugar, se purificó por pases secuenciales primero en una columna
de hidroxiapatito, a continuación en una columna High Performance Q
(Pharmacia) y finalmente en una columna Ultrogel AcA44.
La proteína de 74 kD estaba asociada a células
bacterianas cultivadas en caldo CY. Se extraía fácilmente en tampón
fosfato (10 mM, pH 6,0) que contenía Triton X-100™
al 0,1% tras una hora de agitación a TA. Las proteínas de 74 kD de
las cepas O35E y 430-345 se encontraban entre las
pocas proteínas en el extracto de células enteras que se unían a la
columna S, y constituían el 50-70% de la proteína
total en las fracciones que eluían con tampón fosfato 10 mM (pH 6,0)
que contenía NaCl 70-210 mM. Presentaba una fuerte
unión a la columna de hidroxiapatito y eluía con tampón fosfato 500
mM sin detergente. La mayor parte de los contaminantes se
encontraban en la fracción del volumen muerto de esta columna. El
principal pico que eluía de la columna AcA44 de exclusión por
tamaños contenía una sola banda homogénea con una masa molecular de
74 kD en SDS-PAGE con un gel de gradiente de
acrilamida al 4-15% teñido con azul de
Coomassie.
La proteína de 74 kD de la cepa TTA24 resultó
enriquecida por la columna de HA. Se encontraba entre las pocas
proteínas que no se unían a la columna Q, y fue purificada
finalmente utilizando una columna de exclusión por tamaños. El
rendimiento de proteínas purificadas, tal como se indica a
continuación en la Tabla 1, fue aproximadamente 1-3
mg a partir de 1,3 litros de caldo de cultivo.
Las proteínas de 74 kD purificadas fueron
analizadas en un gradiente de SDS-PAGE al
4-15% teñido con azul de Coomassie y con tinción de
plata. La reactividad a los anticuerpos monoclonales y al suero
policlonal de ratón se determinó por inmunoelectrotransferencia
(Fig. 1).
Los MAb dirigidos contra la proteína de 74 kD
fueron preparados utilizando el procedimiento de Chen et al.
(11). En resumen, los ratones (BALB/c) utilizados para la fusión
fueron inmunizados con vesículas de la membrana externa preparadas a
partir de la cepa O35E de M. catarrhalis. Los hibridomas se
cribaron primero por ELISA frente a células enteras de las bacterias
de O35E. Después, los que reconocían células enteras de O35E fueron
analizados para determinar su reactividad con la proteína de 74 kD
purificada de la cepa O35E tanto por ELISA como por
inmunoelectrotransferencia. La reactividad frente a cepas
heterólogas se determinó mediante ELISA de células enteras. Los
hibridomas seleccionados se clonaron por dilución limitante.
Dos de los MAb reconocían la proteína de 74 kD
purificada tanto por ELISA como por inmunoelectrotransferencia. No
reaccionaban con la proteína CopB. Cuando se analizaron los MAb
denominados 72-32 y 81-8 frente a
otras seis cepas de M. catarrhalis mediante análisis de
inmunoelectrotransferencia, se comprobó que sólo reaccionaban con la
cepa aislada homóloga O35E. Por tanto, estos dos MAb reconocen
epítopos específicos de cepa. La falta de reactividad con cepas
heterólogas se confirmó mediante ELISA de células enteras.
A continuación, se cribaron todos los clones
precursores de dicha fusión mediante ELISA. Una docena de clones
presentaron reactividad tanto contra la proteína de 74 kD purificada
como contra células bacterianas enteras de O35E, pero no
reaccionaron con 11 cepas heterólogas. Sólo cinco de los 12 clones
precursores presentaron reactividad contra la proteína de 74 kD en
pruebas de inmunoelectrotransferencia. Los clones que no
reaccionaban están probablemente dirigidos contra epítopos
conformacionales.
Estos datos indican que la proteína de 74 kD
tiene epítopos expuestos en la superficie, y que algunos de ellos
puede ser conformacionales. También indican que la proteína de 74 kD
de la cepa O35E es antigénicamente heterogénea o que los epítopos
específicos de cepa son más inmunógenos que los epítopos
conservados.
Existen indicios de que la proteína B1 (18) se
une a la transferrina y de que puede ser la proteína B que se une a
la transferrina (TbpB) (19). La proteína de 74 kD descrita en la
presente memoria parece tener una masa molecular similar, así como
la heterogeneidad antigénica típica de TbpB.
Se realizó una prueba inicial para determinar si
la proteína de 74 kD purificada podía unirse a la transferrina. Para
ello, la proteína de 74 kD purificada de la cepa O35E y colocada
mediante transferencia de puntos en una membrana de nitrocelulosa se
hizo reaccionar con transferrina marcada con biotina. Se detectó una
elevada reactividad (véase la Figura 3). Por tanto, la unión a la
transferrina es una propiedad común de la proteína de 74 kD, la B1 y
la TbpB. Dado que se ha descrito que el nivel de expresión de las
proteínas que se unen a la transferrina B1 y TbpB de M.
catarrhalis depende del contenido de hierro del medio de cultivo
(18, 19), la siguiente etapa es determinar si el nivel de expresión
de la proteína de 74 kD puede aumentarse al reducir la concentración
de hierro del caldo de cultivo. Los métodos utilizados para reducir
la concentración de hierro incluyen tanto la precipitación con
fosfato como la quelación con EDDA. La proteína de 74 kD procedente
de lisados de células enteras se cuantificó por transferencia de
puntos e inmunoelectrotransferencia utilizando MAb. No se observaron
cambios apreciables en el nivel de expresión de la proteína de 74 kD
en cultivos que tenía la concentración de hierro reducida (véase la
Figura 2). Sin embargo, el nivel de las proteínas que se unen a la
transferrina, determinado por reacción con transferrina marcada con
biotina en un ensayo de transferencia de puntos, aumentó en un
cultivo con la concentración de hierro reducida (véase la Figura 3).
No se sabe si este aumento se debe a cambios en el nivel de
expresión de TbpA o TbpB. No obstante, estos resultados preliminares
sobre el nivel de expresión de la proteína de 74 kD en condiciones
en las que la concentración de hierro está reducida no concuerdan
con los informes publicados referentes a B1 y TbpB.
