CZ2000530A3 - Protein Neisserie vázající laktoferin - Google Patents

Abstract

Popisují se polypeptidy a polynukleotidy proteinu LbpB a způsoby produkce takových polypeptidů rekombinantními postupy. Také se popisují mimo jiné postupy využití polypeptidů a polynukleotidů LbpB při tvoření postupů pro léčbu neisseriových onemocnění a diagnostické testy takových stavů.

Description

Protein Neísserie vázající laktoferin f!/ ίλή -n v

Oblast techniky

Vynález popisuje nově identifikované polynukleotidy a jimi kódované polypeptidy a použití takových polynukleotidů a polypeptidu a jejich produkci. Polynukleotidy a polypeptidy podle vynálezu se vztahují k rodině proteinů vnější membrány Neisserie (OMP), zvláště pak k proteinu B vázajícímu laktoferin (LbpB). Dále se vynález týká terapeutického použití LbpB, jako je vakcínace proti onemocnění způsobené mikroorganizmem Neísserie.

Dosavadní stav techniky

Meningitida může být buď bakteriálního nebo virového původu, přičemž její bakteriální forma je daleko vážnější onemocnění. Bakterie, které odpovídají za toto onemocnění jsou Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae a Streptococcus pneumonia. Od té doby, co se začala používat konjugované vakcína proti mikroorganizmu H. influenzae typu B (Hib) a začlenila se do rutinní vakcínace dětí, N. meningitidis se stala vedoucím organizmem způsobující meningitidu po celém světě. Odhaduje se, že pouze v USA se vyskytuje ročně 2 600 případů.

Druh N. meningitidis se rozděluje do 13 séroskupin podle složení kapsulárních polysacharidů. Navíc každá skupina je dále rozdělena do sérotypů, subtypů a imunotypů na základě jiných komponentů bakterie. Tři séroskupiny (A, B nebo C) zahrnují více jak 90 % případů meningitidy a u vyspělých průmyslových národů séroskupina B odpovídá za 50 až 80 % případů.

Účinné vakcíny založené na kapsulárních polysacharídech existují, aby zabránily onemocnění meningitidou způsobenou mikroorganizmem N. meningitidis séroskupiny A a C. Vakcíny polysacharidů séroskupiny C neprodukují ochranný účinek u ···· ·· dětí, které jsou mladší 2 let (což je období, kdy existuje

Tento nedostatek lze konjugují s nosičovým největší riziko vzniku meningitidy) obejít tím, že se polysacharidy proteinem. Konjugace má další výhodu. Vyvolává imunologickou paměť proti antigenu.

Naopak polysacharid mikroorganizmu N. meningitidis séroskupiny B vykazuje u lidí malou nebo žádnou imunogenost bez ohledu, zda je nebo není v konjugováné formě. Je proto velmi žádané, vytvořit vakcínu proti onemocnění způsobené mikroorganizmu N. meningitidis ) zvláště séroskupinou B, která se liší od vakcíny založené na polysacharidu.

Slibnou třídu kandidátů vakcín tvoří ty, kteří používají proteiny vnější membrány (OMP) N. meningitidis, protože poskytují antigeny, které jsou imunogenní a přístupné pro lidskou imunitní odezvu. Slibné se jeví OMP, které odpovídají za pohlcení železa buňkou.

Železo je podstatný nutrient pro většinu bakterií. V případě extracelulárních kompartmentů lidského těla se železo vyskytuje v komplexech hlavně s transferinem v séru a s laktoferinem na povrchu sliznic (Finkelstein, R. A., Sciortíno, C. V.,and Mclnlntosh, M. A, (1983) Role of iron in microbe-host interactios. Rev Infect Dis 5: S759-S777) s nepatrným množstvím volné formy. Proto u patogenních bakterii je účinné zavedení železa důležitým faktorem virulence. Co se týče mikroorganizmu N. meningitidis (pro člověka je vážným patogenem), nutné železo je získáváno prostřednictvím receptorů pro proteiny chelatující železo, jako je transferin nebo laktoferin, které umožňují buňce vázat tyto proteiny a pak získat železo, které je nutné pro jeho růst. Syntéza těchto receptorových proteinů se vyvolá, když bakterie pociťují limitaci železem.

Klonovaly se a sekvenovaly se receptorové proteiny podílející se na pohlcení železa z tranferinu TbpA a TbpB (popisuje se v publikaci Cornelissen, C. N., Biswas, G. D.,

99 9· 9 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9 9 9

999 · 9999 99 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 9 99 99

Tsaí, J., Paruchuri, D. K., Thompson, S. A., and Sparling, P.

E. (1992) Gonnococcal transferrin-binding protein 1 is reguired for transferrin utilization and is homologous to TonB-dependent outer membrane receptors. J. Bacteriol 174: 5788-5797, Legrain, M., Marazin, V., Irwin, S. W. , Bouchon, Β., B., Quentin-Millet, M.-J., Jacobs, E., and Schryvers, A.

B. (1993) Cloning and characterisation of Neissería meningitidis genes encoding the transferrin-binding proteins Tbpl a TbP2. Gene 130: 73-80, Anderson, J. E., Sparling, P.

F. , and Cornellisen, C. N. (1994) Gonococcal transferrinbinding protein 2 facilitates but is not essential for transferrin utilization. J. Bacteriol 176: 3162-3170) a proteinu A vázajícího laktoferin (LbpA) (Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tomraassen, J., (1993) Molecular characterizatíon of the 98-kilodalton ironregulated outer membrane protein of Neisseria meningitidis. Infect Immun 61: 4724-4733, Pettersson, A., Maas, A., and

Tommassen, J. , (1994b) Identification of the iroA gene product of Neisseria meningitidis as a lactoferrin receptor. J Bacteriol 176: 1764-1766, Biswas, G. D. , and Sparling, P.

F. (1995) Characterisation of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Inf-ect Immun 63: 2958-2967). Receptorové proteiny vázající transferin tvoří ve vnější membráně komplex. U mikroorganizmu Neisseria meningitidis se zdá, že TbpA i TbpB jsou nezbytné pro transport železa (Irwin, S. W., Averil, N. A., Cheng, C. Y., and Schryvers, A. B. (1993) Preparetion and analysis of isogenic mutans in the transferrin receptor protein genes, tbpA and tbpB from Neisseria meningitidis. Mol Microbiol 8: 1125-1133) . TbpA je zabudovaný membránový protein, zatímco TbpB je lipoprotein a je zakotven v membráně pouze svou částí. Současný model mechanizmu receptoru naznačuje, že transferin se železem se váže na komplex receptoru. V tomto komplexu protein TbpB rozlišuje transferin se železem a apo• 4

40 0 ·0 00 • 0 0 000 · 0 0 0 • 00 0000 000· 00 000 0000000 00 0

0000 00

00 transferin. Navázání transferinu vede u receptoru ke změnám v konformaci, které uvolňují železo z transferinu a otevírají se póry v TbpA a železo se může transportovat skrz vnější membránu (Cornelissen and Sparling, 1994, 1996) .

Receptor laktoferinu se také zdá být důležitým virulentním faktorem mikroorganizmu Neisseria meningitidis. Hlavní místo vstupu do lidského těla je nosofaryng, kde laktoferin je hlavní zdroj železa. Dále, dříve uvedené práce ukazují, že v případě akutních zánětů je laktoferin schopen procházet hematoencefalickou bariérou (Gschwentner, C., Lassmen, H., and Huettinger, M. (1997) Lactoferrin and its receptor(s): modulators of inflammation? Abstracts of Third International Conference on Lactoferrin. p. 68). Je možné, že laktoferin je v pozdějším stádiu infekce, kdy bakterie dosáhli měkkých plen mozkových, pro meningokoky také důležitým zdrojem železa. Za použití afinitního izolačního postupu se původně identifikoval jediný protein vázající laktoferin (Schruvers, A. Β., and Morris, L. J. (1988) Identification and characterisation of the human lactoferrinbinding protein from Neisseria meningitidis. Infect Immun 56: 1144-1149). Charakterizoval se strukturální gen tohoto receptoru označený LbpA (Pettersson, A., van der Ley, P., Podmaň, J. T., and Tommassen, J. , (1993) Molecular characterization of the 98-kilodalton iron-regulated outer membrane protein of Neisseria meningitidis. Infect Immun 61: 4724-4733, Pettersson, A., Maas, A., and Tommassen, J., (1994b) Identification of the iroA gene product of Neisseria meningitidis as a lactoferrin receptor. J Bacteríol 176: 1764-1766, Biswas, G. D., and Sparling, P. F. (1995) Characterisation of lbpA, the structural gene for a lactoferrin receptor in Neisseria gonorrhoeae. Infect Immun 63: 2958-2967) a navrhl se model topologie pro protein ve vnější membráně (Pettersson, A., Klarenbeek, V., van Deurzen,

J., Poolman, J. T., and Tommassen, J., (1994a) Molecular * · • · · · ··· «··· • ·· · · · · · · · ₉ 9 9 ··· ······· ·« « ······ ·· · ·· chracterisatíon of the structural gene for the lactoferrin receptor of the meningococcal strain H44/76. Microbial Pathogen 17: 395-408). Protein vykazuje homologii s tbpA. Navic se proti směru exprese genu IbpA identifikovala část možného otevřeného čtecího rámce a dedukovaná aminokyselinová sekvence vykazuje homologii

Klarenbeek,

Tommassen, structural (Pettersson, A.,

T., of of and the the s TbpB

V., van Deurzen, J. , Poolman, J.

J., (1994a) Molecular chracterisatíon gene for the lactoferrin receptor meningococcal strain H44/76. Microbial Pathogen 17: 395-408).

TbpB a jiné čištěné meningokokální OMP se popisují v předchozích patentových dokumentech s ohledem na jejich použití jako vakcín proti Neisseria meningitidis (například TbpB se popisuje v dokumentu WO 9307172, povrchový protein o molekulové hmotnosti 22 000 se popisuje v dokumentu WO

9629412, receptor haemoglobinu se popisuje v dokumentu WO 9612020, protein porinu se popisuje v dokumentu WO 9503413, piliové proteiny se popisují v dokumentu WO 9408013, OMP o molekulové hmotnosti 64 000 se popisují v dokumentu EP

474313-B1) .

Existuje nutnost identifikace a charakterizace dalších členů rodiny OMP, které mohou mít jistou úlohu při prevenci nebo opravě dysfunkcí nebo onemocnění, které zahrnují, ale nejsou omezeny na onemocnění způsobené neisseriemi (například meningitida).

Protilátky proti LbpA se nezdají být bakteriocidní a proto mají omezené použití jako vakcinační kandidát (popisuje se v publikaci (Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J. , (1993) Molecular characterization of the 98-kilodalton iron-regulated outer membrane protein of Neisseria meningitidis. Infect Immun 61: 4724-4733).

Vynález dále popisuje a charakterizuje jiný receptorový protein vázající laktoferin, protein B vázající laktoferin • · • 99 · · · · · 9 9 · • 9 · · · 9999999 9 9 ·

9 9 9 9 9 · · · · ······ ·· · 9 9 ·9 (LbpB), jeho úlohu při využití železa z laktoferinu a jeho terapeutické použití.

Existuje několik výhody kterými se staví LbpB před jiné OMP vakcinační kandidáty. Za prvé, ve stádiu meningokokálního onemocnění, které vzniklo v krvi, je laktoferin podstatný pro organizmus, protože vykazuje 300 krát vyšší afinitu pro navázání železa než lidský transferin a proto použití laktoferinu jako zdroje železa je pro organizmus podstatné. Za druhé, laktoferin má známý antibakteriální účinek a jeho koncentrace v krvi při infekci roste. Proto je také pro organizmus důležité vázat lidský laktoferin, jako způsob získání rezistence vůči tomuto účinku. Za poslední, lidský laktoferin je hlavní zdroj železa pro mikroorganizmus Neisseria meníngítidis v místě vstupu bakterie do lidského těla (nosofaryng).

Význam těchto výhod je, že antigeny LbpB se budou pravděpodobně exprimovat na povrchu buněk u většiny meningokoků v těle člověka. Dále je pravděpodobné, že buněčná povrchová oblast LbpB bude velmi konzervativní, protože se musí účině vázat na laktoferin. Dále je pravděpodobné, že imunitní odezva řízená proti antigenu LbpB nemůže zastavit pouze meningokokální infekci v krvi, ale musí dokonce zastavit přestup organizmu v nosofaryngu.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje polypeptidy LbpB a rekombinantní materiály a způsoby jejich produkce. Dále vynález popisuje způsoby použití takových polypeptídů LbpB a polynukleotidů. Takové použití zahrnuje mezi jinými také prevenci nebo léčbu neisseriového onemocnění (například meningitida). Dále se vynález týká diagnostických testů, které detekují onemocnění spojené s přítomností LbpB.

Definice ··· · · · ···· ··· · · · · · · « « • · · · · · ···· · · · 4 · • 4 · · · · · · ·

44·· ·· · ·· ··

Následující definice přinášejí vysvětlení termínů, které se zde často používají.

Termín „LbpB se v obecném případě vztahuje k polypeptidů, upřednostňuje se lipoprotein, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10 nebo její alelové varianty.

Termín „aktivita LbpB nebo aktivita polypeptidů LbpB nebo „biologická aktivita LbpB nebo polypeptidů LbpB znamená metabolickou nebo fyziologickou funkci uvedeného LbpB, přičemž jsou zde zahrnuty i podobné aktivity. Aktivita LbpB je schopnost vázat lidský laktoferin. Tato aktivita LbpB se může testovat za použití způsobu popsaného v příkladu 6. V této definici jsou také zahrnuty antigenní a imunigenní aktivity uvedeného LbpB. Tato antigenicita se může testovat za použití metody imunoblotu, jak se popisuje v příkladu 9, s výhodou za použití polyklonálního antiséra proti LbpB meningokokového kmene BNCV, jak se popisuje v příkladu 10A. Imunogenost je možno nejlépe testovat měřením protilátkové odezvy (za použití polyklonálního séra generovaného proti varientě) v testu ELISA za použití čištěného LbpB pocházejícího meningokokálního kmene BNCV, jak se popisuje v příkladu 10B.

Termín „gen lbpB zahrnuje polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci 100 až 2 274 uvedenou v SEQ ID NO: 1 nebo úplnou nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 3, 5, 7 nebo 9 nebo její alelové varianty a/nebo její komplementy.

Termín „protilátky zahrnuje polyklonální a monoklonální protilátky, chimérové, jednořetězcové a humanizované protilátky, stejně jako fragmenty Fab, zahrnující produkty Fab nebo jinou knihovnu exprimující imunoglobin.

Termín „ izolovaný znamená změněný z původního stádia „zásahem člověka”. Jestliže se in natura objeví „izolovaná kompozice nebo látka, změní se nebo se odstraní z jeho původního prostředí nebo je možné provést obě varianty. Polynukleotid nebo polypeptid, který se přirozeně vyskytuje v živém zvířeti není „izolován, ale stejný polynukleotid nebo polypeptid separovaný stádiu je „izolován.

Termín „polynukleotid libovolný polyribonukleotid z materiálů v jeho přirozeném v obecném případě znamená nebo polydeoxyribonukleotid, kterým může být nemodifikovaná RNA nebo DNA nebo modifikovaná RNA nebo DNA. Termín „polynukleotidy zahrnuje bez omezení jednořetězcovou a dvouřetězcovou DNA, DNA, která je směsí jednořetězcových a dvouřetězcových oblastí, jednořetězcovou a dvouřetězcovou RNA a RNA, která je směsí jednořetězcových a dvouřetězcových oblastí, hybridní molekuly obsahující DNA a RNA, které mohou být jednořetězcové nebo ve více typickém případě dvouřetězcové nebo mohou být směsí jednořetězcových a dvouřetězcových oblastí. Dále termín „polynukleotid znamená troj řetězcové oblasti obsahující RNA nebo DNA nebo obě RNA a DNA. Termín polynukleotid také zahrnuje DNA nebo RNA obsahující jednu nebo více modifikovaných baží a DNA nebo RNA, kde u hlavního řetězce se modifikuje stabilita nebo jiné faktory. Termín „modifikované báze znamená například tritylované báze a neobvyklé báze, jako je inosin. Na DNA a RNA je možné provést řadu úprav. Tak termín „polynukleotid zahrnuje chemicky, enzymaticky nebo metabolicky modifikované formy polynukleotidů, které se v typickém případě objevují v přírodě, stejně jako chemické formy DNA a RNA, které charakterizují viry a buňky. Termín „polynukleotid také zahrnuje relativně krátké polynukleotidy, které se často nazývají oligonukleotidy.