Aunque la expresión no se vio afectada de forma
apreciable por el nivel de hierro, sí que se vio afectada por el
cultivo en un medio diferente. Los lisados de bacterias ajustados a
la misma absorbancia de 550 nm, obtenidos de varias cepas de M.
catarrhalis cultivadas en caldo o en placas de agar, fueron
analizados con anticuerpos policlonales contra la proteína de 74 kD
purificada en una prueba de inmunoelectrotransferencia. Los
anticuerpos policlonales habían sido generados inmunizando ratones
con la proteína de 74 kD purificada a partir de la cepa O35E. El
nivel de expresión de la proteína de 74 kD parecía ser mayor cuando
las bacterias se cultivaban en una placa de agar de
Mueller-Hinton que cuando se cultivaban en caldo de
cultivo (datos no mostrados).
El nivel de expresión de la proteína de 74 kD
parece ser dependiente de la cepa. Cuando se utilizó una dilución
baja de antisuero contra la proteína de 74 kD procedente de la cepa
O35E (1:200) en una prueba de transferencia de puntos para hacerla
reaccionar con lisados de células enteras, diluidos en serie,
procedentes de siete cepas de M. catarrhalis, la máxima
reactividad observada se dio frente las cepas O35E,
120-345 y 430-345. La reactividad
frente a las otras cuatro cepas fue de tres a nueve veces menor
(véase la Figura 4). Se hicieron varios intentos para purificar la
proteína de 74 kD a partir de las cepas que presentaban baja
reactividad, pero parece que en estas cepas sólo estaban presentes
pequeñas cantidades de la proteína.
La proteína de 74 kD purificada a partir de la
cepa O35E de M. catarrhalis fue sometida a análisis por
SDS-PAGE (acrilamida al 10%, p/v) (34) junto con una
amplio intervalo de patrones de proteína (Mark 12: pesos moleculares
aparentes de 200, 116,3, 97,4, 66,3, 55,4, 36,5, 31, 21,5, 14,4, 6,
3,5 y 2,5 kD) adquiridos de Novel Experimental Technology, San
Diego, CA. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie
R-250. El gel desteñido se exploró utilizando un
aparato Personal Densitometer SI (Molecular Dynamics Inc.,
Sunnyvale, CA). Se comprobó que el peso molecular de la proteína
purificada, calculado utilizando el software FragmeNT Analysis
(versión 1.1, Molecular Dynamics), era aproximadamente 74,9 kD, por
comparación con los patrones de peso molecular.
La medición precisa del peso molecular de la
proteína de 74 kD se llevó a cabo por espectrometría de masas con
desorción/ionización mediante láser inducida por matriz y analizador
de tiempo de vuelo (MALDI-TOF), utilizando un
analizador de masas lineal Lasermat™ 2000 (Finnigan Mat Limited). El
aparato Lasermat™ utiliza la técnica de desorción mediante láser
inducida por matriz (35) para ionizar la muestra, y el tiempo de
vuelo para analizar los iones producidos. La muestra fue incluida en
una matriz de ácido
3,5-dimetoxi-4-hidroxi-cinámico
(ácido sinapínico) para aumentar la ionización de la muestra. Un
microlitro de la muestra que contenía 5-10 pmol de
la proteína de 74 kD purificada se mezcló con 1 \mul de la matriz
(10 mg/ml) disuelta en acetonitrilo acuoso al 70% (v/v) que contenía
ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v). Un microlitro de esta muestra
y mezcla de matriz se cargó en un portaobjetos para muestras, se
dejó secar y se irradió con un pulso corto de luz UV procedente de
un láser. Las muestras de proteína generan habitualmente espectros
relativamente simples con este método, debido a que los iones
producidos, relacionados con la proteína, se encuentran
predominantemente en los estados de carga z=+1 [M+H]^{+} y
z=+2 [M+2H]^{2+}.
Para la calibración externa se utilizó seroalbúmina bovina (nº de catálogo A0281, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) de peso molecular 66.430,0.
Para la calibración externa se utilizó seroalbúmina bovina (nº de catálogo A0281, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) de peso molecular 66.430,0.
Se comprobó que el peso molecular de la proteína
de 74 kD en la muestra utilizada para el análisis por
SDS-PAGE anterior era 73.987,7, mientras que el de
la proteína de 74 kD purificada a partir de la cepa TTA24 de M.
catarrhalis era 73.793,6. Además del ion molecular
[M+H]^{+} esperado, también se observaron los iones
moleculares [M+2H]^{2+} y [M+3H]^{3+} de la
proteína de 74 kD. Por tanto, es razonable concluir que el peso
molecular de la proteína de 74 kD es realmente aproximadamente 74
kD, dentro de los límites de error experimental.
Una muestra de la proteína de 74 kD para el
análisis de aminoácidos se hidrolizó en tubos de vidrio utilizando
100 \mul de HCl 6 N que contenía fenol al 5% y
2-mercaptoetanol al 1% en vacío durante 22 horas a
110ºC. Las muestras se secaron a continuación en vacío, y después
volvieron a solubilizarse en tampón Na-S para
dilución de muestras (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA,
U.S.A.). La composición aminoácida se determinó utilizando un
analizador de aminoácidos Beckman, modelo 6300 (36) utilizando un
gradiente de Na-citrato de tres etapas, siguiendo
las instrucciones del fabricante. Los resultados se expresaron en
mol de residuos por mol de la proteína de 74 kD, sobre la base de un
peso molecular de 74.000 para la proteína de 74 kD. Los residuos de
cisteína y triptófano no se determinaron. Los residuos de treonina y
serina no fueron corregidos para tener en cuenta la destrucción
causada por el método de análisis. Se secaron nueve microlitros de
muestra (purificada a partir de vesículas de lavado salino de la
cepa O35E de M. catarrhalis) y se sometieron a hidrólisis
ácida y al análisis de aminoácidos subsiguiente. Los resultados
expuestos en la Tabla 2 representan la media de determinaciones por
duplicado.