Termín „polypeptid znamená peptid nebo protein obsahující dva nebo více amonikyselin vzájemně spojených peptidovými vazbami nebo modifikovanými peptidovými vazbami. To jsou peptidové izostéry. Termín „polypeptid znamená krátké řetězce, které se v běžném případě nazývají peptidy, • · • · •··· · » oligopeptidy nebo oligoméry, a delší v obecném případě nazývají proteiny, obsahovat aminokyseliny jiné než aminokyseliny kódované 20 geny. Termín „polypeptidy zahrnují aminokyselinové sekvence upravené buď přirozenými postupy, jako je post-translační zpracování, nebo chemickými modifikačními úpravami, které jsou dobře známy v oboru. Takové modifikace se dobře popisují v základních učebnicích a více detailů se uvádí v monografiích, stejně jako v objemné vědecké literatuře. Úpravy se mohou objevit kdekoliv v peptidu, který zahrnuje peptidový řetězec, v aminokyselinových bočních řetězcích a na N- a G-konci. Je výhodné, aby se stejné typy úprav objevily ve stejném stupni nebo v různých stupních na několika místech v daném polypeptidu. Daný polypeptid může také obsahovat řadu typů modifikací. Polypeptidy se mohou větvit, mohou tvořit cyklickou strukturu s větvením nebo bez. Cyklické, větvené nebo větvené cyklické polypeptidy mohou vznikat z posttranslačních přirozených způsobů nebo se mohou vytvořit Modifikace zahrnují acetylaci, amidaci, kovalentní syntetickými metodami, acylaci, ADP-ribosylaci, řetězce, které se Polypeptidy mohou flavinu, kovalentní připojení hemové části, připoj em kovalentní připoj em připoj ení připojení nukleotidu nebo nukleotidového derivátu, kovalentní lipidu nebo lipidového derivátu, kovalentní fosfotidylinositolu, síťování, cyklizace, tvoření disulfidových můstků, demetylace, tvoření kovalentního síťování, tvoření cystinu, tvoření pyroglutamátu, fomylace, gamma-karboxylace, glykosylace, hydroxylace, jodizace, metylace, tvoření kotev GPI, myristoylace, oxidace, proteolytické zpracování, fosforylace, prenylace, racemizace, selenízace, sulfanizace, adice aminokyselin na proteiny zprostředkovaná transferovou RNA, jako je arginylace a ubiquitinace (popisuje se například v publikaci proteins structure and molecular properties, 2^nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company , New York, 1993 and Wold, F. , ·· · • · · • ···«

Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslational covalent modification of proteins, B. C. Johnson, Ed., Academie Press, New York, 1983, Seifter et al., „Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646 a Rattan et al., „Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Agíng Ann NY Acad. Sci. (1992) 663: 48-62) .

Termín „varianta znamená polynukleotid nebo polypeptid, který se liší od referenčního polynukleotidu nebo polypeptidu, ale zachovává si podstatné biologické vlastností. Typická varianta polynukleotidu se liší od jiné varianty, kterou je referenční polynukleotid, svou nukleotidovou sekvencí. Změny nukleotidové sekvence varianty mohou nebo nemusí polypeptidu kódovaného změnit aminokyselinovou sekvenci referenčním polynukleotidem. Změny nukleotidů mohou vést k aminokyselinovým substitucím, adicím, delecím, fúzím a zkrácení polypeptidu kódovaného referenční sekvencí, jak se popisuje dále v textu. Typická varianta polypeptidu se liší od jiné varianty, kterou může být referenční polypeptid, aminokyselinovou sekvencí. V obecném případě se rozdíly mohou omezit tak, že sekvence referenčního polypeptidu a varianty jsou velmi podobné a v mnoha oblastech jsou identické. Varianta a referenční polypeptid se mohou sekvencí jednou nebo více delecemi v libovolné kombinaci.

lišit aminokyselinovou substitucemi, adicemi,

Substituované nebo začleněné aminokyselinové zbytky mohou být nebo nemusí být kódovány genetickým kódem. Varianta polynukleotidu nebo polynukleotid se může přirozeně vyskytovat jako alelová varianta (například SEQ ID NO: 3, 5, 7 nebo 9 jsou varianty polynukleotidu IbpB sekvence SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4, 6, 8 nebo 10 jsou varianty polypeptidu LbpB se sekvencí SEQ ID NO: 2) nebo mohou být variantou, která se vyskytuje přirozeně. Varianty polynukleotidů a

9

9 9 9 9 9 9 ··· · η *1 · ·· · · · · 9 9 9 ♦ ·· ··· 9 9999 9 9 99 9

9999 99 99 9 polypeptidů, které se nevyskytují přirozeně, se mohou připravit metodou mutageneze nebo přímou syntézou. Varianty by si měly zachovat jednu nebo více biologických aktivit polypeptidů LbpB. Měly by být například schopny vázat lidský laktoferin (s výhodou, jak se popisuje při testování této aktivity v příkladu 6) nebo by měly mít podobné antigenní nebo imunogenní aktivity, jako LbpB. Antigenicita se může nejlépe testovat za použití imunoblotovací metody popsané v příkladu 9. Upřednostňuje se použití polyklonálního séra proti LbpB meningokokálního kmene BNCV, jak se popisuje v příkladu 10A. Imunogenost je možné nejlépe testovat měřením protilátkové odezvy (za použití polyklonálního protiséra proti variantě) v testu ELISA za použití čištěného LbpB z meningokokálního kmene BNCV, jak se popisuje v příkladu 10B. Je výhodné, aby si varianta zachovala všechny shora uvedené biologické aktivity.

Termín „identita zahrnuje měření identity nukleotidových sekvencí nebo aminokyselinových sekvencí. V obecném případě se sekvence uspořádaly tak, že se získá nejvyšší stupeň správného párování. Termín „identita per se má smysl, který je znám v oboru, a může se vypočítat za použití publikovaných metod (popisuje se například v publikaci Computational molecular biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988, Biocomputing: Informatics and genome projects, Smith, D. W. ed., Academie Press, New York, 1993, Computer analysis of sequence data, part 1, Griffin, A. M. and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994, Sequence analysis in molecular biology, von Heijne, G., Academie Press, 1987, a Sequence analysis primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991) . Zatímco existuje řada metod pro měření identity mezi dvěma polynukleotidovými nebo polypeptidovými sekvencemi, termín „identita je dobře znám v oboru (Carorillo, H., and Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48:1073). Metody, ·· Μ ♦ Φ · «

9 9

9

9 9

999 9 9 9 • * · ♦ « · Φ « • Φ Φ Φ φ

Φ · Φ ·

Φ · ΦΦ které se běžně používají ke stanovení shody nebo podobnosti mezi dvěmi sekvencemi zahrnují, ale nejsou omezeny na ty, které se popisují v publikaci Guide to Huge Computers, Martin J, Bishop, ed., Academie Press, San Díego, 1994 and Carillo,

H. , and Lipton, D. , SIAM J Applied Math. (1988) 48 : 1073. Způsoby vhodné pro stanovení shody a podobnosti se kodifikují v počítačových programech. Preferované počítačové metody pro stanovení shody a podobnosti mezi sekvencemi zahrnují, ale nejsou omezeny na program GCS (devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1): 387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. (1990) 215: 403).

Když polynukleotíd obsahující nukleotidovou sekvenci vykazující alespoň například 95 % shodu s referenční nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 1, znamená to, že nukleotidové sekvence polynukleotidu je identická s referenční sekvencí s tou výjimkou, že polynukleotídová sekvence může zahrnovat v průměru pět bodové mutace v každých 100 nukleotidech referenční nukleotidové sekvence SEQ ID NO:

I. Jinými slovy, aby se získal polynukleotid vykazující nukleotidovou sekvenci, který vykazuje alespoň 95 % shodu s referenční nukleotidovou sekvencí, musí se v referenční sekvenci deletovat nebo substituovat jiným nukleotidem až 5 % nukleotidů nebo řada nukleotidů a do referenční sekvence se může začlenit až 5 % celkového množství nukleotidů. Tyto mutace referenční sekvence se mohou objevit v polohách 3 a 5'konce referenční nukleotidové sekvence nebo v libovolném místě mezi terminálními konci. Kde se jednotlivě začlení mezi nukleotidy v referenční sekvenci nebo se do referenční sekvence začlení v podobě jedné nebo více skupin.

Podobně, když polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci vykazující alespoň například 95 % shodu s referenční aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2, lze říci, že aminokyselinová sekvence polypeptidu je shodná s referenční sekvencí s tou výjimkou, že sekvence polypeptidu může • · • · · • 9 9 ·

99·· « « * 9 9 9 9 • 99 ·

9 9 9 9

9 9 9

9999 99 99 zahrnovat v průměru pět změn aminokyselin na každých 100 aminokyselin referenční aminokyseliny se sekvencí SEQ ID NO:

2. Jinými slovy, aby se získal polypeptid vykazující alespoŇ 95 % shody s referenční aminokyselinovou sekvencí, může se deletovat nebo substituovat jinou aminokyselinou až 5 % celkového množství aminokyselinových zbytků v referenční sekvenci se může začlenit do referenční sekvence. Tyto změny v referenční sekvenci se mohou objevit v N- a C-terminálních polohách referenční aminokyselinové sekvence nebo libovolně mezi těmito termínálními polohami. Mohou být jednotlivě začleněny mezi zbytky do referenční sekvence nebo v podobě jedné nebo více skupin.

Polypeptidy podle vynálezu

Vynález se týká polypeptídů LbpB (nebo proteinů LbpB). Polypeptidy LbpB zahrnují polypeptidy se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10 (zbytky 1 až 18 je přirozený signální peptid každého z proteinů a zbytek Cysl9 je N-terminální aminokyselina, která lipiduje na přirozený zralý protein). Stejně jako polypeptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10 a polypeptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci, který vykazuje alespoň 65 % shodu s polypeptidem se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10 po celé délce. Více se preferuje polypeptid vykazující alespoň 70 % shodu a více výhodný je polypeptid vykazující alespoň 80 % shodu a dokonce nejvýhodnější je alespoň 90 % shoda se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10. Dále se velmi preferují polypeptidy vykazující alespoň 95 až 99 % shodu. Vedle LbpB polypeptídů se také zahrnují polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 65 % shodu s polypeptidem vykazující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10 v celé délce sekvence a stále více se preferuje alespoň 70 % shoda. Více výhodná je alespoň 80 % shoda a nejvíce se preferuje alespoň 90 % shoda se sekvencí

99999 9 9 ·· · » 9

SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10. Dále se vysoce preferuje alespoň 95 až 99 % shoda.

Polypeptidy LbpB popsané sekvencí SEQ ID NO: 2? 4, 6, 8a 10 jsou LbpB polypeptidy z mikroorganizmu Neisserie meningitidis kmeny BNCV, M981, H44/76, M990 a 881607.

Polypeptidy LbpB mohou být ve formě zralého proteinu nebo mohou být částí většího proteinu, jako je fúzní protein. Může být výhodné, když budou zahrnovat další aminokyselinovou sekvenci, která obsahuje sekreční nebo vedoucí sekvenci (takovou, jako je přirozená vedoucí sekvence LbpB, zbytky 1 až 18 v sekvenci SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 a 10), pro-sekvence, sekvence, které pomáhají při čištění například více histidinových zbytků, nebo další sekvenci zvyšující stabilitu během rekombinatní produkce.

Vynález dále popisuje fragmenty polypeptidů LbpB. Fragment je polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je zcela stejná, jako část, ale ne celá aminokyselinová sekvence dříve uvedených polypeptidů LbpB. Stejně jako je tomu u polypeptidů LbpB, fragmenty mohou být volné nebo mohou být obsaženy ve větším poiypeptidu, ve kterém tvoří jeho část nebo oblast, preferovanější je jednoduchá oblast. Reprezentativní příklady polypeptidových fragmentů podle vynálezu zahrnují například fragmenty z aminokyseliny číslo 1 až 20, 21 až 40, 41 až 60, 61 až 80, 81 až 100 a 101 až nakonec poiypeptidu LbpB. V tomto kontextu termín „přibližně znamená zvláště uvedené oblasti větší nebo menší než několik 5, 4, 3, 2 nebo 1 aminokyselina v jednou nebo v obou extrémech.

Preferované fragmenty zahrnují například zkrácené polypeptidy vykazující aminokyselinovou sekvenci polypeptidů LbpB, s výjimkou delece kontinuální série zbytků, které zahrnují N-konec nebo souvislou sérii zbytků, které zahrnují C-konec a/nebo transmembránovou oblast nebo deleci dvou souvislých sérií zbytků, kdy jedna zahrnuje N-konec a druhá

• · • · zahrnuje C-konec. Také se preferuj í fragmenty charakterizované strukturními a funkčními atributy, jako jsou fragmenty, které obsahují alfa-helix a oblasti tvořící alfahelix, smyčky a oblasti tvořící smyčky, dvoušroubovice a oblasti tvořící dvoušroubovice, hydrofilní oblasti, hydrofobní oblasti, alfa-amfipatické oblasti, betaamfipatické oblasti, oblasti tvořící povrch, oblast vázající substrát a oblast s vysokým antigenním indexem. Jiné preferované fragmenty jsou biologicky · aktivní fragmenty. Biologicky aktivní fragmenty jsou ty, které zprostředkovávají aktivitu LbpB, které zahrnují ty s podobnou aktivitou nebo se zlepšenou aktivitou nebo se zvýšenou nežádoucí aktivitou. Zahrnují se také ty, které jsou antigenní nebo imunogenní u zvířat, zvláště pak u lidí.

Fragmenty by si měly uchovat jednu nebo více biologických aktivit polypeptidu LbpB. Upřednostňuje se, aby polypeptidové fragmenty tvořily kontinuální pruhy (více jak 16 aminokyselin) aminokyselinové sekvence získané ze sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10 vykazující antigenní nebo imunogenní biologickou aktivitu, kterou také vykazuje polypeptid LbpB plné délky, ze kterého se fragmenty získaly.

Vynález dále popisuje varianty definované sekvence a fragmenty. Preferované varianty jsou ty, které se liší referenční sekvence substitucemi konzervativní aminokyseliny. To znamená ty substituce, které nahrazují zbytky jinými podobnými charakteristikami. Typické takové substituce jsou mezi Ala, Val, Leu a Ile, mezi Ser a Thr, mezi kyselými zbytky Asp a Glu, mezi Asn a Gin a mezi bazickými zbytky Lys a ARG nebo aromatickými zbytky Phe a Tyr. Zvláště se preferují varianty, kde několik 5 až 10, 1 až 5 nebo 1 až 2 aminokyselin se substituuje, deletuje nebo aduje v libovolné kombinaci.

Nejvíce preferované varianty jsou ty, které se liší od referenčních aminokyselinovoými substitucemi , které se • · :: , • · · · 4 • * • 4 4 4 4 4 nacházejí ve strukturálně ekvivalentních polohách (jak se ukázalo homologním uspořádáním) ostatních sekvencí LbpB (například homologické uspořádání sekvencí 5 LbpB zobrzených na obrázku č. 9). Zvláště preferované varianty obsahují aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň 65 % shodu s aminokyselinovou sekvencí referenční sekvence (například SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10) po celé její délce. Výhodnější je alespoň 70 % identita a více se preferuje alespoň 80 % identita a stále více se preferuje alespoň 90 % shoda. Dále se vysoce preferují sekvence s alespoň 95 % až 99 % shodou. Například na obrázku č. 9, jestliže LbpB z BNCV je referenční sekvence, varianta bude zdůrazňovat zbytky 300 až 308, které se nahradily libovolnými zbytky v ekvivalentních polohách v sekvencích LbpB kmene H44/76 (zbytky 305 až 313), kmene M990 (zbytky 307 až 315), kmene M981 (zbytky 302 až 310) nebo kmen 881607 (zbytky 303 až 311). Aminokyselinová sekvence NPDLAKSHA by se mohla proto substituovat sekvencí STDVATNLA (ST (z M981 zbytky 302 až 303), D (z BNVC zbytek 302), V (z 881607 zbytek 306), A (z M990 zbytek 311), T (z H44/76 zbytek 310), NLA (z M990 zbytek 313 až 315) a výsledný protein se může zařadit mezi varianty a polypeptidy podle vynálezu.

Takové substituce, mohou také zahrnovat delece například zbytky 357 až 366 LbpB kmene M981, jsou deletovány (neexistují zde žádné akvivalentní aminokyselinové polohy v LbpB z kmene BNCV, nachází se na obrázku č. 9) . Takový protein může vytvořit variantu a polypeptid podle vynálezu.

Navíce je dobře známo, že genomy mikroorganizmu Neisseria meníngitidis a jiné kmeny Neisserie (například Neisseria gonorrhoeae) jsou genomem velmi homologní s každým jiným kmenem. Genomy Neisseria meníngitidis a Moraxella catarrhalís (dříve nazývaná Neisseria catarrhalís) jsou také dostatečně homologní, aby se uskutečnila výměna genů. Proteiny ekvivalentní s LbpB (nebo alelové varianty LbpB) kmenů Neisseria a kmenů Moraxella catarrhalís také tvoří • 0 • · · • ···· ·♦ ·· * · · 1 polypeptidy podle vynálezu, jestliže uspokojují kritéria % sekvenční shody, která se popisují shora v textu. A dále takové ekvivalentní proteiny budou také tvořit polypeptidy podle vynálezu, jestliže sdílí přednostně 65 % sekvenční podobnosti s jednou z referenčních sekvencí (SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10) po celé jejich délce, jak se měřilo programem

BLAST (popisuje se v publikaci Altschul, S. F. et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, Karlin, S. and Altschul, S. F. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, Karlin,

S. and Altschgul, S. F. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-7) a více se upřednostňuje alespoň 70 % podobnost, stále více se upřednostňuje alespoň 80 % podobnost a dokonce výhodnější je alespoň 90 % podobnost. Velmi se preferuje alespoň 95 až 99 % podobnost. Takové proteiny by mohly vázat lidský laktoferin (podle definice) a jsou také schopny s polyklonálním kmenů. Za polynukleotidových sérem proti LbpB použití informace a polypeptidových zkříženě reagovat z meningokokálních z meningokokálních sekvencí SEQ ID NO:

až 10 je možné snadno stanovit přesnou aminokyselinovou sekvenci takových variant.