Se sometieron las preparaciones de la proteína
de 74 kD purificada a SDS-PAGE (34) para determinar
su homogeneidad. Las muestras que contenían rastros de impurezas
fueron después sometidas a transferencia electroforética a una
membrana de difluoruro de polivinilideno (membrana ProBlott, Applied
Biosystems, Foster City, CA) utilizando ácido
3-[ciclohexilamino]-1-propanosulfónico
(CAPS) 10 mM, metanol al 10% (pH 11,0) como tampón de transferencia
(37). La membrana se tiñó con azul brillante de Coomassie
R-250 y la banda principal correspondiente a la
proteína de 74 kD se cortó. El análisis de la secuencia
amino-terminal de la proteína se llevó a cabo
utilizando un secuenciador de proteínas/péptidos modelo 477A de
Applied Biosystems, equipado con un analizador de PTH en línea,
modelo 120A (Applied Biosystems). Tras la escisión de cada extremo
aminoterminal sucesivo, el derivado de anilinotiazolinona formado se
convirtió en el derivado, más estable, de feniltiohidantoína (PTH)
mediante tratamiento con ácido trifluoroacético al 25% a 64ºC
durante 20 minutos. Los derivados de PTH fueron separados e
identificados con el analizador de PTH por HPLC en fase inversa,
utilizando una columna Brownlee PTH C-18 (tamaño de
partículas: 5 \mum, 2,1 mm de diámetro interno x 22 cm de
longitud; Applied Biosystems) con un sistema modificado de gradiente
de dos disolventes preparado por el fabricante (35). A continuación
se resumen los resultados del análisis de la secuencia
N-terminal de diferentes preparaciones de la
proteína de 74 kD:
En el caso de la proteína de 74 kD purificada a
partir de vesículas de lavado salino de la cepa O35E de M.
catarrhalis, aproximadamente 18,7 \mul de muestra que contenía
20 \mug de proteína purificada se sometieron a
SDS-PAGE, seguido por electrotransferencia y 20
ciclos de análisis de la secuencia N-terminal de la
proteína. Se determinaron los primeros 13 residuos, a excepción de
un pico no identificado en el residuo 1 (SEC ID nº: 1):
\sa{Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala
Pro Thr}
En el caso de la proteína de 74 kD purificada a
partir de un extracto de células enteras de la cepa O35E de M.
catarrhalis, aproximadamente 7,41 \mul de muestra que contenía
20 \mug de proteína purificada se sometieron a
SDS-PAGE, seguido por electrotransferencia y 25
ciclos de análisis de la secuencia N-terminal de la
proteína. Se determinaron los primeros 17 residuos, a excepción de
un pico no identificado en el residuo 1 (SEC ID nº: 2):
\sa{Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala
Pro Thr Pro Ile Pro Asn}
En el caso de la proteína de 74 kD purificada a
partir de un extracto de células enteras de la cepa TTA24 de M.
catarrhalis, se cargaron aproximadamente 14,3 \mul de muestra
que contenía 74,4 \mug de proteína purificada directamente en el
secuenciador, y se llevaron a cabo 30 ciclos de análisis de la
secuencia N-terminal de la proteína. Se determinaron
los primeros 20 residuos, a excepción de un pico no identificado en
el residuo 1 (SEC ID nº: 3):
\sa{Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala
Pro Thr Pro Ile Pro}
\sac{Asn Ala Ser Gly}
El pico no identificado en el residuo 1 era
idéntico en cada una de las muestras anteriores y seguía al pico de
PTH-Glu después de aproximadamente 0,2 minutos.
Durante el análisis de la secuencia
N-terminal de la proteína de 74 kD se observó que la
abundancia de residuos de prolina (Pro) causaba una terminación
temprana de la lectura de la secuencia. Los residuos de Pro se
liberan parcialmente durante la etapa estándar de escisión con ácido
de la secuenciación. La liberación del resto de las Pro con los
siguientes residuos causa dificultades en la identificación de la
secuencia. Con el objeto de generar secuencias
N-terminales más largas de la proteína de 74 kD se
llevó a cabo una escisión con ácido más prolongada de los residuos
de Pro. Así se obtuvieron mejores resultados, pero hubo un aumento
del fondo de aminoácidos que parecía ser debido a la secuenciación
simultánea de productos de escisión no específicos, inducidos por
ácido, de la proteína de 74 kD. La reducción química de la
acumulación del fondo de aminoácidos durante el análisis de la
secuencia se realizó en algunos de los ciclos en los que aparecían
residuos de prolina. Esto se logró mediante la introducción de
O-ftalaldehído, un reactivo que reacciona
específicamente con los grupos amino de todos los aminoácidos
N-terminales principales, sin afectar a los
correspondientes residuos de prolilo, bloqueando de esta manera las
cadenas residuales de proteína/péptido (fondo) en la secuenciación
subsiguiente (39, 40). Se disolvieron veinte miligramos de
O-ftalaldehído en 50 \mul de
2-mercaptoetanol en 10 ml de acetonitrilo y se
colocaron en el frasco X1 del secuenciador. Se cargaron en el
secuenciador veintiséis microlitros de la proteína de 74 kD (un lote
purificado a partir de la cepa O35E de M. catarrhalis -
extracto de células enteras) que contenían 80,6 \mug de proteína.
Durante la secuenciación se llevó a cabo una escisión prolongada con
ácido trifluoroacético de los residuos de Pro en las posiciones 9,
10, 12, 14 y 16, mientras que el tratamiento con
O-ftalaldehído se realizó en el caso de los residuos
de Pro en las posiciones 9 y 16. Así se logró una reducción eficaz
del fondo, que permitió una determinación adicional de la secuencia
N-terminal (los primeros 27 residuos) de la proteína
de 74 kD (SEC ID nº: 4):
\sa{Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala
Pro Thr Pro Ile Pro}
\sac{Asn Ala Ser Gly Ser Gly Asn Thr Gly Asn
Thr}
Esta secuencia se analizó utilizando el programa
de alineación BLAST en busca de homología con otras proteínas. No se
observó homología significativa con ninguna de las proteínas
bacterianas en las bases de datos mencionadas anteriormente.