Polypeptidy LbpB podle libovolným vhodným způsobem, izolované přirozeně se vynálezu se mohou připravit Takové polypeptidy zahrnují vyskytující lipopolypeptidy, rekombinantně produkované polypeptidy nebo lipopolypeptidy, synteticky produkované polypeptidy nebo polypeptidy produkované kombinací uvedených metod. Způsoby přípravy takových polypeptidů jsou dobře známy v oboru.

Polynukleotidy podle vynálezu

Vynález dále popisuje LbpB polynukleotidy. Polynukleotidy

LbpB zahrnují izolované polynukleotidy, které kódují polypeptidy LbpB a fragmenty a jejich blízce příbuzné polynukleotidy. Polynukleotid LbpB podle vynálezu zahrnuje polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci obsaženou

ΦΦ φφ • φ φ φ • ··

9 9

ΦΦΦ 9999 99

9

9 9 • · 9 9 • Φ 9999 9

9 9

9

99

Φ Φ Φ Φ

Φ Φ Φ Φ

Φ Φ Φ Φ

Φ Φ Φ Φ

Φ· ΦΦ v sekvencích SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 nebo 9 kódující polypeptid

LbpB se sekvencí SEQ ID NO: 2,

6, 8 nebo 10 polynukleotid vykazující určitou sekvenci SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 nebo 9. Polynukleotidy LbpB dále zahrnují polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň 65 % shodu po celé délce s nukleotidovou sekvencí kódující polypeptid LbpB se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10 a polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která je alespoň ze 65 % identická se sekvencí SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 100 do nukleotidu 2 274 a polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která vykazuje alespoň 65 % shodu se sekvencí SEQ ID NO: 3, 5,7 nebo 9. Pokud jde o to, více se preferují polynukleotidy vykazující alespoň 70 % shodu

Zvláště se preferují polynukleotidy vykazující alespoň 80 % shodu. Nejvíce výhodné jsou polynukleotidy vykazující alespoň 90 % shodu. Dále, zvláště preferované jsou polynukleotidy vykazující alespoň 95 % shodu a nejvíce polynukleotidy vykazující alespoň 98 až 99 % se preferují shodu. Nejvíce se preferují polynukleotidy, které vykazují alespoň 99 % shodu. Mezi nukleotidy LbpB se zahrnuje nukleotidová sekvence, která vykazuje dostatečnou shodu s nukleotidovou sekvencí získanou v SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 nebo 9. Tato sekvence hybridizuje za podmínek vhodných pro amplifikaci a může se použít jako sonda nebo jako markér. Vynález také popisuje polynukleotid, který je komplementární s takovými polynukleotidy LbpB. Polynukleotidy LbpB uvedené v SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 a 9 jsou polynukleotidy LbpB pocházející z mikroorganizmu Neisseria meningitidis kmeny BNCV, M981,

H44/76, M990 a 881607.

Nukleotidová sekvence kódující polypeptid LBPB se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 6 nebo 10 může být shodná s polypeptidem kódujícím sekvenci obsaženou v nukleotidech 100 až 2 274 sekvence SEQ ID NO: 1 nebo polypeptid kódující sekvenci získanou v sekvenci SEQ ID NO: 3, 5, 7 nebo 9 nebo ·· ·· ·· · • · * · · · · • ·· · · 9 · • · · · « · ···· • · · · · · ··»· ·« ··> 9 • 9 9 9

9 9 9

9 9 9 9 • · · »

99 to může být sekvence, která je výsledkem nadbytku (degenerace) genetického kódu, také kóduje polypeptid se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10.

Když se polypeptidy podle vynálezu používají při rekombinantní produkci polypeptidu LbpB, polypeptid může zahrnovat kódující sekvenci zralého polypeptidu (zbytek 19 až C-konec sekvence SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 a 10) nebo samotný její fragment; kódující sekvenci zralého polypeptidu nebo fragment ve čtecím rámci s jinými kódujícími sekvencemi, jako jsou kódující vedoucí nebo sekreční sekvence, pre-nebo pro- nebo prepro- proteinová sekvence nebo jiné části fúzního peptidu (například zbytky 1 až 18 SEQ ID NO: 2, přirozená signální sekvence LbpB). Například může být kódována markerová sekvence, která umožňuje čištění fúzovaného polypeptidu. V jistých preferovaných provedeních vynálezu markerovou sekvencí je hexa-histídínový peptid, jak ho poskytuje vektor pQE (Qiagen, lne.) (popisuje se například v publikaci Gentz et al., proč. Nati. Acad. Sci USA (1989) 86: 821-824), nebo je to HA tag nebo gluthion-transf eráza.

Také se preferuje LbpB fúzovaný se svou signální sekvencí (zbytky 1 až 18 sekvence SEQ ID NO: 2). Polynukleotid může také obsahovat nekódující 5'a 3'sekvence, takové, které se přepisují, nepřekládané sekvence, signály sestřihu a polyadenylační signály, místa pro navázání ribozómu a sekvence stabilizující mRNA.

Dále preferovaným provedením vynálezu jsou polynukleotidy kódující varianty polypeptidu LbpB popsané dříve v textu. Nejvíce se preferuje, aby varianty polypeptidů obsahovaly aminokyselinovou sekvenci LbpB polypeptidu SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10, kde několik 10 až 25, 5 až 10, .1 až 5, 1 až 3, až 2 nebo 1 aminokyselinový zbytek se substituoval, deletoval nebo adoval libovolnou kombinací a polypeptidy si uchovaly alespoň jednu z biologických aktivit polypeptidu LbpB.

• 0 0000 00

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0

Vynález se dále týká polynukleotidů, které hybridizují se shora popisovanými sekvencemi. Vynález se zvláště týká polynukleotidů, které hybridizují za přísných podmínek se shora popsanými polynukleotidy. Termín „přísné podmínky znamená, že hybridizace proběhne pouze v případě, že existuje alespoň 80 %, upřednostňuje se alespoň 90 % a více se upřednostňuje alespoň 95 %, dokonce více se upřednostňuje 97 až 99 % shoda mezi sekvencemi.

Polynukleotidy podle vynálezu, které jsou identické nebo podstatně identické s nukleotidovou sekvencí obsaženou v SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 nebo 9 nebo s jejím fragmentem, se mohou použít jako hybridizační sondy v případě cDNA a genomová DNA za účelem izolace cDNA celé délky a genomové klony kódující polypeptid LbpB a k izolaci cDNA a genomových klonů jiných genů (zahrnující geny kódující homology a ortology z druhů jiných než je mikroorganizmus Neisseria meningitidis) , které mají vysokou sekvenční podobnost s genem LbpB. Takové hybridizační techniky jsou známy v oboru. V typickém případě tyto nukleotidové sekvence jsou z 80 % identické, upřednostňuje se z 90 % identické, více se upřednostňuje z 95 % identické s referenční sekvencí. Sondy budou v obecném případě obsahovat alespoň 15 nukleotidů. Zvláště preferované sondy budou v rozmezí mezi 30 až 50 nukleotidy.

Jedno provedení vynálezu, aby se získal polynukleotid kódující polypeptid LbpB zahrnující homology a ortology z druhů jiných než Neisseria meningitidis, obsahuje kroky testování vhodné knihovny za přísných hybridizačních podmínek se značenou sondou, která má nukleotidovou sekvenci obsaženou v sekvencí SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 nebo 9 nebo její fragment, a izolaci cDNA v plné délce obsahující uvedenou polynukleotidovou sekvenci. Polynukleotidy LbpB podle vynálezu dále zahrnují nukleotidovou sekvenci obsahující nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje za přísných podmínek s nukleotidovou sekvencí, která má nukleotidovou

9· ·· • · · · • ·· • · · * • · · ···· »«

9

11

111

11111

111

1

99 • 11 1

19 9 • 1 11 1

19 1

11 sekvenci obsaženou v SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 nebo 9 nebo s jejím fragmentem. Vedle polypeptídů LbpB jsou zahrnuty polypeptidy obsahující aminokyselinové sekvence kódované nukleotidovými sekvencemi získanými za shora uvedených hybridizačních podmínek. Takové hybridizační metody jsou dobře známy v oboru. Přísné hybridizační podmínky, jak se definuje shora v textu, jsou inkubace přes noc při teplotě 42 °C v roztoku, který obsahuje: 50 % formamid, 5xSSC (150 mM

NaCl, 15 mM trisodium citrát), 50 mM fosforečnan sodný (pH 7,6), 5x Denhardtův roztok, 10 % síran dextranu a 20 pg/ml denaturované DNA mlíčí lososa. Pak následuje promytí filtrů roztokem 0,lxSSC při teplotě přibližně 65 °C.

Polynukleotidy a polypeptidy podle vynálezu se mohou použít jako materiály a činidla určená pro výzkum při zkoumání léčby a diagnostických metod nemocí u zvířat a u lidí.

Vektory, hostitelské buňky, exprese

Vynález dále popisuje vektory, které obsahují polynukleotid nebo polynukleotidy podle vynálezu a hostitelské buňky, které jsou geneticky upraveny vektory podle vynálezu, a produkci polypeptídů podle vynálezu pomocí rekombinantních postupů. Pří produkcí takových proteinů za použití RNA získaných z konstrukcí DNA podle vynálezu se mohou použít bez buněčné translační systémy.

V případě rekombinantní produkce se mohou hostitelské buňky geneticky upravit tak, že se začlení expresívní systémy nebo jejich části vhodné pro polynukleotidy podle vynálezu. Zavedení polynukleotidů do hostitelských buněk se může provést způsoby popsanými v řadě standardních laboratorních manuálů, jako je Davis et al., Basic methods in molecular biology (1986) a Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ν. Y (1989). Jsou to transfekce

0000 00 ·» ·· ·» » ·« ·>

» · 0 0 0 « 0 · · · « • · · · · · · · 0 0 « • · · · « · <··· 00 00 a ^Α 0·0 0 t e a ·· · 00 00 fosforečnanem vápenatým, transfekce zprostředkovaná DEAEdextranem, transfekce, mikroinjekce, transfekce zprostředkovaná kationtovými lipidy, transdukce, nanesení škrábnutím, balistické infekce.

Příklady vhodných hostitelů zahrnují bakteriální buňky, jako jsou menigokoci, streptokoci, stafylokoci, E. coli, Streptomyces a Bacillus subtilis. Dále zahrnují buňky hub, jako jsou buňky kvasinek a buňky Aspergillus, hmyzí buňky, jako je Drosophila S2 a Spodoptera Sf9 a buňky zvířat, jako jsou CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 a buňky Bowesova melanomu a rostlinné buňky.

Může se použít řada expresívních systémů. Takové systémy zahrnují mezi jinými chromozomální, epizomální systémy a systémy odvozené z virů, například vektory získané z bakteriálních plazmidů, bakteriofágů, z transpozonů, z kvasinkových epizomů, z inzerčních elementů, z kvasinkových chromozomálních elementů, z virů, jako jsou bakuloviry, papovaviry, jako je SV40, viry vakcinie, adenoviry, virus planých neštovic, virus pseudo-vztekliny a vektory získané jejich kombinací, jako jsou ty získané z plazmidových a bakteriofágových gentických elementů, jako jsou kosmidy a fágemidy. Expresívní systémy mohou obsahovat řídící oblasti, které regulují stejně jako vyvolávají expresi. V obecném případě se může použít libovolný systém nebo vektor vhodný pro udržení, propagaci nebo expresi polynukleotidů, přičemž dojde k produkci polypeptidu v hostiteli. Vhodná nukleotidové sekvence se může začlenit do expresívního sytému libovolnou variantou dobře známých a rutinních metod, které se například popisují v publikaci Sambrook et al., Molecular cloning, A laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y (1989).

V případě vylučování překládaného proteinu do lumenu endoplazmatického retikula, periplazmatického prostoru nebo elektroporace, zavedení nebo «· ·· ·« · «· ·, * · 4 44 4 4 4 * a

44 444« 4444 » » 444 4 4444 · 4 4 4 4

4444 44

4 44 je nutné začlenit do sekreční signály. Tyto do extracelulárního prostředí, požadovaného polypeptidu vhodné signály mohou být endogenní vůči polypeptidu (zbytky 1 až 18 sekvence SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10) nebo to mohou být heterogenní signály.

Za účelem exprese lipidovaného rekombinantního LbpB se přednostně endogenní signál peptidu kóduje genovou konstrukcí a preferovaný hostitelský systém je bakteriální hostitel.

Jestliže polypeptid LbpB se bude exprimovat pro použití v testech, v obecném případě se preferuje, že se polypeptid bude produkovat na povrchu buňky. V tomto případě se buňky mohou sklízet dříve než se použijí v testu. Jestliže se polypeptid LbpB vylučuje do kultivačního média, médium je možné získat za účelem izolovat a čistit polypeptid. Jestliže se polypeptid produkuje uvnitř buňky, buňky se musí nejdříve lyžovat a pak se získá polypeptid.

Polypeptidy LbpB se mohou získat a čistit z rekombinantních buněčných kultur metodami dobře známými v oboru, které zahrnují srážení síranem amonným nebo etanolem, kyselou extrakci, chromatografii s výměnou aniontů nebo kationtů, chromatografie na fosfocelulóze, chromatografie na základě hydrofóbních interakcí, afinitní chromatografie, hydroxylapatitová chromatografie a lektinová chromatografie. Při čištění se nejvíce preferuje vysoce výkonná kapalinová chromatografie. Velmi dobře známé techniky znovu svinutí proteinů se mohou použít k regeneraci aktivní konformace, kdy polypeptid se denaturuje během izolace a nebo čištění.

Diagnostické testy

Vynález dále popisuje použití LbpB, protilátek proti LbpB a fágem vykazovaných protilátek proti LbpB, které se mohou použít jako diagnostická činidla. Detekce LbpB bude ·· ·· 44 · • · · · 4 4 Φ • ·· 4 4 4 4

444 4 4444

4 4 4 4«

4444 44 44 4

4 4

4 4

4 4 • 4 4

4 4 *4 poskytovat diagnostický nástroj, který se může mezí jinými použít při diagnostikování onemocnění způsobené neisseriemi.

Materiály pro diagnostiku je možné získat z buněk subjektů, jako je krev, moč, sliny, biopsie tkáně.

Vynález se týká diagnostických sad pro stanovení onemocnění a náchylnosti na onemocnění, zvláště onemocnění způsobené nesseriemi, které obsahují:

(a) polynukleotid LbpB, upřednostňuje se nukleotidové sekvence SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7 nebo 9 nebo její fragment, (b) nukleotidové sekvence komplementární s uvedenou sekvencí popsanou v odstavci (a), (c) polypeptid LbpB, upřednostňuje se polypeptid SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10 nebo její fragment nebo (d) protilátky proti poiypeptidu LbpB, přednostně proti poiypeptidu se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10 (a více se· upřednostňují proti zbytku 19 až k C-konci poiypeptidu se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10), (e) fágem vykazované protilátky proti poiypeptidu LbpB, přednostně proti poiypeptidu se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nbeo 10 (a více se upřednostňují proti zbytku 19 až k C-konci poiypeptidu se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10),

Protilátky

Polypeptidy podle vynálezu nebo jejich fragmenty nebo jejich analogy nebo buňky je exprimující se mohou také použít jako imonogeny při produkci protilátek, které jsou imunospecifické vůči polypeptidům LbpB. Termín „imunospecifické znamená , že protilátky vykazují podstatně větší afinitu vůči polypeptidům podle vynálezu ve srovnání s jejich afinitou vůči jiným dříve popsaným příbuzným polypeptidům.

·· · · • · 0 0 0 0 • 0

Protilátky vytvořené proti polypeptidům LbpB se mohou získat aplikací polypeptidů nebo fragmentů nesoucích epitop, analogů nebo buněk zvířatům, nikoli člověku, za použití rutinního protokolu. Za účelem přípravy monoklonálních protilátek se může použít libovolné metoda, která poskytuje protilátky produkované v kontinuálních kulturách buněčných linií. Příklady zahrnují metodu hybridomů (popisuje se v publikaci Kohler, G. And Milstein, C. , Nátuře (1975) 256: 495-497), tríomovou techniku, techniku hybridomů lidských Bbuněk (popisuje se v publikaci Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4: 72) a techniku EBV-hybridomů (popisuje se v publikaci Cole et al., Monoclonal antibodies and cancer therapy, pp. 77-96, Alan R. Lisss, lne. 1985).

Techniky vhodné pro produkci jednořetězcových protilátek (popisuje se v dokumentu US patent č. 4,946,778) se mohou také přizpůsobit pro produkci jednořetězcových protilátek vůči polypeptidům podle vynálezu. Za účelem exprese humanizovaných protilátek se mohou také použít transgenní myší a jiné organizmy zahrnující jiné savce.

Shora popsané protilátky se mohou použít při izolaci nebo identifikaci klonů, které exprimují polypeptid, nebo při čištění polypeptidů afinitní chromatografií.

Protilátky proti polypeptidům LbpB se mohou také použít mezi jinými při léčbě onemocnění způsobeným neisseriemi (například meningitida). Také se mohou použít při diagnostice onemocnění.

Vakcíny

Dále se vynález vztahuje k metodě indukce imunologické odezvy u savců (upřednostňuje se člověk). Tato metoda zahrnuje inokulaci savce s polypeptidem LbpB nebo s fragmenty nesoucími epitop, analogy, vesikly vnějších membrán (atenuované nebo jiné), adekvátní pro produkci protilátek a/nebo imunitní odezvy T-buněk, aby se ochránila uvedená

9

9 zvířata před onemocněním, které způsobují neisserie. Dále vynález popisuje způsob vyvolání imunologické odezvy u savce (upřednostňuje se člověk), který zahrnuje zavedení polypeptidů LbpB prostřednictvím vektoru, který řídí expresi polynukleotidu LbpB in vivo za účelem indukovat takovou imunologickou odezvu, aby se produkovaly protilátky vhodné pro ochranu zvířete před onemocněním.

Dále vynález popisuje imunologickou kompozici nebo vakcinační přípravek, který, když se zavede do savčího hostitele (upřednostňuje se člověk), indukuje imunologickou odezvu uvedeného savce vůči polypeptidů LbpB. Taková kompozice obsahuje gen LbpB nebo polypeptid LbpB nebo fragmenty nesoucí epitop, analogy, vesíkuly vnějších membrán nebo buňky (atenuované nebo jiné). Vakcinační formulace může dále obsahovat vhodný nosič. Vakcinační kompozice LbpB se s výhodou aplikuje orálně nebo parenterálně (podkožně, intramuskulárně, intravenózně, intradermálně například injekcí). Formulace vhodné pro parenterální aplikaci zahrnují vodné a nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat anti-oxidanty, pufry, bakteriostaty a rozpouštědla, která činí formulaci izotonickou s krví recipienta. Dále mohou zahrnovat vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou zahrnovat suspendační činidla a zahušťovací činidla. Formulace se mohou vyskytovat v kontejnerech pro jednotkovou nebo vícenásobnou dávku. Jsou to například zatavené ampule a zkumavky a mohou se také skladovat jako lyofilyzáty, což vyžaduje pouze těsně před použitím přidat sterilní kapalný nosič. Vakcinační formulace může také zahrnovat systémy adjuvans vhodné pro zvýšení imunogenosti formulace, jako je například olej ve vodním systému a jiné systémy, které jsou dobře známy v oboru. Dávka bude záviset na specifické aktivitě vakcíny a může se snadno stanovit v rutinních experimentech.

·* ·· • · ··

Vynález dále popisuje imunologickou/vakcinační formulaci, která obsahuje polynukleotid podle vynález. Takové techniky jsou dobře známy v oboru a popisují se například v publikaci Wolff et al., Science, (1990) 247: 1465-8.

Třídící testy

Polypeptid LbpB podle vynálezu se může použít v testovacím procesu sloučenin, které antagonizují (anatagonisti nebo jinak se nazývající inhibitory) polypeptid LbpB podle vynálezu. Tak polypeptidy podle vynálezu se mohou také použít při identifikaci antagonistů pocházejících například z buněk, bezbuněčných přípravků, chemických směsí přirozených produktů. Takovými antagonisty přirozené nebo upravené substráty, ligandy, knihoven a mohou být receptory, enzymy atd.

V tomto případě to může být polypeptid podle vynálezu nebo strukturální nebo funkční napodobenina polypeptidu podle vynálezu (popisuje se v publikaci Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2): Chapter 5 (1991).

Polypeptidy LbpB mají řadu biologických funkcí, které zahrnují řadu patologických funkcí. V zhledem k tomu je nutné získat sloučeniny a léky které inhibují funkci polypeptidu LbpB. V obecném případě antagonisty se mohou použít pro různé terapeutické a profylaktické účely v takových případech, jako je onemocnění způsobené neísseriemí.

V obecném případě třídící testy mohou zahrnovat použití vhodných buněk, které exprimují polypeptid LbpB nebo vykazují odezvu na polypeptid LbpB podle vynálezu. Takové buňky zahrnují buňky savců, kvasinek, Drosophila nebo mikroorganizmu E. coli. Buňky, které exprimují polypeptid LbpB (nebo Buňka obsahující exprimovaný polypeptid) nebo vykazuje odezvu ne polypeptid LbpB pak přijde do kontaktu s testovanou sloučeninou, aby se pozorovalo navázání nebo inhibice funkční odezvy. Schopnost buněk, které byly • · • · ► « > « » ·

9 9 9999 9 9 v kontaktu se sloučeninou, se porovnává se stejnými buňkami, které nebyly v kontaktu. Hodnotí se jejich aktivita LbpB.

Testy mohou jednoduše analyzovat navázání sloučeniny, která je kandidátem. Při tomto testu se hodnotí adherence na buňky, které nesou polypeptid LbpB, způsobem přímého nebo nepřímého značení sloučeniny nebo jiný test zahrnuje kompetici se značeným kompetitorem.

Dále testy mohou zahrnovat kroky smíšení sloučeniny s roztokem obsahujícícm polypeptid LbpB za vzniku směsi, měření LbpB aktivity ve směsi a porovnání aktivity LbpB směsi se standardem.

Za účelem vytvoření testu pro detekci účinku přidaných látek na produkci mRNA a proteinu LbpB v buňkách se může také použít cDNA LbpB, protein a protilátky proti proteinu. Například se může navrhnou test ELISA pro měření vylučovaného množství proteinu LbpB nebo množství proteinu LbpB spojeného s buňkami za použití monoklonálních a polyklonálních protilátek ve standardních metodách, které jsou dobře známy v oboru. Tuto metodu je možné použít pro objevení činidel, které mohou inhibovat produkci LbpB (tak zvaných antagonistů) z vhodně upravených buněk nebo tkání.

Příklady potencionálních antagonistů polypeptidů LbpB zahrnují protilátky nebo v některých případech oligonukleotidy nebo proteiny, které jsou úzce příbuzné s ligandy nebo se substráty polypeptidů LbpB. Je to například fragment ligandů nebo substrátů. Nebo to mohou být malé molekuly, které se váží na polypeptid podle vynálezu, ale nevyvolávají odezvu, čímž se předchází aktivitě polypeptidů.

Dále se vynález týká testovacích sad určených pro účely identifikace antagonistů, ligandů nebo substrátů pro LbpB, které obsahují:

(a) polypeptid LbpB, upřednostňuje se nukleotidové sekvence

SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10, • · · · • · · ·

		2 q ··· ···· ···· ······ ···· ······ ·· · · · · ·
(b)	rekombinantní buňka	exprimuj ící	polypeptid LbpB,
	upřednostňuje se ten	se sekvencí SEQ	ID NO: 2, 4, 6, 8
	nebo 10,
(c)	buněčná membrána	exprimuj ící	polypeptid LbpB,
	upřednostňuje se ten	se sekvencí SEQ	ID NO: 2, 4, 6, 8
	nebo 10,
(d)	protilátky proti polypeptidu LbpB,	přednostně proti

polypeptidu se sekvencí SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10.

Formulace a aplikace

Peptidy, jako je rozpustná forma polypeptidů LbpB a antagonistické peptidy nebo malé molekuly se mohou tvořit v kombinaci s vhodným farmaceutickým nosičem. Takové formulaci obsahují terapeuticky účinné množství polypeptidu nebo sloučeniny a farmaceuticky účinný nosič nebo ekcipient. Takové nosiče zahrnují, ale nejsou omezeny na fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický rozotok, dextrózu, vodu, glycerol, etanol a jejich kombinace. Formulace musí vyhovovat módu aplikace. Dále vynález popisuje farmaceutické balíčky a kity obsahující jednu nebo více kontejnerů naplněných jednou nebo více ingrediencí shora v textu uvedených kompozic podle vynálezu.

Polypeptidy a jiné sloučeniny podle vynálezu se mohou použít samotné nebo ve spojení s jinými sloučeninami, jako jsou terapeutické látky.

Preferované formy systémové aplikace farmaceutických kompozic zahrnují injekci. V typickém případě to je intravenózní injekce. Dále se může také použít jiné druhy injekcí. Jsou to podkožní, do svalu nebo intraperitoneální. Alternativní způsoby systémové aplikace zahrnují aplikaci sliznicí a kůží za použití penetrantů, jak jsou žlučové sole nebo kyselina fusidová nebo jiné detergenty. Navíc se může použít také orální aplikace v případě, že jsou dobře připravené střevní formulace a formulace v kapsulích.

• ·

3U *

» 4 » 4 «

Aplikace uvedených sloučenin může také být povrchová a/nebo lokální ve formě masti, pasty, gelu a podobně.

Rozmezí požadované dávky závisí na volbě peptidu, způsobu aplikace, podstatě formulace, podstatě stavu subjektu odhadu lékaře. Vhodné dávky jsou však v rozmezí 0,1 až 100 μρ/kg subjektu. Širší rozmezí dávek lze však očekávat v závislosti na volbě sloučeniny, které vykazují různou účinnost při různých způsobech aplikace. Například u orální aplikace jsou nutné vyšší dávky než při aplikaci intravenózní injekcí. Variace dávek je možné stanovit za použití standardních empirických způsobů optimalizace, které jsou dobře známy v oboru.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je zobrazena analýza westernovým přenosem proteinů z celých buněk, které rostou při limitaci železem.

V dráze 1 a 5 je kmen BNVC, v dráze 2 a 6 je IbpA mutant CE1452, v dráze 3 a 7 je IbpB mutant CE1454, v dráze 4 a 8 je IbpAB mutant CE1402. Užívané antisérum se řídilo proti syntetickým peptidům, které se zakládají na sekvenci LbpB.

V dráze 1 až 4 je sérum 17-3 vytvořené proti peptidu Cl.

V dráze 5 až 8 je sérum 19-1 vytvořené proti peptidu El. Polohy standardů molekulových hmotností jsou uvedeny v právo v tisících. Protein LbpB je označen šipkou na levé straně.

Na obrázku č. 2 je zobrazena restrikční mapa fragmentů DNA, které obsahují geny IbpB a IbpA kmenu BNCV. Inzerty v různých rekombinantních plazmidech a produktech PCR jsou uvedeny v prázdných rámečkách. Plazmidy pAM23 a pAMl obsahují fragmenty lokusu IbpBA, ktré se charakterizovaly už dříve (Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J., (1993) Molecular characterization of the 98kilodalton iron-regulated outer membrane protein of Neisseria meningitidis. Infect Immun 61: 4724-4733; Pettersson, A., • · • >

• · » 1 φ ·

Klarenbeek,	v.,	van Deurzen, J.,	Poolman, J.	T.,	and
Tommassen,	J.,	(1994a) Molecular	chracterisation	of	the
structural	gene	for the lactoferrin receptor	of	the

aby se dosáhlo optimálního pro imunizaci myší jsou meningococcal strain H44/76. Microbial Pathogen 17: 395-408).

Otevřené čtecí rámce jsou označeny plnými šipkami. Sondy používané při testování knihovny nebo pro Souternův přenos jsou zobrazeny nad otevřenými čtecími rámci. Polohy primerů užívaných při PCR amplifikacích jsou zobrazeny pod otevřenými čtecími rámci. Místo začlenění boxu nesoucího rezistenci na kanamycin v ρΑΜβΚ je zobrazeno prázdnými trojúhelníky. Box nesoucí rezistenci na erytromycin v pAM23E je zobrazen plnými trojúhelníky.

Na obrázku č. 3 je uspořádání proteinů LbpB kmenu BNCV a TbpB kmene B16B6. Indikované aminokyseliny jsou označené čárkovaně. Čísla na pravé straně indikují polohy aminokyselin. Zavedly se Gap(-) uspořádání. Peptidy používané označeny nad sekvencí LbpB. Dva pásy, které obsahují velké množství negativně nabitých zbytků, jsou podtrženy. Putativní místo štěpení rozeznávané signální peptidázou II je označeno šipkou nad sekvencí.

Na obrázku č. 4 je zobrazena sekvence oblasti promotoru s proti směru exprese genu IbpB. Místo iniciace translace (ATG) je označeno tučným písmem. Vazebné místo ribozomu a putativní boxy -10 a -35 jsou podtrženy (tlustá čára respektive tenká čára). Ohraničen je putativní box Fur.

Na obrázku č. 5 je zobrazena analýza westernová přenosu proteinů z celých buněk, které se kultivovaly v kultivačním médiu TSB (dráha 1, 3, 5 a 7) nebo TSB s EDDA (dráha 2, 4, 6 a 8). Používané protilátky byly monoklonální protilátky mn98kl a mn98k2 řízené proti LbpA (panel A) nebo antisérum 17.3 proti LbpB peptidu Cl (panel Β) . V dráze 1 a 2 je kmen BNCV, v dráze 3 a 4 je lbpA mutant CE1452, v dráze 5 a 6 je IbpB mutant CE1454, v dráze 7 a 8 je IbpAB mutant CE1402.

• ·

0···

Na obrázku 6A je zobrazena analýza westerovým přenosem proteinů z vnějších membrán meningokokálního kmene BNCV, který roste při limitaci železem. Proteiny vnější membrány se zkoumaly na elektroforéze za nedenaturačních podmínek a protein LbpB se detekoval sérem řízeným proti syntetickému peptidu Al. Dráha 1 a 2 obsahuje vzorky, které se před elektroforézou inkubovaly při teplotě 0 °C respektive 95 °C. Polohy standardů molekulových hmotností jsou označeny na pravé straně a jsou vyjádřeny v tisících. Na obrázku č. 6B je znázorněn test navázání laktoferinu provedený na westerově blotu s proteiny z vnějších membránových komplexů meningokokálního kmene BNCV, který se kultivoval za limitace železem. Proteiny z komplexů vnějších membrán se analyzovaly na elektroforéze za nedenaturačních podmínek a blot se inkuboval s lidským laktoferinem, který je spojen s peroxidázou. Dráhy 1 až 3 obsahují vzorky, které se před elektroforézou inkubovaly při teplotě 0 °C, 37 °C respektive 95 °C. Polohy standardů molekulových hmotností jsou označeny na pravé straně a udávají se v tisících.

Na obrázku č. 7 je znázorněno navázání laktoferinu na lbp mutanty při testu ELISA s celou buňkou. Prohlubně se potáhly kmeny označenými na pravé straně. Laktoferin se přidal v koncentracích 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 a 0 ng/ml (řada 1 až 8). Laktoferin navázaný na buňky se detekoval antisérem specifickým pro laktoferin konjugovaným s peroxidázou.

Na obrázku č. 8 jsou znázorněny deskové testy kmenů s rekombinantním lidským laktoferinem. Je zobrazena pouze relevantní část desky. Stimulace růstu kapkami laktoferinu při označených koncentracích se monitorovala po kultivaci přes noc. Šipky označují polohu prohlubní, kam se přidal laktoferin na panelu Β. V tomto experimentu se použil laktoferin saturovaný 11 % železem.

• ·· « ♦ · · · • ·· · ► · · · · • · · »· ·· ·

Na obrázku č. 9 je zobrazeno uspořádání proteinů LbpB z pěti meningokokálních kmenů. Uspořádání se provedlo programem CLUSTAL (PC Gene, IntellGenetics) a ručně e optimalizoval. Čísla na pravé straně označují polohy aminokyselin. Za účelem optimalizovat uspořádání začlenily se Gap(-). Polohy, kde všech pět sekvencí je identických, je označeno hvězdičkou.

Na obrázku č. 10.A jsou zobrazeny restrikční mapy relevantních částí pJP29 (Bosch, D., Leunissen, J., Verbakel, J. , de Jong, M., van Erp, H., and Tommassen, J. (1986) Periplasmic accumulation of truncated forms of outer membrane PhoE protein of Escherichia coli K-12. J. Mol. Biol. 189: 449-455), pAM31 a pAM32. Je zobrazen pouze inzert. Vektorem je pACYC184. pJP29 obsahuje za svým vlastním promotorem gen phoE (šedivá barva). Promotor a sousedící sekvence jsou znázorněny bíle. Restrikční místo Pstl je na hranici sekvencí odpovídající signální sekvenci a zralé části proteinu PhoE. PAM31 obsahuje z leva doprava: promotor phoE (bílá barva) a rekombinantní gen kódující signální sekvenci PhoE (světle šedá) a zralý LbpB (černý) . Přítomny jsou také fragmenty DNA odpovídající N konci LbpA (tmavě šedá), C konci PhoE (světle šedá) a lemujícím sekvencím (bílá). pAM32 se zkonstruoval z pAM31 začleněním linkeru (pruhovaný rámeček) kódující místa štěpení His-tag a factorem Xa do restrikčního místa Pstl pAM31. Detaily konstrukce pAM31 a pAM32 se popisují v příkladu 8. Restrikční místa v pAM32 jsou vzávorkách, protože zmizely během postupu klonování.

B. Aminokyselinové sekvence rekombinantní konstrukce LbpB (dole) se porovnávají se sekvencí LbpB divokého typu (nahoře). Jsou zobrazeny pouze poslední aminokyselinový zbytek signálních sekvencí respektive LbpB. Zcela jsou zobrazeny místa štěpení His-tag a faktoru Xa. Šipkou jsou označena místa štěpení vedoucí peptidázy I a II (LPázal respektive II) a faktoru Xa.

a první LbpB/PhoE • · • · ·· • · · · ♦ ·♦ • · ·

··

Na obrázku č. 11 je zobrazen test PAGE čištěného rekombinantního proteinu LbpB. Linie 1 a 2 ukazují vzorky, které se inkubovaly při teplotě 0°C respektive 100 °C. Polohy standardů molekulových hmotností jsou označeny na pravé straně a jejich hodnota se udává v kDa.