Se utilizó un procedimiento similar para obtener
la secuencia N-terminal de la proteína de 74 kD de
la cepa 430-345 de M. catarrhalis. Un nanomol
y medio de la proteína de 74 kD de la cepa 430-345
de M. catarrhalis se sometió a análisis de la secuencia
N-terminal de la proteína utilizando un secuenciador
de proteínas/péptidos modelo 477A de Applied Biosystems, equipado
con un analizador de PTH en línea, modelo 120A (Applied Biosystems),
como se ha descrito anteriormente. Durante la secuenciación se llevó
a cabo una escisión prolongada con ácido trifluoroacético del
residuo de Pro en la posición 14, mientras que el tratamiento con
O-ftalaldehído se realizó en el caso de los residuos
de Pro en las posiciones 10 y 16. Se determinaron los primeros
dieciocho residuos del extremo N-terminal, sin
determinar, una vez más, el primer residuo (SEC ID nº: 5):
\sa{Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala
Pro Thr Pro Ile Pro}
\sac{Asn Ala}
Una muestra de la proteína de 74 kD (1,5 mg de
un lote purificado de la cepa O35E de M. catarrhalis -
extracto de células enteras) se digirió durante toda la noche a 37ºC
en PBS con quimotripsina (Boehringer Mannheim Biochemicals,
Indianapolis, IN) utilizando una relación de sustrato:enzima de 1:60
(p/p). La digestión fue completa, a juzgar por el análisis de
SDS-PAGE. El material digerido se purificó por HPLC
en fase inversa, utilizando una columna Vydac Protein C4 (tamaño de
partículas 5 \mum, 0,46 cm de diámetro interno x 25 cm de
longitud; The Separations Group, Hesperia, CA). Las condiciones de
HPLC fueron las siguientes: caudal 1,0 ml/min; disolvente A = ácido
trifluoroacético acuoso al 0,1%; disolvente B = acetonitrilo:agua,
80:20 (v/v), que contenía ácido trifluoroacético al 0,1% (v/v);
gradiente lineal de 0-100% de disolvente B durante
45 minutos. Los picos eluidos se detectaron por su absorbancia a 220
nm, y las fracciones se recogieron. Las fracciones se secaron y se
resuspendió cada una en 50 \mul de agua. Las fracciones adecuadas
se agruparon, y se sometieron partes alícuotas a
SDS-PAGE en tricina (41) utilizando geles en
gradiente de 10-18% (v/v, acrilamida). Los geles se
tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250 y
después se transfirieron a una membrana de difluoruro de
polivinilideno como se ha indicado anteriormente. Se cortaron cuatro
bandas distintas y se sometieron a análisis de la secuencia
aminoácida N-terminal. Dos de los péptidos,
"fragmento 1" (SEC ID nº: 6) y "fragmento 3" (SEC ID nº:
8), generaron secuencias de catorce residuos esencialmente
idénticas; siendo la única diferencia que el residuo
N-terminal era Thr en el primer caso, mientras que
Gly fue el correspondiente residuo predominante en el segundo caso,
aunque se detectó una menor cantidad de Thr. Ambas secuencias se
superponían en cuatro residuos con la secuencia
N-terminal de otro péptido "fragmento 2" (SEC
ID nº: 7) hasta generar una extensión continua de 25 residuos
aminoácidos. Dado que la quimotripsina escinde generalmente las
proteínas en el lado carboxiterminal de los residuos Trp, Tyr, Phe,
Leu y Met, es evidente que la escisión parcial del enlace
Tyr^{10}-Asn^{11} en cualquiera de los péptidos
"fragmento 1" o "fragmento 3" dio lugar al péptido
"fragmento 2". Por otro lado, la escisión parcial del enlace de
Tyr^{4}-Gly^{5} en el "fragmento 2"
permitió obtener información sobre la secuencia más allá de este
punto. Además,
era evidente que ambos péptidos, "fragmento 1" y "fragmento 3", habían sido secuenciados completamente.
era evidente que ambos péptidos, "fragmento 1" y "fragmento 3", habían sido secuenciados completamente.
\sa{Thr Asp Glu Lys Asn Lys Pro Asp Gly Tyr Asn
Gly Glu Tyr}
\hskip1cm(Fragmento 1; SEC ID nº: 6)
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Gly Glu Tyr Gly His Ser Ser Glu Phe Thr
Val Asn Phe Lys}
\hskip1cm(Fragmento 2; SEC ID nº: 7)
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asp Glu Lys Asn Lys Pro Asp Gly Tyr Asn
Gly Glu Tyr}
\hskip1cm(Thr)
\hskip1cm(Fragmento 3; SEC ID nº: 8)
Además de lo expuesto anteriormente, un cuarto
péptido obtenido por digestión con quimotripsina ("fragmento 4"
(SEC ID nº: 9)) proporcionó la siguiente secuencia de veinte de sus
residuos del extremo N-terminal. El residuo de Thr
en la posición 20 no pudo asignarse con certeza.
\sa{Lys Ser Ile Val Ile Arg Asp Ala Asp Val Thr
Gly Gly Phe}
\sac{Tyr Tyr Pro Asn Ala (Thr)}
\hskip1cm(Fragmento 4; SEC ID nº: 9)
Estas secuencias fueron analizadas utilizando el
programa de alineación BLAST para su comparación con otras proteínas
en las bases de datos mencionadas anteriormente. El péptido de 25
aminoácidos generado por superposición de los fragmentos 1 a 3
presentaba homología con una porción conservada de la proteína TbpB
de Neisseria meningitidis, así como con una secuencia similar
de Haemophilus influenzae. Se comprobó que el fragmento 4
presentaba homología con una secuencia repetida de la proteína TbpB
de Neisseria meningitidis.
Se llevó a cabo un ensayo de actividad
bactericida como se ha descrito anteriormente (11). Brevemente, se
mezclaron 50 \mul de la suspensión bacteriana (aproximadamente
1.200 unidades formadoras de colonias (UFC) en PBS que contenía
CaCl_{2} 1 mM y MgCl_{2} 0,2 mM), y se incubaron con 25 \mul
de antisuero contra la proteína de 74 kD (el mismo empleado en la
Tabla 1) durante 30 minutos a 4ºC. El antisuero se analizó en
diluciones de 3 veces, comenzando por 1:50. A continuación se
añadieron veinticinco microlitros de suero humano sin
inmunoglobulinas, como fuente de complemento, y la mezcla se incubó
durante otros 30 minutos a 35ºC. El número de bacterias viables
restantes se determinó sembrando 50 \mul de la mezcla de ensayo en
placas agar de Mueller-Hinton. El testigo estaba
formado por bacterias, suero problema y suero con complemento que
había sido termoinactivado a 55ºC durante 30 minutos. Los títulos en
ELISA de células enteras y los títulos bactericidas se determinaron
sobre la base de muestras de suero mezcladas. El porcentaje de
bacterias destruidas se calculó mediante la siguiente fórmula: % de
bacterias destruidas = 100 X (UFC del testigo - UFC de la
muestra)/UFC del testigo). La actividad bactericida de los
antisueros se expresó como título bactericida, es decir, la máxima
dilución del suero que da lugar a una destrucción del 50% o más de
las bacterias.
Los antisueros de ratón generados contra las
proteínas de 74 kD en varios estudios fueron analizados en un ensayo
de actividad bactericida frente a siete cepas de M.
catarrhalis. Se inmunizaron ratones BALB/c (10 animales/grupo,
hembras, de 6-8 semanas de edad al principio del
estudio) en las semanas 0 y 4 con 1 \mug de antígenos mezclados
con 25 \mug de Stimulon™ QS-21. Los resultados se
presentan en la Tabla 3:
Los sueros contra la proteína de 74 kD
purificada a partir de las cepas O35E o 430-345
resultaron bactericidas contra casi todas las cepas (Tabla 3). La
cepa O35E parece ser resistente a los efectos bactericidas generados
por la proteína de 74 kD de dicha cepa. Los títulos de anticuerpos
bactericidas variaban de cepa a cepa y parecían correlacionar con
los títulos de ELISA de células enteras (datos no mostrados). En
casi todas las cepas analizadas, los títulos de anticuerpos
bactericidas fueron mayores para el antisuero contra la proteína de
74 kD de la cepa 430-345 que para el dirigido contra
la cepa O35E. Este resultado concuerda con los títulos de ELISA de
células enteras. Los sueros preinmunitarios de los mismos animales
no fueron bactericidas. Por tanto, los anticuerpos contra la
proteína de 74 kD presentaron de modo uniforme actividades
bactericidas contra cepas heterólogas de M. catarrhalis a
pesar de los bajos títulos de anticuerpos en ELISA de células
enteras. Esto indica que los anticuerpos bactericidas están
dirigidos contra los epítopos conservados de la proteína de 74
kD.
Los anticuerpos contra la proteína de 74 kD de
la cepa TTA24 resultaron bactericidas contra las seis cepas
analizadas, y los títulos fueron > 500. Estos resultados se
presentan en la Tabla 4:
\vskip1.000000\baselineskip
Los antisueros contra la mezcla de proteínas de
74 kD de las cepas TTA24 y 430-345 presentaron
títulos bactericidas equivalentes contra las cepas heterólogas.
Se compararon varios adyuvantes para determinar
si la selección de adyuvante podría aumentar la respuesta de
anticuerpos contra los epítopos conservados de la proteína de 74 kD
de la cepa O35E. Los sueros generados contra la proteína de 74 kD de
la cepa O35E fueron analizados frente a siete cepas de M.
catarrhalis mediante ELISA de células enteras. En esta prueba se
inmunizaron ratones BALB/c (10 animales/grupo, hembras, de
6-8 semanas de edad al comienzo del estudio) en las
semanas 0 y 4 con 1 \mug de la proteína de 74 kD. Las dosis de
adyuvantes fueron: 25 \mug en el caso de Stimulon™
QS-21, 50 \mug en el caso de MPL™, y 100 \mug en
el caso de fosfato de aluminio (Alum). Se prepararon sueros
inmunitarios con proteínas purificadas a partir de la cepa O35E. Se
determinaron los títulos en ELISA de células enteras utilizando
sueros agrupados obtenidos en la 6 semana. Los resultados se
presentan en la Tabla 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Sobre la base de los títulos contra la cepa
homóloga, parece que todos los adyuvantes, Stimulon^{TM}
QS-21, MPL™ y la mezcla MPL™-Alum, potenciaron la
capacidad inmunógena de la proteína de 74 kD en la misma medida,
mientras que el fosfato de aluminio no pareció actuar como
adyuvante. Cuando se examinaron los títulos en ELISA de células
enteras frente a cepas heterólogas, sólo la proteína de 74 kD
mezclada con el adyuvante Stimulon™ QS-21 o con
MPL™-Alum generó títulos significativos de anticuerpos. Los ratones
inmunizados con la proteína de 74 kD y MPL™ parecían presentar
títulos muy inferiores de anticuerpos, que eran equivalentes a los
del grupo sin adyuvantes.
Se analizaron los títulos de anticuerpos
bactericidas con sueros generados contra la proteína de 74 kD de la
cepa O35E utilizando diferentes adyuvantes. Los resultados se
presentan en la Tabla 6:
\vskip1.000000\baselineskip
Sólo los sueros generados contra la proteína de
74 kD utilizando Stimulon™ QS-21 o los adyuvantes
mezclados presentaron actividad bactericida contra cepas
heterólogas. Por tanto, Stimulon™ QS-21 y los
adyuvantes mezclados parecían aumentar la respuesta de anticuerpos
contra los epítopos conservados de la proteína de 74 kD.
Se inmunizaron ratones BALB/c hembras (Taconic
Farms, Germantown, NY), de 6-8 semanas de edad, por
vía subcutánea en las semanas 0 y 4 con 1 \mug de la proteína de
74 kD purificada formulada con 25 \mug del adyuvante Stimulon™
QS-21, a no ser que se indique otra cosa. Los
ratones testigo recibieron inyecciones de 1 \mug de CRM_{197}
(una variante no tóxica de la toxina diftérica) y Stimulon™
QS-21. Se recogieron muestras de suero en las
semanas 0 y 6. Los ratones fueron sometidos a exposición por vía
intratraqueal con 3,5 x 10^{5} UFC de bacterias cinco días
después de la extracción de sangre final en la semana 7.
La capacidad inmunógena de la proteína de 74 kD
purificada se evaluó en estos ratones con diversos estudios que
proporcionaron resultados similares. Un estudio representativo se
muestra en la Tabla 7. Los títulos de ELISA se determinaron en
muestras de suero agrupadas procedentes de diez ratones utilizando
la proteína purificada como antígeno de detección. Como se muestra a
continuación en la Tabla 7, la proteína de 74 kD purificada fue
inmunógena en los ratones. La inmunización con dos dosis de 1 \mug
de antígeno separadas por cuatro semanas generó elevados títulos de
anticuerpos contra la proteína purificada, determinados en la prueba
de ELISA (Tabla 7). Los anticuerpos generados por el antígeno de 74
kD purificado a partir de las cepas O35E o 430-345
reaccionaban intensamente con el antígeno de 74 kD purificado a
partir de ambas cepas, lo que indica que las proteínas de 74 kD de
estas dos cepas eran antigénicamente similares. Cuando se analizaron
estos sueros por ELISA frente a la proteína de 74 kD purificada de
la cepa TTA24 se detectaron títulos bajos (Tabla 7). Por tanto, la
proteína de 74 kD de la cepa TTA24 parece ser antigénicamente
distinta de las proteínas de 74 kD de las cepas O35E o
430-345. Sin embargo, cuando los anticuerpos
generados contra la proteína de 74 kD de la cepa TTA24 fueron
analizados frente a la proteína de la cepa O35E, se detectó un
título moderado, lo que indica que hay cierto grado de conservación
entre las proteínas de 74 kD de las cepas TTA24 y O35E, y que los
epítopos específicos de cepa puede ser más inmunógenos que los
epítopos conservados en la proteína de 74 kD de la cepa O35E. Los
antisueros no reaccionaron con otras proteínas de M.
catarrhalis analizadas, a saber: CopB recombinante, C/D
recombinante, o UspA purificada, a juzgar por las pruebas de ELISA o
de inmunoelectrotransferencia (datos no mostrados).