Na obrázku č. 12 je westernův blot provedený se svinutým (dráhy 1, 3, 5, 7 a 9) a denaturovaným (linie 2, 4, 6, 8 a 10) rekombinantním LbpB s pěti lidskými séry rekonvalescentů. V dráze 1 a 2 se aplikovalo sérum 69, dráze 3 a 4 je sérum 262532, v dráze 7 a 8 je sérum 263017 a v dráze 9 a 10 je sérum 330. Polohy standardů molekulové hmotnosti denaturovaného (dLbpB) a svinutého LbpB (fLbpB).

Na obrázku č. 13 jsou uvedeny výsledky testů ELISA provedené s celými buňkami a LbpB (Tabulka č. 7), jak se popisuje v příkladu 10. Na obrázku č. 10A je znázorněna odezva u myší imunizovaných buď LbpB nebo celými buňkami mikroorganizmu N. meningitidis kmen BNVC. Kontrolní imunizace se provedla roztokem PBS. Na obrázku č. 10B je znázorněna odezva proti celým buňkám (kmen BNCV, které se kultivují za na železo deficitních podmínek) u myší imunizovaných buď LbpB nebo celými buňkami mikroorganizmu N. meningitidis kmen BNVC. Kontrolní imunizace se provedla roztokem PBS. Na obrázku č. 10C je znázorněna odezva proti celým buňkám (kmen H44/76 kultivovaných za podmínek deficitních na železo) u myší imunizovaných buď LbpB nebo celými buňkami mikroorganizmu N. meningitidis kmen BNVC. Kontrolní imunizace se provedla roztokem PBS.

Na obrázku č. 14 jsou znázorněny výsledky baktericidních aktivit (tabulka č. 8) séra vytvořeného proti celým buňkám a proti kmenu BNCV LbpB, což se provedlo způsobem, který se popisuje v příkladu 10. A. Baktericidní titr proti mikroorganizmu N. meningitidis kmen H44/76 (pěstovaných při podmínkách s dostatkem železa) . B. Baktericidní titr proti »4 44 >» ·· ·· « • 4 4 · * · -r - . .

* ·**a aZ · · * * ♦ · · • · · · 4 44«4 4 4 · · ₉ • · 4 4 4 4 ·· * ·· «4 mikroorganizmu N. meningitidis kmen H44/76 (pěstovaných za podmínek s nedostatkem železa) .

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Bakteriální kmeny a podmínky kultivace

Použití bakteriální kmeny se uvádějí v tabulce č. 1. Meningokoci se kultivovaly přes noc na plotnách s GC agarem (Difco), doplněným přípravkem Vítox (Oxoid) ve vlhké atmosféře s 5 % C0₂ při teplotě 37 °C. Optimální exprese proteinů regulovaných železem se dosáhlo přidáním 5 μg/ml chelátoru železa, kterým je kyselina etylendiamin-di-ohydroxyfenyloctová (EDDA, Sigma). Za účelem přípravy vzorků pro SDS-PAGE, imunoblotů a izolace chromozomální DNA se buňky kultivovaly jak se popisuje dříve v textu (popisuje se v publikací Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J. , (1993) Molecular characterization of the

98-kilodalton iron-regulated outer membrane protein of Neisseria meningitidis. Infect Immun 61: 4724-4733) .

Mikroorganizmus E. coli kmen Y1090 (Young, R. A. and Yeast RNA polymerasell genes: isolation Science 222: 778-782), který se použil při pomnožení fága Xgtll se kultivoval na kultivačním médiu podle Luria-Bertoldi (LB) doplněném ampicilinem (100 μΐ/ml),. 0,2 % maltózou a 10 mM ΜςΟ1₂. Kmen DH5a užívaný pro klonování se kultivoval na kultivačním médiu LB doplněném 100 μΐ/ml ampicilinem, 25 μg/ml kanamycinem nebo 100 μο/ml erytromycinem, v případě, že jenutné selektovat rekombinanty. Po transformaci s pEMBL19-deriváty, se buňky nanesly na plotny obsahující LB kultivační médium doplněné vhodným antibiotikem a 5-bromo-4-chloro-3-indoyl-p-D-galaktosidem (40 μρ/ιηΐ) a 0,5 mM izopropyl-p-D-thiogalaktopyranosidázou, což jsou látky vhodné k testování inzertů v plazmidech. Kmen

Davis, R. W. (1983) and antibody probes

Φ· ·· • φ φ φ .*.··.

• Φ Φ • φφφ φφ

PC2494 používaný pro přípravu jednořetězcové DNA se udržoval na plotnách s minimálním médiem doplněným 5 gg/ml thiaminu a 0,2 % glukózou.

Příklad 2:

2A: Příprava myšího antiséra proti peptidům

Peptidy (obrázek č. 3) se syntetizovaly za použití automatického syntetizátoru peptidů a spojily se s toxoidem tetanu, jak se popisuje v publikaci van der Ley, P., and Poolman, J. T. (1992) Construction of a multivalent meningococcal strain based on the class 1 outer membrane protein. Infect Immun 60: 3156-3161. Myši BALB/c se imunizovaly 50 μρ peptidů a 20 μρ přípravku Quíl A, který složí jako adjuvans. Provedly se dvě vakcinace. Sérum se shromáždilo 54 dní po první injekci.

2B: Identifikace produktu genu IbpB

Za účelem zjistit, zda putativní gen IbpB kóduje protein, vytvořilo sérum proti syntetickým peptidům (označuje se jako Al-El na obrázku č. 3), které bylo založeno na dedukované aminokyselinové sekvenci částečného otevřeného rámce. Antisérum se testovalo westernovými bloty proti celým buňkám kmene BNCV, který se kultivoval za podmínek omezení železem. Séra proti peptidů B1 nevykazují žádnou reakci (data nejsou uvedeny). Antiséra proti jiným peptidům reagovala s pruhem odpovídajícímu molekulové hmotnosti 95 000 (obrázek č. 1) .

Protože tento pruh chyběl u mutanta IbpB (konstruovaného podle popisu dále v textu) (obrázek č. 1, dráha 3 a 7), udělal se závěr, že gen IbpB se exprímuje v kmeni divokého typu a že kóduje protein se zjevnou molekulovou hmotností (Mr) 95 000. Některá séra proti peptidům Dl a El vykazují adiční reakci s pruhem, který odpovídá molekulové hmotnosti Mr 60 000 (obrázek č. 1) . Oba tyto peptidy obsahují sekvenci VVFGAK, která je také přítomna v TbpB (obrázek č. 3) . Prto je * · • 4 · • ·»·ΐ možné, že pruh odpovídající molekulové hmotnosti 68 000 je

TbpB. Za účelem testování této možnosti mutant TbpB, N91 a jeho rodičovský kmen B16B6 se testoval westernovými bloty. Sérum 19-1 (proti peptidů El) reagoval se dvěma pruhy odpovídající molekulové hmotnosti 95 000 a 68 000 v kmeni B16B6, ale pouze s pruhem o molekulové hmotnosti 95 000 v kmeni N91. Tento výsledek indikuje, že pruh odpovídající molekulové hmotnosti 68 000 je TbpB (data nejsou uvedena).

Příklad 3: SDS-PAGE a imunoblotování

Provedl se test SDS-PAGE celých buněčných proteinů, jak se popisuje v publikaci Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J., (1993) Molecular characterization of the 98-kilodalton iron-regulated outer membrane protein of Neisseria meningitidis. Infect Immun 61: 4724-4733, Pettersson, A., Kuipers, B., Pelzer, M., Verhagen, E., Tiesjema, R. H., Tommassen, J., and Poolman, J. T. (1990). Monoclonal antibodies against the 70-kilodalton ironregulated protein Neisseria meningitidis are bectericidal and strain specific. Infect Immun 58: 3036-3041). V experimentech kde se musí předejít denaturaci LbpB se musí provést následující úpravy. Vzorkový pufr neobsahoval žádný βmerkaptoetanol. Komplexy vnější membrány se před elektroforézou nezahřály na teplotu 95 °C ve vzorkovém pufru, ale inkubovaly se buď na ledu nebo pří teplotě 37 °C po dobu 10 minut. Při experimentu, kterým se testuje schopnost vázat laktoferin, polyakrylamidový gel byl tvořen 5 % (hmotn./objem) gel tvořící podklad a 8 % (hmotn./objem) dělící gel obsahující 0,05 % (hmotnost/objem) SDS.

Elektrodový pufr obsahoval pouze 0,05 % SDS místo 0,1 %.

Elektroforéza proběhla při konstantním napětí 100 V po dobu 2 hodin při teplotě 4 °C. Použil se standardní vzorkový pufr s % SDS.

provedla systémem za použití gelů a SDS ·· 00 »0 0 • · · 0 · 0 0 • »· 0 0 0 0 * * ·00 00000 ··♦ 00 · * · · ·

0t ·

0 0 0

0· ··

Za účelem detekce svinutých forem se elektroforéza proteinů vnější membrány se PhastSystem (Pharmacia) podle instrukcí výrobce 7,5 % (hmotn./objem) homogenních polyakrylových pufru.

Imunoblotování se uskutečnilo způsobem, jak se popisuje dříve (Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J., (1993) Molecular characterization of the 98kilodalton iron-regulated outer membrane protein of Neisseria meningítidis. Infect Immun 61: 4724-4733, Pettersson, A., Kuipers, B., Pelzer, M., Verhagen, E., Tiesjema, R. H., Tommassen, J., and Poolman, J. T. (1990). Monoclonal antibodies against the 70-kilodalton iron-regulated protein Neisseria meningítidis are bectericidal and strain specific. Infect Immun 58: 3036-3041). V případě použití gelů PhastSystemu blotovací pufr obsahoval 0,05 % (hmotn./objem) SDS a aktivita peroxidázy se detekovala za použití systému ECL podle instrukcí výrobce (Amersham). Myší antisérum se použilo při ředění 1:500. Monoklonální protilátky mn98Kl a mn98K2 specifické pro LbpA (Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J. , (1993) Molecular characterization of the 98-kilodalton iron-regulated outer membrane protein of Neisseria meningítidis. Infect Immun 61: 4724-4733) se použily jako kokteíl pří ředění 1:2 000.

Příklad 4:

4A: Strategie klonování a sekvenování

Genová knihovna Xgtll z kmene BNCV původně poskytuje E.

C. Gostlich (The Rockefeller University, New York, USA). Knihovna se propagovala v mikroorganizmu E. coli kmen Y1090 a testovala se sondami DNA BEl a AP6 (obrázek č. 2) . Sonda BE1 se připravila izolací BstEII-EcoRI fragmentu plazmidu pAMl o veliksoti 355 bp (Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J., (1993) Molecular characterization jy

4· 44 ·4 4 4» * · 4 4 4 4 4 · · · • ·4 4·»4 444 * · · 4 4 4 4444 44 4 · . ·*··· · 4 4 of the 98-kilodalton iron-regulated outer membrane protein of Neisseria meníngitidis. Infect Immun 61: 4724-4733). AP6 je EcoRI-EcoRV fragment o velikosti 417 bp, který se připravil z plazmidu pAM6. Značení sond, blotování plaků a detekce se provedla způsobem, který se popisuje v publikaci Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J. , (1993) Molecular characterization of the 98-kilodalton ironregulated outer membrane protein of Neisseria meníngitidis. Infect Immun 61: 4724-4733 za použití značící a detekční sady DIG DNA Labeling and Detection kit (Boehringer Mannheim). Izolovala se λ DNA (popisuje se v publikaci Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y (1989)) a inzerty se sub-klonovaly do fagemidu pEMBL19. Plazmidová DNA se izolovala na mini kolonách Jetstar (Genomed) způsobem popsaným výrobcem. Jednořetězcová D Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y (1989).NA se pomnožila za použití pomocného fága VCSM13 (Stratagene).

Chromozomální DNA se izolovala způsobem, který se popisuje v publikaci Ausubel, F. Μ., Brent, R. , Kingston, R. E., Moore, D. Μ. , Seidman, J. G., Smith, J. A., and Struhl,

K. (1989) Current protocols in molecular biology. Brooklyn, NY: Greene Publishing Associates. DNA se štěpila restrikčními enzymy AccI a Dral a separovala se na 1 % agarózovém gelu. Southernovy bloty se provedly způsobem, jak se popisuje v publikaci Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J. , (1993) Molecular characterization of the 98-kílodalton iron-regulated outer membrane protein of Neisseria meníngitidis. Infect Immun 61: 4724-4733. Sonda ESI (obrázek č. 2) se připravuje izolací EcoRI-SalI fragmentu o velikosti 320 bp z pAM13 a značí se způsobem popsaným shora v textu. Sonda reagovala Southernově blotu s fragmentem, který vznikl štěpením chromozomální DNA restrikčními enzymy • 444 4 · » 44

4 4 · 4

4 4

4 « •4 44

44 4 4 4 4

4U 4* ·*\ 4

4 4 4444 44

AccI/Dra Γ, o velikosti 1,5 kb. Fragmenty o velikosti 1, 5 kb se izolovaly z gelu a ligovaly se do pEMBL19. Ligační směs se amplifikovala PCR za použití univerzálního primeru M13 (Pharmacia) a primeru LB11 (tabulka č. 2). Polymeráza Goldstar a derivát Taq polymerázy (Eurogentec) se použily při PCR amplifikaci podle instrukcí výrobce. Produkt PCR o velikosti 1,3 kb se čistil z agarózového gelu.

Sekvenování DNA se uskutečnilo manuálně za použití sekvenační směsí deáza G/A T7 (Pharmacia) nebo automaticky za použití přístroje ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer). V případě automatického sekvenování se značení uskutečnilo za použití sekvenační sady Dye Terminátor Cycle (Perkin Elmer). Vnitřní primery (syntetizované firmou Pharmacia nebo Gibco BRL) a M13 univerzální a reverzní primery (Pharmacia) se použily pro sekvenování jednořetězcové DNA, dvouřetězcové plazmidové DNA nebo produktu PCR.

Podobné strategie se použilo při sekvenování genu IbpB pocházející z kmenů H44/76 a M981 mikroorganizmu Neisserie meningitidis.

4B: Klonování a sekvenování genu IbpB

Za účelem klonování chybějící části genu IbpB se testovala genová' knihovna Zgtll v kmeni BNCV pomocí sond DNA. Našly se dva odlišné klony lambda. Tyto inzerty se subklonovaly do pEMBL19 za vzniku plazmidů ρΑΜβ a pAM13 (obrázek č. 2) a dále proběhlo sekvenování. Tímto způsobem se nenašel promotor ani začátek genu IbpB. Při několika dalších pokusech klonování chyběl 5'konec genu, což naznačuje, že exprese je pro mikroorganizmus E. coli toxická. Aby se získal zbytek sekvence, připravila se bohatá banka fragmentů, které vznikly tak, že chromozomální DNA se štěpila restrikčními enzymy AccI a Dra I. Fragmenty chromozomální DNA o přibližné velikosti 1,5 kb se ligovaly do pEMBL19 a amplifikace PCR proběhla přímo v ligační směsi za použití primeru (LB11, uvedeno na ·· 00 00 · 99 ««

9 9 9 9 9 9 9 9 9 4 • ·· · · 0 0 ·«·< * · · · · ····«·· 0 « <

0 0 · 0 · ·«·« ···· ·· 00 0 00 99 obrázku č. 2) založeném na známé části sekvence genu lbpB a primerů M13. Výsledný produkt PCR (obrázek č. 2) se použil přímo pro sekvenování. Tato strategie zabrání klonování možná toxického genu do mikroorganizmu E. coli.