\vskip1.000000\baselineskip
Los antisueros generados contra las proteínas de
74 kD de las cepas O35E y 430-345 en ratones fueron
analizados en una prueba de ELISA de células enteras frente a varias
cepas de M. catarrhalis. Las dosis en las columnas 1, 3 y 5
de la Tabla 8 siguiente corresponden a 2 x 1 \mug de proteína; las
dosis en las columnas 2 y 4 corresponden a 2 x 5 \mug de proteína.
El adyuvante utilizado fue 25 \mug de Stimulon™
QS-21. Estos sueros presentaron elevados títulos en
ELISA de células enteras frente a las cepas O35E y
430-345, pero los títulos frente a otras 5 cepas
fueron muy inferiores (Tabla 8). Cuando los lisados de células
enteras de nueve cepas de M. catarrhalis fueron sometidos a
SDS-PAGE al 4-15%, transferidos a
una membrana de nitrocelulosa y analizados con antisuero contra la
proteína de 74 kD, se detectó una única banda en la región de 74 kD
en todas las cepas aisladas (véase la Figura 5). Esto indica que los
títulos frente a células bacterianas enteras se debían a la
reactividad específica contra la proteína de 74 kD.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Proteína de 74 kD de la cepa TTA24: Está
claro que las proteínas de 74 kD de las cepas O35E y
430-345 son antigénicamente similares. Los
anticuerpos generados por la proteína de 74 kD procedentes de estas
dos cepas presentaban escasa reacción con muchas otras cepas de
M. catarrhalis, incluida la cepa TTA24. Debido a esta
observación, la proteína de 74 kD de la cepa TTA24 fue purificada y
evaluada en ratones para determinar si presentaba la misma pauta de
conservación. Como parte de este experimento, se examinó asimismo
una mezcla de dos proteínas de 74 kD antigénicamente distintas.
Se inmunizaron ratones BALB/c (10
animales/grupo, hembras, de 6-8 semanas de edad al
comienzo del estudio) en las semanas 0 y 4 con 5 \mug de la
proteína de 74 kD (10 \mug en el caso del grupo con la mezcla de
proteínas de 74 kD) mezclados con 25 \mug de Stimulon™
QS-21. Se determinaron los títulos en ELISA de
células enteras en muestras de suero agrupadas. Como referencia en
este ensayo, se incluyó el suero contra la proteína de 74 kD de la
cepa O35E procedente de un estudio previo. Los resultados presentan
en la Tabla 9:
Los resultados de la Tabla 9 indican que los
anticuerpos generados por la proteína de 74 kD de la cepa TTA24
presentaron títulos muy elevados contra la cepa homóloga y títulos
moderadamente elevados contra 10 cepas heterólogas en la prueba de
ELISA de células enteras. Los títulos contra las cepas heterólogas
son significativamente superiores a los de los sueros generados por
las proteínas de 74 kD de las cepas O35E y 430-345.
La reactividad específica del suero contra la proteína de 74 kD se
confirmó por inmunoelectrotransferencia (Fig. 6, zona inferior).
Como era de esperar, una mezcla de las proteínas
de 74 kD de las cepas TTA24 y 430-345 generó un
elevado nivel de anticuerpos frente a las cepas homólogas y frente a
la cepa O35E, con la que está relacionada antigénicamente. Tanto los
títulos en ELISA como los de anticuerpos bactericidas contra otras
ocho cepas fueron casi los mismos que los títulos generados por la
proteína de 74 kD de la cepa TTA24 sola (Tabla 9). La reactividad
específica de los anticuerpos contra la proteína de 74 kD se
confirmó por inmunoelectrotransferencia (Fig. 6, zona superior).
En resumen, la proteína de 74 kD de las cepas de
M. catarrhalis parece presentar variación antigénica. La cepa
TTA24 parece expresar una forma de la proteína de 74 kD que está
mejor conservada que las de de la cepas O35E y
430-345. La proteína de 74 kD de la cepa TTA24
generó anticuerpos reactivos contra todas las cepas de M.
catarrhalis analizadas. También pareció innecesaria la
utilización de una mezcla de las proteínas de 74 kD para generar una
buena respuesta.
Para determinar si la inmunización con la
proteína de 74 kD purificada aumentaba la eliminación pulmonar de
las bacterias introducidas por vía intratraqueal en un modelo
murino, se sometieron ratones inmunizados con la proteína de 74 kD,
preparada a partir de las cepas O35E y 430-345, a
exposición a las cepas O35E o TTA24 de M. catarrhalis. La
exposición se llevó a cabo utilizando un procedimiento descrito
anteriormente (11). En resumen, 3,5 x 10^{5} UFC de bacterias de
un cultivo en fase logarítmica media se instilaron por vía
intratraqueal en los pulmones de ratones anestesiados mediante
inyección intramuscular de una mezcla de 2 mg de HCl de ketamina
(Fort Dodge Lab., Ford Dodge, IA) y 0,2 mg de maleato de
acepromacina (Butler Co., Columbus, OH). Se recuperaron bacterias
viables de los pulmones de los ratones seis horas después de la
exposición, y se determinó el porcentaje de eliminación de bacterias
en los ratones inmunizados en comparación con las UFC recuperadas de
los animales testigo. Los animales testigo fueron inmunizados con
CRM_{197} y Stimulon™ QS-21. El análisis
estadístico se realizó utilizando la prueba de la suma de rangos de
Wilcoxon (JMP Software, SAS Institute, Cary, NC). Un valor de la
probabilidad (p) inferior a 0,05 se consideró estadísticamente
significativo.
Ocho grupos de ratones procedentes de varios
estudios, que fueron inmunizados con la proteína de 74 kD purificada
de la cepa O35E, fueron expuestos a las cepas O35E o TTA24. Los
grupos 9 y 10 fueron inmunizados con la proteína de 74 kD de la cepa
430-345 y expuestos a la cepa O35E (grupo 9) o a la
cepa TTA24 (grupo 10). Se inmunizaron ratones BALB/c (hembras, de
6-8 semanas de edad al comienzo del estudio, 10 por
grupo) en las semanas 0 y 4 con 1 \mug de antígenos mezclados con
25 \mug de Stimulon™ QS-21. Los sueros, recogidos
4 días antes de la exposición, fueron analizados mediante exposición
a la cepa en una prueba de ELISA de células enteras. Los resultados
se expresan como títulos de IgG de punto final en muestras
agrupadas. El testigo con CRM_{197} presentaba títulos en ELISA
inferiores a 100 en el mismo ensayo. Los ratones fueron sometidos a
exposición por vía intratraqueal con 3,5 x 10^{5} UFC de
bacterias, y las bacterias viables se recuperaron de los pulmones 6
horas después de la exposición. El porcentaje de eliminación es el
porcentaje de bacterias eliminadas de los ratones inmunizados en
comparación con los testigos que fueron inmunizados con CRM_{197}
y Stimulon™ QS-21. Los resultados del estudio de
eliminación pulmonar se muestran en la Tabla 10:
La eliminación de bacterias en comparación con
los testigos para cada experimento fue considerada estadísticamente
significativa en la prueba de rangos con signo de Wilcoxon si p era
inferior a 0,05.
En comparación con los ratones testigo
inmunizados con CRM_{197}, el aumento de la eliminación pulmonar
de bacterias heterólogas sólo se observó en el caso de los ratones
expuestos a la cepa O35E (Tabla 10). La falta de aumento en la
eliminación de TTA24 concuerda con la escasa reactividad de los
anticuerpos frente a esta cepa en la prueba de ELISA de células
enteras (véase la Tabla 8). También se observó aumento en la
eliminación de la cepa O35E, pero no de la cepa TTA24, en ratones
inmunizados con la proteína de 74 kD purificada a partir de la cepa
430-345 (Tabla 10). Una vez más, esta observación
correlacionaba con la reactividad de los anticuerpos frente a
células enteras. La proteína de 74 kD de TTA24 parece ser
antigénicamente distinta de la de la cepa O35E o
430-345. Este dato puede explicar la incapacidad de
eliminar esta cepa que se observa en los ratones inmunizados con las
proteínas de 74 kD. Los datos de exposición en animales indican que
la inmunización con la proteína de 74 kD purificada provocará un
aumento
de la eliminación pulmonar de las cepas de M. catarrhalis que tienen proteínas de 74 kD antigénicamente similares.
de la eliminación pulmonar de las cepas de M. catarrhalis que tienen proteínas de 74 kD antigénicamente similares.
Las investigaciones indicaron que los sueros de
adultos sanos contienen anticuerpos adquiridos de forma natural que
son específicos de M. catarrhalis (datos no mostrados). Para
determinar si estaban dirigidos contra la proteína de 74 kD, se
analizaron sueros de seis adultos sanos en busca de reactividad con
la proteína de 74 kD purificada de las cepas O35E y TTA24 en una
prueba de ELISA. Los seis sueros presentaban títulos detectables, y
los títulos contra la proteína de 74 kD de la cepa TTA24 eran
mayores, como se muestra en la Tabla 11:
Se observó reactividad específica contra la
proteína de 74 kD en cada uno de los sueros mediante
inmunoelectrotransferencia (véase la Figura 7). Esto indica que la
proteína de 74 kD es expresada por M. catarrhalis in vivo, y
es una diana de la respuesta de anticuerpos.
Para determinar si los anticuerpos humanos
contra la proteína de 74 kD reconocen epítopos en la superficie
bacteriana, se purificaron por afinidad anticuerpos específicos
contra la proteína de 74 kD a partir del plasma mezclado de dos
adultos sanos (American Red Cross, Rochester, N.Y.). Los anticuerpos
se precipitaron añadiendo sulfato de amonio hasta una saturación del
50%, se resuspendieron y se dializaron frente a PBS. Se incubó una
membrana de nitrocelulosa (2 x 3 pulgadas) con la proteína de 74 kD
purificada a partir de la cepa O35E a una concentración de 1,0 mg/ml
en PBS durante una hora a TA, se lavó dos veces con PBS, y se
bloqueó el resto de los sitios de unión en la membrana con leche en
polvo al 5% (peso/volumen) en PBS durante dos horas a TA. Después
se lavó la membrana dos veces con PBS, glicina 100 mM (pH 2,5), y
finalmente con PBS, antes de su incubación con la preparación de
anticuerpo dializado. Tras incubar durante cuatro horas a 4ºC, la
membrana se lavó con PBS, y después con tampón Tris 10 mM (pH 8,0)
que contenía cloruro de sodio 1 M para eliminar las proteínas unidas
de forma no específica. Los anticuerpos unidos fueron eluidos
incubando la membrana en 5 ml de glicina 100 mM (pH 2,5) durante dos
minutos con agitación. Se añadió inmediatamente un mililitro de
Tris-HCl (1 M, pH 8,0) a la solución eluida para
neutralizar el pH. Los anticuerpos eluidos fueron dializados frente
a PBS, distribuidos en partes alícuotas y conservados a -20ºC.
Como se muestra en la Figura 8, una
inmunoelectrotransferencia confirmó que el anticuerpo purificado
reaccionaba específicamente con la proteína de 74 kD, pero no
reaccionaba con otras proteínas de la membrana externa de lisados de
células enteras de la cepa O35E.
Los títulos de ELISA y de punto final son las
máximas diluciones del anticuerpo que proporcionan una A_{415}
superior a tres veces el fondo cuando se analizan frente a células
bacterianas enteras. Como se muestra en la Tabla 12, aunque los
anticuerpos se prepararon utilizando la proteína de 74 kD de la cepa
O35E y la cepa TTA24, cada uno reaccionaba con otras cinco cepas en
ELISA de células enteras con títulos similares:
Los resultados presentados en la Tabla 12
indican que los seres humanos generan una respuesta de anticuerpos
contra los epítopos superficiales conservados de la proteína de 74
kD tras la infección natural.