Sekvenováním různých fragmentů genu lbpB se odhalil otevřený čtecí rámec o velikosti 2 175 bp. Tento rámec kóduje protein tvořený 725 aminokyselinovými zbytky (obrázek č. 3) s molekulovou hmotností 79 400. Analýza sekvence N-konce ukázala charakteristiky signální sekvence, kterou rozeznává segnální peptidáza II (von Heijne, G. (1989) The structure of signál peptides from bacterial lipoproteins. Prot. Eng. 2: 531-534). Takové signální sekvence jsou přítomny v prekurzorech lipoproteinů, které jsou acylovány na Nterminálním cysteinovém zbytku zralého proteinu. Podobná signální sekvence se zjistila u proteinu TbpB, který se ukázal, že je opravdu upraven lipidem (popisuje se

Anderson, J. E., Sparling, P. F., and

C. N. (1994) Gonococcal transferrin-binding v publikaci Cornellisen, protein 2 facilitates but is not essential for transferrin utilization. J. Bacteríol 176; má vypočítanou molekulovou

3162-3170). Zralý protein LbpB hmotnost 77 500, která je podstatně nižší než je zřejmá molekulová hmotnost 95 000, která se zjistila při elektroforéze na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) (obrázek č. 1). Testováním databáze Swiss Prot za účelem zjištění podobností jiných proteinů se objevila homologie s TbpB mikroorganizmu Actinobacillus pleuropneumoniae. Nejvyšší je 33 % shoda, se zjistila s TbpB

N. meningitidis kmen B16B6 (popisuje se

Neisseriae a homologie, což mikroorganizmu v publikaci Legrain, M., Marazin, V., Irwin, S. W. , Bouchon, Β., B., Quentín-Millet, M.-J., Jacobs, E., and Schryvers, A. B. (1993) Cloning and characterisation of Neisseria meningitidis genes encoding the transferrin-binding proteins Tbpl a TbP2. Gene 130: 73-80) (obrázek č. 3). V proteinu TbpB • · ·· · • · « • · · · * «··· « • ♦ · ·· ♦ • · ·« * · « « • · · ♦ • ♦ « · « · · · • · · · se našly vnitřní repetice a navrhlo se, že molekula má dvoulaločnou strukturu, která se vyvine po vnitřní duplikaci (Fuller, C. A., Retzer, M. D. , Jacobs, E., and Schryvers, A. B. (1996) Evidence for a bi-lobed structure for meningococcal transferrin binding protein B. In Pathogeníc Neisseria. Zollinger, W. D., Frash, C. E. , and Deal, C. D. (eds) . Abstract book from the 10^th Pathogeníc Neisseria Conference. pp 572-573, Renauld-Mongénie, G., Poncet, D., and QuentinMillet, M. J. (1996) Study of human transferrin bindings sites within the transferrin binding protein Tbp2 from N. Meningitidis M982 using the pMAL expression systém. In Pathogeníc Neisseria. Zollinger, W. D., Frash, C. E. , and Deal, C. D. (eds) . Abstract book from the 10^th Pathogeníc Neisseria Conference. pp 585-586). Když se 354 aminokyselin N-konce zralého proteinu LbpB porovnalo s 353 aminokyselin Ckonce, zjistila se 30 % a 10 % shoda (data nejsou uvedeny). Tento výsledek naznačuje, že také protein LbpB může vykazovat dvoulaločnou strukturu. Izolelektrický bod uvedeného proteinu je 4,5. V sekvenci se mohou rozeznat dva dlouhé pruhy, které jsou bohaté na kyselé zbytky (obrázek č. 3) . Protože tyto pruhy se nevyskytují v TbpB, mohou mít důležitou úlohu při navázání laktoferinu, který je oproti transferinu, pozitivně nabitá molekula.

V oblasti promotoru se vyskytuje typická Shine-Dalgarnova sekvence. Také se zjistila přítomnost putativních boxů -10 až -35 (obrázek č. 4). Sekvence připomínající Fur-vazebné místo překrývají -10 box. Fur působí ve spojení s ionty Fe²⁺ jako represor genů, které se regulují železem, tak, že se naváže na sekvenci o velikosti 19 bp v oblasti promotoru (popisuje se v publikaci Begg and Neilands 1987). Sekvence takového boxu Fur je GATAATGATAATCATTATC, přičemž 16 z 19 bp uvedené sekvence je v tomto elementu promotoru genu IbpB konzervativních. Dále, proti směru exprese genu od promotoru se zjistila přímá repetice o velikosti 131 bp (data nejsou ·« ·· «φ · • · · · · · ·

A · ·· · · « ····«·» • · 9 9 9

9999 99 ·φ uvedena). Tato sekvence se vyskytuje v uvedené poloze alespoň dvakrát. Stejná přímá repetice se zjistila po směru exprese genu lbpA (Prinz et al., nepublikované pozorování). Zkoumáním homologie v databázi FASTA se zjistila homologie této repetice s řadou sekvencí mikroorganizmu Neisserie, které většinou lemují otevřené čtecí rámce (data nejsou uvedeny).

Sekvenční homologie mezi proteiny LbpB kmenu BNVC a M981 mikroorganizmu N. meningitidis a mezi proteiny LbpB kmenů BNCV a H44/76 mikroorganizmu N. meningitidis je 72,7 % respektive 78,5 %.

Příklad 5:

5A: Konstrukce izogenních mutantů

Plazmidy pAM23 a pAM6 se použily k inzertové deaktivaci genu lbpA respektive IbpB. Kazeta nesoucí rezistenci na erytromycin (Erm^r) pocházející z pER2 (popisuje se v publikaci Jennings , Μ. P., van der Ley, P., Wilks, K. E., Maskell, D. J., Polman, J. T., and Moxon, E. R. (1993) Clonning and molecular analysis of hene galE of Neisseria meningitidis and its role in lipopolysaccharide biosynthesis. Mol. Microbiol. 10: 361-369) se vystřihla restrikčními enzymy Clal a HindlII. Fragment se ošetřil DNA polymerázou T4 a ligoval se do pAM23 štěpeného restrikčním enzymem EcoRV za vzniku plazmidu pAM23E. Kazeta nesoucí rezistenci na kanamycin (Km^r) pocházející z pUC4K (Pharmacia) se vystřihla restrikčním enzymem HíncII. Plazmid pAM6 se linearizoval restrikčním enzymem BglII a ošetřil se DNA polymerázou T4. Kazeta Km^r se ligovala na uvedené místo za vzniku plazmidu pAM6K. Linker se skládal z oligonukleotidů nusl a nus2 (tabulka č. 2), které obsahují sekvenci (GCCGTCTGAA), jenž jsou schopny Nesserie přijmout. Jednořetezcový konec kompatibilní s restrikčním místem KpnI se klonoval do restrikčního místa KpnI pAM6K za vzniku plazmidu pAM6K-nus. Geny nesoucí rezistenci na antibiotika byly ve stejném směru jako geny lbpA a IbpB *· ♦· «9 9 99 99 ► · · 9 99« 9 φ 9 9 * ·· · « 9 9 9 9 9 9 • · 999 9999999 99 «

9999 99 v plazmidech pAM23E a linearizovaný restrikčním

Plazmid pAM23E se použil pro pAM6K(-nus). enzymem KpnI transformaci kmene H44/76, jak se popisuje v publikaci van der Ley, P., and Poolman, J. T. (1992) Construction of a multivalentmeningococcal strain based on the class 1 outer membrane protein. Infect Immun. 60: 3156-3161. Transformanti se selektovaly na plotnách s GC kultivačním médiem, které obsahuje 5 μς/ιηΐ erytromycinu. Správné nahrazení genu v jednom z tranformantů označených CE1449 se ověřilo pomocí PCR za použití primerů FW5 a DVAS2 (tabulka č. 2) a analýzou Southernovým přenosem za použití sondy AP23 (obrázek č. 2, sonda se izolovala jako fragment SspI-HindlII z pAM23) . Pro analýzu Southernovým přenosem se chromozomální DNA štěpila restrikčními enzymy Clal a Sáli. Izogenní mutanti v kmenu BNCV se připravily elektroporací (popisuje se v publikaci Genco, C. A., Chen, C. Y. , Arko, R. J. , Kapczynski, D. R. , and Morse, S. A. (1991) Isolation and characterization of a mutant of Neisseria gonorrhoeae that is detective in the uptake of iron from trnsferrin and hemoglobin and is avirulent in mouše subcutaneous chambers. J. Gen. Microbiol.

137: 1313-1321), transformovatelný.

protože tento kmen se jeví být

Chromozomální DNA pocházející z IbpA mutantu CE1449 se použila při přípravě IbpA mutantu. Transformanti se selektovaly na plotnách GC s erytromycinem a ověřily se způsobem, který se uvádí shora v textu. Plazmid pAM6K-nus se použil při přípravě IbpB mutantu. Transformanti se selektovaly na plotnách GC,' které obsahují 100 μς/πιΐ kanamycinu. Správná náhrada genu se ověřila pomocí PCR za použití primerů SDAl a PRl (tabulka č. 2) a Southernovým přenosem za použití sondy AP23.

5B: Konstrukce izogenních mutantů

Za účelem ověření identity proteinu o molekulové hmotnosti 94 000 a zkoumání úlohy jednotlivých proteinů ·· ·· ·« * ·· «· • · · » · < « . , · · • *· ·*»· · · · · • · · · · * *.»· « i « « « ··· ··· . « · « ·♦·· ·· ·* » »« »· vázajících laktoferin při vázání laktoferinu a jiném využití se zkonstruovala sada izogenních derivátů BNVC, kterým chybí buď LbpA nebo LbpB. Tato konstrukce se popisuje v příkladu 5. Správné nehrazení genů se ověřilo pomocí PCR a Southernovým přenosem (data nejsou uvedena). Exprese LbpA a LbpB v mutantech se kontrolovala westernovým přenosem (obrázek č.

5). lbpA mutant CE1452 neexprimuje protein LbpA (obrázek č. 5A, dráha 4) a IbpB mutant CE1454 neexprimuje protein o molekulové hmotnosti 94 000 (obrázek č. 5B, dráha 6) . Tento výsledek potvrzuje, že gen IbpB se exprimuje v kmeni divokého typu a kóduje protein s molekulovou hmotností 94 000, která je podstatně vyšší než vypočítaná molekulová hmotnost 77 500. Výsledky na obrázku č. 4 ukazují, že deaktivace genu IbpB nemá polární účinek na expresi proteinu LbpA (obrázek č. 5A, dráha 6) . To se předpokládalo, protože kazeta nesoucí rezistenci na kanamycin, která se začlenila do genu IbpB neobsahuje terminátor transkripce. Ukázalo se, že dříve popsaný spontánní lbpA mutant CE1402 (Pettersson, A., Maas, A., and Tommassen, J., (1994b) Identification of the iroA gene product of Neisseria meningitidis as a lactoferrin receptor. J Bacteriol 176: 1764-1766) nevykazuje expresi LbpB (obrázek č 5B, dráha 8). Protože uvedený mutant a BNCV jsou deriváty kmene M986, jejich genové pozadí je stejné jako pozadí jiných mutantů. Exprese proteinů LbpA a LbpB se jeví být regulována železem (obrázek č. 5) . Slabou expresi proteinu LbpA vykazuje kmen CE1454 dokonce když se buňky kultivovaly bez chelátoru železa (obrázek č. 5A, dráha 5). K této expresi pravděpodobně dochází na základě transkripce řízené promotorem genu nesoucího rezistenci na kanamycin v IbpB. Také v tomto případě je exprese několikrát zeslabena, když se kmen kultivuje v přítomnosti chelátoru železa (obrázek č. 5A, dráha 6).

Příklad 6:

4b ·· ·· ·« · .« ,.

Φ Φ φ φ Φ φ φ Φ A b * • ·· φ · · · φ φ φ φ • · · · · · ·Φ·Φ · φ · · φφφφ Φ· φφ φ φ φ φφ φφ in their Biochem. J.

6A: test navázání laktoferinu

Navázání laktoferinu na celé buňky se testovalo testem

ELISA s celými buňkami. Rekombinantní lidský laktoferin produkovaný mikroorganizmem Aspergillus avamori se získal u firmy Agennix lne., Hopuston, Texas, USA. Laktoferin se saturoval železem, jak se popisuje v publikaci van Berkel, P. H. C., Geerts, Μ. E. J. , van Veen, H. A., Kooiman, P. M., Pieper, F. R., de Boer, H. A., and Nuijens, J. H. (1995) Glycosylated and unglycosylated human lactoferrins both bind iron and show identical affinities toward human lysozyme and bacterial polysaccharide, but differ susceptibilities towards tryptic proteolysis.

312: 107-114 s výjimkou následující modifikace. Místo Fe(NC>3)3 se použil FeCl3 a dialýza se provedla proti pufru obsahujícímu 5 mM Na2HPO₄/NaH2PO₄ pH7,7 po dobu 4 hodin. Kolonie z ploten se resuspendovaly ve fyziologickém roztoku pufrovaném Tris, pH 7,5 (TBS) a usmrtily se zahřátím na teplotu 56 °C po dobu 30 minut. Vzorky (o objemu 100 μΐ), kde optická hustota při vlnové délce 620 nm je 0,05 se rozdělily do prohlubní na mikrotitrační destičce. Vzorky se nechaly vyschnout přes noc při teplotě 37 °C. Test se provedl při teplotě 37 °C. Nespecifickému navázání se bránilo pomocí blokačního roztoku o objemu 100 μΐ, který obsahuje 0,05 % přípravku Protifar (Nutricia) a 0,1 % Tween 20 v pufru TBS. Blokování trvalo po dobu 1 hodiny. Po blokování se prohlubně naplnily různými koncentracemi laktoferinu, který je obsažen v blokačním roztoku. Koncentrace laktoferinu v prohlubních kolísá od 3,125 do 200 ng/ml. Po inkubaci po dobu 1 hodiny a po třech promytích vodou z kohoutku se přidalo do prohlubní králičí polyklonální antisérum spojené s peroxidázou a vytvořené proti lidskému laktoferinu (ICN Bíomedicals) . Protilátky se použily v ředění 1:5 000 v blokačním pufru. Po inkubaci po dobu 1 hodiny a třech promytích vodovodní vodou se detekovalo množství peroxidázy (popisuje se v publikaci Abdilahi, H., • · and Poolman, J. T. (1987) Whole-cell ELISA for typing of Neisseria meningitidis with monoclonal antibodies. FEMS Microbiol. Lett. 48: 367-371).

Navázání laktoferinu na blot se provedlo následujícím způsobem. Nespecifickému navázání se zabránilo blokováním, které proběhlo inkubací membrány v pufru, který obsahuje 0,2 M Na2HPO₄/NaH2PO4 pH5,7 , 0,1 % Tween-20 a 0,5 % přípravek Protifar (Nutricia), po dobu 2 hodin. Blot se inkuboval s 1,2 μς/πιΐ lidského laktoferinu spojeného s peroxidázou (Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J. , (1993) Molecular characterization of the 98kilodalton iron-regulated outer membrane protein of Neisseria meningitidis. Infect Immun 61: 4724-4733) v blokačním pufru po dobu 1 hodiny a třikrát se promyl blokačním pufrem. Aktivita peroxídázy se detekovala systémem ECL podle instrukcí výrobce (Amersham).

6B: Testy dávkování na plotnách

Meningokoci se kultivovaly přes noc v kultivačním médiu doplněném přípravkem Vitox, jak se popisuje v příkladu 1. 300 μΐ kultury kultivované přes noc se suspendovalo ve 3 ml agaru, který tvoří horní vrstvu (1 % GC agar s 20 μς/ιηΐ EDDA, vychlazeno na teplotu 42 °C) , a bezprostředně se vše naneslo na plotny s agarem GC doplněným přípravkem Vitox a 20 μρ/ιηΐ EDDA. Na plotny se nanesly kapky (10 μΐ) rekombinantního lidského laktoferinu (saturovaného z 11 % železem nebo saturovaného, jak se popisuje shora v textu). Koncentrace laktoferinu v kapkách byla 10 respektive 20 mg/ml. Plotny se kultivovaly přes noc.

6C: Navázání laktoferinu na svinutý protein LbpB nacházející se v biotech

Za účelem zkoumání, zda laktoferin se může vázat na protein LbpB na biotech, se provedl test SDS-PAGE za • · forma proteinu (obrázek č hmotnost přibližně 80 000.

podmínek, při kterých je protein LbpB denaturován (popisuje se v příkladu 6A). Když se vzorky před elektrolýzou nezahřály ve vzorkovém pufru, mohla se detekovat rychleji migrující 6A) . Tato forma má molekulovou Po zahřání po dobu 10 minut na teplotu 95 °C se protein LbpB zcela denaturoval a migroval do polohy odpovídající molekulové hmotnosti 94 000 (obrázek č.

6A, dráha 2). Je zajímavé, že s rychleji migrující formou proteinu reagovalo pouze sérum proti peptidů Al (obrázek č. 2) . Tento peptíd obsahuje jeden ze dvou proužků, který je bohatý na negativně nabité aminokyseliny a pravděpodobně se

Navázání protilátek tato část proteinu protein LbpB, blotovaly na na je podílí na navázání laktoferinu. svinutý protein naznačuje, že exponována, zatímco všechny jiné proteinové epitopy jsou skryté ve svinuté struktuře proteinu LbpB.

Následně se odhadlo navázání laktoferinu na svinutý Proteiny vnější membrány kmene BNVC se nitrocelulózovou membránu a inkubovaly se s lidským laktoferinem spojeným s peroxidázou. Specifita navázání laktoferinu se jeví být velmi citlivá na inkubační podmínky. Nejvíce důležitá je hodnota pH. Za optimalizovaných podmínek se laktoferin váže specificky na proteinový pruh o molekulové hmotnosti 80 000 (obrázek č. 6B, dráha 1 a 2) .

Když se vzorek před SDS-PAGE zahřál na teplotu 95 °C po dobu 10 minut nedošlo k navázání (obrázek č. 6B„ dráha 3). Pruh se nedetekoval ve vzorcích IbpB mutantu CE1454 (data nejsou uvedena). Udělal se závěr, že rychleji migrující forma proteinu LbpB reprezentuje svinutou formu proteinu a je schopna vázat laktoferin.

6D: navázání laktoferinu a využití v celých buňkách

Pomocí Testu ELISA se zkoumalo navázání laktoferinu na celé buňky. Plotny vhodné pro test ELISE se potáhly celými buňkami kmene BNCV izogenních mutantů a do prohlubní se • · » 4 » a • · přidal laktoferin v různých koncentracích. Navázání laktoferinu na celé buňky se testovalo za použití protilátek vytvořených proti lidskému laktoferinu, které jsou spojeny s peroxidázou (obrázek č. 7). Schopnost IbpB mutantu vázat laktoferin byla slabě omezena. IbpA mutant vázal laktoferin méně účinně než IbpB mutant, zatímco zdvojený mutant neváže laktoferin vůbec (obrázek č. 7).