Debido a que la transferrina puede ser una
fuente de hierro in vivo para M. catarrhalis, la unión
de los anticuerpos contra la proteína de 74 kD a la superficie
bacteriana puede interrumpir el proceso de adquisición de hierro. Se
utilizó la transferencia de puntos para determinar si los
anticuerpos contra la proteína de 74 kD podían inhibir la unión de
la transferrina al lisado bacteriano. Se aplicaron tres microlitros
de lisado de O35E a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se
bloqueó con PBS que contenía leche en polvo al 5%, y después se
incubó con antisuero de ratón (diluido 1:100 en PBS que contenía
leche en polvo al 5%) contra la proteína de 74 kD de la cepa O35E
durante dos horas a temperatura ambiente. Se incluyeron suero normal
de ratón y antisuero de ratón contra la UspA como testigos. Después
se incubó la membrana secuencialmente con transferrina marcada con
biotina, estreptavidina-fosfatasa alcalina y el
sustrato de la enzima, como se ha descrito anteriormente. Como se
expone en la Figura 9, se observó una reducción de la unión a la
transferrina con anticuerpos contra la proteína de 74 kD. En
contraposición, ni el suero normal de ratón ni el suero
anti-UspA interferían en la unión a la transferrina.
Esto indica que los anticuerpos contra la proteína de 74 kD inhiben
de forma específica la unión a la transferrina.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: American Cyanamid Company
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Five Giralda Farms
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Madison
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: New Jersey
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 07940
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 973/683-2157
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 973/683-4117
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteína de 74 kilodalton de la membrana externa de Moraxella catarrhalis
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con PC de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala
Pro Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala
Pro Thr Pro Ile Pro Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala
Pro Thr Pro Ile Pro}
\sac{Asn Ala Ser Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala
Pro Thr Pro Ile Pro}
\sac{Asn Ala Ser Gly Ser Gly Asn Thr Gly Asn
Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala
Pro Thr Pro Ile Pro}
\sac{Asn Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Asp Glu Lys Asn Lys Pro Asp Gly Tyr Asn
Gly Glu Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Gly Glu Tyr Gly His Ser Ser Glu Phe Thr
Val Asn Phe Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Asp Glu Lys Asn Lys Pro Asp Gly Tyr Asn
Gly Glu Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácida
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Ser Ile Val Ile Arg Asp Ala Asp Val Thr
Gly Gly Phe Tyr Tyr}
\sac{Pro Asn Ala Thr}
Claims (18)
1. Proteína de M. catarrhalis de 74 kD
aislada y purificada de la cepa O35E o TTA24 de M.
catarrhalis, para la generación de antisueros que presentan
actividad bactericida frente a una cepa heteróloga de M.
catarrhalis en un hospedador mamífero, en la que la proteína de
74 kD presenta:
- (a)
- un peso molecular de aproximadamente 74 kD como se ha medido por espectrometría de masas; y
- (b)
- la secuencia aminoácida amino-terminal:
- Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asn Pro Pro Ala Pro Thr (SEC ID nº: 1), en la que el primer residuo no está identificado.
2. Proteína de 74 kD aislada y purificada de la
cepa O35E de M. catarrhalis según la reivindicación 1, que
presenta la secuencia aminoácida amino-terminal:
3. Proteína de 74 kD aislada y purificada de la
cepa TTA24 de M. catarrhalis según la reivindicación 1, que
presenta la secuencia aminoácida amino-terminal:
4. Proteína de 74 kD aislada y purificada de la
cepa O35E de M. catarrhalis según la reivindicación 1, que
presenta la secuencia aminoácida amino-terminal:
5. Proteína de 74 kD aislada y purificada según
la reivindicación 1, que presenta un peso molecular de
aproximadamente 74,9 kD como se ha medido en un gel de
SDS-PAGE al 10%.
6. Proteína de 74 kD aislada y purificada según
la reivindicación 1, que presenta la composición aminoácida de
residuos por mol de la proteína de 74 kD de aproximadamente Asp +
Asn=104, Thr=58, Ser=44, Glu + Gln=67, Pro=27, Gly=77, Ala=56,
Val=35, Met=6, Ile=21, Leu=40, Tyr=25, Phe=28, His=8, Lys=72,
Arg=21, en la que los residuos de Cys y de Trp no están
determinados.
7. Composición de vacuna que comprende una
proteína de 74 kD aislada y purificada de la cepa O35E o TTA24 de
M. catarrhalis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6.
8. Composición de vacuna según la reivindicación
7, que comprende además un adyuvante, diluyente o portador.
9. Composición de vacuna según la reivindicación
8, en la que el adyuvante se selecciona de entre el grupo
constituido por hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio,
Stimulon™ QS-21, monofosforil-lípido
A 3-O-desacilado, e
IL-12.
10. Composición de vacuna según la
reivindicación 7, que comprende además por lo menos un antígeno
adicional de M. catarrhalis.
11. Composición de vacuna según la
reivindicación 10, en la que el antígeno adicional de M.
catarrhalis se selecciona de entre el grupo constituido por las
proteínas denominadas CopB, UspA, C/D y E.
12. Composición de vacuna según la
reivindicación 7, en la que la proteína de 74 kD está acoplada a un
agente que protege contra otro organismo patógeno.
13. Composición de vacuna según la
reivindicación 7, en la que la proteína de 74 kD está acoplada a ora
parte antigénica de M. catarrhalis.
14. Proteína de 74 kD aislada y purificada de
M. catarrhalis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a
6, para su utilización en terapia.
15. Proteína de 74 kD aislada y purificada de
M. catarrhalis según la reivindicación 14, que está acoplada
a un agente que protege contra otro organismo patógeno.
16. Proteína de 74 kD aislada y purificada de
M. catarrhalis según la reivindicación 14, que está acoplada
está acoplada a otra parte antigénica de M. catarrhalis.
17. Utilización de una proteína de 74 kD aislada
y purificada de M. catarrhalis según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 ó 14 a 16, para su utilización en la
preparación de una composición de vacuna en una cantidad que genera
una respuesta inmunitaria protectora contra una cepa heteróloga de
M. catarrhalis en un hospedador mamífero.
18. Método para preparar una composición de
vacuna que comprende incluir la proteína de 74 kD aislada y
purificada de M. catarrhalis según la reivindicación 1 en una
cantidad suficiente, de manera que dicha composición de vacuna
genere una respuesta inmunitaria protectora contra una cepa
heteróloga de M. catarrhalis en un hospedador mamífero.
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