Testy nanesením ne plotny se zkoumala schopnost použití laktoferinu jako zdroje železa. Meningokoci se kultivovaly za limitace železem na plotnách. Na plotny se nanesly kapky rekombinantního lidského laktoferinu a monitorovala se stimulace růstu. IbpB mutant se kultivoval v přítomnosti laktoferinu, zatímco IbpA mutant se nekultivoval v přítomnosti laktoferinu (obrázek č. 8). Laktoferin byl saturován z 11 %. Stejný experiment proběhl s alktoferinem naneseným spolu se železem a dosáhlo se v podstatě stejných výsledků (data nejsou uvedena). Tyto data ukazují, že protein LbpA je nezbytný pro příjem železa prostřednictvím laktoferinu, zatímco protein LbpB se nezdá být podstatný.

Příklad 7:

Za účelem studia variability meningokokového proteinu LbpB se sekvenovaly geny IbpB ze čtyř dalších kmenů H44/76, M981, 881607 (uvádí se v tabulce č. 1).

7A: Sekvenování genu IbpB ze čtyř dalších meningokokových kmenů - způsoby provedení

Bakterie se kultivovaly stejným způsobem, jak se popisuje v příkladu 1. Chromozomální DNA se izolovala z bakterií rostoucích na plotnách. Po celonoční kultivaci se bakterie seškrabaly z ploten a resuspendovaly se v 1,5 ml 10 mM TrisHCl, 10 mM EDTA, pH8 a přidalo se 10 μΐ lysozymu (10 mg/ml) . Suspenze se inkubovala po dobu 15 minut při teplotě místnosti a pak se přidalo 1,5 ml 2 % Tritonu X-100, 50 mM Tris-HCl, 10

mM EDTA pH 8. Po 15 minutách inkubace se přidalo 10 μΐ proteinázy K (v koncentraci 10 mg/ml). Zkumavky se inkubovaly po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Směs se jednou extrahovala směsí fenol, chloroform, izoamylalkohol (smícháno v poměru 24:24:1), jednou s chloroformem saturovaným vodou. Chromozomální DNA se srážela etanolem.

Chromozomální DNA se použila pro PCR amplifikaci genů lbpB. Primery LB20 a REV2 (tabulka č. 3) se použily v případě kmenů H44/76, M990 a 881607. Primery LB20 a LB23 se použily v případě kmenů M981. Primery jsou založeny na sekvenci genu lbpB z kmene BNCV. Primer LB20 se váže proti směru exprese genu lbpB a primer LB23 a REV2 se váže na začátek genu lbpA. Primer LB23 vykazuje restrikční místo BamHI na 5'konci. Podle návodu výrobce se při amplifikaci pomocí PCR použila polymeráza Goldstar, což je derivát Taq polymerázy (Eurogentec). Teplota teplotní hybridizace je ve všech případech 50 °C a amplifikace proběhla ve 30 cyklech. Produkty PCR se čistily z agarózových gelů za použití βagarázy (New England Biolabs) podle návodu výrobce.

Sekvenování DNA proběhlo za použití primerů vhodných pro geny lbpB. Primery se syntetizovaly firmou Gibco BRL. Sekvenování se provedlo automaticky za použití přístroje ABI Prism 310 Genetic Analyser (Perkin-Elmer). Značení se provedlo použitím Dye Terminátor Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer).

V případě translace nukleotidové sekvence na aminokyselinovou sekvenci se použily počítačové programy TRANSL, PALIGN a CLUSTAL z balíku software PC Gene 6.70 (IntelliGenetics).

7B: Sekvenování genů lbpB ze čtyř meningokokových kmenů výsledky

Nukleotidové sekvence genů lbpB čtyř kmenů jsou uvedeny v SEQ ID NO: 3, 5, 7 a 9. Nukleotidové sekvence se překládaly

• · · · · ··<*· ·· «· na aminokyselinové sekvence a srovnávaly se s pěti známými sekvencemi proteinů LbpB. Výsledky jsou uvedeny na obrázku č. 9. Na úrovni aminokyselin shoda LbpB proteinů různých kmenů byla 70 až 80 %. Porovnání identity párů se uvádí v tabulce

č. 4.

Příklad 8:

Síla exprese proteinu LbpB v mikroorganizmu Neisseria meningitidis je velmi malá. Když se paterny proteinů vnější membrány analyzovaly testem SDS-PAGE, protein LbpB se nemohl detekovat. Za účelem imunologické a strukturnš/funkční studie proteinu LbpB se připravila konstrukce vhodná pro expresi proteinu v mikroorganizmu Escherichia coli. Aby se umožnilo čištění rekombinantního proteinu, protein kódovaný konstrukcí obsahoval His-tag a lipidové modifikaci N-konce se zamezilo nahrazením přirozené signální sekvence a prvních dvou aminokyselinových zbytků zralé oblasti.

8A: Exprese rekombinantního proteinu LbpB - bakteriální kmeny a kultivační podmínky

Meningokokový kmen BNCV (-:2a:P1.2) se kultivoval přes noc na plotnách s agarem GC (Difco) doplněném přípravkem Vítox (Oxoid) ve vlhké atmosféře 5 % CO₂ při teplotě 37 °C. Konstrukce kódující rekombinantní protein LbpB se exprimovala v mikroorganizmu E. coli kmen CE1448 (kmen poskytnul C. Jansen), který je htrA ompT derivát kmene CE1224 (Tommassen, J., van Tol, H., and Lugtenberg, B. (1983) The ultimate localization of an outer membrane protein of Escherichia coli K-12 is not determined by the signál sequence. EMBO J. 2: 1275-1279). Kmen se kultivoval při teplotě 37 °C v syntetickém kultivačním médiu pufrovaném Hepes (popisuje se v publikaci Tommasen, J., and Lugtenberg, B. (1980) Outer membrane proteine of Escherichia coli K-12 is co-regulated with alkaline phosphatase. J. Bacteríol. 143: 151-157) • · · 4

44444 4 4

JE

4 4 • 4 4 4 ·« doplněném činidly, které mohou způsobit auxotrofní mutace, a 1,32 mM K2HPO4 (podmínky saturované fosforečnanem). Po celonoční kultivaci se kultura naředila 1:13,5 do stejného kultivačního média, které však neobsahuje K₂HPO₄ (podmínky bez fosforečnanu) a nechala se kultivovat po dobu 6 hodin při teplotě 37 °C.

8B: Exprese rekombinantního proteinu LbpB - klonování do mikroorganizmu E. coli

Chromozomální DNA se izolovala z meningokokálních buněk kultivovaných přes noc na plotnách. Bakterie se seškrabaly z ploten, suspendovaly se v 1,5 ml 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH8 a přidalo se 10 μΐ lysozymu ( v koncentraci 10 mg/ml) . Suspenze se inkubovala po dobu 15 minut při teplotě místnosti a pak se přidalo 1, 5 ml 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH8 a přidalo se 10 μΐ lysozymu (v koncentraci 10 mg/ml). Suspenze se inkubovala po dobu 15 minut při teplotě místnosti a pak se přidalo 1,5 ml 2 % Tritonu X-100, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8. Po 15 minutách inkubace se přidalo 10 μΐ proteinázy K (v koncentraci 10 mg/ml) . Zkumavky se inkubovaly po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Směs se jednou extrahovala směsí fenol, chloroform, izoamylalkohol (smícháno v poměru 24:24:1), jednou s chloroformem saturovaným vodou. Chromozomální DNA se srážela etanolem.

Chromozomální DNA se použila jako templát pro amplifikací části genu lbpB, která odpovídá zralému proteinu LbpB, pomocí PCR za použití primerů LB22 a LB23 (tabulka č. 5) . Primer LB22 se naváže v místě, které odpovídá N-terminální části proteinu LbpB a zavede do produktu PCR restrikční místo Pstl. Primer LB23 se navázal po směru exprese genu lbpB na začátek genu IbpA a zavedl restrikční místo BamHI. Při PCT reakci se použila polymeráza Pwo (Boehringer Mannheim) podle instrukcí výrobce. Teplota teplotní hybridizace je 60 °C a proběhlo 30 cyklů. Produkt PCR se izoloval se izoloval z gelu za použití »»

- - · · • · · 1 » · · 4 » · 4 4 » ·« I • * « · β-agarázi (New England Biolabs) podle instrukcí výrobce. Produkt PCR se štěpil restrikčními enzymy Pstl a BamHI a ligoval se do pJP29 (obrázek č. 10A) , který se také štěpil restrikčními enzymy Pstl a BglII. Ve výsledné konstrukci pAM31 se ztratily restrikční místa BamHI a BglII. Protein Exprese proteinu LbpB v této konstrukci je řízena promotorem phoE a obsahuje místo autentické signální sekvence signální sekvenci PhoE. První dva zbytky od N-konce se změnily z Cys a Ile na Ala a Val. Aby se umožnilo čištění proteinu, tak se mezi signální sekvenci a zralou část proteinu LbpB začlenil His-tag. pAM31 se štěpil restrikčním enzymem Pstl a ligoval se s linkerem, který obsahuje oligonukleotidy VG012a a VG013a (tabulka č. 5) . Výsledkem je plazmid pAM32 (obrázek č. 10A) . Po ligaci dojde ke ztrátě restrikčního místa Pstl. Linker kóduje 6 zbytků His a místo štěpení pro faktor Xa (obrázek č.

B) .

8C: Čištění rekombinanntího proteinu LbpB

Rekombinanntí protein LbpB se produkoval v kmeni CE1448, který obsahuje plazmid pAM32. Buňky limitované fosforečnanem z kultury o objemu 5 1 se sklidily po 6 hodinách kultivace. Buňky se promyly jednou v 500 ml ve fyziologickém roztoku a resuspendovaly se ve 150 ml 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, pH 8. Suspenze se zmrazila při teplotě -20 °Cpřes noc. Buňky se rozmrazily a přidaly se tři tablety kokteilu inhibitoru proteáz (Complete™, Boehringer Mannheim). Buňky se dvakrát stlačily způsobem podle Frenche při tlaku 56 MPa. Nepoškozené buňky se odstranily centrifugací na rotoru Sorvall GSA při rychlosti 5 000 ot./min. po dobu 20 minut. Supernatant se centrifugoval na rotoru Beckman Ti60 při rychlosti 40 000 ot./min. po dobu 90 minut. Buněčné obaly se rozpustily v 5 mM Na2HPO4-NaH2PO4-pufru s hodnotou pH 7,6.

Buněčné obaly se extrahovaly dvakrát 2 % n-oktyl-oligooxyetylenem (Oktyl-POE) při teplotě 37 °C. První extrakce se • · · • « · · « « uskutečnila po dobu 1 hodiny a druhá extrakce trvala po dobu 3 hodin. Mezi extrakcemi a po extrakcích se nerozpustné peletovaly centrifugací za použití rotoru Beckman TLA100.2 při rychlosti 100 00 ot./min. po dobu 1 hodiny. Supernatenty obsahující protein LbpB se zkombinovaly a přidala se Ni-NTA agaróza. Čištění proteinu se provedlo diskontinuálně za přirozených podmínek podle instrukcí doporučených výrobcem (Qiagen). Koncentrace imidazolu a NaClběhem navázání a promývání je 20 mM respektive 300 mM. Celkem se použilo 2 ml Ni-NTA agarózy, které se rozdělily do 10 zkumavek. Eluce se provedla v jednotlivých krocích se 3 ml 100 mM, 200 mM a 250 mM imidazolu. Po eluci se protein dvakrát dialyzoval v dialyzačním sáčku Spectra/Por 2 (Spectrum) proti 2,5 1 fyziologického roztoku pufrovaným roztokem fosforečnanu. Protein se zakoncentroval v zařízení Fugisept Maxi Centrifugal Concentrator (Intersept), který oddělí molekuly s molekulovou hmotností 10 000. Centrifugace proběhla na rotoru Sorvall GSA při rychlosyi 5 000 ot./min. až se celkový objem pohyboval v rozmezí 1 až 1,5 ml.

Elektorforéza na polyakrylovém gelu (PAGE) se uskutečnila, jak se popisuje v publikaci Lugtenberg, B., Meyers, J., Peters, R., van der Hoek, P., and van Alphen, L. (1975) Electrophoretic resolutionof the „major outer membrane protein of escherichia coli K-12 into four bands. FEBS Lett. 58: 245-258 pouze s malými modifikacemi. Polyakrylamidový gel se skládal z 5 % podložního gelu a z 11 % dělícího gelu, který neobsahuje žádné SDS. Aby se zabránilo denaturaci proteinu LbpB, vzorkový pufr (Lugtenberg, B., Meyers, J., Peters, R. , van der Hoek, P., and van Alphen, L. (1975) Electrophoretic resolutionof the „major outer membrane protein of escherichia coli K-12 into four bands. FEBS Lett. 58: 245-258), který neobsahoval žádný β-merkaptoetanol, a vzorky se před testem PAGE uchovávaly při teplotě 0 °C. Aby došlo k denaturaci proteinu LbpB, vzorkový pufr se doplnil β-

	*· ·* ·· · • · · · · · · _ ··♦♦·····» • * 0 · · · ····<· «.	·· ·· • * « * 0 · 0 · • · · · · « · · « • * * «
merkaptoetanolem	avzorky	se povařily po dobu	5	minut.
Elektroforéza se	provedla	při konstantním proudu	20	mA při
teplotě 4 °C.	Gel se	barvil briliantovou modří	podle

Coomassie.

v N-terminálním Cys. s membránami nikoliv

8D: Exprese a čištění rekombinanntího proteinu LbpB-výsledky

Rekombinantní forma proteinu LbpB mikroorganizmu N.

meningitidis kmen BNCV se exprimovala v mikroorganizmu E. coli kmen CE1448. Připravila se konstrukce pAM32 kódující rekombinanntí protein obsahující signální sekvenci PhoE, Histag a zralý protein LbpB (obrázek č. 10A) . Expresi proteinu řídil promotor phoE za limitace fosforečnanem. Autentická signální sekvence typu II proteinu LbpB se nahradila signální sekvencí typu I a His-tag následován místem štěpení faktoru Xa se začlenil mezi signální sekvenci a zralý protein LbpB. Dále první dvě aminokyselinové sekvence zralého proteinu LbpB Cys a Ile se zaměnily za Ala a Val (obrázek č. 10B) . Rekombinantní protein nemůže být tudíž modifikován lipidem Rekombinantní protein LbpB se dělil s rozpustnými proteiny (data nejsou uvedena). Proto se musí extrahovat z membrány detergentem. Použil se Oktyl-Poe, protože rozpouští přibližně 50 % celkového množství rekombinanntího LbpB z membrány. Když extrahovaný protein není denaturován povařením ve vzorkovém pufru, migruje rychleji v PAGE ve srovnání s denaturovaným proteinem (data nejsou uvedeny). Tato skutečnost naznačuje, že protein je správně svinutý. Po extrakci se protein s Histag čistil na Ni-afinitní chromatografii. Většina proteinu se vymyla do 100 mM a 200 mM imidazolových frakcí. Před dialýzou se všechny frakce kombinovaly. Když se protein hodnotil na gelu obarveném briliantovou modří podle Coomassie (obrázek č. 11) byl čistý. Většina proteinu se vyskytovala ve svinuté formě, která během PAGE migruje rychleji ve srovnání s denaturovanou formou. Svinutá forma proteinu LbpB, nikoli • · • · však denaturovaná forma, se v příkladu 6).

váže na blotu laktoferin (popisuje

Příklad 9:

Za účelem studia imunogenost proteinu LbpB u člověka, se testovala přítomnost protilátek, které rozeznávají protein LbpB kmene BNCV v lidském séru rekonvalescenta, na imunoblotech.

9A: Imunogenost proteinu LbpB u člověka - způsoby provedení

Lidské sérum rekonvalescentů se získalo u instituce SmithKline Beecham Biologicals SA, Belgium a sedm sér pochází z instituce National Institute of Public Health and Environment, The Nederlands (tabulka č. 6) . Jednotlivci se infikovaly kmeny různých sérotypů a subtypů.

Rekombinantní protein LbpB se izoloval za použití postupu, který se popisuje v příkladu 8. Elektorforéza na pokrylamidovém gelu (PAGE) se uskutečnila, jak se popisuje v publikaci Lugtenberg, B., Meyers, J., Peters, R., van der Hoek, P., and van Alphen, L.

resolutionof the „major outer escherichia coli K-12 into four bands.

(1975) Electrophoretic membrane protein of FEBS Lett. 58: 245-258 s několika málo modifikacemi. Polyakrylový gel se skládá z 5 % podložního gelu a z 11 % dělícího gelu, kter Lugtenberg, B., Meyers, J., Peters, R., van der Hoek, P., and van Alphen,

L. (1975) Electrophoretic resolutionof the „major outer membrane protein of escherichia coli K-12 into four bands. FEBS Lett. 58: 245-258 neobsahuje žádný SDS. Aby se zabránilo denaturaci proteinu LbpB, vzorkový pufr (Lugtenberg, B., Meyers, J., Peters, R., van der Hoek, P., and van Alphen, L. (1975) Electrophoretic resolutionof the „major outer membrane protein of escherichia coli K-12 into four bands. FEBS Lett. 58: 245-258), který neobsahoval žádný β-merkaptoetanol, a vzorky se před testem PAGE uchovávaly při teplotě 0 °C. Aby • · • » « · · · · • · ♦ · ♦ · · došlo k denaturaci proteinu LbpB, vzorkový pufr se doplnil βmerkaptoetanolem a vzorky se povařily po dobu 5 minut. Elektroforéza se provedla při konstantním proudu 20 mA při teplotě 4 °C.

Imunoblotování se uskutečnilo způsobem, který se popisuje v publikaci Pettersson, A., van der Ley, P., Poolman, J. T., and Tommassen, J., (1993) Molecular characterization of the 98-kilodalton iron-regulated outer membrane protein of Neisseria meningitidis. Infect Immun 61: ' 4724-4733. Lidské sérum se naředilo v poměru 1:500. Jako sekundární protilátky se použily v pracovním ředění 1:5 000 králičí protilátky proti lidskému IgG spojené s peroxidázou (Dako A/S). Aktivita peroxidázy se detekovala systémem ECL podle instrukcí výrobce (Amersham).

9B: Imunogenost proteinu LbpB u člověka - výsledky

Přítomnost protilátek specifických pro protein LbpB v lidském séru se testovala proti čištěnému, rekombinantnímu proteinu LbpB kmene BNCV (-:2a:P1.2) v imunoblotech. Reaktivita se testovala proti svinutému LbpB a proti denaturovanému proteinu (zobrazeno například na obrázku č. 12). Výsledky se uvádějí v tabulce č. 6. čtyři séra silně reagovala s denaturovanou i svinutou formou proteinu LbpB. Pět sér slabě reagovalo s oběma formami. Dvě séra slabě reagovala pouze se svinutou formou. Dvě séra slabě reagovala pouze s denaturovanou formou a čtyři séra vůbec nereagovala s proteinem LbpB. Tyto výsledky ukazují, že meningokokový protein LbpB je pro člověka imunogenní a naznačují podstatný stupeň imunologické zkřížené reaktivity mezi proteiny LbpB, které pocházejí z různých kmenů.

Příklad 10: Test ELISA a bakteriální testy za použití séra získaného z myší imunizovaných meningokokovými buňakami nebo proteinem LbpB.

10A: Protokol imunizace

Imunizace mikroorganizmem N. meningitidis kmen BNCV: Skupina 10 myší (6 týdnů staré myši Balb/C) se imunizovala (100 μΐ intraperitoneálně nebo 100 μΐ podkožně) třikrát s 5 x 10⁸ CFU celých buněk BNCV deaktivovaných zahřátím v adjuvans SBAS2. Tři imunizace se provedly po 21 dnech. Zvýřata se nechala vykrvácet 56. den intrakardiální punkcí. Séra se sloučila podle skupin.

Imunizace proteinem LbpB pocházející z mikroorganizmu N. meningitidis kmen BNCV: Imunizace proběhla stejným způsobem, jak se popisuje shora v textu s tou výjimkou, že dvě první imunizace se provedly 10 μς surového proteinu LbpB (buněčné obaly mikroorganizmu E. coli obsahující rekombinanntí protein LbpB) a třetí imunizace se uskutečnila 2,5 μς čistého proteinu LbpB (který se připravil stejným způsobem, jak se popisuje v příkladu 8).

10B: Měření odezvy testu ELISA s celými buňakmi (WCE) a ELISA s čistým proteinem LbpB

Za tímto účelem se použily imunologické destičky Nunc s 96 prohlubněmi s rovným dnem. Do jednotlivých prohlubní se daly alikvoty 100 μΐ teplem deaktivované suspenze mikroorganizmu Neisseria meningitidis B (mikroorganizmus se kultivoval za podmínek s nedostatkem železa (fe-) za použití EDDA, jak se popisuje v příkladu 1) (20 μς/ιηΐ celkového proteinu) v PBS a prohlubně se nechaly přes noc odpařit při teplotě 37 °C.

Potažené destičky se čtyřikrát promyly 0,9 % NaCl, 0,05 % Tween 20 a saturovaly se 0,3 % kaseinem v PBS (Merck) po dobu 30 minut při teplotě místnosti za stálého míchání. Do první prohlubně se přidalo 100 μΐ spojeného séra 100 krát ředěného v PBS (obsahuje 0,05 % Tween 20, 0,1 % kasein) . Pak se ·

9 9 9

·* ·· • · 9 9

9 9 9

9 9 9 provedlo 12 ředění, kdy v každém ředění se sérum naředilo 2 krát. Destičky se inkubovaly po dobu 30 minut při teplotě 37 °C za stálého míchání. Po promytí se přidalo 100 μΐ 2 000 krát naředěných králičích anti-myších imuno-globulinů značených biotinem (Dakopatts E0413) v PBS (obsahuje 0,05 % Tween 20, 0,3 % kasein ) a destičky se inkubovaly stejným způsobem jako dříve. Destičky se promyly a pak se přidalo 100 μΐ 4 000 krát naředěného komplexu streptavidin-biotinovaná křenová peroxidáza v PBS (obsahuje 0,05 % Tween 20, 0,3 % kasein ) a destičky se inkubovaly stejným způsobem. Po promytí se přidalo 100 μΐ čerstvě připraveného barvícího roztoku tvořeného 4mg O-fenyldiamin(OPDA) (Sigma P8787) v pufru obsahujícím 0,1 M citrát s pH 4,5. Destičky se inkubovaly po dobu 15 minut při teplotě místnosti v tmavé místnosti. Reakce se skončila přidáním 50 μΐ IN HC1. Stanovila se absorbance při vlnové délce 490 nm.

Test anti-LBPB ELISA pracuje stejným způsobem, jako WCE s tou výjimkou, že potažení se provádí jiným způsobem. Prohlubně se potáhly 100 μΐ roztoku, který obsahuje 0,5 μg/ml čistého proteinu LbpB v 0,05 M pufru obsahujícím uhličitan/hydrogenuhličitan s hodnotou pH 9,6 a destičky se inkubovaly přes noc při teplotě 37 °C (nedošlo k odpařování).

10C: Baktericidní testy

Kultura meningokoků skupiny B (kmen H44/76) (kultivavaná buď za podmínek nedostatku železa (fe-), jak se popisuje v příkladu 1 nebo za podmínek bohatých na železo (fe+), při kterých se vypustilo přidání EDDA) v logaritmické fázi růstu (hodnota optické hustoty je přibližně 0,3) se suspendovala ve sterilním Hanksově médiu, které obsahuje 0,3 % BSA, za účelem získat fungující buněčnou suspenzi, jenž obsahuje 20 000 jednotek tvořících kolonie v jednom mililitru.

·· « rn · · ♦ * · · ·♦*· · * · * ·

OV 9 9 9 9 9 9 « * 4 Z **·· ** ·· · ·4

Připravila se primární reakční směs (75 μΐ) obsahující 50 μΐ dvakrát ředěných testovaných sérových vzorků na jednu prohluběň (příklad 10A) (která se deaktivovala teplem při teplotě 56 °C po dobu 30 minut) a 25 μΐ na jednu prohluběň logaritmické fáze meningokoků skupiny B obsahující 20 000 jednotek tvořících kolonie v jednom mililitru. Reakční zkumavky se inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 15 minut a míchaly se rychlostí 210 ot./min. Konečná reakční směs (100 μΐ) dále obsahovala 25 % předem testované králičí sérum, které slouží jako zdroj komplementu. Reakční smě s-e inkubovala za stejných podmínek po dobu 60 minut. Pro tento test se použily sterilní mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi se dnem do tvaru písmene U.

Z každé prohlubně se odebral za použití více kanálové pipety alikvot o objemu 10 μΐ a nanesl se na plotny s MuellerHintonovým agarem obsahujícím 1 % přípravek Isovitalex a 1% teplem deaktivované koňské sérum. Plotny se inkubovaly po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % C0₂.

Jednotlivé kolonie se mohly spočítat. Alikvot obsahoval až 80 jednotek tvořících kolonie.

Jako kontroly se použily následující tři testované vzorky: pufr + bakterie + komplement; pufr + bakterie + deaktivovaný komplement; sérum + bakterie + deaktivovaný komplement.

Za použití programu Excel (Microsoft) se vypočítaly titry. Výsledkem je přesné stanovení ředění za použití regresního výpočtu, které odpovídá 50 % usmrcení bakterií.

Příklad 10D: výsledky

Tabulka č. 7 a obrázek č. 13 zobrazují, že imunizace proteinem LbpB vyvolává dobrou odezvu proti proteinu LbpB (obrázek č 13), stejně jako proti vzorkům celých buněk kmene BNCV (zdroj rekombinantního proteinu LbpB) a kmene H44/76 (protein LbpB, který vykzuje pouze 78,5 % sekvenční shody ·« ♦ ř ι :

·* ·* t · » ♦ · * « » » t · * * · * • » · ♦ s proteinem LbpB kmene BNCV) (uvádí se na obrázku č. 13B a C) . Séra, která se získala použitím imunizačního plánu, a zahrnují pouze rekombinantní protein LbpB, vykazují stejný výsledek (data nejsou uvedeny). Je zřejmé, že imunizace proti celým buňkám kmenem BNCV vede k vyšší ELISA proti celým buňkám u buněk kmene BNCV i H44/76 (zobrazeno na obrázku č. 13B respektive 13 C).

Imunizace rekombinantním proteinem LbpB, který pochází z mikroorganizmu N. meningitidis kmen BNCV vyvolává protilátky, které se vážou na protein s podobnou molekulovou hmotností ve vzorku celých buněk z mikroorganizmu Moraxella catarrhalis na imunoblotu, který se vytvořil způsobem, jak se popisuje v příkladu 9 (data nejsou uvedena).

Tabulka č. 8 a obrázek č. 14 ukazují, že protilátky produkované v séru po imunizaci rekombinantním proteinem LbpB (z kmene BNCV) jsou baktericidní proti heterolognímu kmeni (H44/76), přičemž protein LbpB vykazuje pouze 78,5 % sekvenční shodu s proteinem pocházejím z kmene BNCV. To je také případ použití séra získaného po imunizaci zahrnující pouze rekombinantní protein LbpB (data nejsou uvedena). To je pravda, v případě, kdy se H44/76 kultivuje za podmínek, které obsahují železo (obrázek č. 14A) a při nedostatku železa (obrázek č. 14B). Větší účinek se dá očekává za podmínek kultivace bakterií s nedostatkem železa, kdy protein LbpB se exprimuje ve větším množství.

Protein LbpB je proto imunoprotektivní antigen a dále se dokázalo, že poskytuje zkříženou imunitní ochranu proti heterologním kmenům mikroorganizmu N. meningitidis.

Claims (34)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný polynukleotid kódující protein LbpB mikroorganizmu Neisseria meningitidis.
2. 2. Polynukleotid podle nároku 1, který je polynukleotidem SEQ ID NO: 1 (od nukleotidu 100 do nukleotidu 2 274),

   SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 nebo SEQ ID NO: 9.
3. 3. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvencí, která je alespoň ze 65 % shodná s nukleotidovou sekvencí' SEQ ID NO: 1 od nukleotidu 100 do nukleotidu 2 274.
4. 4. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která je alespoň ze 65 % shodná s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 3.
5. 5. Izolovaný polynukleotid obsahující nukleotidovou sekvenci, která je alespoň ze 65 % shodná s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 5.
6. 6. Izolovaný polynukleotid obsahující mukleotidovou sekvenci, která je alespoň ze 65 % shodná s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 7.
7. 7. Izolovaný polynukleotid obsahující nukletidovou sekvenci, která je alespoň ze 65% shodná s nukletidovou sekvencí SEQ ID NO: 9.
8. 8. Polynukleotid podle nároků 3 až 7 obsahující rekombinantní expresivní sytém, kde uvedený expresívní systém je schopen produkovat polypeptid LbpB v kompatibilní hostitelské buňce.
9. 9. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, že obsahuje expresívní systém podle nároku 8.
10. 10. Způsob produkce polypeptidu LbpB, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje kultivaci hostitele podle

    4 4 4 4 4

    4 · ♦ · 4

    4 4 4 4 4 4 •44444 ·· · « · 4 ·

    4 4 4 4 · ·

    4 4 · 4 4

    103 • 444 4 4 44 nároku 9 za podmínek dostatečných pro produkci uvedeného polypeptidu a získání polypeptidu z kultury.
11. 11. Způsob produkce buňky, která produkuje polypeptid LbpB, vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci nebo transfekci hostitelské buňky expresívním systémem podle nároku 8 tak, že hostitelská buňka za vhodných kultivačních podmínek produkuje polypeptid LbpB.
12. 12. Polypeptid LbpB z mikroorganizmu Neisseria meningitidis.
13. 13. Polypeptid podle nároku 12, který je polypeptid SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 nebo 10.
14. 14. Izolovaný polypeptid LbpB obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 65 %. shodná s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 2 po celé délce sekvence.
15. 15. Izolovaný polypeptid LbpB obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 65 % shodná s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 4 po celé délce sekvence.
16. 16« Izolovaný polypeptid LbpB obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 65 % shodná s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 6 po celé délce sekvence.
17. 17. Izolovaný polypeptid LbpB obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 65 % shodná s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 8 po celé délce sekvence.
18. 18. Izolovaný polypeptid LbpB obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň ze 65 % shodná s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 10 po celé délce sekvence.
19. 19. Polypeptid podle nároků 14, 15, 16, 17 nebo 18, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 • · · « » · · • ·« • · • · · · φφφ·· · ·

    104 nebo respektive 10 od polohy aminokyseliny 19 do C-konce polypeptidu.
20. 20. Fragment polypeptidu podle nároků 14 až 19, kde fragment si uchoval antigenní aktivitu polypeptidu s podmínkou, že fragmenty reprezentované polohou aminokyseliny 650 až 725 sekvence SEQ ID NO: 2 a 559 až 741 sekvence SEQ.ID NO: 6 nejsou zahrnuty.
21. 21. Protein obsahující fragment podle nároku 20.
22. 22. Protilátky, které jsou imunospecifické pro polypeptid LbpB podle nároku 14 až 19.
23. 23. Způsob identifikace látek, které inhibují polypeptid LbpB podle nároků 14 až 19, vyznačující se t í'm, ž e zahrnuje:

    (a) kontakt kandidátové látky s buňkami, které exprimují polypeptid LbpB a (b) pozorování navázání nebo inhibice funkční odezvy nebo porovnání schopnosti buněk, které přišli do kontaktu kandidátovými látkami, vykazovat aktivitu polypeptidu LbpB, se stejnými buňkami, které nebyly s uvedenou látkou v kontaktu.
24. 24. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství polypeptidu podle nároků 14 až 19 a farmaceuticky přijatelného nosiče.
25. 25. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství fragmentu polypeptidu nároků 14 až 19 a farmaceuticky přijatelný nosič, přičemž fragment si uchoval antigenní aktivitu polypeptidu.
26. 26. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství proteinu zahrnujícího fragment polypeptidu podle nároků 14 až 19 a farmaceuticky přijatelný nosič, přičemž fragment si uchoval antigenní aktivitu polypeptidu.

    105 • · « · · · · • · · · · · · ·

    9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 9 9

    9 9 9 9 9 · · .%
27. 27. Vakcína podle nároků 24 až 26, vyznačující se tím, že uvedená kompozice obsahuje alespoň jeden jiný antigen mikroorganizmu N. meningitis.
28. 28. Způsob vakcínace člověka proti onemocnění způsobené neisseriemi, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci kompozice uvedenému člověku, přičemž kompozice obsahuje účinné množství polypeptidu, fragmentu nebo proteinu podle nároků 14 až 21.
29. 29. Způsob vakcínace člověka proti onemocnění způsobené neisseriemi, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci kompozice uvedenému člověku, přičemž kompozice obsahuje účinné množství polynukleotidu podle nároků 3 až 7.
30. 30. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že uvedený polypeptid, fragment nebo protřen se aplikuje orálně, subkutánně, rektálně, intratracheálně, intramuskulárně nebo intranasálně.
31. 31. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že uvedený polynukleotid se aplikuje subkutánně, intratracheálně, intramuskulárně nebo intranasálně.
32. 32. Způsob diagnostikování onemocnění člověka způsobené neisseriemi, vyznačující se tím, že zahrnuje inkubaci protilátek, které vznikají tak, že se vhodnému člověku nebo zvířeti aplikuje polypeptid podle nároků 14 až 19, se vzorkem biologických tekutin pocházejích ze člověka, jenž je diagnostikován, přičemž při přítomnosti neisseriových bakterií se tvoří komplex antigen-protilátka a následně se v uvedeném vzorku tekutiny analyzuje přítomnost komplexu.
33. 33. Terapeutická kompozice, vyznačující se tím, ž e je použitelná při léčbě lidí trpících neisseriovým onemocněním a obsahuje alespoň jedny • ♦ ·

    106 • · · · · • · · · • · · φ · • · · · • · · · · · protilátky určené proti polypeptidů podle nároku 14 až 19 a vhodný farmaceutický nosič.
34. 34. Sada vhodná pro diagnózu infekce neisseriovými bakteriemi u člověka, vyznačující se tím, že obsahuje polynukleotid podle nároků 3 až 7 nebo polypeptid, fragment nebo protein podle nároků 14 až 21 nebo protilátky podle nároku 22.